[0001] 本发明涉及医药领域，尤其涉及一种蔓荆子黄素在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

[0002] 骨肉瘤(osteosarcoma)是一种恶性程度较高的原发性实体骨肿瘤，多发源于间充质细胞，以肿瘤细胞直接形成未成熟骨或类骨基质为特征。骨肉瘤常起病于膝关节，多累及长骨干骺端、股骨远端和胫骨近端，临床主要表现为瘤体生长或转移引起的持续性疼痛肿胀、关节活动受限和局部包块等。

[0003] 骨肉瘤具有死亡率高、复发率高和转移率高的特点，患者的总体预后较差。一般人群中骨肉瘤的发病率为2‑3例/百万/年，而青少年人群中的发病率最高可达8‑11例/百万/年，占儿童癌症相关死亡的8.9％，此外男性的发病率为女性的1.4倍。骨肉瘤已成为12‑18岁人群中继白血病和淋巴瘤之后第三种最常见的癌症类型，严重危及青少年的生命安全。如果不及时进行正规的治疗，骨肉瘤的微小病灶将会迅速发展，并加速进入恶性肿瘤的局部转移阶段，造成难以挽救的结局。

[0004] 近年来，骨肉瘤的免疫治疗和靶向治疗得到了一定发展，但骨肉瘤的有效治疗仍然是临床所面临的难题。目前骨肉瘤的标准治疗模式为手术切除联合药物化疗，然而该策略在改善患者的5年生存率方面一直未能取得革命性的进展与突破。手术切除严重影响患者的肢体功能，降低了长期幸存者的生活质量，而药物化疗的疗效仍受到副作用和耐药性等因素的限制。因此临床实践对骨肉瘤的治疗研究提出了在传统化疗药物以外增进药物多样性的要求。

[0005] 蔓荆子黄素(casticin)是从马鞭草科植物单叶蔓荆或蔓荆的干燥成熟果实蔓荆子中提取的多甲氧基黄酮类化合物，对正常细胞未表现出明显毒性，目前作为一种抗炎药物被长期使用。据报道，蔓荆子黄素对某些癌细胞产生作用，包括人类宫颈癌细胞系Hela、肝癌细胞系HepG2、肺癌上皮细胞系A549和白血病细胞系K562等。蔓荆子黄素对癌细胞的作用为抑制细胞增殖、阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。但是，尚未有报道阐明蔓荆子黄素对人类骨肉瘤细胞的作用。

[0006] 本发明要解决的技术问题，在于提供一种蔓荆子黄素在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

[0007] 本发明是这样实现的：

[0008] 本发明提供了一种蔓荆子黄素在制备治疗骨肉瘤的药物中的应用。

[0009] 进一步地，所述药物为针对PI3K/AKT信号通路的药物。

[0010] 进一步地，所述药物包括抑制肿瘤生长的药物。

[0011] 进一步地，所述药物包括抑制肿瘤转移的药物。

[0012] 本发明具有如下优点：

[0013] 1、本发明验证了PI3K/AKT信号通路为蔓荆子黄素抗骨肉瘤的作用途径。通过预测蔓荆子黄素抗骨肉瘤的可能位点和机制，研究蔓荆子黄素对骨肉瘤细胞生物学功能的影响。

[0014] 2、蔓荆子黄素通过PI3K/AKT信号通路抑制骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的生长，为骨肉瘤的防治提供新策略。附图说明

[0015] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。

[0016] 图1为蔓荆子黄素抑制骨肉瘤细胞PI3K、p‑AKT的表达；其中(A)PI3K和p‑AKT的蛋白条带，以β‑ACTIN为内参；(B)PI3K和p‑AKT的蛋白相对表达；与0μM组相比，*p＜0.05,***p＜0.001,****p＜0.0001。

[0017] 图2为蔓荆子黄素抑制骨肉瘤的体内生长；其中(A)肿瘤组织大体观；(B)肿瘤体积变化；(C)肿瘤重量；与0mg/kg组相比，***p＜0.001,****p＜0.0001。

[0018] 图3为蔓荆子黄素对骨肉瘤组织形态学的影响。

[0019] 图4为蔓荆子黄素抑制PCNA的表达。

[0020] 图5为蔓荆子黄素对骨肉瘤裸鼠脏器组织的影响。

[0021] 一、蔓荆子黄素对骨肉瘤细胞PI3K/AKT信号通路的调控

[0022] 采用Western blot检测蔓荆子黄素对骨肉瘤143B和U2OS细胞PI3K、p‑AKT蛋白表达的影响。明确蔓荆子黄素通过PI3K/AKT信号通路发挥抗骨肉瘤作用。

[0023] 1研究对象

[0024] 143B细胞购自上海中乔新舟生物科技有限公司，U2OS细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

[0025] 2主要生物材料

[0026] 试剂名称 生产商

[0027] PI3K单克隆抗体 英国Abcam公司

[0028] p‑AKT(Ser473)单克隆抗体 美国CST公司

[0029] 3实验方法

[0030] 3.1细胞培养

[0031] 3.1.1完全培养基配制

[0032] 将胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、青霉素‑链霉素溶液和DMEM高糖培养基/McCoy's 5A培养基以10:1:89的比例配制成含10％FBS的完全培养基，颠倒混匀后置于4℃冰箱保存备用。

[0033] 3.1.2细胞复苏

[0034] 打开水浴锅，预热至37℃。取出细胞冻存管，迅速置于水浴锅中，左右摇晃冻存管使内容物尽快融化。轻轻吸出细胞悬液，加入到已备好的含有3mL完全培养基的15mL离心管中，1000rpm离心3min后弃去上清，加入适量完全培养基重悬细胞，转入10cm细胞培养皿中。轻轻摇动培养皿使细胞均匀分布后置于37℃、5％CO2培养箱内培养。

[0035] 3.1.3细胞计数与传代

[0036] 显微镜下观察细胞生长情况，当细胞汇合度达到80‑90％时，即可进行传代。吸弃原培养基，用2mL磷酸盐缓冲液(phosphate‑buffered sal ine，PBS)润洗细胞1次。加入1mL胰酶，轻轻晃动培养皿使之完全覆盖培养皿底部，37℃消化1‑2min。加入2mL完全培养基终止消化，吹打细胞使之脱壁。收集细胞悬液至15mL离心管中，1000rpm离心3min。弃去上清，加入2‑3mL完全培养基重悬细胞。取细胞计数板，将10μL细胞悬液缓慢注入细胞计数板的凹槽中。将计数板平稳地插入细胞计数仪中，等待30s，读取细胞密度，计算细胞总数，以1:3‑1:5比例将细胞传代至培养皿中，置于37℃、5％CO2培养箱内培养。

[0037] 3.1.4细胞冻存

[0038] 胰酶消化的操作同3.1.3，细胞离心后尽量吸净上清，加入适量的细胞冻存液于离心管中，轻柔混匀，制成细胞冻存悬液，转移至已标示完全的冻存管中，用封口膜封口，放入‑80℃冰箱冷冻保存。

[0039] 3.2Western blot

[0040] 3.2.1实验分组

[0041] 按照蔓荆子黄素的不同浓度进行分组，分为0、0.5、5μM组，蔓荆子黄素作用于143B和和U2OS细胞24h后进行后续实验。

[0042] 3.2.2抗体稀释比例

[0043] PI3K 1:1000稀释，p‑AKT 1:2000稀释。

[0044] 3.2.1主要溶液配制

[0045] (1)电泳缓冲液配制：依次称量10g十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、30.3g Tris和144g甘氨酸，加双蒸水定容至1000mL，磁力搅拌均匀后室温保存备用，电泳时用双蒸水将电泳液稀释10倍使用。

[0046] (2)转膜液配制：依次称量30.3g Tris和144g甘氨酸，加双蒸水定容至1000mL，磁力搅拌均匀后室温保存备用。转膜时量取100mL转膜液，加双蒸水定容至800mL，再加入200mL甲醇，充分混匀后使用。

[0047] (3)Tris缓冲盐溶液(Tris buffered sal ine，TBS)配制：依次称量80g氯化钠和24.2g Tris，加双蒸水定容至1000mL，磁力搅拌均匀后室温保存备用。使用时量取100mL TBS，加双蒸水定容至1000mL，再加入1mL吐温‑20，充分混匀，即为TBST(TBS with Tween‑
20)。

[0048] (4)5％脱脂奶粉配制：称量0.5g脱脂奶粉，加入10mL TBST，磁力搅拌均匀后4℃保存备用。

[0049] 3.2.2细胞蛋白提取

[0050] (1)细胞培养及给药处理：

[0051] (1.1)取对数生长期的骨肉瘤细胞，以2×105/孔的密度接种于6孔板中，培养过夜。次日弃去原培养基，分别向培养孔中加入2mL含0、0.5、5μM蔓荆子黄素的完全培养基，继续培养24h。

[0052] (1.2)EdU标记细胞：将EdU用完全培养基配制成终浓度为10μM的EdU工作液。去除原培养液，每孔加入2mL 37℃预热的EdU工作液，放入培养箱孵育2h。

[0053] (1.3)细胞固定与通透：去除培养液，每孔加入1mL固定液(4％多聚甲醛)，室温固定15min。去除固定液，用洗涤液(含3％牛血清白蛋白的PBS)洗涤细胞3次，每次5min。去除洗涤液，每孔加入1mL通透液(含0.3％Triton X‑100的PBS)，室温孵育15min。去除通透液，用洗涤液洗涤细胞3次，每次5min。

[0054] (1.4)根据说明书配制Cl ick反应液，去除洗涤液，每孔加入0.5mL Cl ick反应液，轻轻摇晃培养板以确保反应混合物均匀覆盖样品，室温避光孵育30min。吸除反应液，用洗涤液洗涤细胞3次，每次5min。

[0055] (1.5)按1:1000的比例用PBS稀释Hoechst 33342，吸除洗涤液后，每孔加入1mL稀释后的Hoechst 33342溶液，室温避光孵育10分钟。吸除Hoechst 33342溶液，用洗涤液洗涤细胞3次，每次5分钟。

[0056] (2)弃去旧培养基，用PBS清洗2遍，每孔加入150μL细胞裂解液(RIPA裂解液：蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂＝98:1:1)，用细胞刮将细胞从板底刮下，收集到1.5mL离心管。

[0057] (3)超声波细胞破碎仪以8％功率，冰浴破碎细胞1min。冰上裂解30min后以4℃，14000rpm离心15min，吸取上清液到另一洁净离心管中。

[0058] (4)向上清液中加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，充分混匀后置于99℃金属浴中加热10min，变性完成后置于‑80℃保存待用。

[0059] 3.2.3PAGE凝胶制备

[0060] 清洗玻璃板，晾干后装配到制胶架上。根据目的蛋白的分子量选择浓度合适的分离胶。按照说明书分别配制分离胶和浓缩胶并充分混匀。先将分离胶注入玻璃板中，再缓慢注入浓缩胶，插入梳齿。15min后将凝胶置于去离子水中，4℃保存。

[0061] 3.2.4上样及电泳

[0062] (1)将制好的凝胶安装到电泳槽中，加入适量电泳液，拔去梳齿。

[0063] (2)取出蛋白样品，金属浴99℃加热3min，将样本缓慢加入空白泳道，样本两侧泳道均加入2.5μL Marker。

[0064] (3)连接电源，采用浓缩胶80V，30min；分离胶120V，50‑60min的方式进行电泳。

[0065] 3.2.5转膜

[0066] (1)拆除玻璃板，切除多余凝胶，将凝胶与转膜夹浸没在转膜液中。裁剪大小合适的聚偏二氟乙烯(polyvinyl idene fluoride，PVDF)膜，置于甲醇中活化。

[0067] (2)在转膜槽中加入预冷的转膜液。按照黑色夹子、海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫、白色夹子的顺序组装转膜夹，同时排除胶与膜之间的气泡。将转膜夹插入转膜槽，转膜槽置于冰中，以360mA，35min的方式进行转膜。转膜电流和时间可根据目的蛋白的分子量大小进行适当调整。

[0068] 3.2.6封闭

[0069] 转膜结束后，TBST洗膜3次，每次5min。将PVDF膜放入5％脱脂奶粉中，室温摇床封闭2h。

[0070] 3.2.7一抗孵育

[0071] 封闭结束后，TBST洗膜3次，每次5min。按照Marker指示的位置在膜上切下目的蛋白条带，放入相应的一抗(PCNA 1:1000稀释，β‑ACTIN 1:2000稀释)中，4℃摇床孵育过夜。

[0072] 3.2.8二抗孵育

[0073] 将PVDF膜取出，TBST洗涤3次，每次10min。完成后按照一抗种属将蛋白条带放入对应的二抗(1:5000稀释)中，室温摇床孵育1h。

[0074] 3.2.9显影

[0075] 取出PVDF膜，TBST洗涤3次，每次10min。配制ECL化学发光液(A液：B液＝1:1)，均匀滴加在PVDF膜上，放入凝胶成像仪中曝光显影并保存结果。

[0076] 3.3统计学分析

[0077] 所有实验均独立重复3次，实验数据以均数±标准差(x±s)表示。应用Excel、Image J和GraphPad Prism等软件进行统计分析。两组间均数比较应用t检验，多组间均数比较应用单因素方差分析，p＜0.05时认为差异具有统计学意义。

[0078] 4结果

[0079] 采用Western blot检测不同浓度蔓荆子黄素对骨肉瘤细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响。结果表明，与0μM组相比，143B、U2OS细胞PI3K、p‑AKT的表达水平随着药物浓度的增大而降低(图1)，提示蔓荆子黄素可能通过抑制PI3K/AKT信号通路发挥肿瘤调控作用。

[0080] 综上所述，蔓荆子黄素在体外展现出良好的骨肉瘤治疗潜力，但其是否会在体内发挥抗癌作用尚不清楚，后续将在骨肉瘤的裸鼠皮下移植瘤模型中进行深入验证。

[0081] 二、蔓荆子黄素对骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的影响

[0082] 利用143B细胞构建骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤，并给予不同剂量蔓荆子黄素进行灌胃处理，通过大体观察、苏木精‑伊红(hematoxyl in‑eos in，HE)染色、免疫组织化学染色和Western blot等方法，研究蔓荆子黄素对143B细胞在裸鼠体内成瘤的影响，为蔓荆子黄素调控骨肉瘤提供体内实验依据。

[0083] 1研究对象

[0084] 动物实验经福建医科大学实验动物伦理委员会审查批准，编号为IACUC FJMU 2023‑Y‑0386。BALB/c裸鼠，雌性，6‑8周龄，18±2g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲养于福建医科大学实验动物中心无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级屏障区域。饲养环境温度保持20‑26℃，相对湿度为50‑60％，通风状况良好，裸鼠可自由摄食与饮水。

[0085] 2主要试剂

[0086] 所有材料均为市售。

[0087] 3实验方法

[0088] 3.1裸鼠成瘤实验

[0089] 3.1.1实验药物配制

[0090] (1)0.5％羧甲基纤维素钠：取0.5g羧甲基纤维素钠，加入100mL蒸馏水，水浴超声至完全溶解。

[0091] (2)蔓荆子黄素原液：取5mg蔓荆子黄素，加入1mL 0.5％羧甲基纤维素钠，水浴超声助溶，配制成5mg/mL的原液。使用前用0.5％羧甲基纤维素钠稀释至相应剂量，现配现用。

[0092] (3)2％戊巴比妥钠：取2g戊巴比妥钠，加入100mL生理盐水，震荡混匀至完全溶解。

[0093] 3.1.2细胞准备

[0094] 取成瘤能力较强的143B细胞作为动物实验所用细胞。细胞的常规培养见第二部分3.1。取对数生长期的143B细胞，胰酶消化后离心，弃去上清，加入预冷的PBS重悬，得到单细
7
胞悬液，调整细胞浓度为1×10/mL。

[0095] 3.1.3皮下接种

[0096] 选取裸鼠左侧前肢腋下作为接种部位。75％酒精消毒局部皮肤，注射200μL细胞悬液至裸鼠皮下。

[0097] 3.1.4实验分组及给药处理

[0098] 接种143B细胞3天后，观察裸鼠生命体征及成瘤情况，采用随机数字表法将裸鼠分为0、5、10mg/kg组。其中0mg/kg组每天给予200μL 0.5％羧甲基纤维素钠灌胃，其余两组每天分别给予200μL 5、10mg/kg蔓荆子黄素灌胃，连续给药15天。

[0099] 3.1.5观察测量

[0100] 每天观察裸鼠饮食和活动情况，每3天用游标卡尺测量肿瘤的最大长径(L)和最小3 2
短径(W)，计算肿瘤体积(V)，公式为：V(mm)＝(L(mm)×W(mm))/2。

[0101] 3.1.6取材

[0102] 末次给药24h后，采用腹腔注射2％戊巴比妥钠(100mg/kg)的方式对裸鼠实施安乐死。确认无生命体征后，剥离瘤体及主要脏器，称量瘤体重量后拍照。将瘤体与脏器分成两部分，一部分转移至‑80℃冰箱保存，另一部分用4％多聚甲醛固定，用于后续实验。

[0103] 3.2组织HE染色

[0104] (1)包埋、切片：动物组织在4％多聚甲醛中固定24h以上，对组织进行脱水浸蜡处理后，应用石蜡包埋机进行包埋，将修整好的蜡块用石蜡切片机切成厚度为4μm的切片，置于摊片机40℃温水上展平，再移至载玻片上，60℃烘箱内烤片。

[0105] (2)脱蜡至水：将石蜡切片依次放入二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ20min，无水乙醇Ⅰ5min，无水乙醇Ⅱ5min，75％酒精5min，蒸馏水洗。

[0106] (3)苏木素染色：切片依次放入苏木素染液中染色3‑5min，蒸馏水洗，分化液分化，蒸馏水洗，返蓝液返蓝，蒸馏水洗。

[0107] (4)伊红染色：切片依次放入85％、95％的梯度酒精中脱水各5min，放入伊红染液中染色5min，蒸馏水洗。

[0108] (5)脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，无水乙醇Ⅲ5min，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min，自然晾干后滴上中性树胶封片。

[0109] (6)镜检：于显微镜下观察，选取合适视野，采集图像并分析。

[0110] 3.3免疫组织化学染色

[0111] (1)脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯I10min，二甲苯II 10min，二甲苯III 10min，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，无水乙醇III 5min，蒸馏水洗。

[0112] (2)抗原修复：将切片浸没在柠檬酸抗原修复液中，中高火10min至沸腾，保温10min，再转中低火10min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将切片置于PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

[0113] (3)阻断内源性过氧化物酶：在切片上滴加3％过氧化氢，室温避光孵育25min后将切片置于PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

[0114] (4)血清封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在组化圈内滴加山羊血清均匀覆盖组织，室温封闭1h。

[0115] (5)一抗孵育：轻轻甩掉封闭液，在组化圈内滴加100μL稀释后的一抗(PCNA 1:500稀释)，切片平放于湿盒内4℃孵育过夜。

[0116] (6)二抗孵育：切片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。稍甩干后在圈内滴加相应的二抗(1：50稀释)覆盖组织，室温孵育50min。

[0117] (7)DAB显色：切片置于PBS中，在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，自来水冲洗切片终止显色。

[0118] (8)细胞核复染：苏木素复染3min，蒸馏水洗，分化液分化数秒，蒸馏水洗，返蓝液返蓝，蒸馏水洗。

[0119] (9)脱水封片：将切片依次放入75％酒精5min，85％酒精5min，无水乙醇I 5min，无水乙醇II 5min，正丁醇5min，二甲苯I 5min中脱水透明，自然晾干后滴加中性树胶封片。

[0120] (10)镜检：于显微镜下观察，选取合适视野，采集图像并分析。

[0121] 3.4Western blot实验

[0122] 3.4.1组织蛋白提取

[0123] (1)组织称重后切成小块放入研磨管，加入研磨珠。将RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂以98:1:1的比例配制成组织裂解液。每10mg组织加入100μL组织裂解液，于低温研磨仪中匀浆，完成后置于冰上继续裂解30min，每隔5min震荡一次确保组织完全裂解。

[0124] (2)以4℃，14000rpm离心15min，吸取上清液至另一洁净1.5mL离心管中，加入1/4体积的蛋白上样缓冲液，充分混匀后置于99℃金属浴中加热10min，变性完成后置于‑80℃保存待用。

[0125] 3.4.2其余操作

[0126] 同第一部分3.2.1‑3.2.9。

[0127] 3.5统计学分析

[0128] 同第一部分3.3。

[0129] 4结果

[0130] 4.1蔓荆子黄素抑制骨肉瘤的体内生长

[0131] 为了验证蔓荆子黄素在体内的抗骨肉瘤作用，选择成瘤能力较强的143B细胞进行裸鼠成瘤实验。通过灌胃给予裸鼠不同剂量的蔓荆子黄素，测量瘤体体积，实验结束后剥离瘤体，测量瘤体重量。如图2所示，与0mg/kg组相比，5、10mg/kg组的瘤体体积差异随时间变化逐渐明显，药物剂量升高，瘤体体积减小。取出瘤体后，5、10mg/kg组的瘤体重量小于0mg/kg组，蔓荆子黄素给药处理显著降低了裸鼠瘤体的重量，且10mg/kg组的作用更为明显。这些结果表明蔓荆子黄素可在裸鼠体内有效抑制骨肉瘤的生长。

[0132] 4.2蔓荆子黄素对骨肉瘤组织形态学的影响

[0133] HE染色结果显示各组肿瘤细胞形态不规则、核大深染，可见病理性核分裂象。0mg/kg组细胞排列致密紊乱、互相挤压，随着蔓荆子黄素剂量的升高，细胞排列逐渐疏松，细胞完整性下降，出现不同程度的核溶解、核固缩和核碎裂等现象(图3)。

[0134] 4.3蔓荆子黄素抑制骨肉瘤组织PCNA的表达

[0135] 为了进一步明确蔓荆子黄素对骨肉瘤的体内增殖抑制作用，瘤体切片后进行免疫组织化学染色。结果显示，0mg/kg组细胞核深染，随着蔓荆子黄素剂量的升高，组织细胞的阳性程度减弱，表明用药后裸鼠瘤体中PCNA的蛋白水平发生了下降(图4)。

[0136] 4.4蔓荆子黄素对骨肉瘤裸鼠脏器组织的影响

[0137] 为了探究蔓荆子黄素对骨肉瘤裸鼠主要器官的影响，将裸鼠的肺、肝、心、脾、肾进行HE染色，观察器官组织学改变。在0mg/kg组裸鼠的肺、肝组织中观察到排列致密、形态异质的细胞团，表明骨肉瘤发生远处转移，而在5、10mg/kg的给药组中，没有观察到类似现象，这表明蔓荆子黄素具有抑制骨肉瘤远处转移的潜力。此外蔓荆子黄素未对主要脏器造成明显的组织病理损伤(图5)。

[0138] 综上所述，蔓荆子黄素能够抑制骨肉瘤裸鼠皮下移植瘤的体内生长和远处转移，降低PCNA的表达，抑制PI3K/AKT信号通路的激活，从而起到治疗骨肉瘤或延缓疾病进程的作用。

[0139] 虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。