决明子发酵液及其制备方法和应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410943066.8 | 申请日 | 2024-07-15 |
| 公开(公告)号 | CN118845877A | 公开(公告)日 | 2024-10-29 |
| 申请人 | 青岛奔月生物技术有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 谢昊晖; 陈炜基; 王晗; 封伟; | 第一发明人 | 谢昊晖 |
| 权利人 | 青岛奔月生物技术有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 青岛奔月生物技术有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：山东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：山东省青岛市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：山东省青岛市高新区河东路368号3号楼303 | 邮编 | 当前专利权人邮编：266114 |
| 主IPC国际分类 | A61K36/482 | 所有IPC国际分类 | A61K36/482 ; A61P1/10 ; A61K131/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 青岛发思特专利商标代理有限公司 | 专利代理人 | 王晶莹; |
| 摘要 | 本 发明 属于 微 生物 发酵 技术领域，具体涉及一种决明子发酵液及其制备方法和应用。所述决明子发酵液是以决明子为原料，采用保藏编号为ACCC 21324的 酵母 菌作为发酵菌种，发酵制备而成的，决明子与 水 的料液比为1:25~40g/mL， 碳 源为乳糖，碳源 质量 浓度为0.5%~2%，酵母菌的接种量按体积百分比计为4%~8%，发酵 温度 为30~40℃，发酵时间为2~4d，制备得到的发酵液有效成分含量高，可应用于制备润肠通便产品，可显著改善便秘情况，为了评价所述决明子发酵液的效果，本发明还提供了一种有效的小鼠便秘模型建立方法，以解决在 现有技术 条件下造模不稳定，耐药性等问题，实现资源的高效利用。 | ||
| 权利要求 | 1.一种决明子发酵液，其特征在于：所述发酵液是以决明子为原料，采用保藏编号为ACCC 21324的酵母菌作为发酵菌种，发酵制备而成的。 |
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| 说明书全文 | 决明子发酵液及其制备方法和应用技术领域背景技术[0002] 便秘是一种常见的消化系统问题，它指的是排便次数减少、粪便干硬和/或排便困难，现在的人便秘问题呈现出日益严重的趋势，在老年人群中尤为突出。决明子作为传统中药材，具有润肠通便的功效，可用于防治便秘。然而，目前市场上以决明子为主要成分的产品大多存在营养成分利用不充分的问题，因此，有必要开发能提高决明子的药物价值的方法。 [0003] 随着中医药基础研究的不断深入，有关功能性便秘的发病机制及干预起效机制的研究日益受到重视，因此，基于动物载体的基础实验成为了中医药研究中的重要部分。因此亟需开展高质量的动物实验进行探索，而科学合理的造模方法是开展中医药动物实验的前提和基础。便秘动物的造模方法繁多，尚无公认、统一的方法，如使用洛哌丁胺诱导的便秘小鼠的便秘和应激相关行为或使用地芬诺酯建立便秘模型以探究所用药物的功效。但是一些小鼠在长期重复使用相同的治疗药物后可能会发展出耐受性或抗药性，使得后续的药效评估和机制研究受到影响。不同小鼠个体之间可能存在遗传背景、代谢差异等，导致对特定药物或治疗方法的反应有所不同，增加了研究结果的变异性和复杂性。因此，还有必要开发一种便秘小鼠模型，用于防治便秘产品的评价和相关研究。 发明内容[0004] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种决明子发酵液及其制备方法，制备得到的发酵液有效成分含量高，可显著改善便秘情况，本发明同时提供了所述决明子发酵液在润肠通便方面的应用。 [0006] 本发明所述的决明子发酵液的制备方法，包括以下步骤：（1）将决明子炒熟后，粉碎为粉末，与水混合，加入碳源，进行灭菌； （2）向步骤（1）的混合物中接种酵母菌，进行发酵制得。 优选的，所述决明子与水的料液比为1:25 40g/mL，优选1:30 35g/mL。 ~ ~ [0007] 优选的，所述碳源为乳糖，碳源质量浓度为0.5% 2%。~ [0008] 优选的，酵母菌的接种量按体积百分比计为4% 8%，优选5.6%。~ [0010] 本发明提供了所述决明子发酵液在制备润肠通便产品中的应用。 [0011] 本发明还提供了评价所述决明子发酵液润肠通便效果的方法，包括以下步骤：（1）建立小鼠便秘模型：让小鼠在连续禁水但不禁食的条件下进行3 6d的造模过~ 程，当小鼠出现精神不佳，进食量少，体重变轻，毛发无光泽、粪便量减少且较小形态、粪便含水量降低时，表明小鼠便秘模型建立成功； （2）给模型小鼠饲喂所述决明子发酵液，通过观察小鼠首粒黑便时间、粪便数、粪便含水率、小肠推进率及血液中的NO、Ach、Gas含量来评价所述决明子发酵液润肠通便的效果。 [0012] 所述小鼠便秘模型使用的小鼠为SPF级KM雌性4周龄小鼠。 [0013] 本发明所述决明子发酵液显著降低了小鼠血液中的NO含量，提高了Ach和Gas含量，提高了小肠推进率，具备良好的润肠通便效果。 [0014] 与现有技术相比，本发明具有以下有以效果：1.本发明提供的决明子发酵液，具备良好的润肠通便效果，针对便秘问题提供了一种安全有效的药物替代品或辅助治疗方法。本发明所述的决明子发酵液的制备方法，决明子通过酵母菌发酵，优选了最佳菌种和发酵条件，使得决明子充分释放其营养成分，提高了决明子的药用价值。能够有效缓解便秘问题，改善患者的生活质量，减少便秘相关病症带来的健康负担，具有显著的社会益处和经济效益。该制备方法的创新为健康保健产品的开发提供了新的技术思路和参考。 [0015] 2.为了评价所述决明子发酵液的效果，本发明还提供了一种有效的小鼠便秘模型建立方法，以解决在现有技术条件下造模不稳定，耐药性等问题，实现资源的高效利用。可以帮助研究人员更准确地模拟和研究便秘的生理和病理机制，进行各种治疗方法的效果评估，这对于便秘相关疾病的治疗和预防研究具有重要的科学意义。 [0016] 本发明所述的小鼠便秘模型为失水燥结模型，通过限制水分摄入，而不影响食物摄入，更贴近自然便秘的发生过程，能够更真实地模拟便秘状态。相比给药造模，失水燥结方法操作简单，不需要复杂的药物给予或者侵入性操作，减少了干扰因素。失水燥结便秘模型相对稳定，因为依赖的是营养物质与水的处理，因此模型的稳定性较高，能够更好地重复和控制。水燥结模型无需额外的药物或特殊设备，成本较低，适合大规模实验使用。总体而言，失水燥结便秘模型在模拟便秘状态时具有更自然、简便和经济的优势。附图说明 [0017] 图1.不同菌种得到的决明子发酵液中有效成分含量；图2.不同发酵条件得到的决明子发酵液中蒽醌含量； 图3.决明子发酵液的高效液相色谱图； 图4.小鼠便秘模型与正常小鼠的小鼠状态和粪便形状对比图片； 图5.各组小鼠首粒黑便时间柱状图； 图6.小鼠小肠示意图； 图7.各组小鼠小肠推进率柱状图； 图8.各组小鼠血液NO、Ach、Gas含量柱状图。 具体实施方式[0018] 为使本发明实施例的技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步阐述，实施例中用到的所有原料除特殊说明外，均为市购。 [0020] （2）配制决明子培养基：培养基组成为：决明子与水的料液比为1:30g/mL，碳源质量浓度为2.5%，将培养基进行121℃高压灭菌20min。 [0022] （4）分别将种子液以5%的接种量，接种到决明子培养基中进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为2d，发酵过程中保持恒温振荡培养箱的转速为220rpm，得到决明子发酵液，同时还设置了无发酵菌种的空白组。 [0023] 检测决明子发酵液中有效成分总蒽醌、总黄酮、总多酚的含量，筛选得到效果最佳酵母菌种为保藏编号为ACCC 21324的酵母菌，结果如图1所示，以空白组100%计算其他发酵菌种发酵液中有效成分的相对含量。 [0024] 实施例21、首先以蒽醌含量为评价指标，以酵母菌ACCC 21324为发酵菌种，确定了单因素实验中最佳的碳源、碳源浓度、接种量、料液比、发酵温度和发酵时间。如下： （1）碳源：碳源分别为甘油，果糖，麦芽糖，乳糖，葡萄糖，其他发酵条件参考实施例 1。 [0025] （2）碳源浓度：碳源为乳糖，碳源的质量浓度分别为：0、0.5%、1%、1.5%、2%、4%，其他发酵条件参考实施例1。 [0026] （3）接种量：酵母菌接种量分别为2%、4%、6%、8%、10%，其他发酵条件参考实施例1。 [0027] （4）决明子粉末与水的料液比：决明子粉末与水的料液比分别为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40g/mL，其他发酵条件参考实施例1。 [0028] （5）发酵温度：发酵温度分别为30℃、34℃、37℃、40℃、44℃，其他发酵条件参考实施例1。 [0029] （6）发酵时间：发酵时间分别为2d、3d、4d、5d、6d、8d、10d，其他发酵条件参考实施例1。 [0030] 检测最终决明子发酵液中蒽醌含量，结果如图2。 [0031] 2、Plackett‑Burman 实验结果采用Design‑Expert对单因素进行Plackett‑Burman 实验设计，其中以蒽醌含量 2 作为响应值（表1）。根据回归方差分析可知，方程的决定系数R =0.952，说明有95% 的数据用来解释该模型，模型与实际试验拟合良好，试验预测值与实际值相关性较高。综合其影响因素的排序为：发酵温度＞接种量＞发酵天数＞乳糖浓度＞料液比，选择排名前三种主要影响因素设计实验（表2）。 [0032] 表1 Plackett‑Burmen实验设计水平范围 [0033] 表2 方差分析结果 [0034] *在95%置信度下显著。 [0035] 3、Box‑Behnken实验结果Box‑Behnken实验结果见表3，根据数据进行多元线性回归和二项式拟合，得到方 2 2 2 程模型为：R=+20.6‑0.35A‑0.69B+1.15C+0.27AB‑0.6AC+0.89BC‑2.41A‑1.1B ‑1.91C。方 2 程的决定系数R =0.988，证明该模型合理可信。主要影响因素的显著性依次为发酵温度、接种量、发酵天数（表4）。通过软件推测，最优发酵条件为发酵温度38.6℃，接种量为5.6%，发酵天数3.2d，预测蒽醌含量可达19.8mg/g。 [0036] 采用得到的最佳发酵条件进行发酵实验，得到决明子发酵液，检测空白组蒽醌含量为7.1mg/g，实验组蒽醌含量为20.4mg/g，与预测结果相近。与空白组对比，实验组蒽醌含量显著提高，提高了2.87倍，发酵液活性成分含量提高的同时使其具备更高的药理作用，而蒽醌物质具有很好的通便作用。使用高效液相色谱测定发酵液的蒽醌类物质成分，结果如图3和表5所示，液相色谱结果显示决明子发酵液中含有以大黄酸、芦荟大黄素、大黄素及少量的大黄酚、大黄素甲醚等其他物质为主的蒽醌类成分。 [0037] 表3 Box‑Behnken 试验因素水平 [0038] 表4 Box‑Behnken响应面法方差表 [0039] 表5 色谱分析 [0040] 实施例31、构建小鼠便秘模型 将50只KM小鼠适应性喂养3d后，随机分为正常组、模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组。正常组不进行任何处理，模型组、低剂量组、中剂量组、高剂量组通过失水燥结的方法建立小鼠便秘模型，均在连续禁水但不禁食的条件下进行4d的造模过程，小鼠便秘模型的小鼠状态和粪便形状与正常小鼠对比如图4。造模成功后，所有小鼠正常喂养水和食物，低剂量组、中剂量组、高剂量组分别灌胃体积浓度为2.5%、5%、10%的决明子发酵液稀释液，所述决明子发酵液是实施例2通过最佳发酵条件得到的发酵液，添加无菌水得到稀释液。灌胃剂量为0.2mL发酵液稀释液/10g小鼠体重，每天1次连续灌胃3d，期间记录小鼠体重、粪便数、粪便含水率、首粒黑便时间、小肠推进率、小鼠血液中的NO、Ach、Gas含量。 [0041] 2、小鼠体重变化、粪便数、粪便含水率指标测定建模前后小鼠体重，见表6；收集并统计建模前后及发酵液灌胃后8h的粪便数，选取最后一小时里排出的新鲜粪便检测其含水率，结果见表7，粪便含水率测定方法：将收集到的新鲜粪便样品放入60℃的烘箱中干燥2h为粪便干重，粪便含水率（%）= （粪便湿重‑粪便干重）/粪便湿重×100%。 [0042] 从表6和表7结果可以看出，建模前，各组小鼠体重差异不显著，建模后小鼠出现体重下降，毛发枯燥不柔顺，精神状态萎靡，活动不频繁，粪便颗粒较小，且与正常组比体重具有显著性(P<0.05)。通过对小鼠进行灌胃给药治疗后，观察到各组小鼠的体重开始逐渐增加，这表明决明子发酵液对小鼠的生长无抑制作用。 [0043] 建模前，各组的粪便数与含水量无明显差异。建模后，除正常组外，其余各组粪便数及含水率明显下降，表示造模成功。通过决明子发酵液灌胃治疗后，观察到模型组粪便数显著低于其他各组(P<0.05)，中剂量组与高剂量组含水率显著高于模型组(P<0.05)，说明灌胃决明子发酵液显著改善了小鼠的便秘情况，效果优于灌胃蒸馏水。 [0044] 表6 小鼠体重变化 [0045] 注：不同字母表示差异显著（P<0.05），下同。 [0046] 表7 粪便数与含水率变化 [0047] 3、小鼠首粒黑便时间指标为了得到小鼠首粒黑便时间，将各组小鼠禁食24h，期间正常饮水，灌胃墨水，剂量为0.2mL/10g，将灌胃墨水后的小鼠单独放置于笼子里，从灌胃开始时间为起点记录每只小鼠排出黑色粪便的时间，结果如图5，左图为小鼠便秘模型建立成功后各组首粒黑便排出时间，右图为发酵液灌胃治疗后各组首粒黑便排出时间。其中，所用墨水为0.5 1g阿拉伯树胶~ 粉加入200mL蒸馏水中，加入5 10g活性炭粉，煮沸30min，得到。 ~ [0048] 如图5所示，小鼠便秘模型建立成功后，模型小鼠排出首粒黑便的时间显著长于正常组，发酵液灌胃治疗后的小鼠，相比于模型组，排出首粒黑便的时间都明显缩短（P<0.05），这表明决明子发酵液治疗对改善肠道蠕动功能和排便情况起到了缓解作用。 [0049] 4、小肠推进率指标在末次灌胃给药结束后4h，每只小鼠灌胃0.2mL/10g墨水，经过40min后，将小鼠进行麻醉，并通过眼眶取血的方式采集血液。将小鼠固定于解剖台上，通过手术刀解剖并剪取小肠至大肠的部分。将剪取部分放置在空白纸片上拉直，如图6，测量小肠全长及墨水在小肠中的推进距离，计算小肠推进率：小肠推进率（%）=墨水推进距离/小肠总长度×100%，结果如图7。 [0050] 在低、中、高不同剂量的决明子发酵液治疗下，小鼠的小肠推进率显著高于模型组（P<0.01），这表明决明子发酵液是通过促进肠道蠕动，改善粪便通过速度，从而缓解便秘症状，起到润肠通便的作用。 [0051] 5、小鼠血液NO、Ach、Gas含量指标通过眼眶取血的方式采集小鼠全血1mL，提取血清样品，测定样品中NO、Ach、Gas含量，结果如图8所示，模型组小鼠血液中的NO含量显著高于其他组，低、中、高剂量发酵液组的Ach和Gas含量显著高于模型组和正常组（P<0.05），说明决明子发酵液可显著改善小鼠便秘情况。 |
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