山茱萸提取物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410623247.2 | 申请日 | 2024-05-20 |
| 公开(公告)号 | CN118512495A | 公开(公告)日 | 2024-08-20 |
| 申请人 | 河南大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 康文艺; 马常阳; 孙勇; 张岩; 刘裕航; 陈宜笑; | 第一发明人 | 康文艺 |
| 权利人 | 河南大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 河南大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：河南省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：河南省郑州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：河南省郑州市郑东新区明理路北段379号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：450000 |
| 主IPC国际分类 | A61K36/40 | 所有IPC国际分类 | A61K36/40 ; A61P29/00 ; A61K131/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 郑州联科专利事务所 | 专利代理人 | 杨海霞; |
| 摘要 | 本 发明 涉及山茱萸提取物在制备抗炎药物方面的应用，并提供了一种从山茱萸中提取分离的方法：以干燥的山茱萸果肉为原料，用 乙醇 浸提获得提取液，减压回收 溶剂 得到提取物浸膏；经过大孔 树脂 柱、 硅 胶柱、凝胶柱等分离纯化得山茱萸提取物纯品，经鉴定为1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene。本发明通过实验发现其能够抑制LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO，抑制TNF‑α、IL‑6的分泌及其mRNA与IL‑1βmRNA表达 水 平，以及抑制RAW264.7细胞P38、ERK、JNK的磷 酸化 水平发挥抗炎作用并通过MAPK 信号 通路发挥作用。可用作制备抗炎药物。 | ||
| 权利要求 | 1.一种山茱萸提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 山茱萸提取物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用技术领域[0001] 本发明属于药物技术领域，具体涉及一种山茱萸提取物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用。 背景技术[0002] 炎症是机体对于外界刺激的一种复杂的防御反应，大多疾病都与此相关。过度的炎症反应会引起机体产生一系列的并发症。巨噬细胞是调控炎症反应的中心细胞，在炎症的发生、维持和恢复中起着至关重要的作用。巨噬细胞上的模式识别受体被激活后可以诱导一系列细胞内信号传导级联反应，如NF‑κB和MAPK信号通路，这些信号通路的激活将会导致相关炎症因子的产生，如一氧化氮(NO)、白介素‑6(IL‑6)、白介素‑1β(IL‑1β)、TNF‑α(肿瘤坏死因子‑α)等，这些炎症因子可以间接地反映出炎症反应的程度。 [0003] 本发明系首次从山茱萸科山茱萸中提取获得山茱萸提取物，并进一步纯化分离获得一种天然化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene，分子式C15H18O4，m/z:262，属于倍半萜类化合物的一种。倍半萜类化合物生物活性多样，具有抗肿瘤及抗心血管疾病等生物活性。目前，关于1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene的研究较少，仅在苗药Alangium chinense(Lour.)Harms的根中被提取分离出来并验证对COX‑2的影响，但未对该化合物进行系统的抗炎活性研究。本发明深入探讨其作用机制，对抗炎类新药的开发具有一定价值。 发明内容[0005] 本发明还提供了上述山茱萸提取物的制备方法和其在制备抗炎药物中的应用。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： [0007] 一种山茱萸提取物的制备方法，其包括如下步骤： [0008] 1)以干燥的山茱萸果肉为原料，用乙醇水溶液浸提获得提取液，减压回收溶剂得到提取物浸膏；将提取物浸膏用甲醇溶解，D101大孔树脂柱上样后，依次用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，收集60％乙醇洗脱部分； [0009] 2)将60％乙醇洗脱部分用硅胶拌样后装柱，体积比30：1～2：1的二氯甲烷‑甲醇进行梯度洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得到17个组分；按照所得组分极性由小到大依次标记为Fr.1‑1至Fr.1‑17； [0010] 3)Fr.1‑1用硅胶拌样后上Flash柱，用体积比15：1～1：1的石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得Fr.1‑1‑1，即为山茱萸提取物。 [0011] 具体的，步骤1)中，乙醇水溶液的体积分数可以为70‑80％，用乙醇水溶液于室温浸提2‑4次，每次6‑8天，合并提取液，减压回收溶剂得到提取物浸膏。 [0012] 进一步的，步骤2)中，可以用体积比为30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1的二氯甲烷‑甲醇进行梯度洗脱；步骤3)中，可以用体积比15：1、12：1、10：1、5：1、1：1的石油醚‑乙酸乙酯进行梯度洗脱。 [0013] 进一步优选的，步骤3)中，可以将Fr.1‑1‑1溶解，用LH‑20凝胶色谱柱纯化，甲醇洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得山茱萸提取物纯品。经鉴定可知，该山茱萸提取物纯品为倍半萜类化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene，结构式如下所示： [0014] [0015] 本发明提供了采用所述制备方法制备所得的山茱萸提取物。 [0016] 本发明还提供了所述山茱萸提取物在制备抗炎药物中的应用。 [0017] 上述的应用，具体的，所述山茱萸提取物通过抑制LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO，抑制TNF‑α、IL‑6的分泌及其mRNA与IL‑1βmRNA表达水平，以及抑制RAW264.7细胞P38、ERK、JNK的磷酸化水平发挥抗炎作用。进一步的，所述山茱萸提取物通过抑制MAPK信号通路来发挥抗炎作用。 [0018] 本发明还提供了一种抗炎药物，其包含所述的山茱萸提取物。 [0019] 进一步的，所述的抗炎药物，其选择本领域常规药用辅料制成片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂或注射剂等。 [0020] 本发明进行了如下山茱萸提取物的抗炎应用的验证实验： [0021] MTT法检测其对RAW264.7细胞活力的影响； [0023] 采用ELISA和RT‑PCR法检测LPS刺激后RAW264.7细胞分泌炎症因子的影响； [0024] Western Blot法分析LPS刺激后RAW264.7细胞P38、ERK、JNK蛋白的磷酸化水平。 [0025] 本发明经常规实验验证后，发现：山茱萸提取物可以抑制LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO，抑制TNF‑α、IL‑6的分泌及其mRNA与IL‑1βmRNA表达水平，以及抑制RAW264.7细胞P38、ERK、JNK的磷酸化水平。并且能够抑制MAPK信号通路的过度激活，发挥抗炎的作用。这表明山茱萸提取物具有抗炎作用，可用于抗炎剂或抗炎药物的制备，对抗炎类新药的开发具有一定价值。 [0026] 本发明技术方案涉及山茱萸提取物的制备和应用，具体是指1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene在制备抗炎药物中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果如下： [0027] 目前，尚无山茱萸提取物抗炎机制的报道，本发明通过测定1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌促炎因子的影响、细胞iNOS和COX‑2蛋白表达的影响、MAPK信号通路的影响分析判断化合物对影响抗炎活性显著性以及机制。实验结果表明：1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene具有显著的抗炎活性并通过MAPK信号通路发挥作用，可用作制备抗炎药物。附图说明 [0028] 图1为化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑21 (3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene的H谱(400MHZ,CD3OD)； [0029] 图2为化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑213 (3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene的 C谱(400MHZ,CD3OD)； [0030] 图3为化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene对RAW264.7细胞的细胞活力的影响；注：图中与空白组比**较，P<0.01，图中标识为化合物Compound 18，下同； [0031] 图4为化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene对LPS刺激下RAW264.7细胞NO分泌的影响；注：图中与空白### ***组比较， P<0.001；与LPS组比较， P<0.001； [0032] 图5为化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF‑α(A)、IL‑6(B)含量及###TNF‑α(C)、IL‑6(D)、IL‑1βmRNA(E)表达的影响；注：与空白组比较， P<0.001；与LPS组比* ** *** 较，P<0.05，P<0.01， P<0.001； [0033] 图6为化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene对LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX‑2的蛋白条带图### * **(左)和蛋白表达的影响(右)；注：与空白组比较， P<0.001；与LPS组比较，P<0.05，P<*** 0.01， P<0.001； [0034] 图7为化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene对LPS刺激下RAW264.7细胞P38、ERK、JNK的蛋白条带图(左)### ***和磷酸化蛋白表达水平的影响(右)；注：与空白组相比： P<0.001；与LPS组相比： P< 0.001。 具体实施方式[0035] 为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施例旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。 [0037] 下述实施例中，作为原料的山茱萸干燥果实采集于河南省洛阳市栾川县。所述乙醇、甲醇浓度如无特殊说明，均为体积浓度。室温指代25±5℃。 [0038] 实施例1 [0039] 一种山茱萸提取物的制备方法，其具体包括如下步骤： [0040] 1)以20kg干燥的山茱萸果肉为原料，用75％乙醇水溶液浸提，于室温浸提3次，每次7天，合并提取液，减压回收溶剂得到提取物浸膏；将提取物浸膏加甲醇溶解，D‑101型大孔树脂柱上样后，依次用20％乙醇、40％乙醇、60％乙醇和95％乙醇梯度洗脱，收集60％乙醇洗脱部分； [0041] 2)将60％乙醇洗脱部分用硅胶拌样后装柱，用体积比30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、2:1的二氯甲烷‑甲醇进行梯度洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得到17个组分。按照所得组分极性由小到大依次标记为Fr.1‑1至Fr.1‑17； [0042] 3)第1个组分Fr.1‑1，用硅胶拌样后上Flash柱，用体积比15：1、12：1、10：1、5：1、1：1的石油醚‑乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得Fr.1‑1‑ 1； [0043] 将Fr.1‑1‑1用甲醇溶解，用LH‑20凝胶色谱柱纯化，甲醇洗脱，薄层色谱检测，合并相同组分并减压回收溶剂，得山茱萸提取物纯品21mg。 [0044] 对上述制备所得的山茱萸提取物纯品运用多种谱学技术鉴定结构，证实其为化合物181‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene，具体如下： [0045] 仪器材料：1H、13C NMR图谱由Bruker am‑500MHz核磁共振仪测定。TMS为内标。图谱见图1和图2，图谱结果和结构式具体如下： [0046] [0047] 1H‑NMR(氘代甲醇,400MHz)δH:7.43(1H,s,H‑3),7.17(1H,s,H‑6),5.90(1H,s,H‑9),2.22(3H,s,H‑11),3.28(1H,m,H‑12),1.26(6H,t,J＝6.9Hz,H‑13,14),1.44(3H,s,H‑ 13 15). C‑NMR(氘代甲醇,100MHz)δC:207.29(C‑1),147.83(C‑2),129.28(C‑3),124.77(C‑ 4),159.12(C‑5),113.36(C‑6),121.60(C‑7),165.93(C‑8),115.91(C‑9),77.30(C‑10), 16.08(C‑11),30.06(C‑12),22.39(C‑13),22.73(C‑14),33.16(C‑15)。 [0048] 对上述实施例1制备所得化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene进行如下抗炎试验。 [0049] 实施例2 [0050] 应用试验 [0051] 一、试验细胞 [0052] RAW264.7细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。 [0053] 二、仪器与试剂 [0054] 分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)； [0055] 全波长酶标仪(Thermo Fisher，1510型)； [0057] 离心机(上海手术器械厂，800型)； [0059] 微型台式冷冻离心机(D‑37520Thermo)； [0060] 电泳仪(EPS600 Tanon)； [0061] 转印槽(Mini‑PROTEAN Tetra System,BIO‑RAD)； [0062] 梯度PCR仪(MyCyclerTMThermal Cycler)； [0063] 实时荧光定量PCR(Thermo Fisher)； [0064] 倒置显微镜(Nikon ECLiPES TS100)； [0065] 96孔、24孔、6孔细胞培养板(Corning)； [0066] DMEM培养基(Solarbio)； [0068] 澳洲胎牛血清(FBS,Gibco)； [0069] 脂多糖(LPS,Sigma)； [0070] PBS缓冲液(博士德)； [0071] 噻唑蓝(MTT,华蓝化学)； [0072] 二甲基亚砜(DMSO,上海麦克林生化科技股份有限公司) [0073] RIPA细胞裂解液(弱)(碧云天生物科技)； [0074] 一氧化氮试剂盒(碧云天生物科技)； [0075] Trizol Reagent(康为世纪生物科技有限公司)； [0076] PCR引物(Thermo Fisher)； [0077] Prime Script TMRT reagent kit with Gdna Eraser试剂盒(TaKaRa)； [0079] BCA蛋白定量试剂盒(Solarbio)； [0080] 蛋白酶磷酸酶抑制剂(Solarbio)； [0081] PMSF蛋白酶抑制剂(Solarbio)； [0082] 5×蛋白上样缓冲液(Solarbio)； [0083] 脱脂奶粉(Amresco)； [0084] PVDF膜(Solarbio)； [0085] Mouse TNF‑αELISA试剂盒； [0086] Mouse IL‑6ELISA试剂盒； [0087] 10×TBST缓冲液(武汉塞维尔生物科技有限公司)； [0088] P38、p‑P38、ERK、p‑ERK、JNK、p‑JNK、β‑actin一抗(Proteintech)； [0089] 辣根过氧化物酶标记的二抗(Cell signaling technology)； [0090] ECL发光液(Solarbio)。 [0091] 三、试验方法 [0092] (1)MTT法测细胞活力 [0093] 实验中RAW264.7细胞采用含有10％胎牛血清和1％双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基(以下简称DMEM完全培养基)，在37℃、5％CO2条件下培养。具体方法如下： [0094] 取对数生长期的细胞以1.5×105个/孔接种在96孔板中置培养箱中在37℃、5％CO2条件下培养24h。实验组每孔分别添加100μL浓度200、100、50、25、12.5μM的1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene，空白组给予等量DMEM完全培养基，6个复孔设为一组，在恒温培养箱中继续孵育24h。在避光条件下，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养，4h后弃去上清后再加入100μL DMSO，37℃孵育10min后测定吸光度值(490nm)。 [0095] (2)炎症因子(NO)的测定 [0096] 将对数生长期的RAW264.7细胞以细胞密度为1×106个/孔接种在24孔板，设置空白组，模型LPS组以及实验组，其中LPS组给予最终浓度为1μg/mL的LPS。实验组分别在DMEM完全培养基中加入100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM的1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene，1h后给予LPS至浓度为1μg/mL后培养24h，收集上清液，离心。用NO试剂盒检测NO的产生，实验重复3次。 [0097] IC50＝(模型‑给药)/(模型‑空白)*100 [0098] (3)炎症因子(TNF‑ɑ和IL‑6)的测定 [0099] 同上述方法处理细胞，设置空白组，模型LPS组以及实验组，其中LPS组给予最终浓度为1μg/mL的LPS。实验组分别在DMEM完全培养基中加入100μM、50μM、25μM的1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene，1h后给予LPS至浓度为1μg/mL后培养24h，收集上清液，离心。收集细胞上清液。根据Mouse TNF‑αELISA试剂盒和Mouse IL‑6ELISA试剂盒说明书，检测细胞上清液中炎症因子IL‑6和TNF‑α的含量。 [0100] (4)RT‑PCR法检验炎症因子mRNA表达的影响 [0101] RAW264.7细胞以细胞密度为1×107个/孔接种在6孔板，每孔接种2mL，在37℃、5％ CO2的培养箱中孵育24h，弃去上清液，同(2)分组方法设置空白组、LPS组和实验组，置于培养箱孵育24h后弃去上清液，用PBS轻洗细胞2次。 [0102] 1)提取总RNA，具体方法如下:首先各孔均加入1mL Trizol试剂，用移液枪吹打，转移到无酶EP管中，冰上裂解5min。后每管加入200μL氯仿，混匀，置于冰上，静置3min。4℃，12000r/min离心15min，吸取适量含RNA的上清转移至新的无酶EP管再加入250μL异丙醇混匀，冰上静置10min。4℃，12000r/min离心15min，弃去上清液，保留管底沉淀的RNA，用1mL 75％乙醇洗涤沉淀，除去残余的异丙醇。4℃，12000r/min离心5min后弃掉上清，室温干燥 5min后加入40μL无酶水，混匀后置于‑80℃冰箱中保存。最后检测RNA纯度和浓度即用Nanodrop 2000测定RNA纯度和浓度，并加无酶水使RNA浓度约为500ng/μL。 [0103] 2)去除gDNA：X(RNA体积)＝1000ng/RNA浓度(ng/μL)。该混合反应体系如表1。 [0104] 表1去除gDNA [0105] [0106] 3)制备cDNA：该混合反应体系如表2。 [0107] 表2逆转录体系 [0108] [0109] 4)PCR扩增 [0110] 引物的浓度100μM，相关基因引物序列如下表3。 [0111] 表3引物序列 [0112] [0113] PCR反应体系如下表4： [0114] 表4PCR扩增体系 [0115] [0116] 按照以上PCR反应体系充分混匀后转移至8联管(10μL/管)。置于7500Real Time ‑△△CtPCR System仪器中，进行PCR扩增反应。相对表达量根据2 法计算。被测引物的相对表达强度通过如下公式计算。 [0117] 被测引物表达强度＝被测引物光密度/GAPDH光密度 [0118] (5)Western blot法检测相关蛋白的表达 [0119] 1)RAW264.7细胞以细胞密度为6×105个/孔接种在6孔板，每孔接种2mL，37℃、5％CO2的培养箱中孵育24h，弃去上清，同(2)分组方法设置空白组、LPS组和实验组，孵育24h，收集细胞，用PBS轻洗2次。 [0120] 2)细胞总蛋白的提取： [0121] 取200μL体积比例为RIPA细胞裂解液：PMSF蛋白酶抑制剂：蛋白酶磷酸酶抑制剂＝100:1:1的总蛋白裂解液加入到细胞中，混匀，冰上裂解10min。离心10min(4℃，12000r/min)后取上清将总蛋白转移至EP管中。加入1/4蛋白体积的蛋白上样缓冲液并混匀，100℃水浴5min，蛋白变性后于‑20℃保存。 [0122] 3)蛋白浓度的测定： [0123] 用PBS将在96孔板中的蛋白样品(2μL/管)稀释10倍，每个样品均设3个复孔。各孔分别加入200μL工作液(BCA：铜试剂＝50:1)，混匀，37℃温育30min后用酶标仪测定吸光度(562nm)，计算蛋白浓度。以每个蛋白上样量为30μg，计算蛋白的上样体积。 [0124] 4)SDS‑PAGE： [0125] 表5分离胶和浓缩胶配比体系 [0126] [0127] [0128] 按上表配制分离胶，加入异丙醇溶液排气泡，37℃恒温凝固后倒出异丙醇并用蒸馏水清洗后吸干。配制浓缩胶后插上梳子待恒温凝固。向电泳槽中倒入1×蛋白电泳液，加样孔加入蛋白样品(30μg)和Marker(2μL)。加样后，电泳30min(电压80V)至条带于浓缩胶与分离胶界限处，再电泳60min(电压120V)。 [0129] 5×蛋白电泳液为15.15g Tris‑base与93.85g甘氨酸与5g十二烷基硫酸钠(SDS)加去离子水900ml溶解定容至1L得到；1×蛋白电泳液为去离子水400ml与100ml 10×蛋白电泳液混合定容得到。 [0130] 5)免疫印迹显色 [0131] ①转膜：电泳结束后，按照正极—海绵垫—滤纸—PVDF膜—胶—滤纸—海绵垫—负极的顺序固定在转膜槽中，加入1×转膜缓冲液进行转模。电压72V，时间60min。 [0132] 10×转膜缓冲液为30.3g Tris‑base与142.6g甘氨酸加去离子水900mL溶解定容至1L得到；1×转膜缓冲液为去离子水350mL与50mL 10×转膜缓冲液加100mL甲醇混合定容得到。 [0133] ②封闭：使用5％脱脂奶粉中封闭2h。 [0134] ③孵育一抗：根据Marker指示，确定目标蛋白位置并剪切，随后将条带与其相对应的一抗孵育，4℃过夜。 [0135] ④洗膜：一抗(iNOS和COX‑2蛋白、P38、ERK、JNK蛋白与其磷酸化蛋白)孵育过后，TBST溶液中洗涤蛋白条带5次，每次5min。 [0136] ⑤孵育二抗：根据一抗来源，赋予相应的二抗，室温孵育1～2h。 [0137] ⑥洗膜：同④，即TBST溶液中洗涤蛋白条带5次，每次5min。。 [0138] ⑦显影分析：使用ECL发光液，根据使用说明配制显影液(现用现配，注意避光)。滤纸吸去条带上多余的TBST溶液，将显影液均匀涂抹在条带上。与多色荧光、化学发光和可见光成像仪上进行显影，分析。条带灰度采用Image软件定量分析，以β‑actin作为内参。 [0139] 四、统计学处理 [0140] 实验结果采用GraphPad Prism 7软件进行统计学分析。实验数据以平均值±SD表示。多组比较采用方差分析(One‑Way ANOVA)，以P<0.05为有统计学意义。 [0141] 五、实验结果 [0142] (1)化合物对RAW264.7细胞活力的影响 [0143] 采用MTT法检测在12.5～200μM的浓度范围内1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene对RAW 264.7巨噬细胞活力的影响，结果如图3所示，在12.5～100μM的浓度范围内，1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene对细胞活力没有显著性影响，故1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene选用6.25～100μM的浓度范围进行下一步实验。 [0144] (2)化合物对RAW264.7细胞分泌NO表达影响 [0145] 图4给出了化合物对LPS刺激下RAW264.7细胞NO分泌的影响。如图4所示，空白组细胞NO释放量较低，LPS刺激后增加NO释放(P<0.001)。相比于LPS组，1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene能够降低细胞的NO释放量(P<0.001,P<0.01)。由图可知，1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene活性良好，根据细胞上清NO含量，通过SPSS软件计算出1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene的IC50为52.50μM。 [0146] (3)化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞分泌促炎因子的影响 [0147] 为了进一步评估1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene的抗炎作用。采用ELISA和RT‑PCR法检测化合物对炎症细胞分泌炎症因子的影响。如图5所示，与空白组相比，LPS组显著促进了RAW264.7细胞分泌TNF‑α和IL‑6(P<0.001，P<0.001)，TNF‑α、IL‑6和IL‑1βmRNA表达水平显著增加(P<0.001，P<0.001，P<0.001)。与LPS组相比，给予浓度为100μM的1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene后，TNF‑ɑ和IL‑6释放量显著降低(P<0.001，P<0.001)，并且在给药量100μM时TNF‑ɑ，IL‑6以及IL‑1βmRNA表达水平显著下降(P<0.01，P<0.001，P<0.001)。以上结果表明，该化合物可能通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中TNF‑ɑ，IL‑6和IL‑1βmRNA的表达从而影响TNF‑ɑ，IL‑6的释放发挥抗炎作用。 [0148] (4)化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞iNOS和COX‑2蛋白表达的影响 [0149] 通过Western blot法，通过对细胞中iNOS和COX‑2蛋白表达情况评估1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene的抗炎活性。如图6所示，与空白组相比，经LPS刺激之后iNOS和COX‑2蛋白表达水平显著增加(P< 0.001，P<0.001)。给予浓度为100、50和25μM的1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene处理后，iNOS和COX‑2蛋白表达量均有不同程度的下降，经过量化计算均具有极显著差异(P<0.001，P<0.001)。据此表明，该化合物可以通过抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中iNOS和COX‑2蛋白的表达发挥抗炎作用。 [0150] (5)化合物对MAPK信号通路的影响 [0151] 如图7所示，与空白组相比，LPS刺激之后，MAPK信号通路中的P38、ERK和JNK磷酸化水平明显升高，经过量化分析也具有显著性差异(P<0.001，P<0.001，P<0.001)，而在给予不同浓度的1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene后，与模型LPS组相比，发现化合物在较低浓度下都能对P38磷酸化水平显示抑制，在给药量为100μM情况时，P38、ERK和JNK磷酸化水平均能显著下降。由此表明，1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene是通过MAPK通路发挥抗炎作用。 [0152] 综上所述：本发明经实验证明了山茱萸提取物化合物1‑carbonyl‑2,8‑dihydroxy‑11‑oxabicyclo[4,4,1]germacra‑2(3),4(5),6(7),8(9)‑tetraene能够抑制LPS刺激的RAW264.7细胞分泌NO，抑制TNF‑α、IL‑6的分泌及其mRNA与IL‑1βmRNA表达水平，以及抑制RAW264.7细胞P38、ERK、JNK的磷酸化水平。表明其抗炎作用是通过抑制MAPK信号通路来实现的，并且能够抑制MAPK信号通路的过度激活，发挥抗炎的作用。 |
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