一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202311324101.X | 申请日 | 2023-10-12 |
| 公开(公告)号 | CN117343981A | 公开(公告)日 | 2024-01-05 |
| 申请人 | 上海交通大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 徐建雄; 罗振; 马升; | 第一发明人 | 徐建雄 |
| 权利人 | 上海交通大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 上海交通大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：上海市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：上海市徐汇区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：上海市徐汇区华山路1954号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：200030 |
| 主IPC国际分类 | C12P39/00 | 所有IPC国际分类 | C12P39/00 ; C12P7/42 ; C12N1/20 ; C12N1/16 ; C12R1/125 ; C12R1/23 ; C12R1/645 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 4 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 常州市夏成专利事务所 | 专利代理人 | 王敏; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种利用 发酵 金针菇菇根制备丁香酸的方法，具体为将 粉碎 灭菌后的金针菇菇根与枯草芽孢杆菌、 酵母 菌和嗜酸乳杆菌混合发酵，通过 益生菌 发酵对金针菇菇根成分进行 生物 转化，提高其生物学利用率，增加酚酸类物质如丁香酸的含量，在体内外证实相比较于发酵前，发酵后具有更好的自由基清除能 力 和抗 氧 化能力。 | ||
| 权利要求 | 1.一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法技术领域背景技术[0002] 丁香酸是蔬菜、水果等植物体内含量丰富的酚类化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和神经保护等作用，它在预防糖尿病、心血管疾病、癌症、脑缺血等方面具有应用潜力，被广泛应用于医药和化工等行业。传统的丁香酸制备及合成常以没食子酸或丁香醛为原料，通过氧化、水解等化学反应获得，但往往具有价格高、副产物较多、纯度差等特点。 [0003] 木质素是植物细胞壁的主要成分之一，主要由苯丙烷基团通过醚键或碳键连接而成的含酚的高分子聚合物，含有丰富的丁香醛化合物，为丁香酸的获得提供了可持续的原料。目前，从植物基质中提取结合态多酚的主要方法包括化学水解(酸、碱水解)和物理辅助水解(微波、超声)等，通过破坏酚类化合物与细胞壁连接的醚键、酯键或糖苷键，释放酚类化合物，但也存在反应时间长、易降解等特点。金针菇富含丰富的维生素、多糖、粗纤维和木质素等成分，具有抗氧化、免疫调节和降低胆固醇等多种生物学功能。金针菇企业生产过程中会产生大量的副产物如菇根、菌糠等，如何实现金针菇废弃物的资源化利用，也是食品生产企业亟需解决的重要问题。 [0004] 微生物发酵是一种传统的生物工艺，在食品工业中因其可改善口感、增加营养和功能性成分，减少抗营养物质而受到广泛关注。微生物产生的水解酶可破坏细胞壁和糖苷类物质，释放和转化酚类化合物，具有反应温和、低成本、效率高、低污染等优点。此外，与单菌种发酵相比较，微生物共培养和联合发酵能有效增加酚类物质含量及其生物利用性。然而目前还没有通过微生物联合发酵金针菇菇根产生酚酸类物质如丁香酸的专利。 发明内容[0005] 本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法。 [0006] 本发明通过以下技术方案来实现上述目的，一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法，包括以下步骤： [0007] ①菌种活化和培养 [0008] 从液氮中分别取出装有枯草芽孢杆菌CMCCB 63501、酵母菌ATCC 9763以及嗜酸乳杆菌CGMCC 1.12735的保存管，置于37℃的水浴中，轻轻摇动1‑2min，至冰完全溶解，在无菌操作台上，用灭菌金属环蘸取菌液，以划线法接种于培养基，待菌液吸收完全后，将接种好的培养基倒置放于培养箱中进行培养1‑2d后，用接种环挑取典型菌落，接种在平板培养基中，继代划线3次，长出菌落后，挑取长势良好的单克隆菌落接种于液体培养基中培养，作为种子液； [0009] 采用TSB液体培养基培养枯草芽孢杆菌CMCCB 63501，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01M PBS缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬 9 液浓度约为10CFU/mL； [0010] 采用YPD液体培养基培养酵母菌ATCC 9763，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01M PBS缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬液浓 8 度约为10CFU/mL； [0011] 采用MRS液体培养基培养嗜酸乳杆菌CGMCC 1.12735，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01M PBS缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬 9 液浓度约为10CFU/mL； [0012] ②金针菇菇根处理 [0014] ③最优发酵条件的选择 [0015] 先采用最陡爬坡试验确定发酵的最佳混合发酵时间、菌种接种量以及含水量，试验结果表明，在混合发酵时间为36h、菌种接种量为1.25％、含水量为40％时，发酵后产生的丁香酸含量最高； [0016] 再依据最陡爬坡试验，选择混合发酵时间(A)、菌液接种量(B)、发酵物含水量(C)为3个因素，以丁香酸含量为响应值设计Box‑Behnken试验，对实验结果进行多元回归分析，得到二次回归方程模型： [0017] Y＝22.63‑0.351*A‑0.601*B+0.930*C‑2.069*A2‑2.894*B2‑3.542*C2‑[0018] 0.285*AB‑1.203*AC‑0.888*BC； [0019] 绘制响应曲面，并最终确定最优发酵条件为混合发酵时间为38h、混菌接菌量1.25％、水分含量40％； [0020] ④发酵制备丁香酸 [0021] 将枯草芽孢杆菌CMCCB 63501的菌液按照1：80比例与粉碎灭菌后的金针菇菇根混合，混合均匀后补充无菌水，控制水分在40％，37℃发酵72h，再将酵母菌ATCC 9763和嗜酸乳杆菌CGMCC 1.12735的菌种分别按照同样比例加入枯草芽孢杆菌CMCCB 63501与金针菇菇根的发酵液中，继续30℃发酵38h，测定活菌数≥5.0*109cfu/L的发酵液，即为金针菇菇根复合发酵菌液； [0022] ⑤检测金针菇菇根复合发酵菌液中的丁香酸 [0023] 采用高效液相色谱法对金针菇菇根复合发酵菌液进行分析，结果表明，与发酵前相比较，发酵后的金针菇菇根复合发酵菌液中丁香酸含量显著升高，丁香酸从0％增加至22.22％； [0024] ⑤金针菇菇根复合发酵菌液氧化应激分析 [0025] 试验设计如下： [0026] 试验选取40只4周龄、体重18‑22g的BALB/c雄性小鼠，随机分为4组，每组10只，分为对照组、模型组、发酵前组和发酵后组，对照组和模型组饲喂基础日粮，发酵前组在饲喂基础日粮基础上每天灌胃2mL发酵前溶液(按50mg/kg体重灌胃量计算)；发酵后组在饲喂基础日粮基础上每天灌胃2mL发酵后溶液(按50mg/kg体重灌胃量计算)；试验周期为60天，饲喂59天后，在最后一天模型组、发酵前组和发酵后组腹腔注射2mL、浓度为3mg/kg脂多糖(LPS)，对照组注射等体积生理盐水，试验结束后采集血清测定氧化应激指标。 [0027] 优选地，所述TSB液体培养基中，每升培养基含胰酪蛋白胨15g，大豆蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，pH 7.3；所述YPD液体培养基中，每升培养基含葡萄糖20g，酵母粉5g，蛋白胨10g；所述MRS液体培养基中，每升培养基含蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖 20.0g、吐温80 1.0mL、K2HPO4·7H2O 2.0g、CH3COONa·3H2O 5.0g、柠檬酸铵2.0g、MgSO4· 7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g。 [0028] 优选地，所述BALB/c雄性小鼠购自，所有小鼠均在25±2℃、相对湿度55±5％、光照/黑暗循环12h的标准条件下饲养，自由饮水。 [0030] 本发明的有益效果是：本发明公开的一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法，通过益生菌发酵对金针菇菇根成分进行生物转化，提高其生物学利用率，增加酚酸类物质如丁香酸的含量，在体内外证实相比较于发酵前，发酵后具有更好的自由基清除能力和抗氧化能力。附图说明 [0031] 图1为本发明金针菇菇根发酵影响因素交互作用响应面图； [0032] 图2为本发明金针菇菇根发酵前后的高效液相色谱分析结果图，图2中(A)为多酚液相色谱酚类标准品液相色谱图；图2中(B)为金针菇发酵前(FVPP)和发酵后(FFVPP)液相色谱图；1：没食子酸；2：绿原酸；3：咖啡酸；4：丁香酸；5：表儿茶素；6；阿魏酸；7：芦丁；8：根皮苷；9：白藜芦醇；10：槲皮素； [0033] 图3为本发明金针菇菇根发酵前(FVPP)和金针菇菇根发酵后(FFVPP)的自由基清除能力比较图；图3中(A)为DPPH清除能力；图3中(B)为OH清除能力；图3中(C)为O2‑清除能力；图3中(D)为T‑AOC，*表示P<0.05，**表示P<0.05。 [0034] 图4为本发明金针菇菇根复合发酵前后对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型对ROS含量的影响图，图中**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)，不同字母表示差异显著(P<0.05)。 具体实施方式[0035] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0036] 本发明中所用到仪器如下： [0037] 离心机：型号Beckman Coulter Microfuge 20R； [0038] 粉碎机：五两装高速万能粉碎机，QE‑250g； [0039] 高压锅：立式压力蒸汽灭菌器，BXM‑50； [0040] DCFH‑DA探针：Dojindo，R252。 [0041] 本发明中所采用的枯草芽孢杆菌CMCCB 63501、酵母菌ATCC 9763以及嗜酸乳杆菌CGMCC 1.12735均由上海创博生态工程有限公司提供。 [0042] 实施例1利用发酵金针菇菇根制备丁香酸预处理 [0043] ①菌种活化和培养 [0044] 从液氮中分别取出装有枯草芽孢杆菌CMCCB 63501、酵母菌ATCC 9763以及嗜酸乳杆菌CGMCC 1.12735的保存管，置于37℃的水浴中，轻轻摇动1‑2min，至冰完全溶解，在无菌操作台上，用灭菌金属环蘸取菌液，以划线法接种于培养基，待菌液吸收完全后，将接种好的培养基倒置放于培养箱中进行培养1‑2d后，用接种环挑取典型菌落，接种在平板培养基中，继代划线3次，长出菌落后，挑取长势良好的单克隆菌落接种于液体培养基中培养，作为种子液； [0045] 采用TSB液体培养基培养枯草芽孢杆菌CMCCB 63501，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01M PBS缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬 9 液浓度约为10CFU/mL； [0046] 采用YPD液体培养基培养酵母菌ATCC 9763，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01M PBS缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬液浓 8 度约为10CFU/mL； [0047] 采用MRS液体培养基培养嗜酸乳杆菌CGMCC 1.12735，培养条件为：35℃恒温培养28h，4000r/min离心15min后收集菌体，利用0.01M PBS缓冲液清洗两次后重悬，调整菌株悬 9 液浓度约为10CFU/mL； [0048] 所述TSB液体培养基中，每升培养基含胰酪蛋白胨15g，大豆蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，pH 7.3；所述YPD液体培养基中，每升培养基含葡萄糖20g，酵母粉5g，蛋白胨10g；所述MRS液体培养基中，每升培养基含蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、K2HPO4·7H2O 2.0g、CH3COONa·3H2O 5.0g、柠檬酸铵2.0g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g； [0049] ②金针菇菇根处理 [0050] 将金针菇菇根通过粉碎机粉碎后，通过0.75mm筛子，粉碎后的菇根使用高压锅蒸汽灭菌，条件为100kPa压力下，温度120℃灭菌20min； [0051] 实施例2最优发酵条件的选择 [0052] 2.1最陡爬坡试验 [0053] 表1最陡爬坡设计及结果 [0054] [0055] 最陡爬坡试验的试验设计及结果如表1所示，由表1可知，金针菇发酵物中丁香酸含量在试验4附近达到最高，故以第4组试验条件为水平中心点进行正交实验设计。 [0056] 2.2Box‑Behnken试验 [0057] 依据最陡爬坡试验，选择混合发酵时间(A)、菌液接种量(B)、发酵物含水量(C)为3个因素，以丁香酸含量为响应值设计Box‑Behnken试验，Box‑Behnken试验设计及结果如表2所示。 [0058] 表2Box‑Behnken试验结果 [0059] [0060] 对实验结果进行多元回归分析，得到二次回归方程模型： [0061] Y＝22.63‑0.351*A‑0.601*B+0.930*C‑2.069*A2‑2.894*B2‑3.542*C2‑[0062] 0.285*AB‑1.203*AC‑0.888*BC。 [0063] 表3回归模型方差分析 [0064] [0065] 注：*表示统计结果显著，P＜0.05。 [0066] 根据上述回归方程和回归模型方差分析绘出响应曲面，如图1所示，结合各因素差异显著性，通过求解回归方程得到金针菇发酵的最佳发酵条件为：确定最优组合为混菌发酵38h、混菌接菌量1.25％、水分含量40％。 [0067] 实施例3发酵制备丁香酸 [0068] 将枯草芽孢杆菌CMCCB 63501的菌液按照1：80比例与粉碎灭菌后的金针菇菇根混合，混合均匀后补充无菌水，控制水分在40％，37℃发酵72h，再将酵母菌ATCC 9763和嗜酸乳杆菌CGMCC 1.12735的菌种分别按照同样比例加入枯草芽孢杆菌CMCCB 63501与金针菇菇根的发酵液中，继续30℃发酵38h，测定活菌数≥5.0*109cfu/L的发酵液，即为金针菇菇根复合发酵菌液。 [0069] 实施例4金针菇菇根复合发酵前后的成分分析 [0070] 采用高效液相色谱分析对金针菇菇根复合发酵菌液进行分析，结果如表4和图2所示，金针菇菇根由没食子酸、绿原酸、阿魏酸、芦丁和槲皮素组成，与发酵前相比较，发酵后丁香酸和槲皮素含量显著升高，其中丁香酸从0％增加至22.22％，绿原酸和芦丁含量显著降低，没食子酸和阿魏酸变化不大。 [0071] 表4多酚的组成及比例 [0072] [0073] 实施例5金针菇菇根复合发酵前后的自由基清除能力比较 [0074] O2‑清除能力的测定方法：以0.1M、pH为7.4的磷酸缓冲液为溶剂，分别配置150μM的氯化四唑氮蓝溶液(NBT)、468μM的还原型β‑烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和60μM的5‑甲基吩嗪硫酸甲酯溶液(PMS)，分别取1ml金针菇菇根复合发酵前、后溶液与1mL NBT溶液、1mL NADH溶液和1mL PMS溶液混匀，室温条件下反应5min，在波长为560nm处测定吸光度，结果记为OD样品。用1mL 0.1M的磷酸缓冲液代替样品作为对照管，进行相同处理，在波长为560nm处测定吸光度(722s可见分光光度计)，结果记为OD对照， [0075] [0076] OH‑清除能力测定方法：将1mL 0.4M、pH为7.4的磷酸盐缓冲液、1mL 2.5mM的菲罗啉(phenanthroline)、1mL 2.5mM的硫酸亚铁(FeSO4)和0.5mL 0.01％w/v的过氧化氢(H2O2)溶液与分别与1ml金针菇菇根复合发酵前、后溶液混合，37℃水浴60min，在536nm处测定吸光度，记为OD样品，以1.5ml去离子水替代样品溶液和0.5mL 0.01％w/v的过氧化氢混合，37℃水浴60min，在536nm处测定吸光度，记为OD对照，以1ml去离子水替代样品溶液，37℃水浴60min，在536nm处测定吸光度，记为OD空白， [0077] [0078] 结果如图3所示，发酵后自由基清除能力和总抗氧化能力T‑AOC高于发酵前，而OH‑和O2‑清除能力差别不显著，表明发酵后自由基清除能力和抗氧化能力更强。 [0079] 实施例6金针菇菇根复合发酵前后对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型对ROS含量的影响 [0080] 于中科院细胞库中获取RAW264.7细胞，采用含有10％胎牛血清(10091148，GIBCO)、1％双抗(15140122，Gibco)和DMEM培养基的工作液，在温度37℃、5％ CO2培养箱中正常培养。 [0081] 将细胞接种于96孔黑酶标板，分为对照组、1μg/mL LPS处理24h组、FVPP组(1μg/mL LPS分别添加25、50和100μg/mL FVPP处理24h)和FFVPP组(1μg/mL LPS分别添加25、50和100μg/mL FFVPP处理24h)，处理结束后PBS洗涤细胞2次，将10μM DCFH‑DA探针加入细胞中，37℃下孵育20min，然后用PBS洗涤细胞2次，在激发和发射波长为485/525nm时，采用酶标仪检测荧光强度，测定活性氧(ROS)值。 [0082] ROS(％)＝100％(处理组‑空白组)/(对照组‑空白组) [0083] 结果如图4所示，与对照组相比，LPS组ROS含量显著升高，FVPP组和FFVPP组金针菇菇根ROS含量降低。当FVPP和FFVPP的添加量均为100μg/mL时，FFVPP组的ROS含量显著低于FVPP组(P<0.05)。 [0084] 实施例7金针菇菇根复合发酵菌液氧化应激分析 [0085] 试验设计如下： [0086] 试验选取40只4周龄、体重18‑22g的BALB/c雄性小鼠，随机分为4组，每组10只，分为对照组、模型组、发酵前组和发酵后组，对照组和模型组饲喂基础日粮，发酵前组在饲喂基础日粮基础上每天灌胃2mL发酵前溶液(按50mg/kg体重灌胃量计算)；发酵后组在饲喂基础日粮基础上每天灌胃2mL发酵后溶液(按50mg/kg体重灌胃量计算)；试验周期为60天，饲喂59天后，在最后一天模型组、发酵前组和发酵后组腹腔注射2mL、浓度为3mg/kg脂多糖(LPS)，对照组注射等体积生理盐水，试验结束后采集血清测定氧化应激指标，结果如表5所示。 [0087] 所述BALB/c雄性小鼠购自，所有小鼠均在25±2℃、相对湿度55±5％、光照/黑暗循环12h的标准条件下饲养，自由饮水。 [0088] 所述鼠基础饲粮购自于江苏省协同医药生物工程有限责任公司，饲料型号为D12492J。 [0089] 由表5可知，与对照组相比，模型组血清H2O2和丙二醛(MDA)增加，过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化酶(GPx)和超氧化物歧化酶(SOD)减少，表明LPS诱导小鼠产生严重的氧化应激；与模型组相比，饲喂发酵前和发酵后金针菇多酚组血清H2O2和MDA显著降低，CAT、GPx和SOD显著升高。而且与发酵前相比较，发酵后组H2O2和MDA显著降低，CAT、GPx和SOD显著升高，表明在体内减少氧化应激方面，发酵后组效果优于发酵前。 [0090] 表5血清氧化应激指标 [0091] [0092] 综上所述，本发明公开的一种利用发酵金针菇菇根制备丁香酸的方法，通过益生菌发酵对金针菇菇根成分进行生物转化，提高其生物学利用率，增加酚酸类物质如丁香酸的含量，在体内外证实相比较于发酵前，发酵后具有更好的自由基清除能力和抗氧化能力。 [0093] 对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。 [0094] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。 |
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