| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202411904564.8 | 申请日 | 2024-12-23 |
| 公开(公告)号 | CN119780406A | 公开(公告)日 | 2025-04-08 |
| 申请人 | 乐凯医疗科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 郭晓燕; 孙伟娜; 高子祺; 严晓强; 卢志凯; 文军; 刘敏; 靳海波; | 第一发明人 | 郭晓燕 |
| 权利人 | 乐凯医疗科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 乐凯医疗科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：河北省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：河北省保定市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：河北省保定市竞秀区创业路359号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：071051 |
| 主IPC国际分类 | G01N33/52 | 所有IPC国际分类 | G01N33/52 ; G01N33/68 ; G01N21/77 ; G01N21/78 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京聿宏知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 吴大建; 刘慧红; |
| 摘要 | 本 发明 提出了一种定量检测 白蛋白 的干化学 试剂 片及其制备方法，涉及干化学试剂片领域。定量检测白蛋白的干化学试剂片，包括支持层、试剂层及扩散层，试剂层设置在支持层的上方，扩散层设置在试剂层的上方，扩散层包括扩散层试剂或由扩散层试剂形成，扩散层试剂包括黏合剂、 表面活性剂 以及颗粒物，颗粒物包括第一颗粒物及第二颗粒物；第一颗粒物和第二颗粒物的数量比为1：(0.25‑4)，第一颗粒物和第二颗粒物的粒径差值为10‑40μm。本发明提供的定量检测白蛋白的干化学试剂片，用于体外诊断，其检测结果精确、储存稳定，具有快速诊断、操作简单、节约成本等优势。 | ||
| 权利要求 | 1.一种定量检测白蛋白的干化学试剂片，其特征在于，包括支持层、试剂层及扩散层，所述试剂层设置在所述支持层的上方，所述扩散层设置在所述试剂层的上方，其特征在于，所述扩散层包括扩散层试剂或由扩散层试剂形成，所述扩散层试剂包括黏合剂、表面活性剂以及颗粒物，所述颗粒物包括第一颗粒物及第二颗粒物； |
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| 说明书全文 | 一种定量检测白蛋白的干化学试剂片及其制备方法[0001] 相关申请的交叉引用 [0002] 本发明要求享有于2024年10月15日提交的名称为“一种定量检测白蛋白的干化学试剂片及其制备方法”的中国专利申请CN 202411438688.1的优先权，上述申请的全部内容通过引用并入本文中。 技术领域[0003] 本发明涉及干化学试剂片领域，具体涉及一种定量检测白蛋白的干化学试剂片及其制备方法。 背景技术[0004] 白蛋白是人血浆和血清中最丰富的蛋白质，占血清总蛋白含量的大约60％，正常浓度范围在30‑50mg/mL。白蛋白的浓度是评估肝脏功能、营养状态和疾病诊断的重要指标，临床检测多与肝功能不全、营养不良或慢性炎症等情况相关，其检测结果能够帮助医生评估肝脏功能和营养状态，还能在疾病的诊断、治疗监测和预后评估中发挥重要作用。然而，临床上常用的湿法检测通常需要样本的准备、试剂的添加、反应的监控等大量的手动操作步骤，操作复杂，误差风险大，同时检测过程通常需要较长的时间来完成，且成本相对较高，一直以来应用相对局限。 [0005] 定量干片检测属于干化学分析法，是一种在临床检验和生物化学研究中广泛应用的技术方法。它的核心特点是将多种反应试剂预先干燥并固定在纸片或其他载体上，然后在实际检测时，利用样品(如全血、血清、血浆、尿液等)中的液体作为反应介质，使样品中的待测成分与干试剂直接发生反应。这种反应通常会产生颜色变化，通过肉眼观察或仪器检测来进行定性或定量分析。与传统的湿化学相比，定量干片检测法有着操作简便便捷、出结果快速、成本低、用量少、易于储存、易于与自动化设备结合、适应性强、环境友好等诸多优势。 [0006] 为此，我们希望开发出一种白蛋白定量检测干片，既可以有效简化白蛋白的检测流程，降低使用成本，也可以优化应用环境，实现方便快捷的POCT(即时检测)。 发明内容[0007] 鉴于以上分析，本发明旨在提供一种定量检测白蛋白的干化学试剂片及其制备方法，用以简化白蛋白的检测流程，降低使用成本。 [0008] 本发明的目的主要是通过以下技术方案实现的： [0009] 第一方面，本发明提供了一种定量检测白蛋白的干化学试剂片，包括支持层、试剂层及扩散层，所述试剂层设置在所述支持层的上方，所述扩散层设置在所述试剂层的上方，其特征在于，所述扩散层包括扩散层试剂或由扩散层试剂形成，所述扩散层试剂包括黏合剂、表面活性剂以及颗粒物，所述颗粒物包括第一颗粒物及第二颗粒物；第一颗粒物和第二颗粒物的数量比为1：(0.25‑4)，优选为1：(0.5‑1.5)，第一颗粒物和第二颗粒物的粒径差值为10‑40μm，优选为15‑25μm。 [0010] 优选地，第一颗粒物包括聚苯乙烯微球，粒径范围为40‑80μm，优选为45‑55μm。 [0011] 优选地，第二颗粒物包括聚苯乙烯微球，粒径范围为10‑40μm，优选为25‑35μm。 [0012] 优选地，扩散层试剂中，表面活性剂的用量为0.5‑0.9g/m2；，优选为0.68‑0.73g/2 2 2 2 m；黏合剂的用量为12.5‑75g/m，优选为37.5‑62.5g/m；颗粒物的用量为400‑600g/m。 [0013] 优选地，第一颗粒物的用量为200‑300g/m2，优选为265‑280g/m2；和/或，第二颗粒2 2 物的用量为200‑300g/m，优选为210‑220g/m。 [0014] 优选地，扩散层试剂中，黏合剂包括聚异丁烯；扩散层试剂中，表面活性剂包括氟表面活性剂。 [0016] 优选地，试剂层试剂中，反应显色试剂的用量为1‑2g/m2，优选为1.4‑1.8g/m2；优选2 地，所述反应显色试剂包括溴甲酚绿钠；亲水性聚合物的用量为30‑150g/m ，优选为90‑ 2 110g/m；优选地，亲水性聚合物包括PVA、PAA、PAM、PVP中的至少一种。 [0018] 优选地，第一表面活性剂的用量为5‑30g/m2，优选为14‑16g/m2。 [0019] 优选地，第二表面活性剂的用量为1‑10g/m2；优选为4‑6g/m2。 [0020] 优选地，所述试剂层试剂中，所述缓冲体系包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)及苹果酸，pH为3‑4。 [0021] 优选地，所述支持层包括透明树脂塑料；所述支持层的膜厚为30‑200μm；所述扩散层的厚度为200‑300μm；所述试剂层的厚度为200‑300μm。 [0022] 第二方面，本发明提供一种所述的试剂片的制备方法，包括如下步骤： [0023] 步骤1：将试剂层试剂涂布在支持层上，干燥，得到试剂层； [0024] 步骤2：将扩散层试剂涂布在试剂层上，干燥，得到干化学试剂片。 [0025] 有益效果： [0027] 图1为本发明提供的定量检测白蛋白的干化学试剂片的结构示意图。 [0028] 图2为本发明提供的实施例1的干化学试剂片滴加血清变色后的测试图，其中，(a)为13g/L血清样本的显色效果；(b)为35g/L血清样本的显色效果；(c)为62g/L血清样本的显色效果。 [0029] 其中，1‑扩散层，2‑试剂层，3‑支持层。 具体实施方式[0030] 下面结合附图来具体描述本发明的优选实施例，其中，附图构成本发明的一部分，并与本发明的实施例一起用于阐释本发明的原理。 [0031] 本发明提供一种定量检测白蛋白的干化学试剂片及其制备方法。该干化学试剂片滴加血清后，血清中的白蛋白会迅速与干片中的溴甲酚绿成分发生反应生成有色复合物附着在干片上，且有色复合物的量与样本中白蛋白的浓度成正比。采用反射光光度法通过仪器对反应后的干片进行测试，通过与标准品测试对应的浓度曲线，可以快速得到测试血清的白蛋白的定量浓度。 [0032] 以下，对本发明进行具体说明。 [0033] 第一方面，本发明提供一种定量检测白蛋白的干化学试剂片，包括支持层及试剂层，所述试剂层设置在所述支持层之上，所述试剂层是待测物质发生化学反应的区域，所述试剂层包括试剂层试剂或由试剂层试剂形成，所述试剂层试剂包括能够与白蛋白结合产生颜色变化的反应显色试剂、亲水性聚合物、表面活性剂和缓冲体系。 [0034] 作为本发明的一个具体实施方式，试剂层试剂中，反应显色试剂的用量为1‑2g/2 2 2 m，优选为1.4‑1.8g/m，更优选为1.65g/m；反应显色试剂选自溴甲酚绿钠。 [0035] 作为本发明的一个具体实施方式，试剂层试剂中，亲水性聚合物可以选自聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酸(PAA)、聚丙烯酰胺(PAM)中的至少一种，亲水性2 2 2 聚合物的用量为30‑150g/m，优选为90‑110g/m，最优选为100g/m。 [0036] 作为本发明的一个具体实施方式，试剂层试剂中，PVA的型号可以选自PVA‑205、PVA‑103、PVA‑117、PVA‑203、PVA‑217中的至少一种；PAA的型号可以为Mn2000、Mn3000、Mn5000的至少一种；PAM型号可以为20％离子度、30％离子度、50％离子度的至少一种；PVP的型号可以选自K90(平均分子量1300000)、K60(平均分子量335000)、K30(平均分子量51500)、K15(平均分子量10000)的至少一种。其中，试剂层试剂中，亲水性聚合物优选为PVA‑205，用作试剂层显色最清楚。 [0037] 作为本发明的一个具体实施方式，试剂层试剂中，表面活性剂包括第一表面活性剂及第二表面活性剂，其中： [0038] 第一表面活性剂的用量为5‑30g/m2，优选为14‑16g/m2，更优选为15g/m2，所述第一表面活性剂选自聚氧乙烯月桂醚，型号可以为Brij‑35、Brij‑30中的至少一种； [0039] 第二表面活性剂的用量为1‑10g/m2；优选为4‑6g/m2，更优选为5g/m2，所述第二表面活性剂选自氟表面活性剂，型号可以为FS‑31、FS‑30、FS‑50、FS‑60、FS‑81中的至少一种。 [0040] 作为本发明的一个具体实施方式，试剂层试剂中，所述缓冲体系为苹果酸‑Tris缓冲体系，包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)及苹果酸，pH为3‑4，其中： [0041] 三羟甲基氨基甲烷(Tris)的用量为1‑10g/m2；优选为4‑8g/m2，最优为6g/m2； [0042] 苹果酸的用量为5‑30g/m2；优选为15‑17g/m2，最优选为16g/m2。 [0043] 本发明中，试剂层试剂中，三羟甲基氨基甲烷与苹果酸形成苹果酸‑Tris缓冲体系，此缓冲体系下，溴甲酚绿钠和苹果酸反应生成的溴甲酚绿与蛋白结合显色的效果区分度较好。 [0044] 本发明中，试剂层试剂中，第一表面活性剂Brij‑35除了有表活作用，还可以提高溴甲酚绿和蛋白质的结合性以及它们的溶解度，起到稳定显色的作用。第二表面活性剂的加入，可以进一步提高显色的均质度及均匀性。 [0045] 作为本发明的一个具体实施方式，所述试剂层的湿膜厚度为300‑500μm，干膜厚度为200‑300μm。需要说明的是，试剂层优化后的湿膜厚度为300‑500μm，此厚度范围内，显示效果相对更佳。 [0046] 作为本发明的一个具体实施方式，所述试剂片还包括扩散层，设置在所述试剂层的上方。 [0047] 作为本发明的一个具体实施方式，所述扩散层包括扩散层试剂或由扩散层试剂形成，所述扩散层试剂包括黏合剂、表面活性剂、颗粒物。 [0048] 作为本发明的一个具体实施方式，扩散层试剂中，黏合剂选自聚异丁烯，黏合剂的2 2 2 用量为12.5‑75g/m，优选为37.5‑62.5g/m ，更优选为50g/m 。作为本发明的一个具体实施方式，聚异丁烯分子量范围200‑3000，优选为2400。 [0049] 作为本发明的一个具体实施方式，扩散层试剂中，表面活性剂可以选自氟表面活性剂，型号可以为FS‑31、FS‑30、FS‑50、FS‑60、FS‑81中的至少一种。表面活性剂的用量为2 2 0.5‑0.9g/m；优选为0.68‑0.73g/m。 [0050] 作为本发明的一个具体实施方式，扩散层试剂中，颗粒物包括第一颗粒物及第二2 2 颗粒物。颗粒物的用量为400‑600g/m。第一颗粒物的用量为200‑300g/m，优选为265‑280g/ 2 2 2 m；第二颗粒物的用量为200‑300g/m，优选为210‑220g/m。 [0051] 作为本发明的一个具体实施方式，第一颗粒物可以选自聚苯乙烯微球；平均粒径为40‑80μm，例如45、50、55、60、65、70、75μm等，优选为45‑55μm，更优选为50μm。 [0052] 作为本发明的一个具体实施方式，第二颗粒物可以选自聚苯乙烯微球；平均粒径为10‑40μm，例如15、20、25、30、35μm等，优选为25‑35μm，更优选为30μm。 [0053] 需要说明的是，本发明中，如无特别说明，颗粒物的粒径为平均粒径。 [0054] 本发明中，聚苯乙烯微球可以为亲水性聚苯乙烯微球，是在聚苯乙烯微球表面修饰了羧基，可以增强与蛋白的吸附。 [0055] 作为本发明的一个具体实施方式，第一颗粒物和第二颗粒物的数量比为1：(0.25‑4)，优选为1：(0.5‑1.5)，更优选为1：1。 [0056] 作为本发明的一个具体实施方式，第一颗粒物和第二颗粒物的粒径差值为10‑40μm，例如15、20、25、30、35μm等，优选为15‑25μm。需要说明的是，本发明中的差值指的是绝对值。 [0057] 本发明中，扩散层主要由颗粒物聚苯乙烯微球组成，通过聚异丁烯作为黏合剂进行固定，扩散层主要作用包括均匀扩散样本，过滤样本中大分子物质和干扰物质，保护试剂层。 [0058] 本发明中，血清样本滴在干片上，白蛋白会在第一颗粒物及第二颗粒物上富集，液体渗透到试剂层，其中的溴甲酚绿染剂会渗到扩散层与样本中的白蛋白结合，而第一颗粒物及第二颗粒物的粒径控制所造成的缝隙差，可以更有效地保证血清扩散的均匀性和速率。 [0059] 作为本发明的一个具体实施方式，所述扩散层的湿膜厚度为400‑600μm，干膜厚度200‑300μm。需要说明的是，不同膜厚度会对作用效果产生影响，此厚度范围内，显示效果相对更佳。 [0060] 作为本发明的一个具体实施方式，所述支持层包括透明树脂塑料，可见光范围的透光率在85％以上，具体材质包括聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚酯甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC和聚对苯二甲酸乙二醇酯PET中的至少一种，优选PET。 [0062] 作为本发明的一个具体实施方式，如图1所示，本发明提供的试剂片，包括扩散层1、试剂层2和支持层3，通过涂布工艺从上到下依次分层贴合在一起。 [0063] 本发明的工作原理是将血清样本滴在干片上，并通过扩散层均匀地分布到下面的试剂层。液体渗透到试剂层，试剂层含干化学试剂，其中的溴甲酚绿染剂会渗到扩散层与样本中的白蛋白结合，进而将使自由染剂的最大反射光的波长发生偏移。因为白蛋白结合的染剂量与样本中白蛋白的浓度成正比，所以可以通过反射光光度法测定生成的有色复合物量，进而根据样本曲线计算得到血清样本中白蛋白的定量浓度。具体反应步骤如下： [0064] 白蛋白+溴甲酚绿→溴甲酚绿‑白蛋白复合物。 [0065] 第二方面，本发明提供一种定量检测白蛋白的干化学试剂片的制备方法，包括如下步骤： [0066] 步骤1：将试剂层试剂涂布在支持层上，干燥，得到试剂层； [0067] 步骤2：将扩散层试剂涂布在试剂层上，干燥，得到干化学试剂片。 [0068] 作为本发明的一个具体实施方式，干化学试剂片的制备方法，包括如下步骤： [0069] 步骤1：试剂层的制备与涂布 [0070] 分别配制溴甲酚绿钠水溶液、聚乙烯醇(PVA)水溶液、聚氧乙烯月桂醚(Brij‑35)水溶液、氟表面活性剂FS‑31水溶液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)水溶液、苹果酸水溶液。将上述溶液混合后，去除混合溶剂中的气泡和表面泡沫，用涂布机在选用的支持层膜上进行涂布。支持层的可选膜材料有聚乙烯PE、聚丙烯PP、聚酯甲基丙烯酸甲酯PMMA、聚苯乙烯PS、聚碳酸酯PC和聚对苯二甲酸乙二醇酯PET中的至少一种，优选湿膜涂膜厚度为300‑500μm，干燥得涂有试剂层的干片。 [0071] 步骤2：扩散层的制备与涂布 [0072] 聚异丁烯与氟表面活性剂FS‑31配制成混合液；之后，加入第一颗粒物、第二颗粒物；搅拌均匀快速涂膜在已制备好的涂有试剂层的干片上，其中，优选50μm和30μm的聚苯乙烯微球的数量比为1：1，湿膜涂膜厚度为400‑600μm，干燥得可用于体外诊断的白蛋白定量检测干片。 [0073] 本发明提供的用于体外诊断的白蛋白定量检测干片的检测方法如下： [0074] 干片按需要量取出，取10μL血清样本直接滴加，等待5min后，用光密度仪在630nm的波长下测试光密度值，并根据不同浓度下标准品绘制的本发明提供的检测干片白蛋白浓度和光密度值关系曲线，计算出测试的血清样本中白蛋白的浓度。检测限范围：白蛋白浓度10‑60g/L。 [0075] 下面来具体描述本发明的优选实施例阐释本发明的原理，并非用于限定本发明的范围。 [0076] 本发明中，试剂层试剂及扩散层试剂中各组分的用量为所列物质的用量，并不包括溶解该组分的溶剂的用量。 [0077] 如无特别说明，本发明中实施例中所采用的试剂均为市售产品。 [0078] 实施例1 [0079] 1、试剂层的制备与涂布 [0080] 分别配制溴甲酚绿钠水溶液、聚乙烯醇(PVA)水溶液、聚氧乙烯月桂醚(Brij‑35)水溶液、氟表面活性剂FS‑31水溶液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)水溶液、苹果酸水溶液，各组分用量如表1所示。将上述溶液混合后，去除混合溶剂中的气泡和表面泡沫，用涂布机在材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯PET膜的支持层膜上进行涂布，优选湿膜涂膜厚度为400μm，干燥得涂有试剂层的干片，干膜厚度250μm。 [0081] 2、扩散层的制备与涂布 [0082] 聚异丁烯(分子量2400)与氟表面活性剂FS‑31配制成混合液。之后，加入数量比为1：1的微粒粒径为50μm和30μm的聚苯乙烯微球，各组分的用量如表2所示，搅拌均匀快速涂膜在已制备好的涂有试剂层的干片上，湿膜涂膜厚度为500μm，干膜厚度250μm，干燥得可用于体外诊断的白蛋白定量检测干片。 [0083] 表1试剂层配方 [0084] [0085] [0086] 表2扩散层配方 [0087] [0088] 实施例2 [0089] 本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，试剂层制备过程中，亲水性聚合物2 2 2 的用量为90g/m；第一表面活性剂的用量为14g/m；第二表面活性剂的用量为4g/m；三羟甲 2 2 基氨基甲烷的用量为4g/m；苹果酸的用量为15g/m。 [0090] 实施例3 [0091] 本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，扩散层制备过程中，聚异丁烯(分子2 2 量2400)的用量为50g/m，表面活性剂(FS‑31)的用量为0.9g/m，配置成和混合液。 [0092] 实施例4 [0093] 本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，扩散层制备过程中，加入数量比为1：2的微粒粒径为50μm和30μm的聚苯乙烯微球。 [0094] 实施例5 [0095] 本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，扩散层制备过程中，加入数量比为1：1的微粒粒径为60μm和20μm的聚苯乙烯微球。 [0096] 实施例6 [0097] 本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，扩散层制备过程中，加入数量比为1：1的微粒粒径为90μm和50μm的聚苯乙烯微球。 [0098] 实施例7 [0099] 本实施例与实施例1基本相同，不同之处在于，扩散层制备过程中，加入数量比为1：5的微粒粒径为50μm和30μm的聚苯乙烯微球。 [0100] 对比例1 [0101] 本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，试剂层制备过程中，不包含聚氧乙烯月桂醚(Brij‑35)。 [0102] 对比例2 [0103] 本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，扩散层制备过程中，颗粒物只加入微粒粒径为30μm的聚苯乙烯微球。 [0104] 对比例3 [0105] 本对比例与实施例1基本相同，不同之处在于，扩散层制备过程中，颗粒物只加入微粒粒径为50μm的聚苯乙烯微球。 [0106] 实验例：评价制得干片检测血清白蛋白浓度的能力 [0107] 取4小片(每片尺寸1.5cm*1.5cm)同批本发明制得的可用于体外诊断的白蛋白定量检测干片，分别滴加白蛋白标准品浓度为13g/L、20g/L、35g/L、46g/L和62g/L的血清样本(其中，浓度为13g/L、35g/L、62g/L的血清样本为市售复合校准品，其余浓度为市售复合校准品的稀释浓度)，等待5min后用光密度仪在630nm的波长下测试光密度值，其中对应光密度值亦呈现梯度变化关系。实施例和对比例的测试结果如表3所示。 [0108] 滴加浓度分别为13g/L、35g/L、62g/L的市售复合校准品至实施例和对比例上进行反应，重复10次计算变异系数CV，结果如表4所示。 [0109] 其中，实施例1的浓度分别为13g/L、35g/L、62g/L的显示效果如图2所示，光密度值同白蛋白浓度呈现正向变化关系，说明本发明的可用于体外诊断的白蛋白定量检测干片可以对不同浓度白蛋白的血清进行检测区分。 [0110] 表3实施例S1‑S7及对比例D1‑D3的测试结果 [0111] [0112] 表2实施例S1‑S7及对比例D1‑D3的重复性测试结果 [0113] [0114] 由表3和表4可以看出，实施例1与对比例1‑3相比，实施例1的相关系数r2为0.9868，表明光密度与白蛋白浓度呈现良好的线性关系，实施例1的斜率为0.011，表明高浓度和低浓度的光密度差值较大，色差明显。且实施例1的变异系数CV值低于对比例1‑3，重复性符合要求，精密度更好。 |
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