【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、シロアリ腸内由来の微生物を用いたクロロエチレン系化合物の生物分解方法、
特にトリクロロエチレン（ＴＣＥ）を含む排水や廃液の浄化に有用な生物分解方法に関する。 【０００２】 【０００３】 【従来の技術】近年、各種環境調査において、有害で分解されにくい芳香族化学物質が検出されるなど、これらによる環境汚染がクローズアップされてきており、生体系に与えるその影響が懸念されている。 【０００４】従って、これら難分解性化学物質による汚染を防止していくためには、これらの物質を環境に移行させない技術の開発が急務となっており、例えば、排水や廃液中の難分解性有害物質を効果的に除去する技術の確立が強く望まれている。 また、難分解性の有害物質による土壌汚染は、土地の再利用を妨げるばかりでなく、
汚染物質の地下水への流れ込みによる一層の汚染の拡大を引き起こすので大きな社会問題となっている。 従って、これら難分解性化学物質による汚染の拡大を防止していくとともに、汚染された環境を再生していく技術の確立が強く望まれている。 【０００５】特に、ＴＣＥは、ＩＣ産業、ドライクリーニングなどで用いられている有機塩素系化合物であり、
発癌性を有しているといわれ、これによる地下水汚染や土壌汚染の問題を含めＴＣＥによる環境汚染は大きな社会問題となってきている。 従って、環境中に含まれるＴ
ＣＥの除去、分解、あるいはＴＣＥを含む排水や廃液の浄化、及び土壌汚染の修復は環境保全の視点から重要な課題となってきている。 【０００６】ＴＣＥの除去処理や分解処理には、活性炭を用いた吸着処理、光や熱による分解処理等があるが、
コストや操作性の面から微生物を用いた生分解処理が注目され始めている。 【０００７】土壌中で微生物の機能を利用して土壌中の汚染物質を分解、無公害化する技術があり、この技術は、微生物により土壌の修復を行うことからバイオレメディーションと呼ばれており、例えば半導体製造工場跡地、金属加工工場の汚染土壌、化学プラント跡地などの汚染土壌の修復への利用が期待されている。 【０００８】しかし、ＴＣＥの分解能を有する微生物で単離された報告は少ない。 例えば、ＴＣＥ分解能を有する微生物としては、 Welchia alkenophila sero 5 （US
P 4877736, ATCC53570 ）、 Welchia alkenophila sero
33 （USP 4877736, ATCC53571）、 Methylosinus tricho
sprium OB3b （Whittenbury R, J. Gen. Microbiol.6
1: 205-218 (1970) 、 Acinetobacter sp. G4 (Nelson M
JK et al, Appl. Eviron. Microbiol. Aug.: 383-384
(1986); Folsom BR et al, Appl. Environ. Microbiol.
May: 1279-1285 (1990); USP 4925802 、ATCC53617 、
この菌は始めPseudomonas cepaciaと分類されていたが、 Acinetobacter sp. に変更された）Methylomonas s
p. MM2 （Henry SM et al, Appl. Environ. Microbiol.
Jan.:236-244 (1991)）、 Alcaligenes denitrificans
ssp. xylosoxidsans JE75 （Ewers Jet al, Arch. Micr
obiol. 154: 410-413 (1990)）、 Alcaligenes eutrophu
s JMP134 （Harker AR & Kim Y, Appl. Environ. Micro
biol. Apr.: 1179-1181(1990) ）、 Pseudomonas putida
F1 （Gibson DT et al, Biochem. 7: 2653-2662 (196
8); wackett LP & Gibson DT, Appl. Environ. Microbi
ol July: 1703-1708 (1988) ）、 Mycobacterium vaccse
JOB5 （Beam HW & Perry JJ, J. Gen. Microbiol. 8
2: 163-169 (1974); Wackett LP et al, Appl. Enviro
n. Microbiol. Nov.: 2960-2964 (1989), ATCC29678
）、 Nitrosomonas europaea （Arciero D etal, Bioch
em. Biophys. Res. Comm. 159: 640-643 (1989)）、 Pse
udomonas fluoescens PFL12 （Vandenbergh PA & Kunka
BS, Appl. Environ. Microbiol. Oct.: 2578-2579 (19
88)）、 Lactobacillus fuctivorans RE （Kunkee, In
t. J. Syst. Bact. 30: 313-314 (1980); J. Appl. Bac
t. 34: 541-545 (1971)）、 Lactobacillus vaginalis s
p. nov. （Embley TM et al, Int. J. Syst. Bacterio
l. 39: 368-370 (1989), ATCC49540）、 Methylosinus t
richosprium （特開平2ー92274 号公報、特開昭3-292970
号公報）などがあるにすぎない。 【０００９】その上、微生物を用いたＴＣＥの分解方法に用いる場合の実用上の諸条件を満たし、なおかつ十分な分解能を持つという観点で眺めてみると現在既知の菌種の範囲では十分なものは見当たらない。 【００１０】また、特に、土壌中で用いる場合には、土壌中という特殊な環境中での処理であるということを考慮する必要があり、用いる微生物には、十分なＴＣＥの分解活性を有するだけでなく、かつ土壌中でもその活性を有効に発揮できることが要求されるが、従来公知の菌においてはこれらの点が十分であるとはいえない。 【００１１】そこで、実用上要求される特性を満足する菌種の獲得が強く要望されているのが現状である。 【００１２】このような菌種としては、十分なＴＣＥ分解能を有することは無論であるが、既知菌種と生育条件等が異なり、その応用範囲が拡大できるもの、あるいはその利用形態が豊富となるもの、特に土壌という特殊環境でも有効に利用できるものが好ましい。 そのような付加的要件としては、例えば薬剤耐性、糖の利用性等を挙げることができる。 【００１３】例えば、ＴＣＥを含む廃液の処理を想定した場合、用いる微生物は、ＴＣＥの分解能もさることながら、廃液中でダメージを受け難く、廃液という劣悪な環境下でも生育できることが要求される。 すなわち、多くの抗生物質に対して耐性を有し、かつ各種の糖に対して資化能力を持ち合わせている方が劣悪環境下においても良好に生育する可能性が高い。 【００１４】このようにＴＣＥ分解能を有し、かつ従来既知の菌種よりも実用上有利な特性を有する菌種が強く求められている。 【００１５】更に、ＴＣＥだけでなく、テトラクロロエチレン（ＰＣＥ）、ジクロロエチレン（ＤＣＥ）等の有機塩素化合物の生物分解において、汚染土壌等の環境中、すなわち開放系で、生物分解処理を行う場合、汚染サイト、例えば土壌中では、原虫による捕食や他の土着菌による影響などにより、投与した生物分解を行わせる微生物の密度は著しく低く抑えられてしまい、必要処理能力に見合うようにその密度を上げることは極めて困難な場合が多い。 係る密度を上げるために、土壌中に空気を送る、栄養素溶液を圧送するなどの方法が挙げられるが、いずれの方法も多大なエネルギーを必要とするにも拘らず、それだけでは単位体積当りの菌数を効果的に増やすことができず、その処理能力は全体として低いレベルに留まっている状況である。 【００１６】開放系と同様に、反応器内などでの処理、
すなわち閉鎖系での処理においても、菌の密度を維持するには、栄養素の供給、エアレーションなど多大なエネルギーを必要とすることには変わりない。 【００１７】また、有機塩素化合物を分解する微生物は、微生物が係る物質を分解し得る酵素を発現させることによって有機塩素化合物を分解するが、この酵素を発現させるために、誘導物質を必要とする。 この時、この誘導物質の量が多いと微生物の分解活性が上がることが、わずかトリプトファンの例についてのみ知られているが（ＷＯ９０／０６９０１）、具体的にこの誘導物質の量に着目した従来例は全くない。 【００１８】 【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、微生物を利用したＴＣＥの分解方法及び係る微生物を利用した土壌修復方法を提供することにある。 また、ＴＣＥの分解に有用な微生物の取得方法を提供することである。 【００１９】更に、本発明の目的は、有機塩素化合物を分解する微生物の単位菌体あたりの分解活性を高めることであり、それにより、菌数の増加が期待できない土壌中等の開放系でも十分な分解処理能力が得られる有機塩素化合物の生物分解法を提供すること、及び、閉鎖系においても、低い菌数でも、十分な分解処理能力が得られ、菌数の増加や維持にかかるエネルギーやコストを低減できる有機塩素化合物の生分解法を提供することである。 【００２０】 【発明が解決しようとする課題】上記の目的は以下の本発明によって達成される。 【００２１】すなわち、本発明のトリクロロエチレンの生物分解方法は、トリクロロエチレンを含む水性媒体を、トリクロロエチレンの分解能を有するシロアリ腸内由来の微生物であるシュードモナス・セパシアＫＫ０１
株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５）と接触させて、トリクロロエチレンを分解する過程を含むことを特徴とする。 【００２２】また、本発明のトリクロロエチレン分解能を有する微生物は、シロアリ体内から分離した微生物を、トリクロロエチレンを唯一の炭素源として含む培地で培養し、生育した微生物を回収する過程を有する取得
方法により得ることができる。 【００２３】更に、 本発明を利用した土壌修復方法は、
土壌中で、シロアリ腸内由来のトリクロロエチレン分解能を有する微生物とトリクロロエチレンを接触させることによりトリクロロエチレンを分解させて土壌を修復することを特徴とする。 【００２４】また、 本発明において参考となる有機塩素化合物の生物分解方法は、誘導物質によりその分解活性が誘導される微生物を、誘導物質存在下で有機塩素化合物に接触させて、前記有機塩素化合物を分解する生物分解方法であって、加える前記誘導物質の量が、下記式： 【００２５】 【数２】 （上記式は、前記誘導物質の存在下で、前記微生物のバッチ培養を行い、前記微生物の増殖曲線がｙ＝ｆ（ｔ）
（ｙ：光学濃度（Ｏ．Ｄ．）により求められた菌数、
ｔ：培養時間）で近似された時における菌数と培養時間の関係を示すものであり、Ｔは菌数ｙが最大となるときの培養時間を示す）で表われる関係を損なわない量であることを特徴とする。 【００２６】 【００２７】 【００２８】
本発明について以下に詳述する。 【００２９】上述のように、本発明のＴＣＥの生物分解方法は、トリクロロ エチレンを含む水性媒体を、トリクロロエチレンの分解能を有するシロアリ腸内由来の 微生
物であるシュードモナス・セパシアＫＫ０１株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−４２３５）と接触させて、トリクロロエチレンを分解する過程を含むことを特徴とする。 【００３０】 なお、土壌中で、シロアリ腸内由来のトリクロロエチレン分解能を有する 上記微生物と、トリクロロエチレンを接触させることによりトリクロロエチレンを分解させて土壌を修復 することができる 。 【００３１】本発明の方法に用いるシロアリ腸内に由来する微生物は、例えば、シロアリ表面を滅菌的に洗浄し、腸を摘出して適当な溶液中でこれをすりつぶし、得られた腸破砕物を含む混合物の一部を、ＴＣＥの分解能でスクリーニングした株を単離することによって得ることができる。 シロアリとしては、各種シロアリを用いることができ、テングシロアリ属（ Nasutiterminae ）のもの、例えばタカサゴシロアリ（ Nasutitermes takasagoe
nsis ）、 Nasutitermes ephratae 、 Nasutitermes exit
iosus 、 Nasutitermes nigriceps等が好ましい。 なかでも、タカサゴシロアリが特に好ましい。 【００３２】ＴＣＥの分解能を有する微生物のスクリーニング用の培地としては、ＴＣＥのほかに、必要に応じて各種炭素源、窒素源、無機塩類、生育因子などを更に加えたものが利用できる。 例えば、シュードモナス属の細菌の場合は、窒素源として酵母エキストラクト、ペプトンなどを単独で、または組み合わせて用いることができ、無機塩類としては、リン酸水素第一カリウム、塩化アンモニウム等を利用することができる。 ＴＣＥの濃度は適宜選択することができるが、例えば、１〜５００ｐ
ｐｍとすることができる。 培養は、分離すべき微生物の種類に応じた条件で行えば良い。 ＴＣＥのみでは生育できないものを分離する場合には、その生育に必要な炭素源等を含む培地で単離株を調製し、その中からＴＣＥ分解能を有するものを選択すればよい。 【００３３】こうして分離された微生物を用いてＴＣＥ
の分解処理を行うことができる。 分解処理にはＴＣＥの分解能を有する微生物の１種、またはその２種以上の混合系を用いることができる。 混合系を用いる場合には、
組成が分かっているもの、あるいは組成は不明であるがＴＣＥの分解性を示すものが利用できる。 従って、上記のスクリーニングにおける培養に複数種の微生物が含まれている場合でも、それぞれを単離することなくそのまま混合系として利用できる。 本発明では
こうして得られ
た単離株であるシュードモナス・セパシア（Ps. cepaci
a ）ＫＫ０１株を利用する。 【００３４】ＫＫ０１株は、フェノール性化合物単独でも生育してフェノール性化合物を分解でき、また抗生物質耐性を有し、更に後述の実施例において示されているように利用できる糖の範囲が広く、その上ＴＣＥの分解能を有するという特長がある。 【００３５】本発明におけるＴＣＥの分解処理は、廃液などの被処理物中のＴＣＥと上記のシロアリ腸内由来の微生物とを接触させることによっておこなうことができる。 微生物と被処理物との接触は、分解すべきＴＣＥを含む水性液体中で該微生物を培養する、あるいは該水性液体を該微生物の培養系に添加する等の方法によって行うことができ、バッチ法、半連続法、連続法等種々の方式を用いて実施できる。 該微生物は、非固定状態で、あるいは適当な担体に固定化して用いることができる。 廃液等の非処理物は、必要に応じて各種前処理を行ってもよい。 例えば、ＴＣＥの濃度、ｐＨ、各種栄養物質の補充等を行っても良い。 ＴＣＥの分解処理領域内での濃度は、例えば酵母エキストラクト等の他の栄養物質の存在下で、１０ｐｐｍ程度以下に調整するとよい。 【００３６】 土壌の修復は、土壌中でＴＣＥの分解能を有する微生物をＴＣＥと接触させることにより行うことができる。 微生物の土壌への散布は、直接土壌中に微生物を導入する、担体に微生物を付着させてからこれを土壌に導入するなどの方法により行うことができる。 土壌への散布量は、土壌の汚染濃度、栄養状態、温度、酸素濃度などの微生物の土壌中での生残因子を考慮し決定することができる。 【００３７】次に、 本発明に適用し得る参考技術につい<br>て詳述する。 【００３８】本発明者らは、有機塩素化合物を分解する微生物の分解活性を高める方法について、分解時に加える誘導物質の量に着目し、鋭意検討した結果、分解活性を高める誘導物質の量と、誘導物質存在下での微生物のバッチ培養時における初期の増殖曲線の形、即ち、その増殖特性の間に相関関係があることを見出した。 即ち、
分解活性を高めるためには、誘導物質の量は、上記曲線が下記式を満足するところまでの量としなければならないこと
を見出した。 【００３９】この関係の理由は、現在のところ解明できていないが、多くの菌種や条件において、係る関係が確認された。 また、閉鎖系バッチリアクターのみならず、
開放系の連続リアクター、更には、土壌等へのヘテロな複雑な系においても係る関係が適用できることが確認された。 【００４０】
係る方法に用いる微生物としては、有機塩素化合物の分解活性が誘導物質によって誘導され、かつ誘導物質に対する分解活性をも持ち合わせたものであれば制限なく利用できる。 このような微生物としては、未同定の微生物、単離されていない混合系の微生物、共生系の微生物群、単離、同定された微生物等が利用できる。 同定されている微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｍａｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｏｒ属、Ｍｅｔｈｙ
ｌｏｃｙｓｔｉｓ属、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ属に属する細菌等で上記の性質を持つものが利用でき、例えば、メタン共存下中でＴＣＥを分解するＭｅｔｈｙｌｏ
ｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ、フェノールを誘導物質とするＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃ
ｅｐａｃｉａＫＫ０１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４２３５）
等を挙げることができる。 【００４１】分解処理される有機塩素化合物としては、
ＴＣＥ、ＤＣＥ等の塩化エチレンなどをあげることができる。 【００４２】誘導物質は、用いる微生物の種類に応じて選択され、例えば、メタンやフェノール、トルエン、ｏ
−、ｍ−またはｐ−クレゾール等の芳香族化合物が利用される。 【００４３】本発明の方法は、廃水処理や土壌処理等、
閉鎖系及び開放系のいずれの場合にも適用できる。 なお、微生物を担体等に固定して用いたり、生育を促進する各種の方法を併用しても良い。 【００４４】 【実施例】以下実施例により本発明を更に詳細に説明する。 なお、各実施例
及び各参考例で用いたＭ９培地は下記の組成を有するものである。 Ｍ９培地組成（１リットル中）； Ｎａ 2 ＨＰＯ 4 ６．２ｇ ＫＨ 2 ＰＯ 4 ３．０ｇ ＮａＣｌ ０．５ｇ ＮＨ 4 Ｃｌ １．０ｇ （ｐＨ７．０） 実施例１（シロアリ腸内由来の微生物によるＴＣＥの分解及びシロアリ体内からのＴＣＥ分解能を持つ微生物の取得方法）タカサゴシロアリのハタラキシロアリを１０
匹シャーレにとり、エチルアルコール（９５％）をこれに注ぎシロアリ表面を殺菌した。 次に、０．６ｐｐｍのＴＣＥを含むＭ９培地でシロアリを２回洗い、その表面からエチルアルコールを除去した。 洗浄後、シロアリの腸をピンセットで摘み出し、それを０．６ｐｐｍのＴＣ
Ｅを含有するＭ９培地中ですり潰し、腸破砕物を含む液状混合物を得た。 次に、この混合物の一部を、３ｐｐｍ
のＴＣＥ、１０ｐｐｍのフェノール及び０．０５％酵母エキストラクトを含有するＭ９培地に接種し、３０℃で好気条件下で培養した。 所定の培養日数経過時に培地をサンプリングして濾過し、濾液中のＴＣＥの量を常法により求め、その結果から培養日数に応じたＴＣＥの残存率を算出した。 得られた結果を図１に示す。 なお、培養開始時のＴＣＥの量を残存率１００％とした。 この結果から、シロアリ腸内からＴＣＥ分解能を有する微生物が得られることがわかった。 【００４５】実施例２（ＴＣＥ分解能を有する単離菌株の取得及びＴＣＥの分解） 実施例１のＭ９培地（３ｐｐｍのＴＣＥ、１０ｐｐｍのフェノール及び０．０５％酵母エキストラクトを更に含有する）での培養により得られた培地（増殖菌体を含む）を、更にＴＣＥ含有Ｍ９寒天培地（３ｐｐｍＴＣ
Ｅ、５０ｐｐｍフェノール及び１．２％寒天を含む）の表面に塗布し、３０℃で２日間培養した。 いくつかのコロニーが寒天培地上に形成されたので、各々のコロニーを０．６ｐｐｍＴＣＥ、１０ｐｐｍフェノール及び０．
０５％酵母エキストラクトを含むＭ９培地（５ｍｌ）に接種し、３０℃で２日間培養した。 【００４６】次に、バイアル瓶に３０ｍｌの３ｐｐｍＴ
ＣＥ、１０ｐｐｍフェノール及び０．０５％酵母エキストラスクトを含むＭ９培地を入れたものを必要数用意し、それぞれに先の各コロニーから採取した菌体の各培養液（０．１ｍｌ）を個々に接種した後、ブチルゴム栓及びアルミシールで完全密封し、３０℃で培養した。 所定の培養日数経過時にバイアル瓶中のＴＣＥの量をガスクロマトグラフィーを用いたヘッドスペース法により定量し、ＴＣＥの分解が生じているものをＴＣＥ分解菌の単離株とした。 【００４７】単離株の１つについてその菌学的性質を調べたところ下記の結果が得られ、この単離株はフェノール、o-クレゾール、m-クレゾール及びp-クレゾールなどのフェノール性化合物等の分解能を有する新規菌株として通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に平成４
年３月１１日に寄託され、平成５年３月９日付でブダペスト条約に基づく国際寄託に変更されたＫＫ０１株（国際寄託番号 ＦＥＲＭＢＰ−４２３５）と同一であることがわかった。 Ａ． 形態的性状（１）グラム染色：陰性（２）菌の大きさ及び形：長さ１．０〜２．０μｍ、幅０．５μｍ前後の桿菌（３）運動性：ありＢ． 各種培地における生育状況【００４８】 【表１】 Ｃ． 生理的性質（１）好気性、嫌気性の区別：偏性好気性（２）糖の分解様式： 酸化型（３）オキシダーゼの生成： ＋ （４）硝酸銀の還元： ＋ （５）硫化水素の生成： − （６）インドールの生成： − （７）ウレアーゼの生成： − （８）ゼラチンの液化： − （９）アルギニンの加水分解：− （１０）リジンの脱炭酸： ＋ （１１）オルニチンの脱炭酸：− （１２）クエン酸の利用： ＋ （１３）メチルカルビノールアセチル反応（ＶＰ反応）：− （１４）トリプトファンデアミナーゼの検出：− （１５）ＯＮＰＧ： − （１６）炭水化物類の利用性： ブドウ糖： ＋ 果糖： ＋ 麦芽糖： ＋ ガラクトース：＋ キシロース： ＋ マンニット： ± 白糖： − 乳糖： ＋ エスクリン： − イノシット： − ソルビット： − ラムノース： − メリビオース：− アミグダリン：− Ｌ−（＋）−アラビノース：＋ 次に、このＫＫ０１株を０．６ｐｐｍＴＣＥ、１０ｐｐ
ｍフェノール及び０．０５％酵母エキストラクトを含むＭ９培地（５ｍｌ）に接種し、３０℃で２日間培養した。 【００４９】次に、バイアル瓶に３０ｍｌの３ｐｐｍＴ
ＣＥ、１０ｐｐｍフェノール及び０．０５％酵母エキストラクトを含むＭ９培地を入れ、これに先のＫＫ０１株の培養液の０．１ｍｌを接種した後、ブチルゴム栓及びアルミシールで完全密封し、３０℃で培養した。 【００５０】所定の培養日数経過時にバイアル瓶中のＴ
ＣＥの量をガスクロマトグラフィーを用いたヘッドスペース法により定量し、培養日数に応じたＴＣＥの残存率を求めた。 得られた結果を図２に示す。 なお、培養開始時のＴＣＥの量を残存率１００％とした。 【００５１】
参考例１ （シロアリ腸内細菌による土壌修復） タカサゴシロアリのハタラキシロアリを１０匹シャーレにとり、エチルアルコール（９５％）をこれに注ぎシロアリ表面を殺菌した。 次に、０．６ｐｐｍのトリクロロエチレン（ＴＣＥ）を含むＭ９培地でシロアリを２回洗い、その表面からエチルアルコールを除去した。 洗浄後、シロアリの腸をピンセットで摘み出し、それを０．
６ｐｐｍのＴＣＥを含有するＭ９培地中ですり潰し、腸破砕物を含む液状混合物を得た。 次に、バイアル瓶に３
０ｍｌの培地（３ｐｐｍのＴＣＥ、１０ｐｐｍのフェノール及び０．０５％の酵母エキストラクトを含むＭ９培地）を入れ、これに滅菌済土壌を水面まで加え、先に得た腸破砕物を含む液状混合の一部を接種した後、バイアル瓶をブチルゴム栓をし、アルミシールで完全密封してから３０℃で培養した。 所定の培養日数経過時にバイアル瓶中のＴＣＥの量をガスクロマトグラフィーを用いたヘッドスペース法により定量し、培養日数に応じたＴＣ
Ｅの残存率を求めた。 得られた結果を図３に示す。 なお、培養開始時のＴＣＥの量を残存率１００％とした。 【００５２】
参考例２ ＫＫ０１株を０．６ｐｐｍＴＣＥ、１０ｐｐｍフェノール及び０．０５％酵母エキストラクトを含むＭ９培地（５ｍｌ）に接種し、３０℃で２日間培養した。 【００５３】次に、バイアル瓶に３０ｍｌの３ｐｐｍＴ
ＣＥ、１０ｐｐｍフェノール及び０．０５％酵母エキストラクトを含むＭ９培地を入れ、これに滅菌土壌を水面まで加え、更に先のＫＫ０１株の培養液の０．１ｍｌを接種した後、ブチルゴム栓及びアルミシールで完全密封し、３０℃で培養した。 【００５４】所定の培養日数経過時にバイアル瓶中のＴ
ＣＥの量をガスクロマトグラフィーを用いたヘッドスペース法により定量し、培養日数に応じたＴＣＥの残存率を求めた。 得られた結果を図４に示す。 なお、培養開始時のＴＣＥの量を残存率１００％とした。 【００５５】
参考例３ ＫＫ０１株を、５ｍｌの培地（Ｍ９培地に、１ｐｐｍＴ
ＣＥ、０．０５％酵母エキス及び所定濃度のフェノールを添加）に接種し、３０℃で種培養を２日間行った。 【００５６】次に、バイアル瓶に１５ｍｌの培地（Ｍ９
培地に、１ｐｐｍＴＣＥ、０．２％グルタミン酸ナトリウム及び所定濃度のフェノールを添加）を入れ、これに先の種培養の培養液から０．１ｍｌ（菌体を含む）を接種した後、ブチルゴム栓及びアルミシールで完全密封し、３０℃で振盪培養した。 経時的にバイアル瓶内の気相をＯ． １ｍｌ採取し、ガスクロマトグラフィー（島津製作所製：ガスクロマトグラムＧＣ−９ＡＭ）で分析した。 【００５７】また、増殖菌体数は培養液をサンプリングして、培養液の吸光度（６６０ｎｍ）を分光光度計で測定することで求めた。 【００５８】誘導物質であるフェノールの濃度を、０、
１、１０、１００、５００及び１０００ｐｐｍとした場合のＴＣＥの残存率（培養開始時のＴＣＥ量を１００％
として求めた）の変化を図５に、菌体数を表わす光学濃度（Ｏ．Ｄ．）の変化を図６に示す。 【００５９】ここで、誘導物質として用いられるフェノールは、活性化させる菌体に対して餌としての資化性と、それに伴うＴＣＥ分解酵素の発現を促すものであるとともに、一方では、その量が多いと菌増殖阻害を起すものでもある。 従って、菌体に対して害を及ぼさない範囲で、しかも菌体のＴＣＥ分解活性をより高めるフェノールの最大量を求めることが必要となる。 図６より、フェノール濃度０（無添加）の場合、培養１日目でほぼ菌数の最大値（Ｏ．Ｄ．＝１．１７；培養２日目）に近いＯ． Ｄ． ＝１．１３まで増殖し、３日目以降徐々にＯ．
Ｄ． が減少していくことが示されている。 これは、フェノールによって増殖が阻害されていない１つの理想的な増殖を表わす。 しかし、この時はＴＣＥ分解酵素が発現しないので、ＴＣＥ分解は起らない（図５）。 フェノール濃度が１ｐｐｍの場合、１日目のＯ． Ｄ． ＝１．１
２、２日目で最大Ｏ． Ｄ． ＝１．２１とほとんどフェノール濃度が０の場合と菌体の増殖特性は変わらないが、
ＴＣＥ分解はドラスティックに向上していることがわかる（図５）。 フェノール濃度を１０ｐｐｍ、１００ｐｐ
ｍと増加させた場合、それぞれ、１日目のＯ． Ｄ． ＝
０．９６（２日目で最大値Ｏ．Ｄ．＝１．２３）、Ｏ．
Ｄ． ＝０．８３（２日目で最大値Ｏ．Ｄ．＝１．１８）
と徐々に１日目の増殖が阻害されはいるが、菌体数の最大値を与える培養日数とその最大値の値は、フェノール濃度０〜１００ｐｐｍでおおよそ不変であり、最大値以降のＯ． Ｄ． の減少についても同様に酷似している。 【００６０】また、図５より、ＴＣＥも良好に分解されていることがわかる。 特に、１００ｐｐｍの場合，１日で検出器（ＦＩＤ検出器；水素イオン化検出器）の検出限界以下までほぼ１００％分解が進んだ。 【００６１】一方、フェノール濃度が５００ｐｐｍ、１
０００ｐｐｍの時、ＴＣＥの分解はあまり起っていない。 そして、この時、菌体の増殖は、１日目のＯ． Ｄ．
＝０．０７、Ｏ． Ｄ． ＝０．０３と大きな増殖阻害を受けている。 このように、種々の培養増殖曲線とＴＣＥ等の分解能の相関を検討したところ、培養日数に対して最大のＯ． Ｄ． 値を与える日数まで、即ち、初期の培養曲線がほぼ凸型で表現される、つまり、前記誘導物質の存在下で、前記微生物のバッチ培養を行い、前記微生物の増殖曲線がｙ＝ｆ（ｔ）（ｙ：光学濃度（Ｏ．Ｄ．）により求められた菌数、ｔ：培養時間）で近似された時、
下記式【００６２】 【数３】 （Ｔ：菌数ｙが最大となる時の培養時間）を満足する範囲内に誘導物質の量を設定すれば、菌の活性度を高めることができる。 特に好ましくは、この範囲内で最大の誘導物質濃度に設定すれば、菌体当りの活性度を最大に設定することが可能となる。 【００６３】誘導物質が少量でも含まれていれば、菌体の分解活性は高められ、生物分解は進行しているものと思われるが、実際には、誘導物質の濃度が分解すべき有機塩素化合物の濃度の０．２倍以上、更に、０．５倍以上が好ましい。 また、有機塩素化合物の濃度が５ｐｐｍ
以上と高濃度のときには、１倍以上で用いることが良好な結果を与える。 【００６４】
参考例４分解対象物であるＴＣＥの濃度を５ｐｐｍとした他は 参
考例３と同様に実験を行った。 ＴＣＥの残存率の変化を図７に、菌体数を表わすＯ． Ｄ． の変化を図８に示す。 【００６５】ＴＣＥ分解については、フェノール濃度１
００ｐｐｍの場合、１日でＦＩＤ検出器の検出限界以下にまで分解が進み、フェノール濃度１、５及び１０ｐｐ
ｍの場合でも、１日でそれぞれ約６２．９３％及び約９
７％の分解が見られた。 これに対し、フェノールを添加しなかった場合、及びフェノール濃度１０００ｐｐｍの場合のＴＣＥの分解はほとんどみられなかった。 【００６６】一方、菌体増殖に関しては、フェノール濃度１００ｐｐｍまでのものは、いずれも初期増殖曲線が凸型を示しており、培養２日で最大菌数（Ｏ．Ｄ．＝
１．２前後）まで増殖している。 フェノール濃度１００
０ｐｐｍのものは、明らかに増殖阻害を受け、最大菌数に達する日数も１００ｐｐｍまでのものと比べ、１日以上遅れている。 【００６７】
参考例５ ＴＣＥの濃度を３０ｐｐｍとした以外は 参考例３と同様にして培養を行った。 得られた結果を、図９、１０に示す。 【００６８】図９に示したように、ＴＣＥ分解についてはフェノール濃度１００ｐｐｍの場合、１日で約４５％
の分解が見られた。 これに対し、フェノール濃度１００
０ｐｐｍの場合、及びフェノール無添加の場合にはＴＣ
Ｅ分解はほとんど進まなかった。 【００６９】一方、図１０に示したように、増殖は、０
及び１００ｐｐｍのフェノール濃度で同様の過程を示した。 【００７０】また、１０００ｐｐｍのフェノール濃度の時の最大菌数及び最大菌数に達する日数は、０及び１０
０ｐｐｍの時と同様であったが、その初期増殖曲線は凸型を示しておらず、増殖阻害が認められた。 【００７１】上述したようにフェノール濃度が１０００
ｐｐｍの時、菌体数も、最大菌体数までの日数も１００
ｐｐｍの時と同じだったにも拘らずＴＣＥの分解はほとんど進まなかった。 このことは、１００ｐｐｍと１００
０ｐｐｍで同程度の菌体数が培養されていても、係る菌体のＴＣＥ分解能力の活性化は増殖曲線が凸型を示している１００ｐｐｍのほうでしか起っていないことを示している。 【００７２】
参考例６通常、土壌中にはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属等の芳香族化合物資化性菌が存在するといわれている。 そこで、神奈川県にて採取した褐色森林土１ｇをフェノール濃度２
００ｐｐｍに調製したＭ９培地１５ｍｌに加え、３０℃
で振盪培養を３日間行った後、その１００μｌを同様の培地に移して更に３日間３０℃で浸透培養を行った。 これを同様の組成（フェノール２００ｐｐｍ含有）の寒天平板培地上でプレートカウントしたところ、土壌１ｇ当り１０
6から１０ 7個の数種類の菌がカウントされた。 【００７３】芳香族化合物資化性菌の存在が確認された上記土壌１ｇをフェノール濃度を、２００ｐｐｍ、ＴＣ
Ｅ初期濃度を１５ｐｐｍに調製したＭ９培地１５ｍｌに加え、３０℃、１２０ｒｐｍで７日間振盪培養し、上記と同様の方法でＴＣＥの分解率を求めたところ、約５０
％のＴＣＥ分解が見られた。 すなわち、上記土壌中でのフェノールの存在下でＴＣＥを分解する菌の存在が確認された。 【００７４】以上の結果に基づいて、土着の芳香族化合物資化性菌ＴＣＥ分解菌のＴＣＥ分解に及ぼすフェノール濃度について実験を行った。 すなわち、
参考例３と同様にして土壌１ｇ当たりのＴＣＥ分解を測定した。 得られた結果を、図１１、１２に示す。 【００７５】図１１の結果では、フェノール濃度１００
ｐｐｍの場合に最大の分解が見られ、１日で約７０％のＴＣＥ分解が見られた。 次いで、フェノール濃度１０ｐ
ｐｍの場合に、１日で約５０％のＴＣＥ分解が見られた。 また、フェノール濃度１０００ｐｐｍの場合には、
極めてゆっくりとした分解に止まっている。 【００７６】一方、図１２に示したように、増殖に関しては、ＫＫＯ１株と同様に、フェノール濃度が０、１０
及び１００ｐｐｍのものは、いずれも初期増殖曲線が凸型を示している。 １０００ｐｐｍのものは、明らかに増殖阻害を受けている。 【００７７】
参考例７ ＴＣＥで５ｐｐｍ（ＴＣＥ５ｍｇ／ｋｇ湿潤土）に汚染された含水率９０％の滅菌された関東ローム層土壌１０
０ｇを入れたバイアル瓶に１５ｍｌの培地（Ｍ９培地に０．２％グルタミン酸ナトリウム及び所定のフェノール濃度（０、１、５、１０、１００、５００及び１０００
ｐｐｍ（ｍｇ／ｋｇ湿潤土）を添加）とＫＫ０１株（Ｋ
Ｋ０１の種培養液０．１ｍｌ）を加え均一に混合し、ブチルゴム栓及びアルミシールで完全密封し、３０℃で静置培養した。 経時的にバイアル瓶内の気相を０．１ｍｌ
採取し、
参考例 ３と同様にＴＣＥの残留率を求め図１３
に示した。
参考例４の培養系のＴＣＥ５ｐｐｍの場合とほぼ対応する分解能を土壌系の場合にもフェノール濃度によって与えられることが判る。 従って、 参考例４の図７、８の結果を踏まえて、つまりは、バッチ液培養における実験で得られる増殖曲線のデータから、実際の土壌の場合の有効な誘導物質濃度を設定することができる。 【００７８】 参考例８分解対象物としてｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレン（ｃｉｓ−ＤＣＥ）を用い、その濃度を１３ｐｐｍとして 参考例３と同様にして培養を行った。 得られた結果を図１４及び１５に示す。 図１４に示したように、フェノール濃度１００ｐｐｍのときに１３ｐｐｍのｃｉｓ−Ｄ
ＣＥが７日間で１ｐｐｍ以下にまで分解された。 これに対し、フェノール濃度１０ｐｐｍのときには７日間で４
ｐｐｍまで、フェノール濃度１０００ｐｐｍのときには８ｐｐｍまでしか分解が進まなかった。 【００７９】一方、図１５に示したように、初期増殖特性に関しては、フェノール濃度０、１０、１００ｐｐｍ
のものはいずれも凸型を示し、最大菌数Ｏ． Ｄ． ＝１．
２〜１．３が得られ、最大となる培養日数も２日目で一致している。 １０００ｐｐｍのものは、明らかに増殖阻害を受け、最大菌数のＯ． Ｄ． も０．７程度で３日目以降に表われている。 【００８０】
参考例９ ＴＣＥ分解誘導物質としてフェノールの代わりにｐ−クレゾールを用いた以外は 参考例３と同様にして培養を行った。 なお、ＴＣＥの濃度は１５ｐｐｍとし、ｐ−クレゾールの濃度を０ｐｐｍ、１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ及び１０００ｐｐｍと変化させて、ｐ−クレゾール濃度の影響を調べた。 得られた結果を図１６及び１７に示す。 【００８１】図１６に示したように、ｐ−クレゾール１
００ｐｐｍにおいて、ＴＣＥ分解が２日で９８％以上、
ｐ−クレゾール濃度１０ｐｐｍの場合は最大で約６２％
進んだのに対し、ｐ−クレゾール濃度１０００ｐｐｍの場合は約１４％のＴＣＥ分解にとどまった。 【００８２】一方、図１７に示したように、初期増殖特性に関しては、ｐ−クレゾール濃度０、１０及び１００
ｐｐｍのものはいずれも凸型を示した。 １０００ｐｐｍ
のものは明らかに増殖阻害を受けていた。 【００８３】
参考例１０ ＴＣＥ分解菌をＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｐｕｔｉｄａ
ＢＨ株とした以外は
参考例３と同様にして実験を行った。 ただし、培地はｐＨ７．６に調整したＭ９培地を用い、ＴＣＥ濃度は５ｐｐｍに調整した。 結果を図１８に示す。 【００８４】フェノール濃度１００ｐｐｍのものは、初期増殖曲線は凸型を示し、この時１日で約９５％のＴＣ
Ｅ分解が進んだ。 これに対し、フェノール濃度１０００
ｐｐｍのものは、明かに増殖阻害を受け、ＴＣＥもほとんど分解されていなかった。 【００８５】 【発明の効果】本発明によりシロアリ腸内からのＴＣＥ
の分解能を有する微生物の取得方法が確立され、該方法によって廃液等に含まれるＴＣＥの生物分解処理に好適な微生物を取得することができる。 【００８６】また、該取得方法によって得た微生物を用いることで、ＴＣＥを含む廃液等の効率良い生物処理が可能となる。 【００８７】本発明によって土壌中でのＴＣＥ化合物の微生物の分解による実用性の高い土壌修復方法を提供することができる。 【００８８】更に、本発明は有機塩素化合物を分解する微生物の単位菌体当たりの分解活性を高める誘導物質の濃度を初期の菌増殖特性から判断し、低い菌体数でも分解活性を高めた効率のよい生分解反応を提供することができる。
【図面の簡単な説明】 【図１】実施例１でのＴＣＥの残存率の経日的変化を示す図である。 【図２】実施例２でのバイアル瓶内のＴＣＥの残存率の経日的変化を示す図である。 【図３】 参考例１でのバイアル瓶内のＴＣＥの残存率の経日的変化を示す図である。 【図４】 参考例２でのバイアル瓶内のＴＣＥの残存率の経日的変化を示す図である。 【図５】 参考例３でのＴＣＥ分解に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図６】 参考例３でのＫＫ０１株の増殖に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図７】 参考例４でのＴＣＥ分解に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図８】 参考例４でのＫＫ０１株の増殖に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図９】 参考例５でのＴＣＥ分解に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図１０】 参考例５でのＫＫ０１株の増殖に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図１１】 参考例６でのＴＣＥ分解に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図１２】 参考例６での土着菌増殖に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図１３】 参考例７でのＴＣＥ分解に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図１４】 参考例８でのｃｉｓ−ＤＣＥに対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図１５】 参考例８でのＫＫ０１株の増殖に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 【図１６】 参考例９でのＴＣＥ分解に対するｐ−クレゾール濃度の影響を示す図である。 【図１７】 参考例９でのＫＫ０１株の増殖に対するｐ−
クレゾール濃度の影響を示す図である。 【図１８】 参考例１０でのＢＨ１株増殖及びＴＣＥ分解に対するフェノール濃度の影響を示す図である。 ───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 7識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38 (72)発明者 小松 利行 東京都大田区下丸子３丁目30番２号 キ ヤノン株式会社内 (56)参考文献 特開 平３−292970（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−212155（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−92274（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−70753（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−105691（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−22769（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−502277（ＪＰ，Ａ) 特表 平２−503866（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／019738（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl. 7 ，ＤＢ名) C12N 1/00 C12S 13/00 C12N 1/20 C02F 3/34 |
