一种含硒高分子化合物修饰的钛材料及其制备方法与用途
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202410220052.3 | 申请日 | 2024-02-28 |
| 公开(公告)号 | CN118085314A | 公开(公告)日 | 2024-05-28 |
| 申请人 | 北京大学口腔医学院; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 周永胜; 吕珑薇; 许华平; 翟墨; 鲜于般若; 白晓强; 付杨; | 第一发明人 | 周永胜 |
| 权利人 | 北京大学口腔医学院 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 北京大学口腔医学院 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：北京市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：北京市海淀区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：北京市海淀区中关村南大街22号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：100081 |
| 主IPC国际分类 | C08G83/00 | 所有IPC国际分类 | C08G83/00 ; A61L27/18 ; A61L27/06 ; A61L27/54 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京知汇林知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 周敏毅; |
| 摘要 | 本 发明 属于 生物 医学工程技术领域，涉及一种含硒高分子化合物修饰的 钛 材料及其制备方法与用途。所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料由含硒高分子化合物与金属钛配位复合得到，所述的含硒高分子化合物由包含HO‑(CH2)11‑Se‑(CH2)11‑OH、1,4‑二(2‑羟乙基)哌嗪、异氰酸酯、聚乙二醇单甲醚的原料通过反应制备得到。利用本发明的制备方法制备得到的含硒高分子化合物修饰的钛材料，能够用作 口腔 种植体或骨科 植入物 ，在植入 机体 后降低种植引起的 炎症 ，实现抗炎与促成骨的协同作用。 | ||
| 权利要求 | 1.一种含硒高分子化合物修饰的钛材料，其特征在于：所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料由含硒高分子化合物与金属钛配位复合得到，所述的含硒高分子化合物由包含HO‑(CH2)11‑Se‑(CH2)11‑OH、1,4‑二(2‑羟乙基)哌嗪、异氰酸酯、聚乙二醇单甲醚的原料通过反应制备得到。 |
||
| 说明书全文 | 一种含硒高分子化合物修饰的钛材料及其制备方法与用途技术领域背景技术[0002] 钛及钛基材料因其优异的生物相容性以及在各种环境中的化学惰性，目前被广泛应用于口腔种植体或骨科植入物中。然而，种植体骨结合不良及种植体周炎仍是目前临床尚未解决的问题，其中大部分是由于种植区域的炎症或感染导致的种植体松动或脱落。另一方面，糖尿病、骨质疏松症等全身慢性病发病率不断增高，在这样的全身背景下机体存在持续的炎症或成骨能力下降，给种植体周围的炎症控制带来更大的挑战。因此，设计并研发抗炎和促成骨协同的表面改性钛基材料，缓解植入早期种植区域的炎症，促进种植体周围骨形成，降低因炎症引起的种植体脱落风险，具有重大的临床意义和应用前景。 [0003] 已有钛及钛基材料表面改性方法着眼于成骨及免疫共同调节，例如专利申请“一种具有促成骨和免疫调控性能的钛表面改性方法”(申请号：CN202211496632.2)通过表面构建三氧化二铋涂层来提高钛基植入物的骨免疫调控能力，然而其仅初步验证了涂层在成骨及骨免疫中的作用。 [0004] 硒是一种人体所必需的微量元素，其在低剂量下可以作为抗氧化剂，支持细胞存活和生长，减轻炎症并有一定抗菌作用。目前含硒高分子研究多着眼于肿瘤靶向治疗领域，例如专利申请“一种靶向还原敏感性聚合物胶束、制备方法及应用”(申请号：CN202211516175.9)应用高剂量水平硒杀灭肿瘤细胞，但对低剂量硒在炎症环境下的最适浓度仍未定论，对成骨的影响也尚不明确。 发明内容[0005] 本发明的首要目的是提供一种含硒高分子化合物修饰的钛材料，以能够在用作口腔种植体或骨科植入物，在植入机体后降低种植引起的炎症，实现抗炎与促成骨的协同作用。 [0006] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种含硒高分子化合物修饰的钛材料，所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料由含硒高分子化合物与金属钛配位复合得到，所述的含硒高分子化合物由包含HO‑(CH2)11‑Se‑(CH2)11‑OH、1,4‑二(2‑羟乙基)哌嗪、异氰酸酯、聚乙二醇单甲醚的原料通过反应制备得到。 [0007] 本发明的第二个目的是提供一种如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备方法，以能够更好地制备如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料，制得含硒高分子化合物修饰的钛材料能够在用作口腔种植体或骨科植入物，在植入机体后降低种植引起的炎症，实现抗炎与促成骨的协同作用。 [0008] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤： [0009] (1)制备含硒高分子化合物：在有机溶剂中混合HO‑(CH2)11‑Se‑(CH2)11‑OH、1,4‑二(2‑羟乙基)哌嗪、异氰酸酯、聚乙二醇单甲醚、催化剂进行反应，反应所得产物进行重结晶并进行洗涤； [0010] (2)将步骤(1)制得的含硒高分子化合物溶于有机溶剂中，然后浸泡入金属钛材料进行修饰反应。 [0011] 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备方法，其中步骤(1)中， [0012] 所述的有机溶剂选自四氢呋喃、N,N‑二甲基甲酰胺、二氯甲烷、三氯甲烷、1,2‑二氯乙烷、乙酸乙酯和乙酸正丁酯中的一种或者多种； [0014] HO‑(CH2)11‑Se‑(CH2)11‑OH、1,4‑二(2‑羟乙基)哌嗪、异氰酸酯、聚乙二醇单甲醚的摩尔比为x:1:(1.1x+1.1):(0.2x+0.2)，其中x为0.1～10； [0015] 所述的催化剂为二月桂酸二丁基锡。 [0016] 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备方法，其中步骤(1)中，反应温度为30‑100℃，反应时间为1‑48小时。 [0017] 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备方法，其中步骤(1)中，所述的重结晶为用乙醚进行重结晶，所述的洗涤为用体积百分比浓度5‑50％的乙醇进行洗涤。 [0018] 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备方法，其中步骤(2)中， [0019] 所述的有机溶剂为二甲基亚砜和/或N,N‑二甲基甲酰胺； [0020] 含硒高分子化合物溶于有机溶剂后的浓度为1‑10mg/ml。 [0021] 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备方法，其中步骤(2)中， [0022] 所述的金属钛材料为金属钛片或金属钛棒； [0023] 所述的金属钛材料在使用前经过打磨和超声清洗。 [0024] 在一种优选的实施方案中，本发明提供一种如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备方法，其中步骤(2)中，所述的修饰反应的时间为1‑2小时。 [0025] 本发明的第三个目的是提供如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料用作口腔种植体或骨科植入物的用途，以能够在植入机体后降低种植引起的炎症，实现抗炎与促成骨的协同作用。 [0026] 为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料用作口腔种植体或骨科植入物的用途。 [0027] 在一种优选的实施方案中，本发明提供如上所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料用作口腔种植体或骨科植入物的用途，其中所述的用途为所述的含硒高分子化合物修饰的钛材料用作糖尿病环境下的口腔种植体或骨科植入物的用途。 [0028] 本发明的有益效果在于，利用本发明的制备方法制备得到的含硒高分子化合物修饰的钛材料，能够在用作口腔种植体或骨科植入物，在植入机体后降低种植引起的炎症，实现抗炎与促成骨的协同作用。 [0029] 本发明将硒元素引入钛及钛基材料表面，利用含硒高分子化合物与金属钛配位复合，植入机体后通过硒对周围组织的影响，降低种植引起的炎症，从而可实现抗炎与促成骨协同的钛基植入材料的多功能化和在疾病中的应用性。 [0030] 本发明中含硒高分子化合物修饰的钛材料具有便于应用、表面处理方便的优势；同时具有广阔的应用前景，因其具有抗炎和促成骨的协同作用，可用于植入物的早期炎症控制、促进种植体周围骨形成、及种植体周围的炎症控制，即使在包括糖尿病在内的全身慢性疾病的病理环境下也具有良好的应用前景。 [0031] 本发明的有益效果具体体现在： [0032] (1)本发明的含硒高分子化合物修饰的钛材料可以促进其表面的hBMMSCs成骨，且可调节THP‑1诱导的巨噬细胞向抗炎的M2型极化，从而抑制其向促炎的M1型极化； [0033] (2)SD大鼠股骨缺损模型表明，本发明的含硒高分子化合物修饰的钛材料可促进植入物周围的骨再生； [0035] 图1为含硒小分子表征结果图，其中图1a为含硒小分子结构；图1b为核磁共振氢谱；图1c为核磁共振碳谱；图1d为核磁共振硒谱表征结果；图1e为电喷雾质谱的实验结果；+ + 图1f为电喷雾质谱的理论模拟峰型。预测分子量[M+Na]：445.26，实验测定分子量[M+Na]： 445.25。 [0036] 图2为含硒高分子化合物的核磁共振氢谱检测结果，其中SePu1为25％Se含硒高分子化合物，SePu2为50％Se含硒高分子化合物，SePu3为75％Se含硒高分子化合物。 [0037] 图3为含硒高分子化合物的凝胶渗透色谱检测结果，其中SePu1为25％Se含硒高分子化合物，SePu2为50％Se含硒高分子化合物，SePu3为75％Se含硒高分子化合物。 [0038] 图4为含硒高分子化合物修饰的钛材料的表征结果图，其中图4a为含硒高分子化合物修饰的钛材料表面的硒离子特征峰图；图4b为纯钛(Ti)和含硒高分子化合物修饰的钛材料(SePu‑Ti)表面硒离子面扫图。 [0039] 图5为含硒高分子化合物修饰的钛材料表面接触角检测结果图，其中图5a为纯钛(Ti)和不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料表面接触角检测结果图；图5b为纯钛(Ti)和不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料表面接触角大小比较图。 [0040] 图6为含硒高分子化合物修饰的钛材料的活/死细胞染色结果图，其中图6a为纯钛(Ti)和不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料对人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的活/死细胞染色结果图； [0041] 图6b为纯钛(Ti)和不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料对人单核细胞白血病细胞(THP‑1)的活/死细胞染色结果图。 [0042] 图7为含硒高分子化合物修饰的钛材料体外间充质干细胞促成骨效果检测结果图，其中图7a为纯钛(Ti)和不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料对人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的碱性磷酸酶(ALP)影响染色结果图；图7b为碱性磷酸酶(ALP)定量结果图； [0043] 图7c为qPCR检测成骨相关基因ALP、OCN、RUNX2的表达检测结果图； [0044] 图7d为Western Blot检测成骨相关蛋白RUNX2的表达检测结果图；图7e为人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的免疫荧光图像检测结果图。 [0045] 图8为含硒高分子化合物修饰的钛材料体外对巨噬细胞极化的影响检测结果图，其中图8a为qPCR检测纯钛(Ti)和不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料对人单核细胞白血病细胞(THP‑1)诱导的巨噬细胞向促炎表型极化基因TNFα、iNOS的表达影响检测结果图； [0046] 图8b为qPCR检测巨噬细胞向抗炎表型极化基因ARG1、TGFβ的表达检测结果图；图8c为Western Blot检测巨噬细胞向促炎表型极化相关蛋白iNOS、向抗炎表型极化相关蛋白ARG‑1的表达检测结果图；图8d为巨噬细胞内活性氧(ROS)表达的荧光染色结果图；图8e为巨噬细胞内活性氧(ROS)表达的荧光染色定量结果图。 [0047] 图9为含硒高分子化合物修饰的钛材料体内对SD大鼠股骨缺损植入修复的影响检测结果图。 [0048] 图10为高糖环境下含硒高分子化合物修饰的钛材料体外间充质干细胞促成骨效果检测结果图，其中图10a为纯钛(Ti)和25％Se 3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料对人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的ARS染色结果图；图10b为qPCR检测成骨相关基因ALP、OCN、RUNX2的表达检测结果图；图10c为Western Blot检测成骨相关蛋白RUNX2的表达检测结果图。 [0049] 图11为含硒高分子化合物修饰的钛材料与亚硒酸钠修饰的钛材料的体外间充质干细胞促成骨效果对比结果图，其中图11a为1μM亚硒酸钠修饰的钛材料和25％Se 3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料对人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)的ALP染色结果图；图11b为qPCR检测成骨相关基因ALP、OCN、RUNX2的表达检测结果图。 具体实施方式[0050] 以下通过实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。 [0051] 实施例1：HO‑(CH2)11‑Se‑(CH2)11‑OH的制备 [0052] 将1.0g硒粉(0.0114mol)与2.0g硼氢化钠(0.0528mol)加入250mL的圆底烧瓶中，冰水浴条件下向其中缓慢滴加30mL水。待反应程度逐渐趋于缓和，停止产生气体后，用插有气球的橡胶塞封口，得到无色透明溶液，恢复至室温备用。将5.7g 11‑溴‑1‑十一醇(0.0227mol)溶解于40mL四氢呋喃中得到溶液，在搅拌条件下，用注射器及针管向上述无色透明溶液加入制备好的11‑溴‑1‑十一醇溶液，于50℃加热反应6h。反应结束后，将反应装置冷却至室温，向剩余混合物中加入二氯甲烷及去离子水，分液并收集有机相。水相用二氯甲烷洗涤至无色，合并有机相溶液。加入无水硫酸钠干燥，过滤除去无水硫酸钠，通过旋转蒸发除去大部分二氯甲烷得到浓溶液，逐滴滴入强烈搅拌的石油醚中进行重结晶，过滤得到淡黄白色固体产物。所得含硒小分子分子结构如图1a所示，核磁共振氢谱、核磁共振碳谱和核磁共振硒谱检测结果分别如图1b、图1c、图1d所示，电喷雾质谱实验结果与电喷雾质谱理论模拟峰型分别如图1e、图1f所示。 [0053] 含硒小分子核磁共振氢谱检测结果：1H NMR(400MHz,Chloroform‑d)δ3.63(dt,J1＝J2＝6.1Hz,4H,‑CH2‑OH),2.54(t,J＝7.5Hz,4H,‑Se‑CH2‑),1.70–1.60(p,J＝6.8Hz,4H,‑CH2CH2‑OH),1.56(p,J＝6.8Hz,4H,‑Se‑CH2CH2‑),1.42‑1.22(m,28H,‑Se‑CH2CH2(CH2)7CH2CH2‑OH). [0054] 含硒小分子核磁共振碳谱检测结果：13C NMR(101MHz,Chloroform‑d)δ63.22(‑CH2‑OH),32.93(‑CH2CH2‑OH),30.80(‑CH2CH2CH2‑OH),30.11(‑CH2CH2CH2CH2‑OH),29.71–29.55(‑Se‑CH2CH2CH2‑(CH2)4‑CH2CH2CH2CH2‑OH),29.29(‑Se‑CH2CH2CH2‑),25.86(‑Se‑CH2CH2‑),24.13(‑Se‑CH2‑). [0055] 含硒小分子核磁共振硒谱检测结果：77Se NMR(76MHz,Chloroform‑d)δ154.90.[0056] 实施例2：含硒高分子化合物的制备 [0057] 在8mL四氢呋喃中加入1.0mmol的1,4‑二(2‑羟乙基)哌嗪和实施例1制备的1.0mmol的含硒小分子HO‑(CH2)11‑Se‑(CH2)11‑OH，以及383.2mg的2,4‑二异氰酸甲苯酯(2, 4‑TDI，2.2mmol)(具体比例和投料量见下表1)，一并加入20μL二月桂酸二丁基锡，用橡胶塞封口并向体系中通入氮气5min以除去反应装置中的空气，随后50℃加热反应过夜。随后称取干燥后的0.8g聚乙二醇单甲醚(重均分子量＝2000,0.4mmol)溶于5mL四氢呋喃，用注射器及针管加入上述反应体系，继续50℃加热反应24h。反应结束后旋转蒸发除去大部分四氢呋喃得到浓溶液，逐滴滴入强烈搅拌的冰乙醚中进行重结晶，过滤收集得到蛋黄白色粘稠固体产物，用含有10％乙醇的水溶液洗涤5次，冻干以除去水分。纯化后的高分子用核磁共振氢谱和凝胶渗透色谱进行表征，结果分别如图2和图3所示。 [0058] 含硒高分子化合物核磁共振氢谱检测结果，以SePU2(50％ Se)为例：1H NMR(400MHz,Chloroform‑d)δ4.33(b,‑NH2COO‑CH2CH2‑N),4.11(b,‑NH2COO‑CH2(CH2)9CH2‑Se‑),3.64(b,‑OCH2CH2‑of mPEG),3.40(b,CH3‑OCH2CH2‑of mPEG),2.86(b,‑NH2COO‑CH2CH2‑N) 2.54(b,‑CH2‑Se‑CH2‑),2.18(b,‑N(CH2CH2)2N‑),1.64(b,‑NH2COO‑CH2CH2(CH2)7CH2CH2‑Se‑),1.30–1.25(b,‑NH2COO‑CH2CH2(CH2)7CH2CH2‑Se‑). [0059] 表1 [0060] [0061] 实施例3：含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备及表征 [0062] (1)含硒高分子化合物修饰的钛材料的制备 [0063] 分别称取50mg实施例2制备的含硒高分子化合物，溶于5mL二甲基亚砜(DMSO)中得到澄清透明的溶液，配制10mg/ml的含硒高分子溶液。根据含硒高分子化合物结构中亲水基团及硒基团的比例，分为75％Se(亲水基团：硒基团＝1:3)、50％Se(亲水基团：硒基团＝1:1)、25％Se(亲水基团：硒基团＝3:1)三种含硒高分子溶液。按照实验需求，再分别将75％Se、50％Se和25％Se的含硒高分子溶液分别用DMSO稀释成1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml三种浓度进行后续实验。 [0064] 将纯钛分别加工成0.2mm×10mm×10mm、0.2mm×20mm×20mm的钛片和Φ1.5mm×5mm的钛棒，逐级打磨至表面光滑无明显纹路备用。含硒高分子化合物修饰前用5000目和 10000目的碳化硅砂纸轻柔打磨去除钛表面致密氧化层，并用无水乙醇、丙酮及去离子水依次超声清洗钛片及钛棒各10分钟。打磨清洗后，擦干钛片及钛棒表面残留水分，将其分别泡入不同浓度的含硒高分子溶液中进行表面修饰，浸泡时间为1.5小时。无水乙醇洗脱钛表面多余含硒高分子化合物，修饰面朝上放置于合适大小的孔板中备用。 [0065] (2)含硒高分子化合物修饰的钛材料的表征 [0066] 使用飞行时间二次离子质谱仪(TOF‑SIMS)分别对纯钛和含硒高分子化合物修饰的钛材料表面进行检测，结果见图4。含硒高分子化合物修饰的钛片表面检测出硒离子‑(Se)的特征峰，且与未修饰的纯钛表面相比，面扫结果表明含硒高分子化合物在修饰钛片表面的分布含量更多。由TOF‑SIMS结果证实钛片上成功修饰了含硒高分子化合物，金属钛可通过浸泡含硒高分子化合物溶液使两者化学结合。 [0067] (3)含硒高分子化合物修饰的钛材料表面静态接触角的检测 [0068] 使用静态接触角测量仪(Dataphysics，德国)分别测量纯钛和不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料表面的静态接触角大小，每组设置2个重复样本，并各测量钛片中心及随机2个角落的静态接触角大小。将事先准备好的钛片放于载物台上，调整光学镜头使样品成像清晰并能观察到针头。确定针头位置后缓缓向外注出去离子水，调整载物台高度使水滴与样品表面接触，随后立即捕捉拍摄图像。确定每次滴加的液滴体积和速度不变，测量水与钛表面的接触角。利用GraphPad分析各组接触角差异，评估钛片表面亲水性。 [0069] 结果如图5所示，与未修饰的纯钛表面相比，修饰含硒高分子化合物的钛表面接触角均有不同程度的升高，表明其亲水性由于含硒高分子化合物的成功修饰而降低。由于三种含硒高分子化合物中硒基团及亲水基团比例不同，随亲水基团比例降低，亲水性逐渐下降，接触角增大。可见25％Se的亲水性最佳，50％Se的亲水性次之，而75％Se的亲水性最差。 [0070] 实施例4：含硒高分子化合物修饰的钛材料的细胞相容性检测 [0071] 应用活/死细胞染色试剂盒(凯基生物，中国)评估含硒高分子化合物修饰的钛材料的细胞相容性。将人骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)接种于纯钛及修饰钛片上，细胞增殖培养基(α‑MEM，10％FBS，1％青链霉素)培养至第3天时利用活/死细胞染色检测在不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料表面黏附后的细胞活力；将悬浮培养的人单核细胞白血病细胞(THP‑1)离心(600rpm，3分钟)弃去上清，沉淀用细胞增殖培养基(RPMI 1640，10％FBS，1％青链霉素)重悬后加入佛波酯(PMA)，使PMA浓度为100ng/ml。将细胞悬液接种于纯钛及修饰钛片上，24小时后镜下观察THP‑1被PMA诱导贴壁生长，更换为不含PMA的细胞增殖培养基继续培养至第3天时利用活/死细胞染色检测在不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料表面黏附后的细胞活力。 [0072] TE2000‑U倒置荧光显微镜(Nikon，日本)搭配F3.0数字照相系统软件(NIS‑Elements，日本)拍摄钛片表面细胞，其中活细胞荧光颜色为绿色，死细胞荧光颜色为红色。如图6a所示，hBMMSCs在含硒高分子化合物修饰的钛材料表面的红色荧光强度明显弱于纯钛表面，同时各组不同亲水基团比例、不同浓度的含硒高分子化合物修饰的钛材料对细胞活力的影响无明显差异。如图6b所示，THP‑1在含硒高分子化合物修饰的钛材料表面的红色荧光强度明显弱于纯钛表面，同时各组不同亲水基团比例、不同浓度的含硒高分子化合物修饰的钛材料对细胞活力的影响无明显差异。 [0073] 实施例5：含硒高分子化合物修饰的钛材料的体外间充质干细胞促成骨效果检测[0074] 用碱性磷酸酶(ALP)染色及定量、实时荧光定量PCR(Quantitative Real‑time PCR，qPCR)、蛋白质印迹(Western Blot)和免疫荧光技术(Immunofluorescence Technic)评估含硒高分子化合物修饰的钛材料的体外间充质干细胞促成骨效果。 [0075] 使用碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(碧云天，中国)和碱性磷酸酶定量试剂盒(碧云天，中国)对在纯钛及不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料表面培养7天的hBMMSCs ALP活性进行检测及定量分析。如图7a所示，hBMMSCs在25％Se的3个不同浓度、50％Se 1mg/ml修饰钛片培养的ALP染色明显深于纯钛和其他亲水基团比例及其他浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料表面，且其中ALP活性最高的实验组为25％Se 3mg/ml。如图7b所示，ALP定量结果也与ALP染色结果一致，故后续实验选用纯钛(Ti)、25％Se 1mg/ml、25％Se 3mg/ml、25％Se5mg/ml和50％Se 1mg/ml共5个分组进行。 [0076] 使用qPCR对纯钛及不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料对hBMMSCs成骨相关基因的表达水平影响进行检测。如图7c所示，不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料组的ALP、OCN、RUNX2表达水平均较纯钛组上调，且以25％Se 3mg/ml组上调最为显著。 [0077] 使用Western Blot和免疫荧光技术对纯钛及不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料对hBMMSCs成骨相关蛋白水平影响进行检测。如图7d所示，不同亲水基团比例、不同浓度含硒高分子化合物修饰的钛材料组的RUNX2蛋白表达增多，且25％Se 3mg/ml组蛋白表达增多最为显著。如图7e所示，免疫荧光结果与Western Blot结果一致，表明含硒高分子可促进hBMMSCs成骨向分化。 [0078] 实施例6：含硒高分子化合物修饰的钛材料的体外促进巨噬细胞向抗炎表型极化检测 [0079] 用实时荧光定量PCR(qPCR)、蛋白质印迹(Western Blot)和活性氧(ROS)荧光染色试剂盒评估含硒高分子化合物修饰的钛材料对PMA诱导贴壁的THP‑1极化的影响。 [0080] 使用qPCR分别对巨噬细胞向促炎和抗炎表型极化相关基因的表达水平进行检测。如图8a、8b所示，含硒高分子化合物修饰的钛材料组较纯钛组，促炎相关基因TNFα、iNOS表达水平均有下调，抗炎相关基因ARG1、TGFβ表达水平均有明显上调。同时如图8c所示，Western Blot结果表明促炎相关蛋白iNOS的表达随钛修饰浓度升高而下降，抗炎相关蛋白ARG‑1的表达在25％Se的3个不同浓度组均有显著升高，表明含硒高分子化合物可以在体外促进巨噬细胞向抗炎表型极化。 [0081] 对THP‑1细胞内的ROS水平进行检测，结果如图8d、8e所示，含硒高分子化合物修饰的钛材料表面的荧光强度显著低于纯钛组，表明含硒高分子化合物可清除巨噬细胞内由于氧化应激而产生的ROS，从而抑制其促炎相关因子的分泌。 [0082] 实施例7：含硒高分子化合物修饰的钛材料的体内促成骨效果检测 [0083] 使用6‑8周龄雄性SD大鼠，制备双侧股骨缺损模型，股骨缺损部位位于双侧股骨距外上髁近心5mm左右，缺损直径为1.5mm，缺损深度为5mm，垂直于股骨长轴打孔，缺损部位植入纯钛及含硒高分子化合物修饰的钛棒。根据体外实验的结果，体内实验分为Ti、25％Se 3mg/ml、25％Se5mg/ml和50％Se 1mg/ml共4个分组。4周及8周后取材，进行Micro‑CT分析。 如图9所示，Micro‑CT扫描显示，植入的钛棒周围出现了不同程度的新骨形成，含硒高分子化合物修饰的钛材料棒较纯钛组新骨形成量更多，且25％Se 3mg/ml组新生骨组织明显多于其他实验组，与体外结果一致。结果表明含硒高分子化合物修饰的钛材料棒具有更佳的骨整合能力，可以促进植入材料周围的新骨生成。25％Se 3mg/ml组的效果最佳，表明含硒高分子化合物在适宜的浓度下可以更有效地促进骨再生。 [0084] 实施例8：高糖环境下含硒高分子化合物修饰的钛材料的体外间充质干细胞促成骨效果检测 [0085] 用茜素红(ARS)染色、实时荧光定量PCR(Quantitative Real‑time PCR，qPCR)和蛋白质印迹(Western Blot)评估在高糖环境下含硒高分子化合物修饰的钛材料的体外间充质干细胞促成骨效果。 [0086] 使用1％茜素红(ARS)溶液(Sigma‑Aldrich)对在纯钛及25％3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料表面培养14天的hBMMSCs进行矿化结节染色。如图10a所示，高糖环境下培养的hBMMSCs在25％Se 3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料(HG‑Se)培养的ARS染色明显深于纯钛表面(HG‑Ti)。 [0087] 使用qPCR对纯钛及25％3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料对高糖环境下hBMMSCs成骨相关基因的表达水平进行检测。如图10b所示，25％Se 3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料组的ALP、OCN、RUNX2表达水平均较纯钛组上调。 [0088] 使用Western Blot对纯钛及25％3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料对高糖环境下hBMMSCs成骨相关蛋白水平进行检测。如图10c所示，25％Se 3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料组的RUNX2蛋白表达增多。实施例9：含硒高分子化合物修饰的钛材料与亚硒酸钠修饰的钛材料的体外间充质干细胞促成骨效果比较检测 [0089] 用碱性磷酸酶(ALP)染色、实时荧光定量PCR(qPCR)评估含硒高分子化合物修饰的钛材料与亚硒酸钠修饰的钛材料的体外间充质干细胞促成骨效果。 [0090] 使用碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(碧云天，中国)分别对25％Se3mg/ml含硒高分子化合物和1μM亚硒酸钠修饰的钛表面培养7天的hBMMSCs ALP活性进行染色。如图11a所示，hBMMSCs在25％Se 3mg/ml含硒高分子化合物修饰钛片表面培养的ALP染色明显深于1μM亚硒酸钠修饰钛片表面。 [0091] 使用qPCR对25％Se 3mg/ml含硒高分子化合物和1μM亚硒酸钠修饰的钛材料对hBMMSCs成骨相关基因的表达水平影响进行检测。如图11b所示，25％Se 3mg/ml含硒高分子化合物修饰的钛材料组的ALP、OCN、RUNX2表达水平均较1μM亚硒酸钠修饰的钛材料组上调。 |
||
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈