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龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用

专利类型	发明授权	法律事件	公开; 实质审查; 授权;
专利有效性	有效专利	当前状态	授权
申请号	CN202210575399.0	申请日	2022-05-24
公开(公告)号	CN115025078B	公开(公告)日	2024-02-23
申请人	长江师范学院;	申请人类型	学校
发明人	谭飔; 李文峰; 罗刚军; 赖彪; 李昌满; 翟立峰; 杜丽娜;	第一发明人	谭飔
权利人	长江师范学院	权利人类型	学校
当前权利人	长江师范学院	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：重庆市	城市	当前专利权人所在城市：重庆市涪陵区
具体地址	当前专利权人所在详细地址：重庆市涪陵区聚贤大道16号	邮编	当前专利权人邮编：408100
主IPC国际分类	A61K31/192	所有IPC国际分类	A61K31/192 ; A61K31/353 ; A61K31/7048 ; A61K31/7034 ; A61K31/352 ; A61P1/16 ; A61P3/06 ; A61P29/00 ; A61K36/77 ; A61K131/00
专利引用数量	1	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	3	专利文献类型	B
专利代理机构	北京深川专利代理事务所	专利代理人	张娴;
摘要	本发明提供了一种龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用。该龙眼果渣多酚提取物具有明确的多酚组成: 没食子酸、原花青素B、表儿茶素、原花青素A2、丁香酸、4‑羟基肉桂酸、枸橘苷、阿魏酸、芦丁、根皮苷和6‑甲氧基柚皮素。本发明提供的龙眼果渣多酚提取物具有增加LXR、PPARα表达作用,从而说明龙眼果渣多酚提取物可通过调控与脂质分解代谢和转运相关基因表达进而起到降脂作用,其具有明确的降脂机制。
权利要求	1.一种龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用，所述龙眼果渣多酚提取物为粉末状，所述药品为片剂、微囊剂、丸剂或散剂；所述药品的剂量为 200mg/kg；所述龙眼果渣多酚提取物的制备方法包括如下步骤： (1)将龙眼果渣置于45‑55℃下干燥36‑48h后，采用超高速粉碎机粉碎获得龙眼果渣粉，备用； (2)将上述龙眼果渣粉加入至质量分数为80％的乙醇中，在转速为5000‑8000rad/min下均质2min；再超声波辅助提取30min，收集滤液； (3)对滤渣再提取2次，分别收集滤液； (4)合并步骤(2)和步骤(3)收集到的滤液，将收集得到的滤液在40‑45℃，压力在10‑ 100mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液A； (5)向上述浓缩液A中加入乙酸乙酯，搅拌20‑30min后至于分液漏斗静置直至出现明显的分层； (6)对上层物在40‑45℃，压力在10‑100mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液B； (7)将上述浓缩液B置于真空冷冻干燥中干燥处理，即得到龙眼果渣多酚提取物；所述龙眼果渣多酚提取物的总多酚含量不低于700mg没食子酸相当量/g，其中主要成分中没食子酸含量不低于20mg/g、原花青素含量不低于25mg/g，表儿茶素含量不低于7mg/g和根皮苷含量不低于300mg/g；所述龙眼果渣多酚提取物对DPPH自由基清除率为230mg Vc/g；对ABTS自由基清除率为250mg Vc/g；还原能力FRAP为550mg Vc/g。 2.根据权利要求1所述的龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用，其特征在于，步骤(2)中所述龙眼果渣粉与所述乙醇的质量体积比为1:10。 3.根据权利要求1所述的龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用，其特征在于，步骤(5)中所述乙酸乙酯的加入量为所述浓缩液A的体积5‑6倍。
说明书全文	龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用技术领域 [0001] 本发明属于龙眼果渣多酚提取物的医药新用途，具体涉及龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用。背景技术 [0002] 非酒精性脂肪性肝病(non‑alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其它明确的肝损伤因素(肝炎病毒、药物、自身免疫等)外，以肝内脂肪过度沉积和炎症反应为主要特征的病理综合征。NAFLD根据其发展过程可分为单纯性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non‑alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纤维化、肝硬化和肝癌。目前，NAFLD全球患病率约25％，我国NAFLD患者人数在10年内从18％增长到近30％，预计到2030年，我国将成为全球NAFLD患病率增长最快的国家。NAFLD不仅会增加肝脏相关疾病的发生风险，还是代谢综合征、动脉粥样硬化以及结直肠癌的重要危险因素，已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。其中，NASH占NAFLD的10％‑30％，是单纯性脂肪肝向肝纤维化、肝硬化、肝癌进展的重要中间环节，然而临床上尚无特定的治疗NASH的药物。因此，挖掘天然无副作用的延缓和阻断NASH进展的生物活性物质成为亟待解决的问题。 [0003] NASH的确切发病机制尚未完全阐明，但可以明确的是脂质在肝细胞中蓄积及其炎症反应、细胞应激和细胞凋亡的相互作用，促进NASH的发展。肝脏中脂质蓄积是NASH发病的核心机制，脂肪沉积是NASH的主要特征。肝脏脂肪变性是由于脂质合成和利用之间的失调造成，包括游离脂肪酸摄取、脂肪酸从头合成、脂肪酸氧化以及甘油三脂的输出等，任何一个环节异常都能影响肝脏脂质蓄积，进而导致NASH发生发展。因此，调节肝脏脂质代谢是预防NASH的重要手段。 [0004] 龙眼又俗称桂圆，是药食同源植物，既是滋补佳品，又有较高的药用价值，具有重要研究意义。龙眼的药用价值与其所含的丰富的多酚类物质密切相关，现有研究发现龙眼果实中含有丰富的多酚类物质，特别地，龙眼果皮和果核中多酚类物质的种类和含量远远高于龙眼果肉。目前，大部分研究集中于龙眼果肉中多酚类物质的鉴定、分离和纯化，以及不同品种龙眼果实中多酚类物质的差异分析。然而，龙眼果渣中丰富的多酚类物质的深入挖掘和功能评价研究较少。龙眼在传统医学中被用作民间药物用于止汗、止血和治疗失眠等症状。现代研究发现，龙眼具有抗氧化、降血糖、抗肿瘤和调节免疫系统等重要生物活性。 [0005] 然而，迄今为止，龙眼多酚对NASH的作用效果还未见相关报道。发明内容 [0006] 针对现有技术中存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用，该龙眼果渣多酚提取物组成明确，可作为有效干预NASH的药物成分。 [0007] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用。 [0008] 进一步，所述龙眼果渣多酚提取物为粉末状。 [0009] 进一步，所述药品为口服制剂。 [0010] 进一步，所述药品为片剂、微囊剂、丸剂或散剂。 [0011] 进一步，所述药品的剂量为200mg/kg。 [0012] 上述龙眼果渣多酚提取物采用如下方法制备而成： [0013] (1)将龙眼果渣置于45‑55℃下干燥36‑48h后，采用超高速粉碎机粉碎获得龙眼果渣粉，备用； [0014] (2)将上述龙眼果渣粉加入至质量分数为80％的乙醇中，在转速为5000‑8000rad/min下均质2min；再超声波辅助提取30min，收集滤液； [0015] (3)对上述滤渣再提取2次，分别收集滤液； [0016] (4)合并步骤(2)和步骤(3)收集到的滤液，将收集得到的滤液在40‑45℃，压力在10‑100mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液A； [0017] (5)向上述浓缩液A中加入乙酸乙酯，搅拌20‑30min后至于分液漏斗静置直至出现明显的分层； [0018] (6)对上层物在40‑45℃，压力在10‑100mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液B； [0019] (7)将上述浓缩液B置于真空冷冻干燥中干燥处理，即得到龙眼果渣多酚提取物。 [0020] 进一步，所述龙眼果渣多酚提取物的总多酚含量不低于700mg没食子酸相当量/g。 [0021] 进一步，所述龙眼果渣多酚提取物对DPPH自由基清除率为230mg Vc/g；对ABTS自由基清除率为250mg Vc/g；还原能力FRAP为550mg Vc/g。 [0022] 进一步，步骤(2)中所述龙眼果渣粉与所述乙醇的质量体积比为1:10。 [0023] 进一步，步骤(5)中所述乙酸乙酯的加入量为所述浓缩液A的体积5‑6倍。 [0024] 以现有技术相比，本发明具有如下有益效果： [0025] 1、本发明采用醇提法制备龙眼果渣多酚粗提取物，采用乙酸乙酯萃取后得龙眼多酚。通过UPLC‑QqQ‑MS/MS分析确定了龙眼果渣多酚组分。通过小鼠实验，确定该龙眼果渣多酚具有预防高脂膳食诱导的小鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用。 [0026] 2、本发明提供的龙眼果渣多酚提取物具有明确的多酚组成：没食子酸、原花青素B、表儿茶素、原花青素A2、丁香酸、4‑羟基肉桂酸、枸橘苷、阿魏酸、芦丁、根皮苷和6‑甲氧基柚皮素。 [0027] 3、本发明提供的龙眼果渣多酚提取物具有显著降低血脂、肝脏脂质和改善肝脏炎症的作用，从而可作为预防NASH制剂。 [0028] 4、本发明提供的龙眼果渣多酚提取物具有增加LXR、PPARα表达作用，从而说明龙眼果渣多酚提取物可通过调控与脂质分解代谢和转运相关基因表达进而起到降脂作用，其具有明确的降脂机制。附图说明 [0029] 图1为本发明龙眼果渣多酚提取物的组成高效液相色谱图； [0030] 图2为本发明龙眼果渣多酚提取物降低高脂膳食诱导的NASH小鼠体重和白脂肪细胞大小图； [0031] 图3为本发明龙眼果渣多酚提取物改善高脂膳食诱导的NASH小鼠血清和肝脏脂质图； [0032] 图4为本发明龙眼果渣多酚提取物对脂质代谢相关基因表达影响图。实施方式 [0033] 下面结合具体实施例和说明附图，对本发明方法进行详细说明。其中，本发明制备的龙眼果渣多酚提取物可以简写为LPPE。 [0034] 一、本发明龙眼果渣多酚提取物的制备实施例 [0035] 一种龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用。 [0036] 上述龙眼果渣多酚提取物采用如下方法制备而成： [0037] (1)将龙眼果渣置于45℃下干燥48h后，采用超高速粉碎机粉碎获得龙眼果渣粉，备用； [0038] (2)按质量体积比为1:10将上述龙眼果渣粉加入至质量分数为80％的乙醇中，所述在转速为5000rad/min下均质2min；再超声波辅助提取30min，收集滤液； [0039] (3)对上述滤渣再提取2次，分别收集滤液； [0040] (4)合并步骤(2)和步骤(3)收集到的滤液，将收集得到的滤液在40℃，压力在10mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液A； [0041] (5)向上述浓缩液A中加入乙酸乙酯，所述乙酸乙酯的加入量为所述浓缩液A的体积5倍，搅拌20min后至于分液漏斗静置直至出现明显的分层； [0042] (6)对上层物在40℃，压力在10mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液B； [0043] (7)将上述浓缩液B置于真空冷冻干燥中干燥处理，即得到龙眼果渣多酚提取物，该提取物为粉末状。 [0044] 其中，该药品为口服制剂。 [0045] 其中，所述药品为片剂、微囊剂、丸剂或散剂，剂量为200mg/kg。 [0046] 其中，所述龙眼果渣多酚提取物的总多酚含量不低于700mg没食子酸相当量/g，其中主要成分中没食子酸含量不低于20mg/g、原花青素含量不低于25mg/g，表儿茶素含量不低于7mg/g和根皮苷含量不低于300mg/g。所述龙眼果渣多酚提取物对DPPH自由基清除率为230mg Vc/g；对ABTS自由基清除率为250mg Vc/g；还原能力FRAP为550mg Vc/g。实施例 [0047] 一种龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用。 [0048] 上述龙眼果渣多酚提取物采用如下方法制备而成： [0049] (1)将龙眼果渣置于55℃下干燥36h后，采用超高速粉碎机粉碎获得龙眼果渣粉，备用； [0050] (2)按质量体积比为1:10将上述龙眼果渣粉加入至质量分数为80％的乙醇中，所述在转速为8000rad/min下均质2min；再超声波辅助提取30min，收集滤液； [0051] (3)对上述滤渣再提取2次，分别收集滤液； [0052] (4)合并步骤(2)和步骤(3)收集到的滤液，将收集得到的滤液在45℃，压力在100mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液A； [0053] (5)向上述浓缩液A中加入乙酸乙酯，所述乙酸乙酯的加入量为所述浓缩液A的体积6倍，搅拌30min后至于分液漏斗静置直至出现明显的分层； [0054] (6)对上层物在45℃，压力在100mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液B； [0055] (7)将上述浓缩液B置于真空冷冻干燥中干燥处理，即得到龙眼果渣多酚提取物，该提取物为粉末状。 [0056] 其中，该药品为口服制剂。 [0057] 其中，所述药品为片剂、微囊剂、丸剂或散剂，剂量为200mg/kg。 [0058] 其中，所述龙眼果渣多酚提取物的总多酚含量不低于700mg没食子酸相当量/g，其中主要成分中没食子酸含量不低于20mg/g、原花青素含量不低于25mg/g，表儿茶素含量不低于7mg/g和根皮苷含量不低于300mg/g。所述龙眼果渣多酚提取物对DPPH自由基清除率为230mg Vc/g；对ABTS自由基清除率为250mg Vc/g；还原能力FRAP为550mg Vc/g。实施例 [0059] 一种龙眼果渣多酚提取物在制备用于防治非酒精性脂肪肝炎的药品中的应用。 [0060] 上述龙眼果渣多酚提取物采用如下方法制备而成： [0061] (1)将龙眼果渣置于50℃下干燥40h后，采用超高速粉碎机粉碎获得龙眼果渣粉，备用； [0062] (2)按质量体积比为1:10将上述龙眼果渣粉加入至质量分数为80％的乙醇中，所述在转速为6000rad/min下均质2min；再超声波辅助提取30min，收集滤液； [0063] (3)对上述滤渣再提取2次，分别收集滤液； [0064] (4)合并步骤(2)和步骤(3)收集到的滤液，将收集得到的滤液在42℃，压力在50mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液A； [0065] (5)向上述浓缩液A中加入乙酸乙酯，所述乙酸乙酯的加入量为所述浓缩液A的体积6倍，搅拌30min后至于分液漏斗静置直至出现明显的分层； [0066] (6)对上层物在42℃，压力在50mbar下进行减压浓缩至粘稠，得到浓缩液B； [0067] (7)将上述浓缩液B置于真空冷冻干燥中干燥处理，即得到龙眼果渣多酚提取物，该提取物为粉末状。 [0068] 其中，该药品为口服制剂。 [0069] 其中，所述药品为片剂、微囊剂、丸剂或散剂，剂量为200mg/kg。 [0070] 其中，所述龙眼果渣多酚提取物的总多酚含量不低于700mg没食子酸相当量/g，其中主要成分中没食子酸含量不低于20mg/g、原花青素含量不低于25mg/g，表儿茶素含量不低于7mg/g和根皮苷含量不低于300mg/g。所述龙眼果渣多酚提取物对DPPH自由基清除率为230mg Vc/g；对ABTS自由基清除率为250mg Vc/g；还原能力FRAP为550mg Vc/g。 [0071] 二、本发明制备的龙眼果渣多酚提取物的组分分析 [0072] 称取一定量LPPE粉末，加入纯净水制备成浓度为1mg/mL的溶液，过0.22μm微孔滤膜后，通过配备了电喷雾电离源(ESI)的超高压液相色谱仪(UPLC，美国加利福尼亚州安捷伦)和三重四极杆质谱仪(6460QqQ‑MS，美国加利福尼亚州安捷伦)进行分析。ZORBAXEclipse Plus C18色谱柱(100mm×2.1mm i.d.,1.8μm,Agilent,USA)用于分离化合物。流动相由0.1％甲酸水溶液(A)和甲醇与0.1％甲酸(B)的梯度溶液组成，流速为0.2mL/min。样品进样量为5μL，柱温为35℃。梯度洗脱的设置如下：0‑10min，100％至20％A；10‑ 11min，20％A；11‑12min，20％至100％A。图1为龙眼果渣多酚提取物的组成高效液相色谱图，如图1所示，龙眼果渣多酚的主要成分是没食子酸、原花青素B、表儿茶素、原花青素A2、丁香酸、4‑羟基肉桂酸、枸橘苷、阿魏酸、芦丁、根皮苷和6‑甲氧基柚皮素。 [0073] 三、本发明制备的龙眼果渣多酚提取物在防治NASH作用中的应用 [0074] 3.1)动物实验设计与方法 [0075] 30只健康的雄性C57BL/6J小鼠(22g±1g)，经过1周的适应性喂养后以每组10只随机分成3组，分别为对照组(Chow)、模型组(HFD)、LPPE组(HFD+0.2％LPPE)。Chow组给予一般饲料(脂肪热量占10％)，HFD组给予高脂饲料(脂肪热量占60％)，LPPE组给予高脂饲料，同时添加0.2％的LPPE，给药期间记录小鼠体重和进食量。实验期间(12周)，小鼠自由进食饮水，实验结束后禁食12h，进行麻醉解剖和组织样本收集。取部分肝脏固定于4％多聚甲醛溶液中用于后续石蜡切片、H&E染色；取部分肝脏液氮速冻后存放于‑80℃用于制备冰冻切片以及脂质、基因及蛋白水平测定； [0076] 小鼠血液在3000×g下离心15min，收集上层血清。采用全自动生化分析仪测定血清总胆固醇(TC)、总甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑c)和高密度脂蛋白胆固醇水平(HDL‑c)。 [0077] 称取50mg肝脏组织，用0.5mL组织裂解液均质后，加入1mL氯仿提取后风干去除有机溶剂，然后按照总胆固醇和甘油三酯定量分析试剂盒说明书测定。 [0078] 固定后的肝脏组织包埋于石蜡中，切成5‑6μm的薄片，经苏木精‑伊红染色，封片后显微镜下镜检。将存放于‑80℃的肝组织取出，制成冰冻切片，经油红O试剂染色，封片后在显微镜下观察。 [0079] 3.2)动物实验结果 [0080] 图2为本发明龙眼果渣多酚提取物降低高脂膳食诱导的NASH小鼠体重和白脂肪细胞大小图，其中，(A)小鼠实验前后体重(g)；(B)小鼠白脂肪细胞H&E染色(×200)。Chow组小鼠给予一般饲料(脂肪热量占10％)，HFD组给予高脂饲料(脂肪热量占60％)，LPPE组给予高脂饲料，同时添加0.2％的LPPE，实验期间，小鼠自由摄水。结果用平均数±标准差表示(n＝8)，相同颜色柱形图上标注的字母不同表示差异显著(P<0.05)。从图2可知，小鼠连续摄入高脂饲料12周，导致体重显著增加、白脂肪细胞增大。然而，给予添加0.2％LPPE后，小鼠体重有明显降低，同时也减小白脂肪细胞大小。 [0081] 图3为本发明龙眼果渣多酚提取物改善高脂膳食诱导的NASH小鼠血清和肝脏脂质图，其中，(A)血清中胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HLD‑c)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑c)水平；(B)肝脏中TG含量；(C)肝脏中TC含量；(D)肝脏H&E染色(×200)；(E)肝脏油红O染色(×200)。Chow组小鼠给予一般饲料(脂肪热量占10％)，HFD组给予高脂饲料(脂肪热量占60％)，LPPE组给予高脂饲料，同时添加0.2％的LPPE，实验期间，小鼠自由摄水。结果用平均数±标准差表示(n＝8)。相同指标不同字母表示差异显著(P<0.05)。从图 3可知，与对照组(Chow组)相比，小鼠连续摄入高脂饲料12周后，血清总胆固醇(TC)、总甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑c)和高密度脂蛋白胆固醇水平(HDL‑c)都显著增加。然而，0.2％LPPE显著降低了肥胖小鼠血清TC、TG和LDL‑c。图3B表明高脂饲料能显著增加小鼠肝脏TG和TC，而0.2％LPPE也能显著降低HFD诱导的肥胖小鼠TG和TC。此外，H&E染色表明HFD组NASH小鼠肝细胞胞浆内可见大小不等脂肪空泡，细胞间界限模糊，胞核碎裂或溶解，伴少量炎性细胞浸润。LPPE处理后肝细胞脂肪空泡明显减少，几乎未见炎性细胞(3C)。最后，油红O染色结果表明，HFD组小鼠肝细胞内有大量红色脂滴聚集，而LPPE处理显著性降低脂滴含量(3D)。以上结果表明，龙眼果渣多酚提取物能显著降低高脂膳食诱导引起的小鼠高血脂、肝脏脂质积累和减缓肝脏炎症。 [0082] 图4为本发明龙眼果渣多酚提取物对脂质代谢相关基因表达影响图，其中，(A)LXR；(B)FAS；(C)PPARα；(D)CYP27A1；(E)CYP7A1；(F)AMPK。Chow组小鼠给予一般饲料(脂肪热量占10％)，HFD组给予高脂饲料(脂肪热量占60％)，LPPE组给予高脂饲料，同时添加0.2％的LPPE，实验期间，小鼠自由摄水。结果用平均数±标准差表示(n＝5)。不同字母表示差异显著(P<0.05)。从图4可知：LPPE肝脏X受体(LXR)及下游FAS、CYP27A1、CYP7A1基因表达，同时能增加PPARα和AMPK表达，抑制脂肪酸合成，促进脂肪酸氧化，进而达到改善脂质代谢效果。 [0083] 最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

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