[0001] 本发明属于海洋生物病原检测技术领域，具体涉及一种用于检测对虾玻璃苗(Vibrio causing translucent post‑larva disease,简称VTPD)致病弧菌的引物及试剂盒。

[0002] 对虾“玻璃苗”(Translucent post‑larva disease，TPD)病害是一种危害养殖对虾的新发疫病，威胁着对虾养殖产业的绿色高质量发展。

[0003] 发明人在研究工作中发现携带有强毒力基因的新型弧菌是导致TPD的病原(VTPD)，基因组测序和毒力因子鉴定结果显示，VTPD内有3个长度不同的质粒，其中180kbd的质粒上携带有编码沙门氏菌毒力蛋白(SpvB)的基因，该基因编码的SpvB蛋白对凡纳滨对虾具有极强的毒性。

[0004] 从组织病理分析结果看，自然感染VTPD凡纳滨对虾虾苗个体中，肝胰腺小管上皮细胞发生坏死及脱落，该现象随着感染时间延长而加重，感染后期肝胰腺小管的管腔中可观察到细菌定植情况；感染早期肠道上皮细胞也出现了坏死和脱落，感染后期肠道上皮细胞严重脱落和消失，仅剩肠道基底膜、环肌与纵肌，肠道内大量细菌定植。在利用VTPD进行人工感染后虾苗患病，且肝胰腺小管上皮细胞也发生了同样的坏死和细胞脱落现象，且随着感染时间延长上皮细胞坏死变得严重，并出现大量细菌定植于坏死组织中。在感染早期，虾苗中肠的上皮细胞也有坏死和脱落现象，感染后期，中肠上皮细胞坏死严重，几乎完全脱离，大量细菌定植在肠道基底膜围成的管腔内。人工回复感染实验表明，VTPD能导致相当比例的凡纳滨对虾虾苗出现“玻璃苗”症状。

[0005] 截至目前，凡纳滨对虾虾苗“玻璃苗”病害在河北、山东和江苏等地沿海养殖凡纳滨对虾中仍大范围发生，所以研究并建立该病害病原微生物的快速检测预警技术，加强凡纳滨对虾亲体、苗种、养殖过程投入品与养殖环境中VTPD的监测，杜绝凡纳滨对虾亲体苗种繁育、养殖过程中VTPD的引入，并积极采取有效防控措施切断VTPD传播，对于降低我国凡纳滨对虾养殖区VTPD的感染率，保障我国凡纳滨对虾育苗和养殖业的高质量发展就显得尤为迫切和重要。

[0006] 进行致对虾“玻璃苗”弧菌早期检测并采取预防措施防止凡纳滨对虾养殖中大规模出现“玻璃苗”病害，仍是当前凡纳滨对虾养殖中降低VTPD流行风险，减少因“玻璃苗”大面积流行造成严重经济损失的有效手段，所以设计VTPD检测引物和探针、建立针对该细菌的现场可用、简单易行的检测方法，并开发适用于VTPD的检测试剂盒成为当下亟待解决的问题。

[0007] 本发明的目的是提供一种用于检测对虾玻璃苗致病弧菌的引物及试剂盒，其中包含有用于特异性检测VTPD的引物组和探针，并建立了一种可以快速灵敏分析致对虾“玻璃苗”弧菌的荧光定量PCR检测方法，从而克服目前产业中无法对致“玻璃苗”病原开展早期检测和预警的难题，使VTPD的检测更便捷、快速和灵敏。

[0008] 本发明首先提供一种用于检测对虾玻璃苗致病弧菌的引物对和探针，该引物组和探针的序列信息如下：

[0009] 上游引物TPD‑SpvB‑F1(SEQ ID NO:1)：

[0010] 5'‑AACTCCCGAAATCCGTCAAG‑3'；

[0011] 下游引物TPD‑SpvB‑R1(SEQ ID NO:2)：

[0012] 5'‑ACACCCAATACTCCAAACGAC‑3'；

[0013] 探针TPD‑SpvB‑P1(SEQ ID NO:3)：

[0014] 5'‑AGGCATGGACCGTAAAGCTCTCAC‑3'。

[0015] 本发明还提供所述的引物对和探针的一种用途，即在制备用于检测对虾玻璃苗致病弧菌的制剂中的应用；

[0016] 所述的制剂，作为实施例的具体记载，为荧光定量PCR检测试剂盒。

[0017] 本发明再一个方面还提供一种检测对虾玻璃苗致病弧菌的试剂盒，所述的试剂盒中包含有上述的引物对和探针。

[0018] 所述的试剂盒，其中还包含有如下的组分：

[0019] 1)扩增试剂及染料，组成成分包含：扩增反应缓冲液，权利要求1所述的引物组和探针；

[0020] 2)阴性对照，内装无VTPD核酸的TE缓冲液；

[0021] 3)阳性对照，内装VTPD的阳性核酸。

[0022] 本发明是提供所述的试剂盒在非疾病诊断治疗目的检测对虾玻璃苗致病弧菌VTPD中的应用。

[0023] 对本发明所设计的检测引物和探针进行性能评估分析，结果显示所设计的引物对和探针能够特异性的检测致对虾“玻璃苗”弧菌，而与常见其他致病菌如金丽假交替单胞菌(CDM8)、芽孢杆菌(20180510028‑2、副溶血弧菌(20200610006‑16)、溶藻弧菌(20150606001‑2)、哈维氏弧菌(20170902102‑3)、欧文氏弧菌(20150709001‑2)、坎贝氏弧菌(20150606027‑2、20150705004‑1、20150824008‑1)的核酸无交叉反应，特异性良好。通过实时荧光定量设备对本发明引物的检测灵敏度进行测试，发现本发明所设计的引物可检测低至1.41拷贝的VTPD靶基因。本发明的检测方法适于水产检疫和检测实验室内使用，因此对于提高VTPD检测水平和防止VTPD的大规模流行，均能起到良好的技术支撑作用。附图说明

[0024] 图1：引物组合1和引物组合2的扩增效率对比结果图，图中“S”型曲线为使用引物组合1和引物组合2分别扩增VTPD(V‑JS20200428004‑2)核酸的结果。

[0025] 图2：引物的特异性检测结果图，图中的1条“S”型曲线为VTPD(V‑JS20200428004‑2)核酸的扩增结果；剩余的直线分别代表金丽假交替单胞菌(CDM8)、芽孢杆菌(20180510028‑2)、副溶血弧菌(20200610006‑16)、溶藻弧菌(20150606001‑2)、哈维氏弧菌(20170902102‑
3)、欧文氏弧菌(20150709001‑2)和坎贝氏弧菌(20150606027‑2、20150705004‑1、
20150824008‑1)的基因组DNA及健康虾组织DNA的扩增结果(因没有扩增，因而线型平直并有部分重合)。

[0026] 图3：引物组合1的灵敏度测试结果图，图中“S”型曲线为引物组合1扩增不同拷贝数人工质粒pMD18‑VTPD的结果。

[0027] 图4：在1.41×109copies/μL的起始模板浓度范围内，扩增Ct值与起始模板浓度的2
回归方程，该方程呈良好的线性关系，R＝0.996。

[0028] 图5：用本发明的荧光定量PCR检测方法检测致对虾“玻璃苗”弧菌VTPD结果图，“S”型曲线自左至右依次使用的模板是：阳性对照，患“玻璃苗”病害的凡纳滨对虾样品编号1‑4；4份健康的凡纳滨对虾样品编号5‑8；阴性对照。

[0029] 本发明从发生“玻璃苗”病害的凡纳滨对虾中分离到致病细菌VTPD，全基因组测序技术克隆获得了VTPD基因组中约180kbp毒性质粒上沙门氏菌质粒毒力蛋白B基因(Salmonella plasmid virulence protein B,SpvB)的保守序列，依据该序列设计了荧光定量PCR的引物和探针。对基于上述引物和探针的荧光定量PCR方法进行优化，对检测特征参数包括检测灵敏度、检测特异性进行测试分析，结果证实，本发明所提供的引物对探针，以及建立的检测方法能够快速、特异和灵敏的检测VTPD。

[0030] 以下通过实施例和附图对本发明作进一步的说明。

[0031] 实施例1致对虾“玻璃苗”弧菌实时RT‑PCR检测引物及探针的设计及筛选[0032] 首先，针对克隆自我国广东和福建等地患“玻璃苗”病害的凡纳滨对虾中分离细菌并全基因组测序技术克隆获得了VTPD基因组中约180kbp毒性质粒上沙门氏菌质粒毒力蛋白B基因(Salmonella plasmid virulence protein B,SpvB)，利用NCBI在线程序Blastn和分子生物学软件BioEitd 7.0比对上述序列的变异情况，选取VTPD的SpvB基因的保守性区序列TM通过在线网站IDT的软件PrimerQuest  Tool设计扩增引物及探针，共设计出1套引物和探针(表1)。

[0033] 表1：依据VTPD毒力蛋白B基因设计的扩增引物和探针表

[0034]

[0035] 分别利用上述设计合成的2套引物组合和探针，按照如下成分配制成反应体系并进行扩增反应(25μL/反应，记作方法1)：扩增反应缓冲液试剂1(FastStart Essential DNA Probes Master；2×cono)8μL，扩增反应缓冲液试剂2(FastStart Essential DNA Probes Master；H2O，PCR grade)8.6μL，引物、探针各0.4μM(0.8μL)，模板1μL，模板为以10倍浓度梯度稀释的质粒标准品pMD18‑VTPD，空白对照为2μL无菌水；然后将配制好的反应试剂置于荧光定量PCR仪( RealPlex 2)上进行95℃预变性1min，40×(95℃变性10s，55.7℃延伸25s)，每分钟(1个cycle)检测一次荧光信号，根据荧光定量PCR仪所记录的扩增曲线对比不同浓度模板的扩增情况，分析确定方法的分析灵敏度(Analytical sensitivity，ASe)并绘制标准曲线。

[0036] 实验结果表明引物组合1在Ct值为12.5‑15.3范围内即可使108的质粒标准品pMD18‑VTPD有效扩增，而引物组合2只能在Ct值为29.0‑31.1值范围内才能有效扩增上述浓度的靶基因，引物组合1的扩增效率最高(图1)。因此引物组合1被用于下一步的特异性和灵敏度分析。

[0037] 分别以高毒力的弧菌VTPD(V‑JS20200428004‑2)、金丽假交替单胞菌(CDM8)、芽孢杆菌(20180510028‑2、副溶血弧菌(20200610006‑16)、溶藻弧菌(20150606001‑2)、哈维氏弧菌(20170902102‑3)、欧文氏弧菌(20150709001‑2)、坎贝氏弧菌(20150606027‑2、20150705004‑1、20150824008‑1)的基因组DNA及健康虾组织DNA为模板，按照上述方法1中反应体系和反应程序进行扩增，测试引物组合1检测VTPD的特异性。扩增结果显示，仅当以VTPD菌株DNA为模板时，扩增反应呈阳性。这说明，引物组合1能够特异性扩增VTPD菌株DNA，而不与上述细菌的核酸发生交叉扩增反应(图2)。

[0038] 配制25μL的PCR反应体系：1μL VTPD的cDNA,2.0μL扩增反应缓冲液试剂1(FastStart Essential DNA Probes Master；2×cono)8μL，2.625μL扩增反应缓冲液试剂2，1μL 10μM上游引物1,1μL 10μM下游引物1，17.375μL RNase Free dH2O，并按照如下程序进行扩增：95℃保温4min,接着35个循环(98℃保温10s，51℃保温30s，72℃保温30s)，最后
72℃延伸7min。将扩增产物进行电泳，用手术刀切出目的条带并进行胶回收，然后将胶回收产物段插入质粒pMD18‑T载体中构建含有VTPD片段的人工质粒pMD18‑VTPD(相关方法参见CMNV质粒的构建方法：Qinlgi Zhang等，Journal of virological methods,2013，187:
9
384‑9)。将含有VTPD目标片段的质粒(1.41×10copies/μL)进行10倍梯度稀释，然后用作模板，按照上述方法1中的反应体系和反应程序进行扩增，分析引物组合1的检测灵敏度。扩增结果显示，引物组合1对含有SpvB靶基因质粒pMD18‑VTPD的最低可检测低至1.41copies/反
9
应的(图3)，且在1.41×10copies/μL的起始模板浓度范围内，扩增Ct值与起始模板浓度呈
2
良好的线性关系，R＝0.996(图4)。

[0039] 实施例2使用本发明的检测试剂盒检测致对虾“玻璃苗”弧菌的方法

[0040] (1)准备4份患“玻璃苗”病害的凡纳滨对虾样品，分别编号为1、2、3、4；准备4份健康的凡纳滨对虾样品，分别编号5、6、7、8；用牙签从1‑4样品中分别蘸取患病组织，从5‑8号样品中蘸取对应组织，在平板培养基上划线；

[0041] (2)将划线的平板在培养箱中倒置过夜培养；

[0042] (3)从上述平板中挑取单菌落到培养基中，在恒温摇床中振荡培养；

[0043] (5)以培养菌液为模板，利用本试剂盒配制反应体系进行RT‑PCR；

[0044] (6)根据标准曲线，将1‑8号菌液Ct值进行换算并得到模板起始浓度；结果显示，患“玻璃苗”凡纳滨对虾样品1‑4循环数在31.5‑33.5，这说明1‑4号样品的VTPD检测结果为阳性；健康凡纳滨对虾样品5‑8号对应的循环数为0(图5)，这说明5‑8号样品的VTPD检测结果为阴性。

[0045] 实施例3使用本发明试剂盒检测各类样品中致对虾“玻璃苗”弧菌存在情况[0046] 从部分省市采集300份凡纳滨对虾样品，使用实施例2中的检测试剂盒对样品进行VTPD的检测分析。

[0047] 检测结果表明相较于套式PCR方法，新开发的VTPD Taqman qPCR方法检测临床样品时的DSe和DSp值分别为100％和81.01％。其中，套式PCR方法检出阳性样品42份，阴性样品258份；此42份样品使用VTPD TaqMan qPCR方法均检出阳性，258份阴性样品中有49份经VTPD TaqMan qPCR方法复检为弱阳性，Ct值在34～39之间。此外，从检出种类来看，养殖南美白对虾、罗氏沼虾样品中均有VTPD阳性检出；从样品来源地来看，山东、江苏、海南等地养殖虾类样品中均有VTPD检出。

[0048] 综上所述，本发明检测试剂盒及其检测方法可以应用于对虾“玻璃苗”样品中弧菌的检测。

[0049] 本发明的试剂盒所使用的试剂和材料：引物和探针由上海生工生物科技有限公司合成；荧光定量PCR的酶及Buffer、dNTP购自Takara公司。上述试剂和材料还可以选用本领域常用的试剂，而不仅限于本发明实施例的具体限定。