[0001] 本发明涉及荔枝的药用技术领域，尤其涉及荔枝核或荔枝皮提取物在制备抗疲劳药物中的应用。

[0002] 疲劳是机体经过复杂的生理生化变化过程所导致的结果。从中枢神经系统到骨骼肌细胞再到细胞内的物质代谢过程，中间任何一个环节或者过程的综合变化都可造成疲劳。Toshihiko等人将疲劳分为4大类型：①运动性疲劳②精神疲劳③热环境引起的环境疲劳④免疫引起的疲劳。根据发展阶段不同，疲劳可以分为急性疲劳、慢性疲劳和过度疲劳三个阶段。不论从事何种作业，随着劳动时间延长，均会出现疲劳，表现为作业能力下降，感觉疲倦，对任何用力都感到厌烦等。美国疾病控制与预防中心(CDC)预测，慢性疲劳综合征将成为21世纪人类健康的主要问题之一。长期持续疲劳容易导致慢性疲劳综合症(chronic fatigue syndrome,CFS)，它的主要症状是持续的疲劳、疼痛、睡眠困难、认知损伤，这些症状已经在临床实践中存在了几百年甚至是几个世纪了。因此，挖掘有效抗疲劳的活性物质将会极大改善疲劳人群的生活和工作质量。

[0003] 秀丽隐杆线虫是研究运动性疲劳的一种优势模型生物。因此，本发明欲利用秀丽隐杆线虫运动性疲劳模型筛选抗疲劳药物，为将来治疗疲劳综合征提供一种新的药物来源。

[0004] 本发明的目的在于提供荔枝核或荔枝皮提取物在制备抗疲劳药物中的应用，该提取物可以有效防止线虫线粒体的损伤，保护线粒体的正常形态。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了荔枝核或荔枝皮提取物在制备抗疲劳药物中的应用。

[0007] 优选的，所述荔枝核或荔枝皮提取物的制备步骤如下：

[0008] (1)分离荔枝果核或果皮，烘干，粉碎，得到荔枝核或荔枝皮粉；

[0009] (2)向荔枝核或荔枝皮粉加入乙醇溶剂进行提取，减压抽滤后，合并滤液，旋转蒸发后于‑36℃冷冻干燥。

[0010] 优选的，所述烘干的温度为45～55℃，所述烘干时长为30～40h，所述粉碎后过30～50目筛。

[0011] 优选的，所述乙醇溶剂体积分数为75～85％，所述乙醇溶剂按料液比1：6～8g/mL加入到荔枝核或荔枝皮粉中进行提取，所述提取次数为2～3次，提取温度为75～85℃，提取时长为1.5～2.5h。

[0012] 优选的，所述旋转蒸发的转速为160～170rpm/min，温度为45～55℃。

[0013] 本发明提供的荔枝核或荔枝皮提取物可以有效防止线虫线粒体的损伤，保护线粒体的正常形态，具有显著的抗疲劳效果。附图说明

[0014] 图1为实施例2中秀丽隐杆线虫在游泳40min后的平均运动速度下降结果图；

[0015] 图2为实施例2中荔枝核提取物和荔枝皮提取物对线虫抗疲劳活性影响图；

[0016] 图3为实施例3中不同浓度的荔枝核提取物对线虫抗疲劳活性影响图；

[0017] 图4为实施例4中荔枝核提取物对线虫游泳运动40min后的恢复能力情况；

[0018] 图5为实施例5中荔枝核提取物处理后对定期运动训练的线虫线粒体的影响图。

[0019] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0020] 实施例1

[0021] 实验材料

[0022] N2野生型秀丽隐杆线虫(C.elegans，the Bristol strainN2)，雌雄同体。

[0023] 大肠杆菌E.coli OP50属于尿嘧啶合成缺陷菌株，在线虫标准培养基上生长缓慢，显微镜下观察线虫时不会影响视野的清晰度。

[0024] N2野生型线虫同期化后将卵随机分成2组，分别放置在含有OP50菌液的线虫生长培养基(Nematode growth medium,NGM)上进行培养，20℃条件下培养3d。

[0025] 线虫的同期化是指线虫在第60h后进入产卵期，此时为适合同期化的时期。将产卵期的线虫用M9缓冲溶液从NGM平板上尽数冲下，所得洗脱液以3000rpm/min离心30s后，自由沉降2min，目的是为了让大多数线虫沉没在离心管底部。随后，弃掉一半上清液，往沉淀中加入等量的现配的线虫裂解液，反复振荡离心管至几乎所有产卵期线虫身体从中部断裂为止，此时以3000rpm/min离心30s后，弃去上清，加入无菌水溶液重新悬浮线虫卵，并以3000rpm/min离心30s，该操作需重复进行3次，直至溶液澄清且无裂解液气味即可。最后，弃去大部分上清，剩余液体与线虫卵混匀成匀浆后转移至含有新鲜的OP50的NGM平板上，吹干，并将含有线虫卵的NGM平板放置在20℃的生化培养箱中培养，此刻完成线虫的同期化。

[0026] M9溶液配置：KH2PO43.0g，NaHPO46.0 g，NaCl 5.0g，MgSO40.12 g，加入三级水定容至1L，于121℃高压灭菌30min后待用。

[0027] 线虫裂解液配方：每份线虫裂解液含4％次氯酸钠：2MNaOH溶液：无菌水＝1:1:1，且裂解液需要先配现用。

[0028] OP50菌液的培养基的制备方法：直接将E.coli OP50菌液涂布于NGM上，晾干后封膜，4℃保存备用。

[0029] 实施例2

[0030] 不同给药物质对线虫抗疲劳活性测定

[0031] 分别利用荔枝皮提取物和荔枝核提取物给药处理后以线虫游泳运动40min(急性运动导致疲劳的最佳时间)后的运动能力作为指标分别测定抗疲劳活性，图1为秀丽隐杆线虫在游泳40min后的平均运动速度下降结果图。

[0032] 荔枝皮提取物和荔枝核提取物的处理方法如下：分离荔枝的果皮、果核，果皮、果核分别于50℃烘干36小时，将烘干后的果皮、果核分别粉碎至40目，按料液比1:7g/mL加入体积分数为80％的乙醇溶剂，置于80℃水浴中，按100rpm/min的速度搅拌提取2h，共提取2次，真空泵减压抽滤后合并滤液，在170rpm/min，50℃条件下减压旋转蒸发溶剂后，得到荔枝皮提取物和荔枝核提取物，‑36℃冷冻干燥备用。

[0033] 结果如图2所示，表明，与运动组(Swim)相比，在60μg/mL的荔枝皮提取物(LPEE)处理下，平均速度得到显著恢复，提升了35.12％(P<0.001)，而40、80μg/mL处理下与运动组没有显著性差异(P>0.05)。与运动组相比，在20、40μg/mL的荔枝核提取物(LSEE)处理下，平均速度得到一定的恢复，分别提升了32.42％(P<0.05)、53.7％(P<0.001)，而60μg/mL处理下与运动组没有明显差异(P>0.05)。因此，荔枝核提取物的抗疲劳活性比荔枝皮的更好。

[0034] 实施例3

[0035] 不同浓度的荔枝核提取物对线虫抗疲劳活性测定

[0036] 在不同的浓度为10，20，30，40，50μg/mL荔枝核提取物处理下，以线虫游泳运动后的运动能力作为指标分别测定抗疲劳活性。

[0037] 结果如图3所示，表明，与游泳运动组(Swim)相比，在30μg/mL的荔枝核提取物处理下，抗疲劳作用浓度最佳，并且与阳性对照牛磺酸(Tau)没有显著性差异(P<0.001)，具有较好的抗疲劳效果；在10、20、40、50μg/mL处理下，与运动组相比没有显著性(P>0.05)。因此，选取30μg/mL作为最佳浓度进行下一步的实验。

[0038] 实施例4

[0039] 最佳给药物质对线虫游泳运动40min后的恢复能力测定：在浓度为30μg/mL的荔枝核提取物处理下，经过1小时的恢复，以线虫的平均运动速度作为指标测定线虫的恢复能力。

[0040] 结果如图4，图4表明，运动组经过一小时的恢复，达到非运动组水平的39.77％；在30μg/mL的荔枝核提取物处理下，经过1小时的恢复，线虫恢复到非运动组水平的56.17％。
56.17％这个数据是指经过荔枝核处理下运动40分钟后经过一小时的恢复得到的非运动组水平的56.17％。

[0041] 实施例5

[0042] 最佳给药物质处理后对定期运动训练的PD4251突变体线虫线粒体影响测定：从卵开始在20℃下培养，分组：非运动组(Crawl)，运动组(Swim)，乙酸乙酯组分+非运动组(EA+crawl)，乙酸乙酯组分+运动组(EA+swim)，牛磺酸阳性对照+运动组(Tau+swim)，EA：荔枝核提取物经过乙酸乙酯进行萃取后得到的乙酸乙酯组分。EA+crawl、EA+swim、Tau+swim组的喂养方式为：将EA或牛磺酸与OP50菌液按照1：9的比例添加到培养基中，EA的终浓度为30μg/mL，牛磺酸组的终浓度为20μg/mL。

[0043] 分组处理三天后，到成虫第一天开始进行每天定时两次的运动训练，早上8点和晚上8点，单次运动时间为2h，以此进行四天处理，到成虫第五天收集线虫进行实验测定。定期游泳训练后的PD4251突变体(Caenorhabditis Genetics Center)，每组至少15只线虫被麻醉(1％NaN3)并固定在载玻片上，使用荧光显微镜40×倍物镜放大倍数拍摄，观察并统计分析不同形态线粒体分布情况，每个实验进行三次生物学重复。线粒体破损情况，分为四个等级，分别是Class1：几乎完整无破损；Class2：少部分破损；Class3：大部分破损；Class4：完全破损。

[0044] 图5所示，左侧为线粒体破损情况的荧光图，其中，A代表Class1；B代表Class2；C代表Class3；D代表Class4。

[0045] 与对照组相比，该方案下的定期运动训练显著增加了碎片化线粒体的形态，即线粒体形态损伤的比例增加，而最佳给药物质则挽救了线虫线粒体的损伤，保护线粒体的正常形态。

[0046] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。