一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒及检测方法专利检索-····用于微生物例如原生动物细菌病毒专利检索查询-专利查询网

一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测 试剂盒及检测方法

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202410201420.X	申请日	2024-02-23
公开(公告)号	CN118027218A	公开(公告)日	2024-05-14
申请人	中国兽医药品监察所;	申请人类型	其他
发明人	朱良全; 王豪杰; 胡云皓; 刘燕; 辛凌翔; 张存帅; 姚文生; 张一帜; 王秀丽; 王琦; 佟仁冬; 金美君;	第一发明人	朱良全
权利人	中国兽医药品监察所	权利人类型	其他
当前权利人	中国兽医药品监察所	当前权利人类型	其他
省份	当前专利权人所在省份：北京市	城市	当前专利权人所在城市：北京市海淀区
具体地址	当前专利权人所在详细地址：北京市海淀区中关村南大街8号	邮编	当前专利权人邮编：100081
主IPC国际分类	C07K19/00	所有IPC国际分类	C07K19/00 ; C12N15/62 ; C12N15/70 ; G01N33/569 ; C12R1/19
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	四川省方圆智云知识产权代理事务所	专利代理人	严晓玲;
摘要	本发明公开了一种猪链球菌病间接ELISA 抗体检测试剂盒及检测方法，属于生物检测技术领域。所述试剂盒包括包被板、样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、终止液、加样槽、封板和血清稀释板。本发明利用原核表达系统表达猪链球菌Sao‑MRP‑EF融合蛋白，并以纯化后的Sao‑MRP‑EF融合蛋白作为包被抗原，建立猪链球菌病间接ELISA抗体检测方法。本发明制备的猪链球菌Sao‑MRP‑EF融合蛋抗原性好，并以此建立间接ELISA抗体检测方法，具有灵敏度高、特性强、重复性好的特点，适合检测猪链球菌抗体，为猪链球菌病准确诊断、及时防控以及疫苗免疫效果评价提供技术支撑。
权利要求	1.重组抗原Sao‑MRP‑EF融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。 2.编码权利要求1所述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。 3.一种表达载体，含有权利要求2所述的基因。 4.权利要求1所述的融合蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的表达载体在制备猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒上的应用。 5.一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有包被有权利要求1所述的重组抗原Sao‑MRP‑EF融合蛋白的酶标板。 6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：还包括样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、终止液、加样槽、封板或血清稀释板中的一种或多种。 7.根据权利要求5所述试剂盒，其特征在于：所述包被有权利要求1所述的重组抗原Sao‑MRP‑EF融合蛋白的酶标板通过以下方法制备：包被浓度为25ug/mL；最佳封闭剂为5％BSA，最佳封闭条件为37℃90min；血清最佳稀释度为1:100，孵育条件为37℃45min。 8.一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1)用样品稀释液将待检血清进行1:100稀释，并向包被有权利要求1所述的重组抗原Sao‑MRP‑EF融合蛋白的酶标板中加入稀释后的待检血清100μL/孔，37℃孵育45min，弃去溶液，洗涤3次； (2)向洗涤后的酶标板中加入1:1000稀释的兔抗猪IgG‑HRP抗体100μL/孔，37℃孵育 90min，弃去溶液，洗涤3次； (3)向洗涤后的酶标板中加入等体积混合的显色液A与显色液B 100μL/孔，避光显色 10min，加终止液50μL/孔，测定待检样品的OD450nm值和P/N值，以判定待检样品中是否含有猪链球菌抗体。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中，洗涤液均为含0.05％吐温‑20的PBST溶液。 10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，判断是否含有猪链球菌的标准为：阴阳性临界值OD450nm≥0.396为阳性，OD450nm<0.396判定为阴性。
说明书全文	一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒及检测方法技术领域 [0001] 本发明涉及一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒及检测方法，属于兽医微生物学诊断领域。背景技术 [0002] 猪链球菌(Streptococcus suis，SS)是造成全球生猪养殖业重大经济损失的最主要病原之一，且严重威胁着公共卫生安全。猪链球菌是一种兼性厌氧革兰氏阳性菌，基于表面荚膜抗原的不同，分为35个血清型。其中猪链球菌2型(S.suis type 2，SS2)危害最为严重，被列为人畜共患传染病，在人群和猪群中均为最主要的致病菌，致病力和流行率均最高，是疫情监控和病原鉴定的首要检测对象。感染该菌后主要表现为脑膜炎、败血症、心肌内膜炎、肺炎和化脓性关节炎等症状。 [0003] 灵敏、特异、快速准确的诊断方法对于疫病诊断防控非常重要。猪链球菌病的检测主要包括流行病学、病原分离鉴定、分子生物学和血清学检测。病原分离鉴定方法过程繁杂、周期长，很难及时诊断；常规PCR、荧光定量PCR等分子生物学检测虽具有特异性强、灵敏度高等优点，但其设备昂贵、对检测人员要求较高。且上述方法无法评价疫苗免疫效果。血清学检测方法包括协同凝集试验、玻片凝集试验和ELISA等，而协同凝集试验和玻片凝集试验在试验过程中影响因素较多，从而降低了试验结果的准确性。ELISA检测具有灵敏度高、特异性强、操作便捷等优点，且可监测动物体内抗体水平。因此，建立灵敏、特异、操作简单、成本低廉的猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒及其检测方法具有重要意义。 [0004] 良好靶抗原是建立ELISA方法关键。Sao是猪链球菌的一种表面蛋白，在不同血清型猪链球菌菌株中高度保守。溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)是猪链球菌的一种重要毒力因子，具有良好的免疫原性。研究表明，对180株猪链球菌2型菌株进行分析，结果从+ +病猪分离的猪链球菌2型中有77％为MRP 、EF，分离自病人的猪链球菌2型中有89％表达‑ ‑ MRP，而86％健康猪分离菌则为MRP 、EF，表明MRP和EF对猪链球菌2型毒力较为重要并具有较大的潜在应用价值。因此，本发明截取三种蛋白疏水性强、免疫原性好的靶点串联表达，并首次报道作为靶抗原开发猪链球菌病间接ELISA试剂盒及其检测方法。发明内容 [0005] 本发明所要解决的技术问题为：提供一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒及其检测方法，从而实现猪链球菌病快速诊断及抗体监测，达到及时防控。 [0006] 本发明的技术方案为：重组抗原Sao‑MRP‑EF融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。 [0007] 编码上述所述的融合蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。 [0008] 一种表达载体，含有上述所述的基因。 [0009] 上述所述的融合蛋白或基因或表达载体在制备猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒上的应用。 [0010] 一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒含有包被有上述所述的重组抗原Sao‑MRP‑EF融合蛋白的酶标板。 [0011] 进一步地，还包括样品稀释液、酶结合物、阳性对照、阴性对照、显色液A、显色液B、浓缩洗涤液、终止液、加样槽、封板或血清稀释板中的一种或多种。 [0012] 进一步地，所述包被有权利要求1所述的重组抗原Sao‑MRP‑EF融合蛋白的酶标板通过以下方法制备：包被浓度为25ug/mL；最佳封闭剂为5％BSA，最佳封闭条件为37℃90min；血清最佳稀释度为1:100，孵育条件为37℃45min。 [0013] 一种猪链球菌病间接ELISA抗体检测的方法，包括如下步骤： [0014] (1)用样品稀释液将待检血清进行1:100稀释，并向包被有上述所述的重组抗原Sao‑MRP‑EF融合蛋白的酶标板中加入稀释后的待检血清100μL/孔，37℃孵育45min，弃去溶液，洗涤3次； [0015] (2)向洗涤后的酶标板中加入1:1000稀释的兔抗猪IgG‑HRP抗体100μL/孔，37℃孵育90min，弃去溶液，洗涤3次； [0016] (3)向洗涤后的酶标板中加入等体积混合的显色液A与显色液B 100μL/孔，避光显色10min，加终止液50μL/孔，测定待检样品的OD450nm值和P/N值，以判定待检样品中是否含有猪链球菌抗体。 [0017] 进一步地，步骤(1)和(2)中，洗涤液均为含0.05％吐温‑20的PBST溶液。 [0018] 进一步地，判断是否含有猪链球菌的标准为：阴阳性临界值OD450nm≥0.396为阳性，OD450nm<0.396判定为阴性。 [0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： [0020] 本发明主要以保守性的猪链球菌Sao蛋白并结合MRP、EF重要毒力因子为靶抗原，建立猪链球菌间接ELISA抗体检测试剂盒及其检测方法，从而实现对猪链球菌病的快速诊断以及抗体水平的监测。附图说明 [0021] 图1SDS‑PAGE和Western blotting检测结果；A：M：180kDa蛋白marker；1：沉淀；2：上清；3‑4：纯化蛋白；B：猪链球菌阳性血清反应；C：猪链球菌阴性血清反应。 [0022] 图2阴阳性血清检测结果。 [0023] 图3ROC曲线。 [0024] 图4特异性验证。 [0025] 图5敏感性检测。具体实施方式 [0026] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。 [0027] 实施例1选择拟表达的目的片段 [0028] 使用DNASTAR.Lasergene.v7.1 软件分别对猪链球菌Sao、MRP和EF蛋白进行抗原表位预测，截取抗原表位突出的片段并运用柔性link(GGTGGCGGCGGCTCT)将截取的片段连接并进行密码子优化。优化后的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，优化后的基因序列如SEQ ID No.2所示。 [0029] 实施例2原核表达 [0030] 将优化后的目的基因连接至pET‑32a(+)表达载体中，构建重组表达质粒pET‑32a‑Sao‑M RP‑EF；将所述重组质粒转入BL21(D3)感受态细胞；选择菌液PCR及测序正确的单菌落进行扩大培养，待菌液OD600nm为0.6‑1.0时，加入IPTG(1mM)，16℃过夜表达，收集菌体并超声破碎，采用GenScript Anti‑His Affinity Resin镍柱对蛋白进行纯化，通过Western blotting鉴定。 [0031] 经SDS‑PAGE和Western blotting检测显示，重组Sao‑MRP‑EF融合蛋白为可溶性表达，且与预期大小一致(图1中A)，可与猪链球菌阳性血清发生特异性反应(图1中B)。 [0032] 实施例3ELISA反应条件的优化 [0033] 3.1最佳抗原包被浓度与血清稀释度的优化 [0034] 运用棋盘法确定Sao‑MRP‑EF融合蛋白抗原最佳包被浓度和血清稀释度，使用碳酸盐缓冲液将Sao‑MRP‑EF融合蛋白进行倍比稀释，将其包被浓度稀释为100、50、25、12.5ug/ml，每孔100μL(依次横排包被)，4℃包被过夜；PBST洗涤3次；每孔加入300μL 5％脱脂乳，37℃封闭2h；PBST洗板3次；使用PBS将猪链球菌阳性血清和阴性血清(阴性对照)进行1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300稀释，每孔100μL(依次竖排加入)，37℃孵育1h；PBST洗板3次；使用PBS按照1:1000稀释兔抗猪IgG‑HRP抗体，每孔100μL，37℃孵育1h；PBST洗板3次；避光每孔加入100μL TMB显色液，37℃孵育10min；每孔加入50μL终止液；比较猪链球菌阳性和阴性血清的OD450nm值和P/N值，从而确定最佳抗原包被浓度和血清稀释度(均设3个重复，求平均值)。 [0035] 结果显示，最佳抗原包被浓度为25ug/ml，最佳阳性血清稀释倍数为1:100(表1)。 [0036] 表1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 [0037] [0038] 3.2最佳封闭条件的确定 [0039] 基于3.1结果，进行封闭条件的优化。将ELISA板包被孔分组，用5％脱脂乳、2.5％脱脂乳、PBST、1％明胶、1％BSA、5％BSA、10％马血清、10％胎牛血清分别在37℃条件下封闭30min、60min、90min、120min、150min(均设3个重复)。比较猪链球菌阳性和阴性血清OD450nm值和P/N值，以确定最佳的封闭条件。(均设3个重复，求平均值) [0040] 结果显示，最佳封闭剂为5％BSA(表2)，最佳封闭时间为90min(表3)。 [0041] 表2封闭剂的确定 [0042] [0043] 表3封闭时间的确定 [0044] [0045] 3.3最佳血清作用时间的确定 [0046] 基于3.1、3.2结果，进行血清最佳作用时间的优化。将ELISA板包被分组，将血清按比例稀释好后，分别在37℃条件下孵育30min、45min、60min、75min、90min。比较猪链球菌阳性和阴性血清OD450nm值和P/N值，以确定血清的最佳作用时间。(均设3个重复，求平均值)[0047] 结果显示，最佳血清作用时间为45min(表4)。 [0048] 表4血清作用时间的确定 [0049] [0050] 3.4最佳酶标二抗稀释度和作用时间的确定 [0051] 基于3.1、3.2、3.3结果，对酶标二抗稀释度和作用进行优化。将ELISA板包被分组，兔抗猪IgG‑HRP抗体分别按1:500、1:1000、1:1500、1:2000、1:2500、1:3000、1:3500、1:4000的稀释度进行稀释，同时每个稀释度分别在37℃条件下孵育30min、45min、60min、75min、90min。比较猪链球菌阳性和阴性血清的OD450nm值和P/N值，确定最佳酶标二抗稀释度以及作用时间。(均设3个重复，求平均值) [0052] 结果显示，最佳酶标二抗稀释度为1:1000(表5)，最佳酶标二抗作用时间为45min(表6)。 [0053] 表5酶标二抗稀释度的缺点 [0054] [0055] 表6酶标二抗作用时间的确定 [0056] [0057] 3.5显色时间的确定 [0058] 基于3.1、3.2、3.3、3.4结果，对显色时间进行优化。将包被ELISA板分组，TMB底物作用时间分别为37℃条件下孵育5min、7min、10min、12min、15min。比较猪链球菌阳性和阴性血清的OD450nm值和P/N值，确定最佳显色时间。(均设3个重复，求平均值)[0059] 结果显示，最佳显色时间为10min(表7)。 [0060] 表7显色时间的确定 [0061] [0062] 实施例4临界值的确定 [0063] 使用猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒分别检测已知标准41份阳性血清(采集猪链球菌疫苗免疫健康猪血清或已诊断为猪链球菌病，并经商品化猪链球菌ELISA试剂盒进行检测抗体阳性)和43份阴性血清(采集未免猪链球菌疫苗的健康猪血清，并商品化猪链球菌ELISA试剂盒进行检测抗体阴性)，通过ROC曲线分析，确定临界值。 [0064] 结果显示，当OD450nm<0.396时，敏感性(100％)和特异性(97.8％)较高，选择该O D值作为临界值；当OD450nm≥0.396时，判定为阳性；当OD450nm<0.396时，判定为阴性(图2和图3)； [0065] 实施例5特异性验证 [0066] 以最优条件包被重组Sao‑MRP‑EF蛋白后，分别将已知抗体阳性的猪链球菌(S.suis)1型、1/2型、2型、7型、9型、16型、31型、33型、多杀性巴氏杆菌(P.multocida)、大肠埃希氏菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、都柏林沙门氏菌(S.dublin)、溶血性曼氏杆菌(M.haemolytica)的标准阳性血清1:100稀释进行检测，同时以猪链球菌阳性血清和阴性血清为对照，具体实验操作步骤按优化后的试验条件进行，最后根据OD450nm值，验证该方法的特异性。 [0067] 结果显示，Sao‑MRP‑EF融合蛋白抗原与不同病原阳性血清反应后，OD450nm值均＜0.396，可见Sao‑MRP‑EF融合蛋白抗原不与上述病原的阳性血清发生非特异性结合，表明建立的ELISA方法具有较好的特异性(图4)。 [0068] 实施例6敏感性检测 [0069] 将猪链球菌阳性血清和阴性血清用PBS分别进行1:100、1:200、1:400、1:800、1:1 600、1:3200、1:6400、1:12800和1:25600倍稀释，然后分别对不同稀释度的阳性血清进行EL ISA试验。 [0070] 结果显示，血清稀释比例为1:3200时，检测结果仍为阳性(OD450nm>0.396)，表明该方法的敏感性较高(图5)。 [0071] 实施例7重复性验证 [0072] 选取6份血清样品，利用建立的猪链球菌病间接ELISA抗体检测方法对同一批次包被的3个不同ELISA板进行批内重复性试验；另外随机选用3个不同批次包被的ELISA板，用该检测方法对上述6份血清样品进行批间重复性试验。计算它们的批间或批内的平均值标准差(SD)和变异系数(CV)，评估该检测方法的重复性。 [0073] 结果显示，批内与批间试验的变异系数均小于10％，表明该方法重复性较好(表8)。 [0074] 表8重复性检测 [0075] [0076] [0077] 实施例8临床应用 [0078] 运用猪链球菌病间接ELISA抗体检测试剂盒检测临床送检疑似猪链球菌病的66份血清样本。 [0079] 表9样品检测结果 [0080] [0081] 结果显示，样本的阳性检出率为32.26％(表9)。

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