[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种海水养殖鱼类用环状mRNA疫苗及其制备方法和应用。

[0002] 鱼类神经坏死病毒（NervoTs Necrosis VirTs，NNV）是一类对全球水产养殖业造成重大经济损失的高致病性RNA病毒。由NNV病毒感染而导致的病毒性神经坏死症（Viral nervoTs necrosis，VNN）属于二类传染病，对仔鱼和幼鱼的致死率极高，严重者在一周内死亡率可达100%，且近年受感染的鱼类种类和受危害程度迅速增加。NNV病毒属于B诺达病毒属（BetanodavirTs）、诺达病毒科（Nodaviridae），20世纪80年代在澳大利亚被首次鉴定。这种病毒的粒子具有无包膜的二十面体形态，大约25纳米大小，由两条正义单链RNA构成其遗传信息，一条是2970碱基对的RNA1，另一条是1440碱基对的RNA2，且这些RNA分子在3'端缺乏poly（A）尾巴。尽管NNV病毒被发现已有很长时间，但防治鱼类病毒性神经坏死症的策略仍然充满挑战。虽然理论上可以通过选择未感染病毒的亲鱼来阻止病毒的垂直传播，但受限于当前检测手段的不足，很难保证所选亲鱼完全摆脱了病毒的感染。此外，尽管臭氧和碘消毒剂的使用有助于降低病毒通过水平途径的传播，但由于病毒可能同时存在于鱼卵的表面及其内部卵膜中，仅进行表面消毒并不足以完全防止病毒的传播。

[0003] 疫苗接种是预防和控制病毒性疾病的关键策略。尽管通过注射重组疫苗在大规格苗种或成体中能实现一定的免疫保护，但NNV主要感染稚苗期，此时鱼苗的特异性免疫系统尚未完全成熟，难以通过传统免疫方法进行有效防控。近年来，环状RNA（circRNA）疫苗技术作为一种创新的疫苗开发方法受到了广泛关注。环状mRNA疫苗具有显著的稳定性，能够在体内产生更高水平、更持久的抗原。与mRNA疫苗相比，环状mRNA疫苗诱导机体产生的中和抗体比例更高，能更有效地对抗病毒变异，降低疫苗潜在的抗体依赖增强症（ADE）副作用。此外，环状mRNA疫苗诱导产生的IgG2/IgG1比例更高，表明其主要诱导产生Th1型保护性T细胞免疫反应，有效降低潜在的疫苗相关性呼吸道疾病（VAERD）副作用。环状mRNA疫苗在环境温度下比线性mRNA更稳定，因此，基于环状mRNA的疫苗可以在没有冷链的情况下储存和运输。在多种动物模型中，环状mRNA疫苗诱导的黏膜免疫反应显示出比传统肠外免疫更为有效，这为鱼类病毒性神经坏死症的防控提供了新的策略。

[0004] 本发明提供了一种海水养殖鱼类用环状mRNA疫苗及其制备方法和应用，解决鱼类养殖业中，幼鱼期容易收到NNV病毒感染造成较大损失的问题。

[0005] 本发明采用如下技术方案：一种海水养殖鱼类用环状mRNA疫苗，所述环状mRNA疫苗携带的目标抗原为NNV病毒的B1基因，所述环状mRNA疫苗由环状mRNA和运载所述环状mRNA脂质纳米载体组成，所述环状mRNA依次由如下3个区域组成，IRES非翻译区、信号肽序列和NNV病毒抗原编码区，所述环状mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0006] 进一步地，所述脂质纳米载体包含如下组分：MC3、DSPC、胆固醇、DMG‑PEG2000按照5：1：3.8：0.2比例混合后置于乙醇溶液中得到，所述环状mRNA与纳米脂质材料的质量比为
1: 10。

[0007] 一种海水养殖鱼类用环状mRNA的制备方法，包括如下步骤：（1）环状mRNA的模板DNA由T7启动子、IRES非翻译区、信号肽序列、NNV病毒抗原编码区连接组成，通过化学合成的方式合成其DNA模版；
（2）使用T7 RNA聚合酶以上一步化学合成的DNA为模版进行T7 RNA转录，采用乙醇沉淀法进行纯化；
（3）使用5’端腺苷酰化酶将上述转录的RNA进行腺苷酰化，采用乙醇沉淀法进行纯化；
（4）使用T4 RNA连接酶2对上一步得到的腺苷酰化的RNA进行环化连接，采用乙醇沉淀法进行纯化；
（5）使用T7 RNA聚合酶以上一步化学合成的DNA为模版进行T7 RNA转录，采用乙醇沉淀法进行纯化，最终得到目标环状mRNA。

[0008] 进一步地，所述T7启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示。

[0009] 进一步地，所述IRES非翻译区的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示。

[0010] 进一步地，所述信号肽序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

[0011] 进一步地，所述NNV病毒抗原编码区中含有NNV‑B1基因，氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示。

[0012] 一种海水养殖鱼类用环状mRNA疫苗的应用，在制备抗鱼类神经坏死病毒药物中的应用。

[0013] B1和B2蛋白在NNV病毒感染过程中的作用机制是多方面的。B1蛋白被认为具有抗坏死细胞死亡因子的功能，能够调节宿主细胞的细胞周期，减少线粒体膜电位的损失，并上调p53/p21以诱导G1/S细胞周期停滞，从而保证病毒的复制。B2蛋白则在NNV的增殖和感染中起着至关重要的作用。它能够与双链DNA结合，防止Dicer的切割，从而拮抗宿主的RNA干扰（RNAi）反应，积累病毒RNA。此外，B2蛋白还能够通过增加线粒体膜电位的损失来诱导细胞ATP耗竭死亡，并且通过上调凋亡基因Bax的表达，导致线粒体膜电位的损失。B2蛋白还通过抑制宿主的转录活性，特别是通过RNA聚合酶II指导的转录，来抑制宿主的I型干扰素反应。这些非结构蛋白的功能对于NNV的感染机制、病毒复制以及宿主的免疫逃逸至关重要。了解B1和B2蛋白的作用机制不仅有助于揭示NNV的致病机理，也为开发新的防治策略提供了潜在的靶点。本项发明通过克隆NNV‑B1基因，构建了NNV‑B1基因的环状RNA疫苗，这在鱼类抗病毒药物的开发和疾病防控策略中具有显著意义。

[0014] 本发明具有如下有益效果：（1）本发明制备得到的NNV‑B1环状mRNA疫苗不含活病毒成分，在体内降解为核苷酸，不会整合到宿主基因组中，因此使用没有风险。NNV‑B1环状mRNA疫苗相比较其他类型疫苗能够激发更强烈的免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫，而且有着更低的免疫原性，对于预防病毒感染至关重要，生产NNV‑B1环状mRNA疫苗成本更低，在大规模生产时在经济上具有较强的竞争力。

[0015] （2）本发明制备得到的NNV‑B1环状mRNA疫苗稳定性较高，经实验 表明具有较好的安全性，在预防NNV病毒感染时，对石斑鱼具有接近90%的保护效力。附图说明

[0016] 图1为本发明的NNV‑B1 环状mRNA疫苗的合成结构示意图。

[0017] 图2为本发明的NNV‑B1 环状mRNA与线性RNA的凝胶电泳分析图。

[0018] 图3为本发明的NNV‑B1 环状mRNA疫苗在HEK293细胞中的表达情况图。

[0019] 图4为本发明的NNV‑B1 环状mRNA疫苗免疫石斑鱼28天后的血清中针对NNV病毒的B1蛋白的抗体滴度。

[0020] 图5为本发明的NNV‑B1 环状mRNA疫苗在石斑鱼上防治NNV病毒的效果图。

[0021] 为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0022] 人胚胎肾细胞293（HEK293细胞）贴壁生长在细胞培养基中，于5% CO2，37℃的恒温培养箱中培养。以含有10%胎牛血清、100T/ml青霉素和100mg/ml链霉素的DMEM培养基 (Gibco)为HEK293细胞的细胞培养基。

[0023] 本发明中的微流控芯片为FluidicLab LNP‑B1,外购于上海澎赞生物科技有限公司。

[0024] 本发明中的神经坏死病毒（NervoTs Necrosis VirTs, NNV）保存在国家水生动物病原库中。

[0025] 实施例1：NNV‑B1环状mRNA疫苗的制备：NNV‑B1基因环状mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0026] 具体步骤如下：（1）NNV‑B1基因环状mRNA疫苗DNA模版的合成：该环状mRNA疫苗的模板DNA由T7启动子、IRES非翻译区、信号肽序列和NNV病毒抗原编码区连接组成，按照上面的顺序通过化学合成的方式合成其DNA模版；其中T7启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:2所示、IRES非翻译区的核苷酸序列为SEQ ID NO:3所示、信号肽序列的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示、NNV病毒抗原编码区为含NNV‑B1基因的抗原区，氨基酸序列为SEQ ID NO:5所示；
（2）NNV‑B1基因环状mRNA疫苗的T7 RNA转录：以上述合成好的DNA为模版进行T7 RNA转录；
具体步骤如下：DNA模版1μg、T7转录缓冲液2μL，NTP 混合物（10mM）4μL，T7 RNA聚合酶（1kT/μl）0.1μL，补无核酶纯水至20μL，于37℃恒温孵育120分钟。反应完成后，使用乙醇沉淀法对上述转录的线性RNA进行纯化，具体步骤如下：首先加入160μL 无核酶纯水将反应体积放大到180μL，再加入pH5.2的20μL 3M醋酸钠或20μL 5M醋酸铵，充分混匀；加入等体积的苯酚/氯仿混合液（1:1）抽提一次，再用氯仿抽提1‑2次，抽提步骤为涡旋混匀20‑30秒，随后14000g离心5‑10min取上清。用双倍体积的无水乙醇沉淀RNA，在‑20℃至少孵育30分钟，随后14000g 4℃离心5‑10min沉淀RNA，弃上清，用500μL预冷的70%乙醇洗涤沉淀，用20μL无核酶纯水重悬并溶解RNA。最后通过琼脂糖凝胶电泳检测合成的环状mRNA；
（3）RNA腺苷酰化： 对上一步纯化得到的RNA进行腺苷酰化，
具体步骤如下：上一步得到的RNA 5μM，腺苷酰化缓冲液2μL，ATP（1mM）2μL，5’端腺苷酰化酶（75T/μL）1μL，补无核酶纯水至20μL，于65℃恒温孵育60分钟，85℃孵育5分钟以终止反应，按照上述的乙醇沉淀法对环化后的RNA进行纯化；
（4）T4 RNA连接酶2环化连接：使用T4 RNA连接酶2对上述纯化后的腺苷酰化RNA进行环化连接，具体步骤如下：取线性RNA 20µM、T4 RNA连接酶缓冲液2μL、T4 RNA连接酶2 1μL，补无核酶纯水至20μL，于37℃条件下恒温孵育1小时，按照上述的乙醇沉淀法对环化后的RNA进行纯化；
（5）RNase R酶去除线性RNA：使用RNase R酶去除上述反应体系中残留的线性RNA，取20μL上述纯化的RNA、3μL RNase R酶缓冲液，补无核酶纯水至30μL，于37℃恒温孵育30分钟，然后按照上述的乙醇沉淀法对环化后的RNA进行纯化，最终得到纯化后的目标环状mRNA，结果如图2所示；
环状mRNA由线性至环化过程如图1所示，由图1可知，线性RNA由接头序列1，由SEQ ID  NO:6所示（GATCCCACCCACAGGCCCA）和接头序列2由SEQ  ID  NO:7所示，（GACGTCGCACTCAAGTGTAG）反向剪接形成，在制备过程中通过RNase R酶去除了反应体系中残留的线性RNA，由图2的凝胶电泳图中可知，线性RNA在进行RNase R酶处理后，RNA条带消失，而环状RNA在RNase R酶处理后条带仍然存在，且浓度与RNase R酶处理前的RNA浓度相近，由此可知，本发明已成功合成得到环状mRNA；
（6）环状mRNA疫苗的制备：将MC3、DSPC、胆固醇、DMG‑PEG2000按照5：1：3.8：0.2比例混合加入到乙醇溶液中制备得到脂质载体，将脂质载体与环状mRNA溶液按照体积比1：4通过微流控芯片混合制备环状mRNA‑LNP溶液，其中环状mRNA与纳米脂质材料的质量比为1: 
10，然后通过切向流系统除去乙醇，即得环状mRNA脂质纳米粒制剂，即环状mRNA疫苗；
（7）检测合成的NNV‑B1基因的环状mRNA疫苗产生目标蛋白的效果：取对数生长期
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的HEK293细胞，使用胰酶消化液消化细胞，随后用细胞培养基稀释至细胞密度为2.5×10 cells/ml，形成细胞悬液，将上述细胞悬液按1ml/孔加入到12孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养，细胞培养箱中CO2体积含量为5％，温度为37℃。

[0027] 上述细胞经过24h培养后，弃去上清液，用灭菌PBS冲洗一遍，然后按1ml/孔添加细胞培养基；然后将制备好的带有NNV‑B1基因环状mRNA的环状mRNA疫苗加进上述的EPC细胞中。转染48h后，去除细胞上清随后使用RIPA裂解缓冲液对细胞进行裂解。裂解后，利用超声波对蛋白样品进行破碎处理，并在4℃下以12000rpm离心10分钟，以分离出上清液。将上清液与6×Loading BTffer混合，随后在95℃下加热10分钟以变性蛋白。接着，将处理后的蛋白样品加载至SDS‑PAGE电泳凝胶孔中进行电泳分离，电泳条件设定为80V持续1小时，之后将电压提升至120V直至电泳结束。以TTbTlin作为内参照，根据蛋白分子量标准，切取凝胶中的待测蛋白条带，并将这些蛋白条带转移到PVDF膜上，转移条件为200mA电流下电泳2小时。膜转移完成后，将PVDF膜置于5%脱脂奶粉溶液中封闭1小时，以减少非特异性结合。封闭后，使用1:1000稀释的NNV‑B1抗体与膜孵育过夜，以便特异性结合目标蛋白。次日，用PBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟，以去除未结合的抗体。之后，将膜与1:2000稀释的羊抗兔二抗孵育2小时，再用PBST缓冲液洗涤3次，每次10分钟，以去除多余的二抗。最后，加入显影剂并检测膜上的化学发光反应，从而评估环状mRNA表达NNV‑B1的效率；结果如图3所示。

[0028] 由图3可知，转染了带有NNV‑B1基因的环状mRNA的HEK293细胞能够高效的表达NNV‑B1蛋白，而对照组没有转染任何东西的HEK293细胞则没有表达NNV‑B1蛋白，这说明合成的环状mRNA能够有效产生目标抗原。

[0029] 实施例2：NNV‑B1环状mRNA疫苗安全性效果验证：为了全面评估本发明中NNV病毒环状mRNA疫苗预防病毒性神经坏死症的安全性，确保其临床应用的安全性，依据《中国兽药典》的规定，对该疫苗进行了一系列的安全性试验。试验选用约5g重的石斑鱼作为实验动物，采用的环状mRNA疫苗注射量为10μg。

[0030] 在实验设计中，按照随机区组法分为对照组、mRNA疫苗组，共2组，每组6条鱼。对照组石斑鱼注射按0.1ml/条腹腔注射PBS溶液，疫苗组石斑鱼按0.1ml/10μg/条腹腔注射环状mRNA疫苗。试验期间，密切监测所有实验组的斑马鱼是否有临床不良反应，并在免疫后的7天内每天记录死亡鱼的数量。此外，在接种后的60天内，定期测量并记录各组鱼的长度和体重变化。

[0031] 结果显示，在对照组石斑鱼生长状况良好的情况下和采用腹腔注射mRNA疫苗的实验组在7天内均未观察到死鱼现象，同时未发现任何临床不良反应。而且，与对照组相比，接种组在60天后的鱼长度和体重也未出现显著差异。这些结果表明，该NNV病毒环状mRNA疫苗具有较高的安全性。

[0032] 实施例3：NNV‑B1环状mRNA的在石斑鱼体内产生抗体的效率：选取重量约为25克的石斑鱼，按照随机区组法分为对照组、环状mRNA疫苗组，共2组，每组3条鱼。对照组石斑鱼注射按0.1ml/条腹腔注射PBS溶液，疫苗组石斑鱼按0.1ml/10μg/条腹腔注射环状mRNA疫苗。隔两周给药免疫1次，连续给药免疫2 次。经过28天的免疫期后，对所有石斑鱼进行尾部静脉采血并分离血清，通过ELISA检测第28天的血清中针对NNV病毒CP蛋白的抗体滴度。结果如图4所示。

[0033] 由图4可知，接种了NNV病毒环状mRNA疫苗的石斑鱼在28天的免疫期后血清中的结4 5
合抗体滴度约为10‑10，该组的抗体阳转率为100%。

[0034] 实施例4：NNV‑B1环状mRNA疫苗的应用：选取重量约为25克的石斑鱼，按照随机区组法分为对照组、mRNA疫苗组，共2组，每组40条鱼。对照组石斑鱼注射按0.1ml/条腹腔注射PBS溶液，疫苗组石斑鱼按0.1ml/10μg/条腹腔注射环状mRNA疫苗，隔两周给药免疫1次，连续给药免疫2 次。经过28天的免疫期后，
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对所有石斑鱼进行腹腔注射，每条石斑鱼接种0.1ml浓度为1×10 TCID50/mL的NNV病毒。
在随后的观察期内，每天记录各组石斑鱼的存活与死亡情况，并根据这些数据绘制生存曲线，以评估疫苗的保护效果。结果如图5所示。

[0035] 由图5所示可知，接种了NNV病毒环状mRNA疫苗的石斑鱼在20天的观察期内，死亡率大约为10%。相比之下，未接种疫苗的阴性对照组石斑鱼在同一时间段内的死亡率达到了100%。这一显著差异表明，通过注射方式接种的NNV病毒环状mRNA疫苗在预防NNV病毒感染方面，对石斑鱼具有接近90%的保护效力。

[0036] 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。