专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
申请号 | CN202211348348.0 | 申请日 | 2022-10-31 |
公开(公告)号 | CN115612124A | 公开(公告)日 | 2023-01-17 |
申请人 | 徐州医科大学; | 申请人类型 | 学校 |
发明人 | 任颖; 徐子棠; 郭舒琪; 封昊天; 袁长永; 王鹏来; | 第一发明人 | 任颖 |
权利人 | 徐州医科大学 | 权利人类型 | 学校 |
当前权利人 | 徐州医科大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
省份 | 当前专利权人所在省份:江苏省 | 城市 | 当前专利权人所在城市:江苏省徐州市 |
具体地址 | 当前专利权人所在详细地址:江苏省徐州市云龙区铜山路209号 | 邮编 | 当前专利权人邮编:221000 |
主IPC国际分类 | C08J3/075 | 所有IPC国际分类 | C08J3/075 ; C08L5/08 ; C08L89/00 ; C08K3/26 ; A61L27/26 ; A61L27/50 ; A61L27/52 ; A61L27/54 |
专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
专利代理机构 | 南京擎天知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 涂春春; |
摘要 | 本 发明 公开了一种包含BMP2模拟肽和SDF‑1的可注射透明质酸 水 凝胶的制备方法,其特征在于,1)制备包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液;2)制备复合SDF‑1的丝素蛋白微球;2‑1)制备丝素蛋白微球:2‑2)将SDF‑1与丝素蛋白微球在溶液中通过正负电 吸附 原理进行复合形成复合SDF‑1的丝素蛋白微球;3)将复合SDF‑1的丝素蛋白微球与透明质酸水凝胶前体溶液混合,常温即可形成包含BMP2模拟肽和SDF‑1的可注射透明质酸水凝胶。本发明以透明质酸为水凝胶的主体,引入丝素微球复合SDF‑1,同时包载BMP2模拟肽,解决了SDF‑1、BMP2因子的体内突释及BMP2因子免疫原性问题,成功制备BMP2模拟肽修饰及包载复合SDF‑1丝素蛋白微球的可注射透明质酸水凝胶,为该 生物 材料 体内促进骨组织再生奠定 基础 。 | ||
权利要求 | 1.一种包含BMP2模拟肽和SDF‑1的可注射透明质酸水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤: |
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说明书全文 | 一种包含BMP2模拟肽和SDF‑1的可注射透明质酸水凝胶的制备方法 技术领域[0001] 本发明涉及材料领域,具体涉及一种包含BMP2模拟肽和SDF‑1的可注射透明质酸水凝胶的制备方法。 背景技术[0002] 水凝胶是通过化学键、氢键、范德华力或物理缠结等方式交联的三维网络结构的特殊软湿性材料,可以在水或生物体液中溶胀但不溶解,兼具有固态和液态两种性质。这一特性使其广泛应用于组织工程、药物载体等生物医学领域。由于水凝胶三维空间网路结构和天然的细胞外基质相似,因此,水凝胶材料可以为细胞粘附、增殖、生长提供支撑作用和代谢空间,水凝胶吸水膨胀的特性以及对小分子的渗透扩散使其具有良好的生物相容性,且水凝胶良好的柔韧性和高弹性可以极大的减少对细胞的损伤,因此可广泛与用于组织工程修复等领域。 [0003] 基质细胞衍生因子(SDF‑1)是一种超细胞衍生因子,可以招募干细胞,引起干细胞的募集行为,同时研究表明SDF‑1可在牙周膜干细胞膜表面分泌,并且和血管内皮生长因子及成纤维细胞生长因子2(FGF2)类似具有支持和促进牙周膜干细胞分化的潜能。此外,SDF‑1参与调节血管生成,部分通过募集内皮祖细胞以及引导干细胞的运输在胚胎发生、发育和组织再生期间发挥重要作用,并可通过激活脂磷酸激酶(P13K)将牙周膜干细胞迁移到牙周组织缺损部位,同时能对牙周组织炎症进行调控,调节免疫反应。目前对SDF‑1因子的使用集中于单独注射或将生物材料浸泡于SDF‑1稀释液中,不利于SDF‑1因子的缓控释及持续作用。 [0004] BMP2(骨形态发生蛋白2)模拟肽(序列:KIPKASSVPTELSAISTLYL)具有BMP2相似的生物学作用,可以促进干细胞成骨,但是目前大剂量BMP2反而不利于干细胞的成骨分化。 发明内容[0005] 本发明的目的在于提供一种包含BMP2模拟肽和SDF‑1的可注射透明质酸水凝胶的制备方法,制备方法简单,解决了SDF‑1、BMP2因子单独使用所涉及的体内突释问题。 [0006] 本发明采用的技术方案如下:一种包含BMP2和SDF‑1的可注射透明质酸水凝胶的制备方法,包括如下步骤: [0007] 1)制备包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液 [0008] 1‑1)制备己二酸二酰肼修饰的透明质酸HA‑ADH; [0010] 1‑3)上述所制备的产物HA‑ADH和HA‑CHO分别用BMP2模拟肽溶液溶解形成包含BMP2模拟肽的HA‑ADH溶液和包含BMP2模拟肽的HA‑CHO溶液,两者即为包含BMP2模拟肽的的透明质酸水凝胶前体溶液; [0011] 2)制备复合SDF‑1的丝素蛋白微球 [0012] 2‑1)制备丝素蛋白微球:以Ca2CO3作为丝素蛋白微球的核心,丝素蛋白包覆于Ca2CO3外; [0013] 2‑2)将SDF‑1与丝素蛋白微球在溶液中通过正负电吸附原理进行复合形成复合SDF‑1的丝素蛋白微球; [0014] 3)将复合SDF‑1的丝素蛋白微球与包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液混合,形成包含BMP2模拟肽和SDF‑1的可注射透明质酸水凝胶。 [0015] 优选地,所述己二酸二酰肼修饰透明质酸HA‑ADH的具体制备方法为:透明质酸与己二酸二酰肼于EDC和HOBT活化条件下反应制备得到HA‑ADH。 [0016] 优选地,所述氧化透明质酸(HA‑CHO)的具体制备方法为:将透明质酸利用高碘酸氧化制备得到HA‑CHO。 [0017] 优选地,所述丝素蛋白微球的具体制备方法为: [0018] a、制备丝素蛋白微球核心‑Ca2CO3模板:将Na2CO3溶液加入搅拌中的CaCl2溶液中,形成Ca2CO3模板; [0019] b、将步骤a制备的Ca2CO3模板离心,去上清液,加入乙醇‑水,离心,去上清液,然后加水离心多次,去上清液; [0020] c、加入水,重悬,然后加入纯化的丝素蛋白,垂直混悬后,离心清洗,加甲醇‑水,再次垂直混悬,离心清洗。 [0021] d、重复步骤c,进行多层包覆; [0022] e、当包裹到理想层时,加入戊二醛溶液,垂直混悬、离心,水洗得丝素蛋白微球; [0023] 优选地,步骤a中,Ca2CO3模板制备中,Na2CO3与CaCl2摩尔比为1:1。 [0024] 优选地,步骤b中,加入乙醇和水的体积比为1:1‑1:3。 [0025] 优选地,步骤c中,加入甲醇和水的体积比为1:5‑1:10。 [0027] 进一步优选地,透析袋的截留分子量为3500MW。 [0028] 进一步优选地,滤膜的孔径为0.22μm。 [0029] 本发明的有益效果如下:本发明公开的可注射透明质酸水凝胶的制备方法中,将SDF‑1通过与丝素蛋白微球复合,同时将BMP2模拟多肽引入HA水凝胶中,然后通过复合SDF‑1的丝素蛋白微球与包含BMP2模拟肽的HA水凝胶前体溶液混合,即可形成包含BMP2模拟多肽和SDF‑1丝素蛋白微球的可注射透明质酸水凝胶,制备方法简单,同时丝素蛋白对SDF‑1的吸附作用以及水凝胶对BMP2模拟多肽的包封作用,解决了SDF‑1、BMP2因子单独使用所涉及的体内突释问题。 附图说明 [0030] 为了更清楚地说明本发明的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。 [0031] 图1为透明质酸(HA)核磁共振氢谱图; [0032] 图2为己二酸二酰肼修饰的透明质酸(HA‑ADH)核磁共振氢谱图,δ=2.1‑2.3ppm处的亚甲基信号峰证实己二酸二酰肼成功修饰透明质酸,以N‑乙酰甲基(δ=1.91‑1.92ppm)作为内标,计算得取代度为30.78%。; [0033] 图3为HA、HA‑CHO、HA‑ADH红外光谱图,1785cm‑1处为醛基吸收峰,1579cm‑1处为酰胺键吸收峰; [0034] 图4为丝素蛋白微球扫描电镜图; [0035] 图5为丝素蛋白与复合SDF‑1丝素蛋白微球Zata电位图; [0036] 图6为包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶扫描电镜图(不包括丝素蛋白微球,即HA‑CHO‑BP溶液与HA‑ADH‑BP溶液混合形成); [0037] 图7为包含BMP2模拟肽和SDF‑1丝素蛋白微球的透明质酸水凝胶扫描电镜图(含丝素蛋白微球,即复合SDF‑1的丝素蛋白微球与HA‑CHO‑BP溶液和HA‑ADH‑BP溶液混合形成)。 具体实施方式[0038] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明具体实施例及相应的附图对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然,所描述的实施例仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。以下结合附图,详细说明本发明各实施例提供的技术方案。 [0039] 实施例1 [0040] 一、制备包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液 [0041] 1、己二酸二酰肼透明质酸(HA‑ADH)的制备 [0042] 1、己二酸二酰肼修饰的透明质酸(HA‑ADH)的制备 [0043] 取200mg(90kDa)透明质酸(HA)溶于40mL蒸馏水中,加入2.6g己二酸二酰肼反应30min。称取0.31g EDC,0.306g HOBT于40mL DMSO中充分溶解(超纯水:DMSO=1:1)。溶解完全后将DMSO缓慢加入HA溶液中。反应4h,每30min将pH调整至6.8。4h反应结束后室温下继续搅拌反应24h。将溶液转移至透析袋中透析3天,用0.22μm的滤膜过滤,冻干得到固体HA‑ 1 1 ADH。H‑NMR检测己二酸二酰肼取代度,计算得30.78%。HA及HA‑ADH的H‑NMR检测如图1、图2所示。 [0044] 2、氧化透明质酸(HA‑CHO)的制备 [0045] 取200mg(90kDa)透明质酸溶于20mL蒸馏水中充分溶解,加入103mg高碘酸钠进行氧化,反应2h,然后加入过量的乙二醇终止反应,将溶液转移至透析袋中透析3天,用0.22μm的滤膜过滤,冻干得到固体HA‑CHO。 [0046] 将50mg HA‑CHO溶于20mL 0.25mol/L的盐酸羟胺溶液中,反应5h后用电位滴定法测定HA‑CHO的氧化度,测定值为26.32%。 [0047] 用傅立叶红外光谱法测定氧化HA中醛基的形成,取少量冻干后的HA‑CHO、HA‑ADH‑1 ‑1及HA,用透射法进行测试,红外测试的光谱范围为400cm ‑4000cm ,红外光谱检测如图3所示。 [0048] 3、制备包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液 [0049] HA‑ADH与HA‑CHO分别用浓度为2mg/mL的BMP2模拟多肽溶液溶解为3wt%的溶液,制备成包含BMP2模拟肽的HA‑ADH溶液(HA‑CHO‑BP溶液)和包含BMP2模拟肽的HA‑CHO溶液(HA‑ADH‑BP溶液),两者即为包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液(包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液指的是独立的,未混合的HA‑CHO‑BP溶液和HA‑ADH‑BP溶液,当与复合SDF‑1的丝素蛋白微球混合时候,HA‑CHO‑BP溶液与HA‑ADH‑BP溶液混合形成包含BMP2模拟肽的HA水凝胶)。 [0050] 二、制备复合SDF‑1的丝素蛋白微囊微球 [0051] 1.丝素蛋白的纯化 [0052] 称取4g丝素蛋白粉于50mL圆底烧瓶中,加入20mL 9.3M LiBr溶液,放于提前预热到60℃的水浴锅里搅拌4h,之后转移到3500MW透析袋超纯水透析3h。将透析袋中SF溶液收集到几个50mL离心管中,转速为8000rpm/min,20min,离心三次去除不溶物,之后0.22μm滤膜过滤,置于4℃保存。 [0053] 2.丝素蛋白微球的制备 [0054] (1)制备丝素蛋白微球核心‑Ca2CO3模板 [0055] 配制1mol/L的Na2CO3溶液(M=106,用250mL容量瓶定容),1mol/L的CaCl2溶液(M=147,用250mL容量瓶定容),按表中数量关系加入(mL) [0056] 溶液名称 溶液体积(mL)水 4 乙二醇 6 Na2CO3 2 CaCl2溶液 2 [0057] 将Na2CO3溶液加入搅拌中的CaCl2溶液中,搅拌1h,不静置。 [0058] (2)包裹丝素蛋白 [0059] ①将准备好的丝素蛋白溶液使用离心机8000rpm/min,20min离心,去上清液。 [0060] ②将步骤1中Ca2CO3模板3500rpm/min,2min离心,去上清液,加入乙醇水(乙醇:水体积比=1:1)到35mL左右,3500rpm/min,2min离心,去上清液,然后用水离心两遍。 [0061] ③去除上清液后,加入水8mL,重悬,丝素蛋白4mL,孵育1h(最好在垂直混悬仪中),然后3500rpm/min,2min离心,用35mL水洗两遍,每次3500r,2min,加入4mL水,重悬,加无水甲醇20mL(水:甲醇体积比=1:5),垂直混悬,30min后,3500rpm/min,2min离心,35mL水洗两遍,3500rpm/min,2min,离心。 [0062] ④重复步骤③,进行第二层包覆,然后加入50%的戊二醛溶液使其浓度为2%,垂直混悬1h,3500rpm/min,2min离心,水洗两遍,制得丝素蛋白微球,其电镜图如图4所示。 [0063] (3)复合SDF‑1 [0064] 由于SDF‑1带正电,丝素蛋白微球表面带负电,2wt%丝素蛋白微球与150ng/mL SDF‑1在溶液中通过正负电吸附原理进行复合,形成复合SDF‑1的丝素蛋白微球,微球冷冻干燥后备用,丝素蛋白与复合SDF‑1丝素蛋白微球Zata电位图如图5所示,由图5显示,复合SDF‑1的丝素蛋白微球电位略有升高。 [0065] 三、制备包含BMP2模拟肽和SDF‑1丝素蛋白微球的可注射透明质酸水凝胶[0066] 将复合SDF‑1的丝素蛋白微球与包含BMP2模拟肽的HA‑ADH溶液(HA‑CHO‑BP溶液)和包含BMP2模拟肽的HA‑CHO溶液(即包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液)三者在PBS作为溶剂下等体积混合,常温即可形成包含BMP2和SDF‑1‑丝素蛋白微球的的可注射透明质酸水凝胶,其电镜图如图7所示。 [0067] 实施例2 [0068] 一、制备包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液 [0069] 1、己二酸二酰肼透明质酸(HA‑ADH)的制备 [0070] 1、己二酸二酰肼修饰的透明质酸(HA‑ADH)的制备 [0071] 取400mg(90kDa)透明质酸(HA)溶于80mL蒸馏水中,加入5.2g己二酸二酰肼反应30min。称取0.62g EDC(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐),0.612gHOBT(1‑羟基苯并三唑)于80mL DMSO中充分溶解(超纯水:DMSO=1:1)。溶解完全后将DMSO缓慢加入HA溶液中。反应4h,每30min将PH调整至6.8。4h反应结束后室温下继续搅拌反应24h。将溶液转 1 移至透析袋中透析3天,用0.22μm的滤膜过滤,冻干得到固体HA‑ADH。H‑NMR检测己二酸二 1 酰肼取代度,计算得30.78%。HA及HA‑ADH的 H‑NMR检测如图1、图2所示。 [0072] 2、氧化透明质酸(HA‑CHO)的制备 [0073] 取400mg(90kDa)透明质酸溶于40mL蒸馏水中充分溶解,加入206mg高碘酸钠进行氧化,反应2h,然后加入过量的乙二醇终止反应,将溶液转移至透析袋中透析3天,用0.22μm的滤膜过滤,冻干得到固体HA‑CHO。 [0074] 将50mg HA‑CHO溶于20mL 0.25mol/L的盐酸羟胺溶液中,反应5h后用电位滴定法测定HA‑CHO的氧化度,测定值为26.32%。 [0075] 用傅立叶红外光谱法测定氧化HA中醛基的形成,取少量冻干后的HA‑CHO、HA‑ADH‑1 ‑1及HA,用透射法进行测试,红外测试的光谱范围为400cm ‑4000cm ,红外光谱检测如图3所示。 [0076] 3、制备包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液 [0077] HA‑ADH与HA‑CHO分别用浓度为4mg/mL的BMP2模拟多肽溶液溶解为6wt%的溶液,制备成包含BMP2模拟肽的HA‑ADH溶液(HA‑CHO‑BP)和包含BMP2模拟肽的HA‑CHO溶液(HA‑ADH‑BP),两者即为包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液。 [0078] 二、制备复合SDF‑1的丝素蛋白微囊微球 [0079] 1.丝素蛋白的纯化 [0080] 称取4g丝素蛋白粉于50mL圆底烧瓶中,加入20mL 9.3M LiBr溶液,放于提前预热到60℃的水浴锅里搅拌4h,之后转移到3500MW透析袋超纯水透析3天。将透析袋中SF溶液收集到几个50mL离心管中,转速为8000rpm/min,20min,离心三次去除不溶物,之后0.22μm滤膜过滤,置于4℃保存。 [0081] 2.丝素蛋白微球的制备 [0082] (1)制备丝素蛋白微球核心‑Ca2CO3模板 [0083] 配制1mol/L的Na2CO3溶液(M=106,用250mL容量瓶定容),1mol/L的CaCl2溶液(M=147,用250mL容量瓶定容),按表中数量关系加入(mL) [0084] 溶液名称 溶液体积(mL)水 4 乙二醇 6 Na2CO3 2 CaCl2溶液 2 [0085] 将Na2CO3溶液加入搅拌中的CaCl2溶液中,搅拌1h,不静置。 [0086] (2)包裹丝素蛋白 [0087] ①将准备好的丝素蛋白溶液使用离心机8000rpm/min,20min离心,去上清液。 [0088] ②将步骤1中Ca2CO3模板3500rpm/min,2min离心,去上清液,加入乙醇水(乙醇:水体积比=1:2)到35mL左右,3500rpm/min,2min离心,去上清液,然后用水离心两遍。 [0089] ③去除上清液后,加入水8mL,重悬,丝素蛋白4mL,孵育1h(最好在垂直混悬仪中),然后3500rpm/min,2min离心,用35mL水洗两遍,每次3500r,2min,加入4mL水,重悬,加无水甲醇20mL(水:甲醇体积比=1:10),垂直混悬,30min后,3500rpm/min,2min离心,35mL水洗两遍,3500rpm/min,2min,离心。 [0090] ④重复步骤③,进行第二层包覆,然后加入50%的戊二醛溶液使其浓度为2%,垂直混悬1h,3500rpm/min,2min离心,水洗两遍,制得丝素蛋白微球,其电镜图如图4所示。 [0091] (3)复合SDF‑1 [0092] 由于SDF‑1带正电,丝素蛋白微球表面带负电,2wt%丝素蛋白微球与150ng/mL SDF‑1在溶液中通过正负电吸附原理进行复合,形成复合SDF‑1的丝素蛋白微球,微球冷冻干燥后备用,丝素蛋白与复合SDF‑1丝素蛋白微球Zata电位图如图5所示,由图5显示,复合SDF‑1的丝素蛋白微球电位略有升高。 [0093] 三、制备包含BMP2模拟肽和SDF‑1丝素蛋白微球的可注射透明质酸水凝胶[0094] 将复合SDF‑1的丝素蛋白微球与包含BMP2模拟肽的透明质酸水凝胶前体溶液在PBS作为溶剂下等体积混合,常温即可形成包含BMP2和SDF‑1‑丝素蛋白的可注射透明质酸水凝胶,其电镜图如图7所示。 [0095] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。 |