组合物、佐剂、疫苗及其应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202311286879.6 | 申请日 | 2023-10-07 |
| 公开(公告)号 | CN119770639A | 公开(公告)日 | 2025-04-08 |
| 申请人 | 长春百克生物科技股份公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 张春; 崔海城; 张海平; 周慧明; 闫昆明; 臧阳; 汤鑫; | 第一发明人 | 张春 |
| 权利人 | 长春百克生物科技股份公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 长春百克生物科技股份公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：吉林省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：吉林省长春市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：吉林省长春市高新开发区火炬路1260号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：130000 |
| 主IPC国际分类 | A61K39/39 | 所有IPC国际分类 | A61K39/39 ; A61K47/02 ; A61K47/12 ; A61K47/32 ; A61K47/34 ; A61K39/145 ; A61K39/12 ; A61P37/04 ; A61P31/16 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京集佳知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 赵青朵; |
| 摘要 | 本 发明 涉及 生物 疫苗 领域，尤其涉及组合物、佐剂、疫苗及其应用。本发明提供了组合物，包括： 角 鲨烷和角鲨烯，所述角鲨烷和所述角鲨烯的 质量 比为：(1～10):(10～1)。本发明提供的新型 纳米乳 佐剂成本低、 稳定性 及安全性好、与流感 抗原 联合应用，能有效增强疫苗的免疫反应。可作为流感疫苗、人 乳头 瘤病毒疫苗、狂犬疫苗等多种疫苗的候选佐剂。 | ||
| 权利要求 | 1.组合物，其特征在于，包括：角鲨烷和角鲨烯，所述角鲨烷和所述角鲨烯的质量比为： |
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| 说明书全文 | 组合物、佐剂、疫苗及其应用技术领域背景技术[0002] 疫苗无疑是人类历史上最引人注目的健康成就之一。 [0003] 随着现代生物技术的迅速发展，新的疫苗抗原纯度高，相对分子量小，疫苗的不良反应低，然而这些抗原的免疫原性普遍较弱，无法诱导足够的免疫保护。因此，通常需要与佐剂配伍使用。佐剂可有效增强机体对抗原的特异性免疫应答，影响免疫反应类型，加快免疫响应速度，减少抗原接种剂量以及疫苗接种次数等。 [0004] 目前，应用最广泛的佐剂仍然是铝佐剂，包括氢氧化铝、磷酸铝等。自1926年Glenny首次使用铝盐粘附白喉类毒素以来，铝佐剂已被用作美国和欧洲多种疫苗的疫苗佐剂，同时积累了令人印象深刻的安全记录，几十年来已接种了数十亿剂。它可以触发强大的体液免疫反应(即抗体产生)，但铝佐剂也存在许多不足，例如对增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性作用不大，而这些活性对于保护免受各种病原体以及对异源流感病毒的交叉反应等至关重要；不同批次之间产品差异较大，质量难以控制；会引起局部不良反应，形成肉芽肿，甚至发生局部无菌性脓肿。 [0005] 目前，已被批准用于人体的流感疫苗佐剂，除铝佐剂外，还有MF59、AS03和AF03。MF59最初是作为抗原递送缓冲液开发的，并首先结合抗原和免疫增强剂MTP‑PE进行测试，而令人惊讶的是，MF59本身就有良好的佐剂活性。含有MF59佐剂的季节性流感疫苗(Fluad)于1997年首次获准用于意大利老年人，随后陆续获得其他国家、欧洲EMA和美国FDA的批准。 除季节性流感疫苗外，其也被普遍应用于流感大流行疫苗中，如2020年美国FDA批准的针对H5N1流感病毒的Audenz疫苗等。它的所有成分都是可生物降解的天然衍生物，安全且耐受性好。此外，通常采用微流化法进行制备。该方法是将Span85分散在角鲨烯相，将另一种表面活性剂Tween80分散在水相中，然后通过匀浆以形成粗乳液。制备的粗乳液反复通过高压均质器以产生均匀的油滴尺寸约160nm的乳液，将其无菌过滤可供临床使用。 [0006] AS03是一种角鲨烯水包油乳液佐剂，它的成分与MF59相似，只是外加了α‑生育酚(维生素E)，一种细胞因子分泌增强剂和先天免疫正调节剂。AS03已获批用于大流行性流感疫苗。尽管AS03诱导免疫的分子机制尚未完全公开，但已知它具有剂量节省效应。就流感疫苗而言，AS03佐剂疫苗比其他基于角鲨烯的佐剂疫苗需要更低的抗原载量。然而，在2009～2010年甲型H1N1流行期间，欧洲多个国家报告疫苗Pandemrix接种者出现神经系统不良反应，在4‑19岁年龄人群，主要表现为嗜睡和睡眠过度，后期从市场撤销，但是一项回顾性研究表明，Pandemrix伴有发作性睡病风险增加和多发性硬化症可能与AS03无关。 [0007] AF03佐剂是一种含有角鲨烯、聚氧乙烯鲸蜡硬脂醚、甘露醇和山梨糖醇油酸酯的水包油乳液。值得注意的是，它并非采用常用的微流化，而是通过相转化温度法进行制备。AF03佐剂被包括到流感大流行疫苗中，但该疫苗从未上市。它的缺点在于制备工艺复杂，质量较难控制。 [0008] 对于已应用于上市疫苗的MF59佐剂，它的油相成分为角鲨烯，是一种天然的生物可降解油，植物、动物和人类均含此类物质。于人类，鲨烯是甾类激素生物合成过程的中间产物，也是胆固醇合成的前体。此外，由于其增强稳定性和生物相容性的特性，目前被用于许多疫苗和药物递送乳液中。它的氢化形式为角鲨烷，也是一种天然产物，在人体皮脂腺中有少量的分泌。鲨烷可由鲨烯氢化制备，已被广泛用于化妆品中，并作为亲脂性药物的载体。角鲨烯和角鲨烷均可被代谢，在毒理学研究方面有良好的记录，而角鲨烷是饱和碳氢化合物，化学性质更为稳定，也更受欢迎。 发明内容[0009] 有鉴于此，本发明提供了组合物、佐剂、疫苗及其应用。 [0010] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案： [0011] 本发明提供了组合物，包括：角鲨烷和角鲨烯，所述角鲨烷和所述角鲨烯的质量比为：(1～10):(10～1)。 [0012] 在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述角鲨烷和所述角鲨烯的质量比为：(1～7):(7～1)。 [0013] 在本发明的一些实施方案中，上述组合物中，所述角鲨烷和所述角鲨烯的质量比为：1:3、1:1、3:1、1:7和/或7:1。 [0014] 本发明还提供了上述组合物在制备佐剂中的应用。 [0015] 本发明还提供了佐剂，包括上述组合物、缓冲体系和表面活性剂。 [0016] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂中，所述组合物的含量占所述佐剂的总体积小于等于10％(m/v)；所述乳化剂的的含量占所述佐剂的总体积的0.3～3％(m/v)。 [0017] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂中，所述组合物的含量占所述佐剂的总体积的3～5％(m/v)。 [0018] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂中，所述组合物的含量占所述佐剂的总体积的3.9％(m/v)。 [0019] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂中，所述乳化剂的的含量占所述佐剂的总体积的0.47％(m/v)。 [0021] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂中，所述缓冲体系的pH值为5.0～8.5。 [0022] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂中，所述缓冲体系的pH值为6.0～8.0。 [0023] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂中，所述缓冲体系的pH值为6.0～7.5。 [0024] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂中，所述缓冲体系包括：柠檬酸钠缓冲液。 [0025] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂，所述表面活性剂包括：Pluronic L121、甘露醇一油酸、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯、山梨醇酐三油酸酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯、三甘醇单月桂基醚、聚乙二醇十六烷基醚和/或聚乙二醇辛基苯基醚中的一种或多种。 [0026] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂，所述表面活性剂包括：聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯和山梨醇酐三油酸酯。 [0027] 本发明还提供了上述佐剂的制备方法，取所述组合物、所述缓冲体系和所述表面活性剂混合，匀浆、乳化后，获得所述佐剂。 [0028] 在本发明的一些实施方案中，上述佐剂的制备方法包括如下步骤： [0029] S1：取所述山梨醇酐三油酸酯分散于所述角鲨烯和所述角鲨烷中，获得油相； [0030] S2：取所述聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯和所述柠檬酸钠缓冲液混合，获得水相； [0031] S3：取所述油相和所述水相混合、匀浆、乳化、过滤后，获得所述佐剂。 [0032] 本发明还提供了上述组合物、上述佐剂和/或上述制备方法获得的佐剂在如下任意项中的应用； [0033] (I)、制备疫苗；和/或 [0034] (II)、制备药物递送载体；和/或 [0035] (III)、制备药物缓控释载体。 [0037] 在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述疫苗的抗原包括：流感病毒。 [0038] 在本发明的一些实施方案中，上述应用中，所述疫苗的抗原的含量不超过1％(m/v)。 [0039] 本发明还提供了疫苗，包括上述组合物、上述佐剂和/或上述制备方法获得的佐剂。 [0040] 在本发明的一些实施方案中，上述疫苗包括：灭活疫苗、减活疫苗、裂解疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等不同疫苗的佐剂，包括但不限于流感疫苗、人乳头瘤状病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗和/或脊髓灰质炎疫苗中的一种或多种。 [0041] 在本发明的一些实施方案中，上述疫苗的给药方式包括：肠道外注射给药、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、经呼吸道吸入、直肠给药、阴道给药、经鼻给药、经口给药、经眼给药、局部给药、透皮和/或皮内给药中的一种或多种。 [0042] 本发明提供了组合物，包括：角鲨烷和角鲨烯，所述角鲨烷和所述角鲨烯的质量比为：(1～10):(10～1)。 [0045] 图1示实施例2的表征结果，其中A和B分别为ZSE‑12.5的粒径、Zeta电位表征图； [0046] 图2示实施例2的表征结果，其中A和B分别为ZSE‑25的粒径、Zeta电位表征图； [0047] 图3示实施例2的表征结果，其中A和B分别为ZSE‑50的粒径、Zeta电位表征图； [0048] 图4示实施例2的表征结果，其中A和B分别为ZSE‑75的粒径、Zeta电位表征图； [0049] 图5示实施例2的表征结果，其中A和B分别为ZSE‑87.5的粒径、Zeta电位表征图； [0050] 图6示实施例2的表征结果，其中A和B分别为ZSE‑100的粒径、Zeta电位表征图； [0051] 图7示实施例3的稳定性结果，其中A、B、C分别为ZSE‑12.5的粒径、PDI、Zeta电位的结果； [0052] 图8示实施例3的稳定性结果，其中A、B、C分别为ZSE‑25的粒径、PDI、Zeta电位的结果； [0053] 图9示实施例3的稳定性结果，其中A、B、C分别为ZSE‑50的粒径、PDI、Zeta电位的结果； [0054] 图10示实施例3的稳定性结果，其中A、B、C分别为ZSE‑75的粒径、PDI、Zeta电位的结果； [0055] 图11示实施例3的稳定性结果，其中A、B、C分别为ZSE‑87.5的粒径、PDI、Zeta电位的结果； [0056] 图12示实施例3的稳定性结果，其中A、B、C分别为ZSE‑100的粒径、PDI、Zeta电位的结果； [0057] 图13示本发明实施例4中，接种新型纳米乳联合单价B/Victoria流感疫苗后的体重、体温的变化情况；其中：A为体温的测定结果，B、C为体重的测定结果； [0058] 图14示本发明实施例4中，新型纳米乳联合单价B/Victoria流感疫苗诱发的血清抗原特异性IgG水平；其中：A、B、C分别为一免后1周、二免后2周及二免后4周的结果；IgG效价展示为GMT±SD； [0059] 图15示本发明实施例4中，新型纳米乳联合单价B/Victoria流感疫苗诱发的IgG分型抗体水平；其中：A为二免后2周血清IgG2c的结果，B为二免后2周血清IgG1的结果图，C为二免后2周血清IgG2c/IgG1的比值结果；IgG分型抗体效价展示为GMT±SD；使用One‑way ANOVA进行统计比较； [0060] 图16示本发明实施例4中，新型纳米乳联合单价B/Victoria流感疫苗诱发的HI水平；其中：A、B、C、D分别为一免后2周、二免后2周、二免后4周及二免后8周的HI水平；HI效价展示为GMT±SD；使用One‑way ANOVA进行统计比较；*，P＜0.05；**，P＜0.01，***,P＜0.001，****，P＜0.0001。 具体实施方式[0061] 本发明公开了组合物、佐剂、疫苗及其应用。 [0062] 应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。 [0063] 术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。 [0064] 应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。 [0065] 本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。 [0066] 此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。 [0067] 本发明的新型纳米乳佐剂主要由水相成分、油相成分及乳化剂组成，所有组分按比例混合后经匀浆、高压均质的方式进行乳化，可形成颗粒均一稳定的乳状悬液。 [0068] 优选的，本发明所述纳米乳中，其水相成分为pH缓冲体系，它选自但不限于磷酸盐缓冲液(PBS)、磷酸(PB)缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸钠缓冲液等。特别优选的，本发明所述的纳米乳，其水相成分由柠檬酸钠缓冲液构成。水相成分的pH值控制在人体可耐受的范围内，优选的，其范围在pH 5.0～8.5，更优选的为pH 6.0～8.0，特别优选的为pH6.0～7.5。 [0069] 优选的，本发明所述的纳米乳，其乳化剂为表面活性剂的组合物，选自但不限于Pluronic L121、甘露醇一油酸、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯(吐温80/聚山梨酯80/Tween‑80)、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸酯(吐温20/Tween‑20)、山梨醇酐三油酸酯(斯盘85/Span‑85)、失水山梨糖醇脂肪酸酯(斯盘80/Span‑80)、三甘醇单月桂基醚(布里杰30/Brij30)、聚乙二醇十六烷基醚(布里杰56/Brij56)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X‑100)等；更优选的，所述乳化剂为Tween‑80及Span‑85的组合物，且所述乳化剂含量占乳剂总体积的0.01％～10％(m/v)；优选的，所述乳化剂的含量占乳剂总体积的0.3％～3％(m/v)；特别优选的，所述乳化剂中Tween‑80的含量及Span‑85的含量均为乳剂总体积的0.47％(m/v)。 [0070] 优选的，本发明所述的纳米乳，其油相成分为可代谢油，选自但不限于角鲨烯、角鲨烷等；特别优选的，本发明所述的纳米乳其油相成分为角鲨烷、不同质量比相混的角鲨烷和角鲨烯混油。油含量不超过乳剂总体积的10％(m/v)，优选的为乳剂总体积的3％～5％(m/v)，特别优选的，其含量为3.9％(m/v)。 [0071] 优选的，本发明所述纳米乳的角鲨烷和角鲨烯混油中，角鲨烷和角鲨烯的质量比介于1:7～7:1之间，特别优选的，角鲨烷和角鲨烯的质量比为1:3、1:1和3:1。 [0072] 制备新型纳米乳佐剂的方法是本领域技术人员公知的微流化法。具体的，将Span85分散在角鲨烷或已不同质量比相混的角鲨烷/角鲨烯混油中得到油相，再将另一种表面活性剂Tween80分散在柠檬酸钠缓冲液中得到水相，然后通过匀浆以形成粗乳液。制备的粗乳液反复通过高压均质器，直至获得包含所需直径油滴的均一乳剂，后经0.22μm滤膜过滤。本发明所述的水包油乳剂中，包含的油滴具有亚微米级的直径，其平均直径小于1μm；优选的，油滴直径小于500nm；更优选的，小于220nm；特别优选的，其直径范围在140～180nm之间。 [0073] 本发明所述的油相成分全部为角鲨烷的纳米乳佐剂简称为ZSE‑100；油相成分中角鲨烷和角鲨烯质量比为1:7的纳米乳佐剂简称为ZSE‑12.5；1:3的纳米乳佐剂简称为ZSE‑25；油相成分中角鲨烷和角鲨烯质量比为1:1的纳米乳佐剂简称为ZSE‑50；油相成分中角鲨烷和角鲨烯质量比为3:1的纳米乳佐剂简称为ZSE‑75；7:1的纳米乳佐剂简称为ZSE‑87.5。 [0074] 本发明所述的一系列新型纳米乳佐剂还可联合抗原得到免疫组合物，抗原的用量为常规，优选不超过1％(m/v)。 [0075] 优选的，所述免疫组合物的抗原为病毒抗原，可选自但不限于流感病毒、人乳头瘤病毒、狂犬病毒、乙型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷病毒等病毒的不同形式抗原。特别优选的，本发明所述的免疫组合物的抗原为流感病毒抗原。 [0076] 优选的，本发明所述的免疫组合物可在临用时佐剂与抗原混合或抗原在生产时，佐剂抗原混合，灌封，供临床使用。特别优选的，所述的纳米乳佐剂与抗原现用现配，后于4℃下储存待用。 [0077] 本发明所述的佐剂ZSE‑25联合流感抗原后简称为HA/ZSE‑25；佐剂ZSE‑50联合流感抗原后简称为HA/ZSE‑50；佐剂ZSE‑75联合流感抗原后简称为HA/ZSE‑75；佐剂ZSE‑100联合流感抗原后简称为HA/ZSE‑100。 [0078] 本发明所用试剂和原料均市售可得，且成本低。 [0079] 特别地，本发明的一系列新型纳米乳佐剂外观均呈均一乳白色液体；平均粒径分布在140～170nm之间，与已应用于上市疫苗的MF59的粒径相近；Zeta电位在‑20～‑35mV之间；多分散性指数PDI小于0.2，表明乳液有良好的均一性；粘度均接近于水的粘度，表明所述的乳液易注射；pH在人体可耐受的范围内。 [0080] 本发明的一系列新型纳米乳佐剂稳定性良好，在2℃～8℃下均可长期保存至少1年。 [0082] 本专利发明的一系列新型纳米乳佐剂与单价流感B/Victoria抗原联合后，均可有效提高疫苗的免疫原性。其中，ZSE‑75的佐剂效果尤为明显，其次是ZSE‑50。此外，HA/ZSE‑100和HA/ZSE‑50有着Th1免疫偏向；HA/ZSE‑75、HA/ZMF59、HA/ZSE‑25更偏向体液免疫，然而，相较于ZMF59，HA/ZSE‑75的Th1型免疫有所改善。 [0083] 本发明提供多种应用方法，包括但不限于：(1)独立包装，临用前与疫苗抗原混匀后使用；(2)组合包装，与疫苗抗原混匀后，灌封，贮藏于2～8℃，直至临床使用。 [0084] 本发明所述的新型纳米乳佐剂及免疫组合物可采用人体可接受的形式进行接种，接种部位包括但不限于肠道外注射给药、肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射、经呼吸道吸入、直肠给药、阴道给药、经鼻给药、经口给药、经眼给药、局部给药、透皮或皮内给药等。 [0085] 本发明的一些列新型纳米乳佐剂，可作为灭活疫苗、减活疫苗、裂解疫苗、DNA疫苗、重组疫苗、亚单位疫苗、多肽蛋白疫苗等不同疫苗的佐剂，包括但不限于流感疫苗、人乳头瘤状病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、狂犬疫苗、脊髓灰质炎疫苗等。 [0086] 本发明所述的新型纳米乳剂还可作为药物递送或缓控释载体的用途。 [0087] 本发明实施例1～实施例4中，所用原料及试剂均可由市场购得。 [0088] 下面结合实施例，进一步阐述本发明： [0089] 实施例1新型纳米乳佐剂的制备 [0090] 1、ZSE‑12.5的制备 [0091] (1)油相的制备：使用精密天平准确称取0.141g Span85、0.1463g角鲨烷和1.0237g角鲨烯制备油相混合液。 [0092] (2)水相的制备：用精密天平准确称取0.141g Tween80完全溶解于28.356mL的柠檬酸缓冲液中。 [0093] (3)初乳的制备：将水相和油相相混，混合液于匀浆机中匀浆5分钟得到初乳。 [0094] (4)乳剂的制备：将初乳反复通过高压均质器，直至获得包含所需直径油滴的均一乳剂。 [0095] (5)无菌化处理：使用0.22μm滤膜过滤，即得ZSE‑12.5。 [0096] 2、ZSE‑25的制备 [0097] (1)油相的制备：使用精密天平准确称取0.141g Span85、0.2925g角鲨烷和0.8775g角鲨烯制备油相混合液。 [0098] (2)水相的制备：用精密天平准确称取0.141g Tween80完全溶解于28.356mL的柠檬酸缓冲液中。 [0099] (3)初乳的制备：将水相和油相相混，混合液于匀浆机中匀浆5分钟得到初乳。 [0100] (4)乳剂的制备：将初乳反复通过高压均质器，直至获得包含所需直径油滴的均一乳剂。 [0101] (5)无菌化处理：使用0.22μm滤膜过滤，即得ZSE‑25。 [0102] 3、ZSE‑50的制备 [0103] (1)油相的制备：使用精密天平准确称取0.141g Span85、0.585g角鲨烯和0.585g角鲨烷制备油相混合液。 [0104] (2)(3)(4)(5)步骤与ZSE‑25一致。 [0105] 4、ZSE‑75的制备 [0106] (1)油相的制备：使用精密天平准确称取0.141g Span85、0.8775g角鲨烷和0.2925g角鲨烯制备油相混合液。 [0107] (2)(3)(4)(5)步骤与ZSE‑25一致。 [0108] 5、ZSE‑87.5的制备 [0109] (1)油相的制备：使用精密天平准确称取0.141g Span85、1.0237g角鲨烷和0.1463g角鲨烯制备油相混合液。 [0110] (2)(3)(4)(5)步骤与ZSE‑25一致。 [0111] 6、ZSE‑100的制备 [0112] (1)油相的制备：使用精密天平准确称取0.141g Span85和1.17g角鲨烷制备角鲨烷/Span85混合液。 [0113] (2)(3)(4)(5)步骤与ZSE‑25一致。 [0114] 实施例2新型纳米乳佐剂的表征 [0115] 将实施例1制备的6款新型纳米乳佐剂进行表征，表征的内容包括外观、粒径、Zeta电位、多分散性指数PDI、粘度及pH。乳剂用柠檬酸钠缓冲溶液进行1:20稀释，取1mL稀释后的样本转移至粒径杯中，使用马尔文粒径仪进行粒径和多分散系数(PDI)检测；新型纳米乳佐剂用1mM氯化钠溶液进行1:200稀释，取1mL稀释后的样本转移至电位杯中进行Zeta电位检测；采用DV3T流变仪进行粘度检测；使用pH计对纳米乳的pH进行测定。表征结果如下表1所示： [0116] 表1新型纳米乳佐剂的表征(值以平均值±标准差表示，n＝3) [0117] [0118] 实施例3新型纳米乳佐剂稳定性的考察 [0119] 将实施例1制备的6款新型纳米乳佐剂于2～8℃下储存并进行稳定性考察，考察的内容包括外观、粒径、Zeta电位、多分散性指数PDI、粘度及pH，测定方法如实施例2。结果见表2、3、4、5、6、7。结果表明，本发明的一系列新型纳米乳佐剂在2～8℃下放置至少1年，外观均呈均一乳白色液体，无变色分层现象；pH均一直处于人体可耐受的范围内6‑7之间；粘度均一直接近于水的粘度。此外，ZSE‑12.5的粒径大小稳定在150nm左右，PDI稳定在0.1左右，Zeta电位一直处于‑20～‑35mV之间；ZSE‑25的粒径大小稳定在150nm左右，PDI稳定在0.1左右，Zeta电位一直处于‑20～‑35mV之间；ZSE‑50的粒径大小稳定在155nm左右，PDI稳定在0.1左右，Zeta电位一直处于‑20～‑35mV之间；ZSE‑75的粒径大小稳定在160nm左右，PDI稳定在0.1左右，Zeta电位一直处于‑20～‑35mV之间；ZSE‑87.5的粒径大小稳定在170nm左右，PDI稳定在0.1左右，Zeta电位一直处于‑20～‑35mV之间；ZSE‑100的粒径大小稳定在170nm左右，PDI一直小于0.2，Zeta电位一直处于‑20～‑35mV之间。 [0120] 表2新型纳米乳佐剂ZSE‑12.5长期稳定性的表征(值以平均值±标准差表示，n＝3) [0121]Time(months) Z‑average(nm) Pdl Zeta(mV) 0 148.7±2.652 0.098±0.012 ‑23.1±1.67 1 146.2±3.05 0.125±0.015 ‑22.7±0.389 4.5 146.9±2.95 0.127±0.026 ‑26.96±0.63 6.5 149.3±0.765 0.117±0.013 ‑25.2±0.829 8 148.1±1.04 0.109±0.016 ‑24.5±0.72 9 148±2.86 0.105±0.012 ‑25.8±0.12 13 150.1±2.588 0.103±0.008 ‑30.0±0.818 16 148.93±1.72 0.114±0.016 ‑26.73±0.472 [0122] 表3新型纳米乳佐剂ZSE‑25长期稳定性的表征(值以平均值±标准差表示，n＝3)[0123]Time(months) Z‑average(nm) Pdl Zeta(mV) 0 151.7±2.702 0.104±0.01 ‑24.1±1.07 3 149.9±1.56 0.096±0.025 ‑29.5±0.638 5 149.6±2.43 0.085±0.017 ‑28.9±2.53 6.5 152.1±5.72 0.109±0.027 ‑25.8±0.22 8 153.1±2.28 0.106±0.028 ‑23.4±0.33 11 149.7±1.53 0.101±0.025 ‑28.3±2.08 14 149.2±0.98 0.0825±0.022 ‑30.6375±2.14 [0124] 表4新型纳米乳佐剂ZSE‑50长期稳定性的表征(值以平均值±标准差表示，n＝3)[0125] Time(months) Z‑average(nm) Pdl Zeta(mV)0 160.8±0.9074 0.131±0.023 ‑21.8±0.451 4 154.3±1.14 0.098±0.014 ‑26.9±1.41 6 155.47125±0.67 0.101±0.020 ‑27.3±1.10 7 154.2±1.95 0.069±0.021 ‑29±1.00 8.5 156.2±3.55 0.072±0.017 ‑27.4±3.27 12 156.1±2.35 0.099±0.035 ‑28.4±2.40 15 155.7±0.65 0.102±0.018 ‑26.9±3.56 [0126] 表5新型纳米乳佐剂ZSE‑75长期稳定性的表征(值以平均值±标准差表示，n＝3)[0127] Time(months) Z‑average(nm) Pdl Zeta(mV)0 166.6±2.684 0.144±0.009 ‑23.0±3.63 3 157±1.96 0.1±0.007 ‑29±0.86 5 156.9±1.87 0.093±0.017 ‑28.5±1.20 7 157.6±4.10 0.074±0.014 ‑29.3±2.43 8 159±1.023 0.088±0.025 ‑26.6±2.77 12 160.9±3.43 0.117±0.021 ‑28.3±0.80 15 156.7±1.27 0.074±0.018 ‑28.6±1.81 [0128] 表6新型纳米乳佐剂ZSE‑87.5长期稳定性的表征(值以平均值±标准差表示，n＝3) [0129] [0130] [0131] 表7新型纳米乳佐剂ZSE‑100长期稳定性的表征(值以平均值±标准差表示，n＝3)[0132] Time(months) Z‑average(nm) Pdl Zeta(mV)0 168.1±2.639 0.123±0.019 ‑23.4±0.987 1 166.2±3.15 0.115±0.017 ‑23.7±0.379 4.5 166.9±2.91 0.137±0.026 ‑26.96±0.52 6.5 166.3±0.755 0.107±0.012 ‑29.2±0.819 8 181.1±1.04 0.199±0.015 ‑28.5±1.72 9 168±2.86 0.109±0.014 ‑27.8±0.1 13 165.1±2.587 0.113±0.004 ‑30.1±0.808 16 168.93±1.71 0.154±0.017 ‑25.73±0.462 [0133] 实施例4新型纳米乳佐剂联合单价B/Victoria流感疫苗的体内评估 [0134] 1、动物的分组、免疫与取血流程 [0135] C57BL/6小鼠(45只)；SPF级；19‑21周龄；雌性；体重22‑24g。实验随机分为9组，每组5只。该免疫实验小鼠的具体分组及剂量如表8所示。按表8进行疫苗配制，其中抗原HA为单价裂解B型维多利亚蛋白。在0、14天采取肌肉注射的方式对C57BL/6小鼠进行免疫，每只左右腿各50μL，共100μL。于一免后1周、一免后2周、二免后1周、二免后2周、二免后4周及二免后8周分别对小鼠进行脸颊取血，分离血清。注：ZMF59及单价裂解B型维多利亚蛋白均由长春百克生物科技股份公司自制。 [0136] 表8新型纳米乳佐剂联合单价B/Victoria流感疫苗免疫实验小鼠分组及疫苗配制[0137] [0138] [0139] 小鼠饲养和上述实验流程均按照动物伦理审查要求进行。 [0140] 1、安全性评价 [0141] 表9为疫苗接种1～4h后小鼠腹部温度变化情况。结果表明，小鼠体温均在合理波动范围内，说明接种不同新型纳米乳流感佐剂疫苗不会对小鼠体温造成影响。 [0142] 表9疫苗接种1～4h后小鼠腹部温度变化情况 [0143] 表10可以看出，与对照组ZMF59相比，ZSE‑100组小鼠在二免后1周体重略有下降，但在二免后3周体重有所回升。与对照组HA/ZMF59相比，HA/ZSE‑50与ZSE‑87.5组小鼠在一免后2周体重略有下降，但在一免后3周体重有所回升。值得注意的是，在所有组中，HA/ZSE‑75组小鼠体重升降趋势与PBS组一致。以上结果表明，新型纳米乳联合单价B/Victoria流感疫苗免疫小鼠后对小鼠体重的影响是一过性的，不会对小鼠的正常生长产生显著影响。 [0144] 表10疫苗接种1‑6周小鼠体重变化情况 [0145] [0146] [0147] 2、抗原特异性抗体IgG评价 [0148] 采用间接ELISA法检测小鼠血清中抗原特异性IgG滴度，结果如表11所示。在所有检测时间点，6款新型纳米乳佐剂流感疫苗组均高于单独的抗原组，均可提高疫苗诱发的特异性IgG水平，表明它们有着良好的佐剂效果。在一免后1周，HA/ZSE‑75和HA/ZSE‑50组略高于HA/ZMF59组，表明ZSE‑75和ZSE‑50较ZMF59引起更快速的免疫响应。在所有检测点，HA/ZSE‑75的抗体水平一直最高，尤其在二免后2周，一骑绝尘，比其他所有组均高，且在统计学上有着极其显著性差异。此外，还值得注意的是，在一免后2周、二免后2周，HA/ZSE‑50的IgG水平与HA/ZMF59相当，而在二免后4周，HA/ZSE‑50的IgG水平比HA/ZMF59略高，但并没有统计学差异。值得注意的是，HA/ZSE‑12.5的抗体滴度接近于MF59，HA/ZSE‑87.5的抗体滴度接近于ZSE‑100，且两者均劣于HA/ZSE‑75和HA/ZSE‑50。 [0149] 表11疫苗接种后不同时间点所产生的抗原特异性抗体滴度 [0150] [0151] [0152] 3、IgG分型抗体评价 [0153] 疫苗佐剂通常会改变机体Th1/Th2型免疫偏向，进而引起抗体的亚型变化。在小鼠中，Th2型反应通常与IgG1抗体有关，而Th1型反应则与IgG2a、IgG2b和IgG2c抗体有关。对于近交系小鼠C57BL/6小鼠，由于IgG2a基因型的缺失，因此需要通过检测小鼠血清中IgG2c亚型来反映小鼠的Th1型反应。本部分实验采用间接ELISA法检测二疫后2周小鼠血清中分型抗体滴度，结果如表12所示。 [0154] 表12疫苗接种后2周所产生的抗原特异性IgG抗体分型滴度 [0155] IgG1 IgG2c IgG2C/IgG1PBS 0 200±0 ZMF59 0 400±244.949 ZSE‑100 0 480±178.885 HA 92340±73705.549 53460±26619.316 0.73±0.365 HA/ZMF59 831060±663349.943 393660±239573.847 0.6±0.365 HA/ZSE‑100 831060±663349.944 743580±71872.54 1.4±1.461 HA/ZSE‑25 918540±586833.68 481140±239573.8467 0.6±0.365 HA/ZSE‑50 568620±195611.227 568620±195611.227 1.27±1.011 HA/ZSE‑75 1180980±718721.54 831060±663349.944 0.822±0.398 [0156] 不论IgG1还是IgG2c，HA/ZSE‑75的抗体水平均高于其他组。根据IgG2c与IgG1比值，HA/ZSE‑100、HA/ZSE‑50组更偏向Th1型免疫。HA/ZSE‑75、HA/ZMF59、HA/ZSE‑25更偏向Th2型免疫。只是相较于HA/ZMF59，HA/ZSE75的Th1型免疫有所改善。 [0157] 4、血凝抑制滴度(HI)评估 [0158] 目前，国际公认HI是流感疫苗抗体检测的金标准，因此，本部分实验采用血凝抑制试验对血清中的抗HA抗体水平进行检测。结果见表13。与抗原特异性IgG结果一致，在所有检测时间点，4款新型纳米乳佐剂流感疫苗组均高于单独的抗原组，再次说明它们有良好的佐剂效果；在一免后1周，HA/ZSE‑75的HI滴度最高，其次是ZSE‑50，且高于HA/ZMF59，虽然没有统计学差异，但也再次说明它们较ZMF59有更快速的免疫响应。二免后2周，HA/ZMF59组的HI水平最高，同时略高于HA/ZSE‑50、HA/ZSE‑75组，但没有统计学差异。值得注意的是，除HA/ZMF59组与单独的抗原HA组有着极其显著差异外，HA/ZSE‑50组与HA组也有着极其显著差异，HA+ZSE‑75也与HA组有极显著性差异。二免后4周、二免后8周，HA/ZMF59的HI滴度仍最高，但与其他组并没有统计学差异，包括单独的抗原HA组。 [0159] 表13疫苗接种后不同时间点所产生的HI滴度 [0160]时间 一免后2周 二免后2周 二免后4周 二免后8周 PBS 0 0 0 0 ZMF59 0 0 0 0 ZSE‑100 0 0 0 0 HA 56±21.909 256±87.636 128±43.818 26±31.305 HA/ZMF59 352±175.271 2304±572.433 1024±943.864 132±116.276 HA/ZSE‑100 256±87.636 1152±286.217 512±175.271 64±21.909 HA/ZSE‑25 448±175.271 1024±858.650 512±175.271 112±117.983 HA/ZSE‑50 576±143.108 2048±701.085 832±429.325 104±121.984 HA/ZSE‑75 576±417.229 1792±701.085 960±905.097 80±48.990 [0161] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。 |
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