[0001] 本发明涉及功能微生物筛选与应用技术领域，具体涉及一种丁酸梭菌及其在畜禽养殖中的应用。

[0002] 在动物养殖中，肠道健康水平对动物的整体健康及其生产水平与效率起着重要作用。近年，随着限用以及禁用抗生素的时代到来，畜禽肠道健康问题日益突出。尤其在现阶段，家禽大规模的养殖环境条件不佳以及饲料营养科学性欠缺的情况下，其胃肠生理状态的好坏直接影响营养物质的消化和吸收，以及机体抗病能力和生产性能的高低，容易引发肠道疾病发生率居高不下。其中，坏死性肠炎是禽养殖肠道疾病中最严重的疾病之一，尤其对于肉鸡是普遍存在的疾病，重创全球禽养殖经济效益，造成全球经济每年超过60亿美元的损失（Wade等，2015）。

[0003] 针对禽坏死性肠炎研究发现，发病阶段球虫在肠道定殖，破坏了上皮细胞正常功能，导致内容物渗漏或者降低肠道消化率，为梭菌增殖提供条件。患病动物的每克肠道产气7 9
荚膜梭菌数量可达到10‑10 CFU（Kondo, 1988）。产气荚膜梭菌引起的细菌感染可造成肉鸡肠道严重的炎症反应。在球虫和产气荚膜梭菌的共同影响下，引发坏死性肠炎。进而降低肉鸡生产力，引起疾病的发生，最终对肉鸡养殖业造成巨大经济损失。

[0004] 如何改善肉鸡的肠道健康水平以及预防和降低坏死性肠炎疾病的发生，提高肉鸡的生产效率，已成为肉鸡养殖行业的一个研究热点。微生态制剂作为一种健康、安全、环保的饲料添加剂走入了人们的视野，逐渐得到了广泛的研究和推广。微生态制剂被定义为一类对宿主有益，并且能够平衡肠道菌群的活性益生菌剂。国内外饲用微生态制剂的微生物主要包括芽孢杆菌属、乳酸杆菌属、酵母菌属、及肠球菌等。由于益生菌能够与宿主共同作用，从而提高其免疫力与肠道形态的健康程度，最后达到减少感染潜在致病菌几率的目的。一个被广泛接受的机理是，益生菌能够在宿主肠道中竞争性抑制病原菌，达到防控疾病发生的目的。在2010年6月，欧盟已经批准了使用芽孢杆菌PB6作为商品菌使用从而防治家禽细菌性肠炎疾病。Jayaraman等研究发现，饲喂芽孢杆菌PB6能够降低肉鸡感染坏死性肠炎
50%的死亡率。Cao等研究发现，在肉鸡饲料中添加发酵乳杆菌1.2029能够有效减少产气荚膜梭菌对肉鸡回肠造成的炎症。

[0005] 时至今日，微生态制剂替代抗生素的呼声越来越高，绿色、安全、高效的精准微生态制剂的筛选和科学推广越来越受青睐，为实现绿色养殖，减少抗生素添加具有重要的作用。

[0006] 本发明为解决现有技术问题，提供了一种丁酸梭菌（Clostridium butyricum）及其应用。所述丁酸梭菌筛选自白羽肉鸡盲肠内容物，产酸能力强，对多种病原菌具有显著的抑制效果，能有效提高肉鸡的抗病能力，改善养殖性能，应用前景广阔。

[0007] 本发明一方面提供了一种丁酸梭菌，为丁酸梭菌719‑D（Clostridium butyricum 719‑D），已于2023年3月14日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023314。

[0008] 所述丁酸梭菌的16SrDNA序列为SEQ ID NO:1。

[0009] 本发明一方面提供了所述丁酸梭菌在饲料生产中的应用。

[0010] 本发明还提供了一种益生菌制剂，包含上述丁酸梭菌。

[0011] 所述益生菌制剂还包含地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、粪肠球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、乳酸片球菌、嗜酸乳杆菌中的任意一种或多种。

[0012] 所述益生菌菌剂中丁酸梭菌的活菌量不低于108CFU/g。

[0013] 本发明还提供了上述益生菌制剂在饲料生产中的应用。

[0014] 本发明提供的丁酸梭菌719‑D具有很强的产酸和产淀粉酶能力，其发酵代谢物中主要包含三种有机酸，其中丁酸含量最高，达到12.70 g/L，乙酸次之，乳酸最少；其中，丁酸和乙酸的含量均显著高于市售丁酸梭菌。

[0015] 所述丁酸梭菌719‑D对产气荚膜梭菌、鸭疫里默氏杆菌、金黄色葡萄球菌等多种病原菌均具有显著的抑菌效果。其中，对鸡源产气荚膜梭菌抑菌圈直径达到17mm，对鸭疫里默氏杆菌RA‑6型抑菌圈直径达到27mm，效果非常显著。

[0016] 所述丁酸梭菌719‑D具有一定的细胞黏附性和抗炎作用。通过在炎症模型中添加丁酸梭菌719‑D的裂解液，能显著下调促炎因子IL‑8的表达水平，相比阳性对照组，促炎因子IL‑8表达量下降约30%左右。

[0017] 所述丁酸梭菌719‑D对肉鸡球虫的防治效果明显优于抗生素组。随着感染时间推移，阳性对照组肉鸡粪便中卵囊值逐渐提高，抗生素组卵囊值较恒定，而丁酸梭菌处理组卵囊值显著降低，在感染后7d，丁酸梭菌处理组肉鸡粪便中卵囊值为0。该菌株能有效保护感染球虫和产气荚膜梭菌的肉鸡的肠道，丁酸梭菌处理组肉鸡肠道损伤的评分低于1分，远低于阳性对照组和抗生素组（p<0.05），肠道基本无明显损伤，没有发生肠壁变薄、变脆。

[0018] 丁酸梭菌719‑D能够显著降低肉鸡的腹泻和死淘发生率，有效改善生产性能。与对照组相比，丁酸梭菌处理组肉鸡粪便成型更好，死淘率和腹泻率分别降低了56.7%和24.2%，料重比也明显降，取得了意料不到的技术效果。

[0019] 本发明提供的丁酸梭菌719‑D可单独或与其他益生菌复配，应用于畜禽养殖饲料的生产，前景广阔。附图说明

[0020] 图1为丁酸梭菌719‑D菌落形态图；图2为丁酸梭菌719‑D革兰氏染色图；
图3为丁酸梭菌719‑D的MALDI‑TOF‑MS蛋白质谱图；
图4为丁酸梭菌719‑D产淀粉酶结果图；
图5为丁酸梭菌719‑D对鸡产气荚膜梭菌的抑制效果图；
图6为丁酸梭菌719‑D在Caco‑2细胞表面黏附的效果图。
实施方式

[0021] 下面结合具体实施例进一步阐述本发明。对于实施例中所用到的具体方法或材料，本领域技术人员可以在本发明技术思路的基础上，根据已有的技术进行常规的替换选择，而不仅限于本发明实施例的具体记载。

[0022] 本发明实施例中所述梭菌强化培养基(RCM培养基)的配制方法为：酵母浸膏3g，牛肉粉10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，氯化钠5g，醋酸钠3g，L‑半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1000ml，pH为6.8，121℃灭菌15min，固体培养基中加入15g琼脂。

[0023] 实施例1 菌株的分离及筛选1.1 样品来源
山东省青岛市莱西养殖场健康白羽肉鸡盲肠内容物。

[0024] 1.2 分离及筛选将盲肠内容物置于无菌离心管中，加入灭菌的生理盐水，制备成混悬液；将混悬液放入70℃的水浴锅中，加热10min，取出冷却；按照10倍梯度稀释至合适的浓度，无菌枪头吸取稀释液100μL涂布于固体RCM培养基平板上，37℃厌氧培养48小时。

[0025] 逐一观察平板上长出的单菌落的形态，筛选出革兰氏染色镜检为梭状的菌体，进一步划线3次，纯化获得单菌株。申请人共筛选出4株梭菌，分别记录为A、B、C、D。

[0026] 液体培养产酸分析：将菌株A、B、C、D分别接种于液体RCM培养基中，37℃厌氧培养48h。培养结束后，分别测定发酵菌液的pH。同时，以不接种任何菌株的液体RCM培养基作为空白对照组。结果见表1。

[0027] 表1 液体培养产酸情况菌株编号 发酵菌液pH值
空白对照 6.4
A 5.5
B 4.5
C 5.3
D 6.0
从表1的结果可知，经过48h厌氧培养后，本发明筛选获得的4株梭菌中菌株B发酵菌液的pH最低。从而表明菌株B的产酸能力最强。

[0028] 申请人将菌株B命名为719‑D，进一步进行鉴定和性能评价。

[0029] 实施例2 719‑D菌株的鉴定2.1 菌落形态及镜检特征
将719‑D菌株接种于固体RCM培养基上，厌氧培养48小时。该菌株的菌落形态如图1所示，菌落直径约1‑3mm，呈现为白色、不透明，表面光滑。

[0030] 719‑D菌株的革兰氏染色结果如图2所示，该菌株革兰氏染色呈阳性，二对生杆状，培养形成芽孢后为梭状，位于中间或端部。

[0031] 2.2 生理生化特征将719‑D菌株在固体RCM培养基上培养48h，选取单菌落，按照梅里埃API 20NE试剂条鉴定说明方法操作，经过24h培养后，统计数据，进行菌株生理生化特征分析。结果见表2。

[0032] 表2 719‑D菌株生理生化特征检测项目 检测结果
NO3硝酸盐还原到亚硝酸盐 ‑
TRP 吲哚 ‑
GLU 酸化葡萄糖 ‑
ADH 精氨酸双水介酶 ‑
URE 脲酶 ‑
ESC 水解七叶灵(β‑葡萄糖甙酶) +
GEL 水解明胶(蛋白酶) ‑
PNPG β‑半乳糖甙酶 ‑
GLU 同化葡萄糖 ‑
ARA 同化阿拉伯糖 ‑
MNE 同化甘露糖 ‑
MAN 同化甘露醇 ‑
NAG 同化N‑乙酰‑葡萄糖胺 ‑
MAL 同化麦芽糖 +
GNT 同化葡萄糖酸盐 ‑
CAP 同化癸酸 ‑
ADI 同化已二酸 ‑
MLT 同化苹果酸 ‑
CIT 同化柠檬酸 ‑
PAC 同化苯乙酸 ‑
“+”表示阳性反应； “‑”表示阴性反应。

[0033] 2.3 16S rDNA分子鉴定采用试剂盒提取菌株719‑D的基因组。以该基因组为模板，利用PCR技术扩增
16SrDNA序列。将扩增得到的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并送测序公司进行测序。

[0034] 结果显示，菌株719‑D的16SrDNA序列为SEQ ID NO:1，长度为1452bp。具体序列如下：CATGCAAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGT
AACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTACCGCATGGTACAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGGATTGTAAAGCTCTGTCTTTAGGGACGATAATGACGGTACCTAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACCCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGGAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCTGTAATGGAGGAAGCCACTTCGGTGGCAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAGCGAGACTGCCCGGGTTAACCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAATGAGATGCAACCTCGCGAGAGTGAGCAAAACTATAAAACCGATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGCAATACCCAAAGTTCGTGAGCTAACCGCAAGGAGGCAGCGACCTAAGGTAGGGTCAGCGATTGGGGTGAAGTCGTAACAA。

[0035] 通过将SEQ ID NO:1在NCBI数据库中进行BLAST比对，发现其与丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的相似性99.99%，因此，初步确定菌株719‑D为丁酸梭菌（Clostridium butyricum）。

[0036] 2.4 MALDI‑TOF‑MS蛋白质谱鉴定挑取新活化的少量719‑D单菌落以薄膜的形式涂布于靶板上；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的裂解液，室温下自然晾干；加1μL质谱样本预处理试剂盒中的基质溶液覆盖样品，室温下自然晾干；将样品靶放入质谱仪进行鉴定。鉴定结果显示菌株719‑D为丁酸梭菌（Clostridium butyricum），其蛋白质谱峰图如图3所示。

[0037] 综上分析，申请人利用16S rDNA测序和MALDI‑TOF‑MS蛋白质谱两种分子生物学方法对菌株719‑D进行鉴定分析，鉴定结果一致。结合菌株719‑D的菌落形态及镜检特征，申请人确定该菌株为丁酸梭菌（Clostridium butyricum），命名为丁酸梭菌719‑D（Clostridium butyricum 719‑D）。

[0038] 申请人已于2023年3月14日将上述丁酸梭菌719‑D（Clostridium butyricum 719‑D）保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 2023314。

[0039] 实施例3 丁酸梭菌719‑D产酸能力评价3.1 供试菌液的制备
将丁酸梭菌719‑D接种到RCM培养基中， 37℃厌氧培养48h，以10000r/min离心5分钟，收集上清液通过0.22μm滤器，备用。

[0040] 对比市售丁酸梭菌样品：接种到RCM培养基中， 37℃厌氧培养48h，以10000r/min离心5分钟，收集上清液通过0.22μm滤器，备用。

[0041] 3.2 丁酸梭菌719‑D产酸能力分析采用高效液相色谱检测方法进行上清液中有机酸定量分析，检测器为紫外检测
器，测定条件为：波长210 nm；流动相：0.1%磷酸水溶液。以空白RCM培养基上样前过0.22μm滤器，作为空白对照组。结果见表3。

[0042] 表3 丁酸梭菌719‑D发酵产酸分析由表3可知，本发明提供的丁酸梭菌719‑D具有很强的产酸能力。该菌株发酵代谢物中主要包含三种有机酸，其中丁酸含量最高，达到12.70 g/L，乙酸次之，乳酸最少；其中，丁酸和乙酸的含量均显著高于市售丁酸梭菌。

[0043] 实施例4 丁酸梭菌719‑D产酶能力评价4.1 供试菌液的制备
将丁酸梭菌719‑D接种到RCM培养基中，37℃厌氧培养48h，作为供试菌液备用。

[0044] 4.2 丁酸梭菌719‑D产淀粉酶分析淀粉酶筛选培养基（g/L）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，可溶性淀粉5g，琼脂
20g，pH7.0，蒸馏水1000ml，121℃，灭菌15min。

[0045] 将培养好的丁酸梭菌719‑D菌液接种到淀粉酶筛选培养基上，37℃厌氧过夜培养，加入稀碘液染色.结果如图4所示，丁酸梭菌719‑D菌液周围有透明圈产生，透明圈直径约为23mm。从而说明本发明提供的丁酸梭菌719‑D具有较强的产淀粉酶能力。

[0046] 实施例5 丁酸梭菌719‑D抑菌能力评价5.1 供试菌液的制备
将丁酸梭菌719‑D接种到RCM培养基中，37℃厌氧培养48h，制备成供试菌液。

[0047] 5.2 病原菌准备将鸡源产气荚膜梭菌、猪源产气荚膜梭菌分别接种于TSB培养基中，37℃厌氧，过夜培养备用。将收集到的鸭疫里默氏杆菌R2型、RA‑6型，分别接种于TSB（添加4%血清）培养基中，37℃，220r/min，过夜培养备用。将大肠杆菌O78、金黄色葡萄球菌分别接种于营养肉汤培养基中，37℃，220r/min，过夜培养备用。

[0048] 5.3 抑菌能力评价取无菌平皿，倾注无菌营养琼脂培养基18‑20mL，使其在平皿内均匀摊布，放置水平台面上使凝固；吸取病原菌菌悬液100μL，使用涂布棒在培养基表面涂匀；使用打孔器在平板上打孔，将多余的培养基挑出，在酒精灯火焰上加热片刻进行封板。吸取供试菌液
100uL，加入加样孔内，静置待孔内液体干燥后，放入培养箱37℃培养24h，测定抑菌圈直径。
丁酸梭菌719‑D抑菌实验结果如表4所示。

[0049] 表4 丁酸梭菌719‑D对不同病原菌的抑菌效果病原菌 抑菌圈直径（mm）
鸡源产气荚膜梭菌 17±0.1
猪源产气荚膜梭菌 15±0.1
鸭疫里默氏杆菌R2型 23±0.1
鸭疫里默氏杆菌RA‑6型 27±0.1
金黄色葡萄球菌 12±0.1
大肠杆菌O78 无明显抑菌圈
从表4的结果可以看出，本发明筛选到的丁酸梭菌719‑D对大肠杆菌O78无明显抑菌作用，但对产气荚膜梭菌、鸭疫里默氏杆菌、金黄色葡萄球菌等多种病原菌均具有显著的抑菌效果。其中，对鸡源产气荚膜梭菌抑菌圈直径达到17mm（如图5所示），对鸭疫里默氏杆菌RA‑6型抑菌圈直径达到27mm，效果非常显著。

[0050] 实施例6 丁酸梭菌719‑D细胞黏附能力评价6.1 供试菌体准备
丁酸梭菌719‑D在RCM培养基中活化3代，10000r/min离心5 min，收集菌体，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）洗涤2次后，用无菌PBS重悬菌体。

[0051] 6.2 Caco‑2细胞的培养Caco‑2细胞采用DMEM培养基培养，并添加20%的热灭活（30 min，56℃）胎牛血清、
1%的青‑链霉素。Caco‑2细胞于CO2培养箱中37℃培养，每1 d换液1次。

[0052] 6.3 黏附试验24孔板中，将Caco‑2细胞在CO2培养箱中培养至长成单层细胞后进行黏附试验。无菌PBS清洗2次，加入250uL丁酸梭菌719‑D菌悬液，在CO2 培养箱中37℃培养2 h。之后移去菌体悬液，用无菌PBS洗涤4次，以除去未黏附的菌体，每孔用无水乙醇固定 30 min，PBS清洗，将细胞爬片取出，进行革兰氏染色，干燥后显微镜观察记录。

[0053] 显微观察结果如图6所示，在Caco‑2细胞表面黏附有丁酸梭菌719‑D菌体，从而表明丁酸梭菌719‑D具有一定的细胞黏附性。

[0054] 实施例7 丁酸梭菌719‑D基于肠上皮细胞HT‑29的炎症模型的抗炎效果评价7.1 供试样品制备
将丁酸梭菌719‑D接种到RCM培养基中， 37℃厌氧培养48h，以10000r/min离心5分钟，收集菌体，使用PBS清洗两次后，重悬，冰浴超声破壁30min，离心取上清获，得裂解液，4℃保存备用。

[0055] 7.2 HT‑29炎症模型试验选用含10%FBS的RPMI‑1640完全培养基培养HT‑29细胞。当HT‑29细胞密度达到60%左右时，用胰酶消化成单细胞悬液，并用血球计数板计数，24孔板的铺板密度为2×
5
10cells/孔。24孔板每孔培养基的添加量为0.5ml。细胞在孔板中继续培养36‑48h后，更换新鲜培养液，正常培养做空白对照组。以炎症刺激物LPS（脂多糖）终浓度为1μg/ml，刺激HT‑
29细胞促炎因子IL‑8的表达量上升，作为炎症模型阳性对照组。实验组1为丁酸梭菌719‑D裂解液添加入到正常的细胞培养液中。实验组2为丁酸梭菌719‑D裂解液，加入到含LPS的炎症模型细胞培养液中。培养24h后，取上清液，使用ELISA试剂盒检测促炎因子IL‑8含量变化情况，以评估供试样品抗炎效果，结果如表5所示。

[0056] 表5 丁酸梭菌719‑D对炎症模型IL‑8表达量的作用效果评价平行1 平行2 平行3 均值 SD
空白对照组 1.278 1.390 1.345 1.338 0.056
阳性对照组 2.364 2.289 2.191 2.281 0.086
实验组1 1.000 1.071 0.987 1.019 0.045
实验组2 1.554 1.650 1.539 1.581 0.059
由表5可知，与空白对照相比，LPS刺激可以使HT‑29细胞促炎因子IL‑8的表达量明显上升，表明该炎症模型是成功的。实验组2通过在炎症模型中添加丁酸梭菌719‑D的裂解液，能显著下调促炎因子IL‑8的表达水平，相比阳性对照组，促炎因子IL‑8表达量下降约
30%左右。从而表明，本发明提供的丁酸梭菌719‑D具有一定的抗炎作用。

[0057] 实施例8 丁酸梭菌719‑D对柔嫩艾美尔球虫‑A型产气荚膜梭菌双重感染肉鸡模型的防治效果8.1 实验场地
青岛农业大学动物医学院实验基地。

[0058] 8.2 柔嫩艾美尔球虫‑A型产气荚膜梭菌双重感染肉鸡模型试验设计双重感染肉鸡模型建立：选取180只健康1日龄肉鸡开展试验，随机分为三组，即对照组、抗生素组和实验组，每组5个重复，每个重复12只鸡。肉鸡饲养到第14日龄时，所有试验肉鸡口腔灌服浓度为10倍剂量的球虫疫苗（球虫病三价活疫苗，购自佛山市正典生物）进行感染，第19‑21日龄连续3日，所有试验肉鸡按1mL/只口腔灌服产气荚膜梭菌菌液（1×
8
10CFU/mL）进行感染。

[0059] （1）阳性对照组：饲喂无抗日粮，正常饮水；（2）抗生素组：在无抗日粮中按583g/吨添加抗生素盐霉素预混剂，正常饲喂和饮水；
（3）丁酸梭菌处理组：在无抗日粮中按500mL/吨添加丁酸梭菌719‑D菌液，正常饲喂和饮水。

[0060] 在肉鸡灌服球虫疫苗后第5、6、7天，每天收集各组肉鸡的粪便。各组准确称取2 g新鲜鸡粪便置于已消毒的100 mL烧杯内，先加入8 mL饱和食盐溶液，用玻棒捣碎混匀，再加入50 mL饱和食盐溶液，混匀后立即用纱布或60目筛网过滤，立即吸取滤液充满2个计数室，静置3‑5min，在10倍物镜下镜检计数，每个计数室内有100个方格，其体积为1cm×1cm×0.15cm=0.15ml，分别查完2个计数室100个方格内的卵囊数量n1和n2，最后按照以下公式计算每克粪便中卵囊数量（OPG）。按照角田清(1983)方法换算成卵囊值，即：卵囊比数小于
1％，卵囊值为0； 2％‑25％时，卵囊值为5；26％‑50％时，卵囊值为10；51％‑75％时，卵囊值为20；76％‑100％时，卵囊值为40。具体结果见表6。

[0061] OPG=[(n1+n2)/(2×0.15)]×60÷2。

[0062] 其中(n1+n2)/2为平均每个计数室内卵囊数，0.15为每个计数室有效体积为0.15ml，60为粪便总体积为60ml，2为所用粪便克数为2g。

[0063] 在肉鸡灌服产气荚膜梭菌后第7天和第14天，每组随机挑选5只肉鸡进行宰杀，打开腹腔，分别摘取肉鸡的十二指肠、空肠和回肠纵剖，清洗后观察肠道损伤情况，进行病变计分。参考Shojadoost（2012）的六分制评分系统作为本试验肠道损伤评分标准。评分越高代表肠道受损越严重。其中：0分：无明显损伤；
1分：肠壁变薄、变脆，或者肠道黏膜表面存在弥散、可清理掉的纤维蛋白；
2分：肠道黏膜有坏死点或溃疡点，或不可清理掉的沉积纤维蛋白，存在1‑5个坏死灶；
3分：肠道黏膜有坏死点或溃疡点，或不可清理掉的沉积纤维蛋白，存在6‑15个坏死灶；
4分：肠道黏膜有坏死点或溃疡点，或不可清理掉的沉积纤维蛋白，存在16及以上坏死灶；
5分：2‑3cm片状坏死，变异大；
6分：坏死性肠炎的典型弥漫坏死，且坏死从肠黏膜深入到下面的固有层和肌肉层。

[0064] 具体结果见表7。

[0065] 表6肉鸡粪便中球虫卵囊值统计组别 感染后5d 感染后6d 感染后7d
阳性对照组 5 5 10
抗生素组 5 5 5
丁酸梭菌处理组 5 0 0
从表6的结果可以看出，随着感染时间推移，阳性对照组肉鸡粪便中卵囊值逐渐升高，抗生素组的卵囊值较恒定，而丁酸梭菌处理组卵囊值显著降低，在感染后6d，丁酸梭菌处理组肉鸡粪便中卵囊值为0，效果明显优于抗生素组。从而表明，丁酸梭菌719‑D对肉鸡球虫的防治效果明显优于抗生素组，取得了意料不到的技术效果。

[0066] 表7肉鸡肠道损伤评分结果组别日龄 阳性对照组 抗生素组 丁酸梭菌处理组
a b c
第28天 1.75 1.05 0.50
a b c
第35天 2.37 1.09 0.42
由表7可知，丁酸梭菌处理组肉鸡肠道损伤的评分低于1分，远低于阳性对照组和抗生素组（p<0.05），说明该组肉鸡的肠道基本无明显损伤，没有发生肠壁变薄、变脆。从而表明，本发明提供的丁酸梭菌719‑D能有效保护感染球虫和产气荚膜梭菌的肉鸡的肠道，取得意料不到的技术成果。

[0067] 实施例9 丁酸梭菌719‑D对白羽肉鸡规模养殖中发病率及生长性能的影响9.1 实验场地：
山东德州禹城养殖场。

[0068] 9.2 实验设计：养殖场中白羽肉鸡以整栋进行试验，2.2万只鸡/栋，采集数据2栋，其中对照组1栋，实验组1栋。对照组正常免疫球虫疫苗，丁酸梭菌处理组按100g/吨水添加丁酸梭菌719‑D（20亿CFU/g）菌粉。至35日龄出栏统计粪便状态、死淘率、料重比等生长性能。具体结果见表8。

[0069] 表8 丁酸梭菌719‑D对35日龄白羽肉鸡生长性能的影响组别 出栏均重 料重比 死淘率 腹泻率
对照组 2.57 kg 1.79 6.7% 3.3%
丁酸梭菌处理组 2.56 kg 1.67 2.9% 2.5%
从表8的数据可知，与对照组相比，丁酸梭菌处理组肉鸡粪便成型更好，死淘率和腹泻率分别降低了56.7%和24.2%，料重比也明显降低。从而说明，通过在白羽肉鸡的规模化养殖中饲喂丁酸梭菌719‑D，能够显著降低肉鸡的腹泻和死淘发生率，有效改善生产性能，取得了意料不到的技术效果。