[0001] 本发明属于基因重组技术领域，具体涉及一种羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L及其重组乳酸乳球菌的构建方法和应用。

[0002] 羊传染性脓疱病(Contagious  Ecthyma，CE)俗称羊口疮，是由痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒属(Parapoxvirus)的羊口疮病毒(Orfvirus，OrfV)引起的一种接触性皮肤传染病，主要感染绵羊和山羊等小反刍动物，也可感染人和其他动物甚至引发养羊业发展和环境安全问题，中国主要养羊地区常有该病发生和流行的报道，由于羊口疮对于农牧业的潜在威胁以及存在人畜共患风险，因此，OrfV及其致病因子的研究已经成为热点。其中，F1L基因位于OrfV基因组中部高度保守区域，编码OrfV的囊膜蛋白，是病毒表面微管的主要成分之一，具有一定的免疫原性，可诱发机体产生体液免疫及细胞免疫应答。此外，F1L蛋白具有与肝素结合的功能，能与大多数哺乳动物细胞表面的硫酸乙酰肝素(HS)受体结合，在病毒吸附和侵入宿主的过程中起着重要作用。

[0003] 羊口疮病毒对畜牧业发展存在的潜在威胁及人畜共患风险，是养殖业不可忽略的问题，且尚未相关药物上市。

[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L及其重组乳酸乳球菌的构建方法和应用。本发明提供的羊口疮病毒免疫原性蛋白，依据乳酸乳球菌密码子偏好性，优化目的基因密码子，成功检测到了目的蛋白的表达。

[0005] 为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L，所述免疫原性蛋白F1L的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0007] 优选的，所述免疫原性蛋白F1L的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 本发明提供了一种扩增上述羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L的编码基因的引物对，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列如SEQ ID NO.3所述，所述下游引物的基因序列如SEQ ID NO.4所述。

[0009] 本发明提供了一种包含上述羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L的重组表达载体；所述重组表达载体的基础载体包括乳酸乳球菌表达载体。

[0010] 本发明提供了上述的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：将上述F1L蛋白的编码基因克隆到所述基础载体的Nco I和Sac I酶切位点之间，得到重组表达载体。

[0011] 本发明提供了一种表达上述的羊口疮病毒免疫原性F1L蛋白的重组乳酸乳球菌，包含上述的重组表达载体。

[0012] 本发明提供了上述重组乳酸乳球菌的制备方法，包括以下步骤：将上述的重组表达载体转化至乳酸乳球菌感受态细胞中，收集阳性克隆转化子，得到重组乳酸乳球菌。

[0013] 本发明提供了上述羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L或上述重组乳酸乳球菌在制备预防羊口疮病毒感染的药剂中的应用。

[0014] 本发明提供了一种预防羊口疮病毒感染的药剂的制备方法，包括以下步骤：将上述的重组乳酸乳球菌接种于GM17培养基中，在诱导肽的作用下培养12h，得到包含羊口疮病毒F1L蛋白的药剂。

[0015] 本发明提供了利用上述制备方法制得的预防羊口疮病毒感染的药剂，其特征在10
于，所述药剂中的活菌数为1.2×10 CFU/mL。

[0016] 有益效果：本发明提供了一种羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L，依据乳酸乳球菌NZ3900特有的密码子偏好性进行核酸分子设计，消除稀有密码子和调整GC含量，将羊口疮病毒F1L基因进行密码子优化，提高了目的蛋白的表达量，成功检测到了目的蛋白的有效表达。

[0017] 本发明利用基因扩增、酶切、连接等技术将F1L目的基因与pNZ8149表达载体相连接，成功构建出含有F1L基因片段的重组乳酸菌表达载体。本发明利用的乳酸菌及其代谢产物具有降低胆固醇、抗病毒、抗肿瘤等作用，与大肠杆菌等表达系统相比，乳酸菌表达系统具有不含内毒素，安全性高，可以直接口服等优势。

[0018] 本发明首次构建了含有羊口疮病毒F1L基因的重组乳酸乳球菌，并成功检测到了F1L蛋白的表达，并电转至乳酸乳球菌感受态细胞中，获得能够稳定表达羊口疮病毒F1L蛋白的重组乳酸乳球菌，更加有利于羊口疮病毒的防控，为羊口疮病毒的预防和进一步研究奠定了基础。附图说明

[0019] 图1为优化后F1L基因扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图，其中M为蛋白Marker，1为F1L基因扩增产物；

[0020] 图2为重组乳酸乳球菌阳性菌液PCR验证的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为蛋白Marker，1～5为挑取的重组乳酸乳球菌单克隆菌落；NC为阴性对照；

[0021] 图3为重组载体pNZ8149‑F1L的质粒结构图；

[0022] 图4为F1L目的蛋白表达的WesternBlot验证图，其中M为蛋白Marker，1为NZ3900/pNZ8149‑F1L，2为NZ3900；

[0023] 图5为F1L目的蛋白稳定表达的Western Blot验证图，其中M为蛋白Marker，1为P2代菌种，2为P4代菌种；3为P6代菌种；4为P8代菌种。

[0024] 本发明提供了一种羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L，所述免疫原性蛋白F1L的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：PAPAPAPKPSPPAPHPKGDHVLKAVEWK DVDSKDYPHFFTDMCKSTCPKEMQRRAAHHLNLWESISAGTVSTKYSDNDFILVVDNDMTFHKPEMVKPLIEAMKTNGWYMAQLKETYMTGALATNVPGTGDPELMVYPGGYDVSLDAYIINVGGMKKLYDAIIKDGGLRSGLLTEVFTLEKRLSLARVVLSGAEQVVYPEYYIQVKTRLGGAPSLWSLLATWLARFWPG。

[0025] 本发明所述免疫原性蛋白F1L的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：5’‑CCAGCTCCGGCACCAGCGCCTAAACCTTCTCCTCCTGCCCCTCATCC AAAAGGAGACCATGTTCTGAAAGCTGTTGAATGGAAAGACGTAGATTCGAAAGATTATCCACATTTTTTTACTGATATGTGTAAATCAACTTGTCCAAAGGAAATGCAAAGACGAGCAGCTCATCATTTAAATCTATGGGAAAGTATTTCAGCAGGCACGGTATCAACAAAATATTCTGATAATGATTTCATCTTAGTCGTTGACAATGACATGACTTTTCATAAACCAGAGATGGTTAAGCCTTTGATTGAAGCAATGAAAACTAATGGTTGGTATATGGCTCAGTTAAAAGAAACTTACATGACAGGGGCTTTGGCAACCAACGTTCCTGGAACAGGAGATCCTGAATTAATGGTCTATCCTGGCGGTTATGACGTATCTCTCGATGCTTACATTATTAATGTTGGGGGAATGAAAAAACTTTATGATGCAATCATTAAAGATGGTGGACTACGCAGTGGGCTCTTAACAGAAGTCTTCACTTTAGAAAAACGGCTTAGTTTAGCAAGAGTTGTGTTGTCTGGAGCCGAGCAAGTTGTTTATCCAGAATATTATATTCAAGTAAAAACACGTCTTGGTGGTGCTCCTTCACTTTGGTCACTGTTAGCTACTTGGTTGGCACGTTTTTGGCCAGGC‑3’。

[0026] 本发明对羊口疮病毒免疫原性蛋F1L的碱基序列进行了密码子优化。乳酸菌表达系统目前仍不成熟，主要表现在其表达量较低，本发明依据乳酸乳球菌密码子偏好性，优化目的基因密码子，成功检测到了目的蛋白的表达。

[0027] 本发明提供了一种扩增上述羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L的编码基因的引物对，其特征在于，包括上游引物和下游引物，所述上游引物的基因序列如SE Q ID NO.3所示：5’‑CATGCCATGGCCAGCTCCGGCACCAGCG‑3’，所述下游引物的基因序列如SEQ ID NO.4所示：
5’‑CCGAGCTCTTAATGATGATGATGG TGGTGGCCTGGCCAAAAACGTGC‑3’。

[0028] 本发明提供了一种包含上述羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L的重组表达载体。本发明所述重组表达载体优选以乳酸菌表达载体为基础载体，所述基础载体优选为pNZ8149。

[0029] 本发明提供了上述的重组表达载体的构建方法，包括如下步骤：将上述F1L蛋白的编码基因克隆到所述基础载体的Nco I和Sac I酶切位点之间，得到重组表达载体。本发明优选通过双酶切的手段将免疫原性蛋白F1L的编码基因克隆至pNZ8149的Nco I和Sac I酶切位点之间，形成重组载体pNZ8149‑F1L。

[0030] 本发明提供了一种表达上述的羊口疮病毒免疫原性F1L蛋白的重组乳酸乳球菌，包含上述的重组表达载体。

[0031] 本发明提供了上述重组乳酸乳球菌的制备方法，优选包括以下步骤：(1)扩增羊口疮病毒F1L基因片段，扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳后经胶回收获得；(2)通过Nco I和Sac I限制性内切酶双酶切羊口疮病毒F1L基因和pNZ8149空载体；(3)将上述羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L的编码基因克隆至pNZ8149乳酸菌表达载体中，构建重组质粒pNZ8149‑F1L；(2)将重组质粒pNZ8149‑F1L转化至乳酸乳球菌感受态中，得到所述重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149‑F1L。本发明优选通过遗传转化的方式转染乳酸乳球菌NZ3900的感受态细胞，经WesternBlot验证后，得所述重组乳酸乳球菌。本发明所述乳酸乳球菌能高效表达F1L蛋白，传代稳定性好，在对羊口疮病毒的预防中应用前景广泛。

[0032] 本发明提供了上述羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L或上述重组工程菌在制备预防羊口疮病毒感染的药剂中的应用。

[0033] 本发明提供了一种预防羊口疮病毒感染的药剂的制备方法，包括以下步骤；将上述的重组乳酸乳球菌接种于GM17培养基中，在诱导肽的作用下培养12h，得到包含羊口疮病10
毒F1L蛋白的药剂。本发明使得所述药剂中的活菌数优选为1.2×10 CFU/mL。与大肠杆菌等表达系统相比，本发明所述乳酸菌表达系统具有不含内毒，安全性高，可以直接口服等优势，更加有利于羊口疮病毒的防控。

[0034] 本发明实施例中所应用的试剂和试材均为市售产品，如限制性内切酶Nco I、Sac I均购自NEB公司，Taq酶、dNTP、DNAMarker DL5000、Agarose Gel DNA Purification Kit、Mini BEST Plasmid Purification Kit购自大连宝生物公司；克隆载体pNZ8149由北京宝赛生物技术有限公司提供；乳链菌肽(Nisin)购自酷莱博生物技术有限公司。

[0035] 为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种羊口疮病毒免疫原性蛋白F1L及其重组乳酸乳球菌的构建方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0036] 实施例1羊口疮病毒F1L基因序列的获得

[0037] 通过GenBank获得羊口疮毒株F1L基因(GenBank：KX951408.1)序列信息，经生物信息学分析软件对F1L蛋白的二级结构进行分析，选取该蛋白免疫原性强的区域，避开蛋白的跨膜结构，确定最佳蛋白表达方案。基于乳酸乳球菌NZ3900特有的密码子偏好性对F1L表达片段进行分子设计，对序列进行密码子优化，优化后的序列见SEQ ID No.1，并将该序列送至南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因合成。

[0038] 实施例2表达羊口疮病毒F1L蛋白的重组乳酸乳球菌的制备

[0039] 以含有上述优化后F1L基因片段的pET28a‑F1L质粒为模板，进行PCR扩增。反应体系：2×PCR mix 25μL、引物F1L‑F和F1L‑R各2μL、模板2μL、ddH2O补足至50μL。反应条件为95℃2min，55℃30s，72℃1min，共36个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得了一条约650bp的特异性条带，与预期大小一致，结果如图1所示，通过胶回收试剂盒对该目的基因进行回收纯化。

[0040] 提取重组乳酸菌表达载体pNZ8149，通过Nco I和Sac I限制性内切酶双酶切后获得线性化的乳酸菌表达载体骨架，与同样经Nco I和Sac I限制性内切酶双酶切后的F1L基因片段通过T4连接酶连接，连接体系为10×T4 Buffer 2μL、T4连接酶2μL、骨架载体4μL、目的片段13μL，连接体系配制完成后，于16℃连接过夜。

[0041] 连接产物电转化至克隆宿主乳酸乳球菌NZ3900中，取10μL连接产物加入至100μL新鲜制备的NZ3900感受态细胞中，冰上孵育10min，转入预冷的电转杯中，擦干电转杯表面残留水分后放入电转仪中，设置参数为：2000KV，5ms，电击完成后迅速放至冰上，静置2min，加入1mL GM17培养基，复苏1h后，收集菌液，涂布于Elliker固体培养平板上，在30℃培养箱中培养36h，可见清晰的黄色菌落出现在平板上，即为疑似阳性克隆菌落。挑取菌落至GM17液体培养基中，30℃静置培养12h，将其作为模板对重组乳酸菌进行菌液PCR鉴定，反应体系如下：2×PCR mix 12.5μL、引物pNZ8149‑F和pNZ8149‑R各1μL、菌液模板1μL、ddH2O补足至25μL，反应条件为：95℃1min，55℃30s，72℃1min，共30个循环，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果如图2所示，其中1，3，4，5扩增到预期条带一致。

[0042] 琼脂糖凝胶电泳验证后，对正确的重组乳酸乳球菌进行扩繁，提取质粒并送至上海生工生物科技有限公司进行测序验证。重组质粒经基因测序后与插入的F1L基因片段进行序列比对，测序结果与预期相符，说明合成的F1L基因片段成功插入到重组乳酸菌表达载体pNZ8149中，重组质粒构建成功(见图3)，阳性质粒命名为pNZ8149‑F1L，阳性重组乳酸乳球菌命名为NZ3900/pNZ8149‑F1L。

[0043] 实施例3Western Blot检测NZ3900/pNZ8149‑F1L蛋白表达情况

[0044] 挑取阳性重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149‑F1L及乳酸乳球菌NZ3900，接种于GM17培养基中，培养至OD600值大约为0.3时，添加诱导肽nisin，继续培养12h后，得到表达F1L蛋白重组乳酸乳球菌。

[0045] 对得到的重组乳酸乳球菌4000rpm/min离心收集菌体，用PBS清洗两次以去除残留的培养基，再用含溶菌酶的PBS对菌体进行处理，得到包含羊口疮病毒F1L蛋白的液体。取上述蛋白适量，加入5×SDS buffer混合均匀，沸水煮8min。经12％SDS‑PAGE电泳后，通过转膜转印至PVDF膜上，用于后续Western Blot分析，转膜条件为：80V，80min，转膜后用0.2％明胶封闭2h，PBST洗涤3次后，用特异性标签Flag抗体(1：5000稀释)孵育，4℃过夜，次日用PBST洗涤3次后，用HRP标记的羊抗兔IgG(1：5000稀释)孵育1h，PBST洗涤3次后，再置于化学发光成像系统进行显影并拍照。

[0046] Western Blot结果表明，NZ3900乳酸菌中未检测到目的条带，而重组乳酸乳球菌NZ3900/pNZ8149‑F1L组可见大小约为33kD左右的特异性条带，如图4所示，说明F1L蛋白在乳酸乳球菌NZ3900中成功表达。

[0047] 实施例4重组乳酸乳球菌连续传代具有稳定性

[0048] 取构建的NZ3900/pNZ8149‑F1L重组乳酸乳球菌菌种，以5％的接种比例接入新鲜的不含抗生素的GM17培养基中，30℃培养12h，每传一次计1代，连续传代8次，取P2、P4、P6、P8代菌种为样品，通过WesternBlot检测F1L蛋白表达情况，结果如图5所示，P2、P4、P6、P8代菌种均检测到目的蛋白，说明乳酸菌表达载体的质粒稳定性良好，该重组乳酸乳球菌能稳定传代。

[0049] 实施例5活菌计数

[0050] 用平板表面散布法：

[0051] 1.编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10‑6、10‑7、10‑8稀释度各3套。另取8支盛‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7 ‑8有0.9mL无菌水的1.5mL离心管，依次标是10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 。

[0052] 2.稀释吸取0.1mL已充分混匀的乳酸乳球菌菌悬液(待测样品)，精确地放至10‑1的‑1离心管中，此即为10倍稀释；将10 试管置振荡器上振荡，使菌液充分混匀，且使用移液枪于‑1 ‑1
10 离心管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀；吸取10 菌液0.1mL，精确地‑2
放至10 离心管中，此即为100倍稀释，其余依次类推。

[0053] 3.取样分别吸取10‑4、10‑5和10‑6的稀释菌悬液各0.1mL，对号放入编好号的无菌平板中，每个平板放0.1mL。

[0054] 4.倒平板配置GM17固体培养基，待高压灭菌后，应尽快倒入培养平板中。待培养基凝固后，加入上述不同稀释度菌液100μL，使用无菌涂布器涂布均匀，再将平板倒置于30℃恒温培养箱中培养。

[0055] 5.计数培养48h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位(CFU)＝同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×10。

[0056] 采用平板计数法对表达羊口疮病毒F1L蛋白的重组乳酸乳球菌的活菌数进行计10
数，测得该菌种在发酵12h后，活菌数可达1.2×10 CFU/mL。

[0057] 由此可见，本发明根据乳酸乳球菌NZ3900特有的密码子偏好性进行核酸分子设计，将羊口疮病毒F1L基因进行密码子优化，最终获得能够稳定表达羊口疮病毒F1L蛋白的重组乳酸乳球菌，为羊口疮病毒的预防和进一步研究奠定了基础。

[0058] 尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。