[0001] 本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及乳酸乳球菌JYLL‑60及其在制备提高免疫力的产品上的应用。

[0002] 免疫力是人体识别和消灭外来侵入的病毒和细菌，处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。

[0003] 饮食是提高免疫力的重要形式，但由于人们难以正常把控，在实际进行当中往往会造成无节制的营养补充，反而导致肥胖等负面影响。

[0004] 运动同样是增强免疫力较为常见的方法。但现在人们工作生活压力较大，往往在完成一天工作之后还要面对生活压力，对现当代都市人群来讲几乎很难抽出足够时间来保证运动量。而且运动提高免疫力是需要长久性运动才可以，且由于户外空气环境影响，运动往往不尽人意，健身房固然可以提供运动场所，但高昂消费并不适合广大人群。

[0005] 通过大量服用保健品是提高免疫力的一种方法。但目前市面上保健品良莠不齐，往往具有夸大功效，而且保健品价格昂贵，普通消费者难以长久服用。中药饮片也是提高免疫力的方法之一。比如人参、红参、西洋参、鹿茸、燕窝等营养补品，对提高免疫力均有一定的作用，但中药饮片并不适合所有人，不同人不同体质，对饮片需求并不一致，而大众消费者并不很好的区分，以至于经常出现相反的效果。

[0006] 针对普通饮食、运动、服用保健品或中药饮品等方式对免疫力的增强效果有限的技术问题，本发明提供一种乳酸乳球菌JYLL‑60及其在制备提高免疫力的产品上的应用，对于中老年人、体弱患者，本发明提供的乳酸乳球菌JYLL‑60胃肠道的存活率及肠道定植率高，对脾脏淋巴细胞的增殖和NK细胞的存活有积极效果，具有提高免疫力的功效。

[0007] 本发明技术方案如下：第一方面，本发明提供一种乳酸乳球菌JYLL‑60，所述乳酸乳球菌JYLL‑60已于
2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.23353，分类命名为乳酸乳球菌Lactococcus lactis。

[0008] 第二方面，本发明提供一种上述乳酸乳球菌JYLL‑60在制备提高免疫力的产品上的应用。

[0009] 进一步的，所述产品的用量以乳酸乳球菌JYLL‑60的菌数计为2×1010cfu/日，即每10
日每人服用乳酸乳球菌JYLL‑60的菌数为2×10 cfu。

[0010] 进一步的，所述产品中含有乳酸乳球菌JYLL‑60的菌粉。

[0011] 进一步的，所述菌粉的制备方法包括如下步骤：（1）取保藏的乳酸乳球菌JYLL‑60在MRS平板培养基上活化，37℃培养24h；
（2）将活化后的乳酸乳球菌JYLL‑60接种到MRS液体培养基中，37℃培养24h，获得菌液；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15wt%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；
10
（4）调整悬浊液的浓度为1.0‑2.0×10 cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉。

[0012] 进一步的，所述MRS平板培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、七水合磷酸氢二钾2.0g、三水醋酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、七水硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。

[0013] 进一步的，所述MRS液体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、七水合磷酸氢二钾2.0g、三水醋酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、七水硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL。

[0014] 进一步的，所述产品中还含有低聚异麦芽糖。

[0015] 本发明的有益效果在于，本发明提供的乳酸乳球菌JYLL‑60有较强的胃肠道存活率和肠道定植能力，可通过增殖脾脏淋巴细胞与NK细胞的数量实现增强人体免疫力的效果，且没有任何副作用。附图说明

[0016] 图1是本发明实施例5各组小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况对比柱状图。

[0017] 图2是本发明实施例6各组小鼠NK细胞活性对比柱状图。

[0018] 为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

[0019] 实施例1 乳酸乳球菌JYLL‑60的筛选和鉴定一、菌株的筛选
1、菌源：
2019年7月，采集西藏那曲牧民家里自然发酵的酸奶，分离乳酸乳球菌菌株。

[0020] 2、MRS平板培养基：MRS平板培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g、牛肉浸粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 
1.0mL、七水合磷酸氢二钾2.0g、三水醋酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、七水硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、琼脂15.0g、蒸馏水1000mL。

[0021] 将上述组分混合后，自然pH，搅拌均匀后，在121℃、0.1MPa下灭菌20min。

[0022] 3、筛选方法：（1）取西藏那曲牧民家里自然发酵的酸奶1mL，备用。

[0023] （2）取灭菌后的生理盐水（0.85%）至于无菌三角瓶中，然后将步骤（1）的样品加入‑1 ‑2 ‑3 ‑4 ‑5 ‑6 ‑7其中，振荡后进行稀释，稀释梯度为10 、10 、10 、10 、10 、10 、10 、依次标记为1#、2#、
3#、4#、5#、6#、7#。

[0024] （3）将步骤②的1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#溶液分别涂布在MRS平板培养基中，37℃厌氧培养48h。

[0025] （4）按照以下菌落特征挑选菌落：直径1‑2mm，菌落圆润、边缘整齐、微白色中间有凸起。

[0026] （5）根据步骤（4）挑取5个单菌落，采用划线法接种至MRS平板培养基中，于37℃、厌氧条件下培养48h，挑取单菌落，置于甘油管中‑70℃保藏。

[0027] 二、菌种的鉴定将单菌落送去鉴定，鉴定单位为生工生物工程（上海）股份有限公司。

[0028] （1）鉴定过程中，使用的引物如下：27F：5'‑AGAGTTTGATCMTGGCTCAG‑3'；
1492R：5'‑GGTTACCTTGTTACGACTT‑3'。

[0029] （2）鉴定得到的基因序列如下：CTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTTGAGCGCTGAAGGTTGGTACTTGTACCAACTGGATGAGCAGCGAACGGGTGAGTAACGCGTGGGGAATCTGCCTTTGAGCGGGGGACAACATTTGGAAACGAATGCTAATACCGCATAAAAACTTTAAACACAAGTTTTAAGTTTGAAAGATGCAATTGCATCACTCAAAGATGATCCCGCGTTGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCGATGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGGTAGAGAAGAACGTTGGTGAGAGTGGAAAGCTCATCAAGTGACGGTAACTACCCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGTGGTTTATTAAGTCTGGTGTAAAAGGCAGTGGCTCAACCATTGTATGCATTGGAAACTGGTAGACTTGAGTGCAGGAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGCCTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGATGTAGGGAGCTATAAGTTCTCTGTATCGCAGCTAACGCAATAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATACTCGTGCTATTCCTAGAGATAGGAAGTTCCTTCGGGACACGGGATACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATTGTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAACGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACAGTGATGTTTAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGGGAGTTGGGAGTACCCGAAGTAGGTTGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTCCTAAGGTAAGACCGATGACTGGGGTGAAGTCGTA。

[0030] （3）经鉴定该菌为Lactococcus（乳球菌属），Lactococcus lactis（乳酸乳球菌），Lactococcus lactis subsp. lactis（乳酸乳球菌乳酸亚种）。其分类单元为：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Lactobacillales；Streptococcaceae；Lactococcus。

[0031] （4）将该菌株命名为乳酸乳球菌JYLL‑60，送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏信息如下；该乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）JYLL‑60于2021年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：
CGMCC No.23353。

[0032] 实施例2 乳酸乳球菌JYLL‑60产品的制备（1）取保藏的乳酸乳球菌JYLL‑60在MRS平板培养基上活化，37℃培养24h；
（2）将活化后的乳酸乳球菌JYLL‑60接种到MRS液体培养基中，37℃培养24h，获得菌液；
MRS液体培养基包括如下组分：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 
1.0mL、七水合磷酸氢二钾2.0g、三水醋酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、七水硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、蒸馏水1000mL；
（3）将菌液离心后，收集菌体，使用无菌生理盐水洗涤后，重悬于15wt%的复原脱脂乳中，获得悬浊液；
10
（4）调整悬浊液的浓度为1.0‑2.0×10 cfu/mL，获得菌悬液，将菌悬液冷冻干燥后，获得菌粉；
9
（5）将冻干菌粉与低聚异麦芽糖混合，分别制成菌体数量为1×10 cfu/g、1.5×
9 10 10
10cfu/g、1×10 cfu/g、2×10 cfu/g的菌剂。

[0033] 实施例3 乳酸乳球菌JYLL‑60的耐胃肠消化液能力实验（1）制备人工模拟胃液：用9.5%盐酸加蒸馏水稀释至pH值为1.5，每100mL加入1.0g胃蛋白酶，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。

[0034] （2）制备人工模拟肠液：将6.8g的KH2PO4溶于500mL蒸馏水中，加入3g胆盐和10g胰蛋白酶，用浓度为4g/L的NaOH溶液调节溶液pH值至6.8，用蒸馏水定容至1L后，混匀后用0.22μm无菌滤膜过滤，现配现用。

[0035] （3）称取若干份实施例2制得的活菌数为1.5×109cfu/g的产品作为样品，每份样品重量为1g，转移至预热的装有9mL模拟胃液/肠液试管中，分别于37℃、80r/min下处理1h、2h、3h、4h，每个处理3个重复。

[0036] （4）对处理后的样品溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数，再计算存活率，存活率=（处理后菌数/原始菌数）×100%。

[0037] 结果如下表1所示。可以看出乳酸乳球菌JYLL‑60在体外模拟胃肠环境下的存活率非常高，在胃液和肠液中4h，存活率依然在90%以上。为后续菌种定植肠道，发挥功能作用垫定基础。

[0038] 表1 体外模拟胃肠环境下乳酸乳球菌JYLL‑60的存活率实施例4 乳酸乳球菌JYLL‑60对Caco‑2细胞的粘附率对照实验
（1）试验试剂：
DMEM培养基，购于GIBCO公司；
无菌PBS缓冲液，KH2PO4 0.27g、Na2HPO4 1.42g、NaCl 8g、KCl 0.2g，加去离子水约
800mL充分搅拌溶解，加浓盐酸调pH至7.4，加去离子水定容至1L，于121℃灭菌20min， pH=
7.4。

[0039] （2）试验准备：将Caco‑2细胞分别置于含10%热灭活新生牛血清和双抗（青霉素浓度100U/mL、链霉素1.0μg/mL）的DMEM培养液中，于37℃、5%CO2、相对湿度95%的二氧化碳培养箱中孵育，每天换1次培养液，3 4d传代1次，18d后将细胞接种于24孔培养板中，接种密度~5
约为5×10cfu/mL，待细胞长至单层后进行黏附试验；
将活化好的乳酸乳球菌JYLL‑60菌株接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养12h，得到各菌株发酵液，离心收集菌体（4000g，4℃，10min），并用PBS缓冲液洗涤3次，将菌体重
8
悬于无菌PBS缓冲液中，得到浓度为2×10cfu/mL的乳酸乳球菌JYLL‑60菌悬液。

[0040] （3）试验操作：将已长成单层的细胞用无菌PBS缓冲液洗涤2次，每孔加入0.5mL乳酸乳球菌JYLL‑60菌悬液和0.5mL新鲜的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2、相对湿度95%的二氧化碳培养箱中孵育1h，然后用无菌PBS缓冲液漂洗细胞5次，以除去未黏附的细菌，并对处理后的样品溶液进行梯度稀释，使用倾注法做活菌计数，计算出黏附率，黏附率=（初始菌数‑漂洗下的菌数）/初始菌数×100%，每个处理做3个平行。

[0041] 结果如下表2所示，乳酸乳球菌JYLL‑60在细胞定植方面有较强的能力。

[0042] 表2 乳酸乳球菌JYLL‑60的细胞黏附能力实施例5 乳酸乳球菌JYLL‑60对小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应
采用免疫功能低下模型动物进行试验，将雄性小鼠60只，适应期5天，随机分为3组（空白组、模型组、和实验组），每组各20只小鼠。动物饲养保持环境温度为21±2℃，湿度为
30% 70%，12h光照交替，自由饮水，自由摄入饲料。每三天换一次垫料，及时添加饲料和水。
~

[0043] （1）空白组：小鼠每天灌胃2mL无菌生理盐水，共持续30天。

[0044] （2）模型组：连续20天每天灌胃2mL无菌生理盐水，第21天开始每天腹腔注射40mg/kg免疫抑制剂环磷酰胺，共注射10天。

[0045] （3）实验组：连续20天每天灌胃2mL无菌生理盐水，第21天开始每天服用2g乳酸乳9
球菌JYLL‑60菌粉（浓度为1.0×10cfu/g），共服用10天。

[0046] 从空白组、模型组、实验组三组随机各抽取1只小鼠，处死小鼠，无菌取脾脏，用眼科剪将脾脏剪碎后，用无菌的玻璃注射器芯将其碾碎，经200目金属筛网过滤后，加入含10%胎牛血清的无菌Hank’s液，1000r/min、4℃离心5min，收获细胞。加入5倍于细胞体积的细胞裂解液，裂解5min，加入含10%胎牛血清的无菌Hank’s液终止裂解，1000r/min、4℃离心5min去上清。用含10%胎牛血清的RPMI‑1640培养基洗涤两次，洗涤方式为1000r/min、4℃离心5min，沉淀重悬于5mL含10%胎牛血清的RPMI‑1640培养基中，调整脾脏淋巴细胞浓度为5×
6
10cells/mL，得到脾脏淋巴细胞悬液。

[0047] 乳酸乳球菌JYLL‑60菌悬液（1.0×109cfu/mL，制备方法同实施例2步骤（1）‑（4））在4000r/min室温下离心10min去上清，PBS洗涤两次，加入适量含10%胎牛血清的RPMI‑1640培养基，调整其OD600至0.50±0.10，制得样品一。

[0048] 将三组脾脏淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板，其中，对于空白组脾脏淋巴细胞悬液，每孔加入细胞培养基100μL；对于模型组脾脏淋巴细胞悬液，每孔加入细胞培养基100μL+10μg/mL免疫抑制剂环磷酰胺100μL；实验组每孔加入细胞培养基100μL+10μg/mL免疫抑制剂环磷酰胺100μL+10μg/mL样品一100μL），置二氧化碳培养箱37℃培养72h。每孔加入20μL MTT溶液（2.5mg/mL），37℃显色4h后，1500r/min，4℃离心10min，吸出上清，再加入100μL DMSO，用酶标仪于490nm下测定吸光值。

[0049] 结果如图1所示。可以看出，实验组显著促进了脾淋巴细胞的增殖。OD值从0.197分别提高0.322（＊＊P<0.01）。相比于模型组小鼠的OD值是空白对照组的58%，该菌株小鼠的OD值达到空白对照组的85%。该实验表明了添加乳酸乳球菌JYLL‑60益生菌有助于淋巴细胞的增殖，对提高免疫力具有促进作用。

[0050] 实施例6 NK细胞活性实验5
采用LDH法检测NK细胞活性。取浓度为4×10个/mL的YAC‑1靶细胞和效应细胞（空白组、模型组、实验组的NK细胞）各100μL（效靶比50：1），加入U型96孔培养板；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1% NP‑40各100μL；上述各项均设三个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养4小时，然后将96孔培养板以1500rpm离心
5min，每孔吸取上清100 μL置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100 μL，反应3min，每孔加入30μL 1mol/L HCl，在酶联仪492nm处测定光密度值。

[0051] 结果如图2所示，与模型组相比，实验组的NK细胞活性从51.9%提高到78.6%（＊＊P<0.01），这表明乳酸乳球菌JYLL‑60显著增强NK细胞的活性特点，对提高免疫力极具促进作用。

[0052] 实施例7 人群试验在山东本地某敬老院，选取146名年龄65‑75周岁的志愿参加试验的健康老人，随机分成2组（试验组、对照组各73人），于2021年11月8日至2022年1月8日进行试验。试验组每
10
天服用实施例2菌剂（菌体数量共计2.0×10 cfu）。试验结果如表3所示。

[0053] 表3 人群试验结果（单位：人）北方冬季寒冷，是流感高发季节，免疫力的强大有助于老人身体健康。试验组服用乳酸乳球菌JYLL‑60，在冬季2个月试验期间仍有60名老人经敬老院医护人员鉴定健康，约占试验人群的82%；共有15位老人发生感冒咳嗽及发烧症状，其中8人在不服用抗生素的药物治疗下即可痊愈，5人必须通过输液治疗才能痊愈。而相比较对照组，整个试验期间，未生病老人仅有44人，约占总实验人数60%，生病人群共有29人，输液治疗更是达到14人，接近试验组的3倍。由此可见，服用本发明乳酸乳球菌JYLL‑60产品有助于提高人体免疫力。

[0054] 尽管通过优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。