一种嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）HCLA01及其在制备具有增强免疫力的产品中的应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202310467822.X | 申请日 | 2023-04-27 |
| 公开(公告)号 | CN116410903A | 公开(公告)日 | 2023-07-11 |
| 申请人 | 深圳海创生物科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 刘晓宇; 刘杰; 王怀玲; 郭奕彤; 林沛纯; 单紫庆; 张渐麒; 林燕玲; 吴嘉顺儿; | 第一发明人 | 刘晓宇 |
| 权利人 | 深圳海创生物科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 深圳海创生物科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省深圳市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省深圳市南山区南头街道莲城社区南山软件园B903 | 邮编 | 当前专利权人邮编：518052 |
| 主IPC国际分类 | C12N1/20 | 所有IPC国际分类 | C12N1/20 ; A23L33/135 ; A23L33/175 ; A61K31/197 ; A61K35/747 ; A61P37/04 ; C12R1/23 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 深圳市世纪宏博知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 董博; |
| 摘要 | 本 发明 涉及医学技术领域，具体公开了一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01及其在制备具有增强免疫 力 的产品中的应用。所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01，其保藏编号为GDMCC No：63137。所述的组合物，其包含嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01和γ‑ 氨 基丁酸。研究表明，本发明所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01具有增强免疫力作用；并且其增强免疫力作用要显著优于已知的嗜酸乳杆菌。 | ||
| 权利要求 | 1.一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01，其保藏编号为GDMCC No： |
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| 说明书全文 | 一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01及其在制备具有增强免疫力的产品中的应用 技术领域背景技术[0002] 大量研究表明，肠道益生菌也可通过直接刺激免疫细胞、调节机体免疫信号通路调节机体免疫，而益生菌发酵产生的短链脂肪酸与人体健康、人体免疫力密切相关。γ‑氨基丁酸(γ‑aminobutyric acid)是一种重要的功能性非蛋白质氨基酸，具有多种生理功能，如食用含有γ‑氨基丁酸的食品可改善睡眠、提高免疫力、降血压、增加脑部蛋白分泌等。γ‑氨基丁酸因其良好的生物活性，在食品、化妆品领域均有大量应用。但目前，γ‑氨基丁酸的生产多以化学合成为主，产量低、纯度低以及副产物污染等极大的限制了其应用。 [0003] 益生菌发酵用于γ‑氨基丁酸的制备生产具有多种优势，如污染少，对生产条件要求低等。此外，γ‑氨基丁酸及益生菌均报道具有增强机体免疫力的活性，但将益生菌与外加γ‑氨基丁酸联合使用是否具有更优秀的增强机体免疫力的活性却鲜有研究及报道。 发明内容[0004] 为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01。 [0005] 本发明提供的一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01，其保藏编号为GDMCC No：63137。 [0006] 该菌株已于2023年1月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所)。 [0007] 所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01形态呈细长杆状；经分析其16s rDNA序列(如SEQ ID NO:1所示)，利用测序结果在NCBI数据库中进行比对，与GenBank中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的同源性为97％。 [0008] 发明人在大量的实验中筛选得到了一种全新的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01，发明人在进一步研究中惊奇的发现，其具有增强免疫力作用；并且其增强免疫力作用要显著好于现有的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。 [0009] 本发明还提供了一种组合物，其包含嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01和γ‑氨基丁酸。 [0010] 发明人在进一步研究中惊奇的发现，将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01与γ‑氨基丁酸组合后得到的组合物，其增强免疫力作用相比于单独的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01或单独的γ‑氨基丁酸，得到了大幅的提高；具有更加显著的增强免疫力作用。这可能是由于将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01与γ‑氨基丁酸组合后产生协同增效的结果。 [0011] 优选地，所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01冻干粉。 [0012] 优选地，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01冻干粉和γ‑氨基丁酸的质量比为1:(1‑100)。 [0013] 进一步优选地，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01冻干粉和γ‑氨基丁酸的质量比为1:(1‑100)。 [0014] 最优选地，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01冻干粉和γ‑氨基丁酸的质量比为1:10。 [0015] 本发明还提供了一种上述嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01在制备具有增强免疫力的产品中的应用。 [0016] 本发明还提供了一种上述组合物在制备具有增强免疫力的产品中的应用。 [0017] 优选地，所述的产品为食品、膳食补充剂、功能性食品、保健品或药物。 [0018] 优选地，所述的所述产品的剂型为丸剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂或粉剂。 [0019] 有益效果：本发明首先提供了一种全新的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01；研究表明，其具有增强免疫力作用；并且其增强免疫力作用显著优于已知的嗜酸乳杆菌。发明人在进一步研究中发现，将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01与γ‑氨基丁酸组合后得到的组合物，其增强免疫力作用相比于单独的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01或单独的γ‑氨基丁酸，得到了大幅的提高，具有更加显著的增强免疫力作用。 [0020] 由于所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01以及组合物具有增强免疫力作用；因此，将本发明所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01或组合物作为有效成分用于制备具有增强免疫力作用的产品具有重要的应用价值。 具体实施方式[0021] 下面将结合实施例对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0022] 实施例1嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01的分离与鉴定[0023] (1)富集培养：取来自健康儿童的粪便处理液加入含有谷氨酸的培养基(培养基：蛋白胨8.0g/L、酵母粉8.0g/L、谷氨酸钠8.0g/L、葡萄糖8.0g/L、吐温80 1mL/L、醋酸钠 4.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.2g/L)中，37℃静止培养48h。 [0024] (2)定性检测：分别对实施例1步骤(1)培养后的培养液进行浓缩、点样到预制硅胶板上，通过层析液展开。层析液‑氯仿：冰醋酸：水(55:35:10)，添加0.5％茚三酮。层析结束后自然晾干，90℃显色3min，分别对培养后的培养液进行浓缩、定性检测，与γ‑氨基丁酸标准品比较。 [0025] (3)分离单菌落：对实施例1步骤(2)获得的有γ‑氨基丁酸生成的培养液，先进行镜检，判断细菌种类，进而稀释涂布，涂布平板培养基为含有10g/L CaCO3的嗜酸乳杆菌固体培养基(培养基：蛋白胨8.0g/L、酵母粉8.0g/L、谷氨酸钠8.0g/L、葡萄糖8.0g/L、吐温80 1mL/L、醋酸钠4.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.2g/L，琼脂15.0g/L)，37℃培养48h，挑取若干有溶钙圈的疑似嗜酸乳杆菌的菌落，接种至含谷氨酸的培养基中，37℃，静止48h，定性检测并比较γ‑氨基丁酸产量大小；挑选出γ‑氨基丁酸产量较高的菌株，即得所述的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01(以下简写为嗜酸乳杆菌HCLA01)； [0026] 其中，所述的嗜酸乳杆菌HCLA01形态呈细长杆状；经分析其16s rDNA序列(如SEQ ID NO:1所示)，利用测序结果在NCBI数据库中进行比对，与GenBank中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)的同源性为97％。 [0027] 实施例2嗜酸乳杆菌HCLA01冻干粉的制备 [0028] (1)嗜酸乳杆菌HCLA01种子液制备：将嗜酸乳杆菌HCLA01菌种接入培养基(培养基成分为：蛋白胨8.0g/L、酵母粉8.0g/L、谷氨酸钠8.0g/L、葡萄糖8.0g/L、吐温80 1mL/L、醋酸钠4.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.2g/L)，摇瓶发酵12h，获得OD 600＞1.5的嗜酸乳杆菌HCLA01种子液。 [0029] (2)扩大培养：将步骤(1)所得的嗜酸乳杆菌HCLA01种子液接入20L发酵罐中的液体培养基(20L，培养基成分为：蛋白胨8.0g/L、酵母粉8.0g/L、谷氨酸钠8.0g/L、葡萄糖8.0g/L、吐温80 1mL/L、醋酸钠4.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.2g/L)； 在pH值为6；培养温度为37℃条件下搅拌培养48h；结束发酵得发酵液； [0031] 实施例3组合物的制备 [0032] 将1.0g按实施例2方法制备得到的嗜酸乳杆菌HCLA01冻干粉(活菌数为100亿cfu/g)和10gγ‑氨基丁酸混合均匀，即得所述的组合物(为了进行区分，以下写为γ‑氨基丁酸HCLA01组合物)。 [0033] 对比例1组合物的制备 [0034] 将1.0g嗜酸乳杆菌LGG冻干粉(购买得到，活菌数为100亿cfu/g)和10gγ‑氨基丁酸混合均匀，即得所述的组合物(为了进行区分，以下写为γ‑氨基丁酸LGG组合物)。 [0035] 效果实施例 [0036] 按《保健食品功能评价方法(2020年版)(征求意见稿)》进行增强免疫功能实验，经口给予小鼠适当剂量的干预品(分别为按实施例2方法制备得到的嗜酸乳杆菌HCLA01冻干粉(100亿cfu/g)、嗜酸乳杆菌LGG冻干粉(100亿cfu/g)、γ‑氨基丁酸、γ‑氨基丁酸HCLA01组合物以及γ‑氨基丁酸LGG组合物；给药剂量为40mg/kg)，不同剂量干预品用适量的0.5％ CMC‑Na稀释到一定体积后按20mL/kg体重灌胃给药，每日一次，30d后，进行小鼠脾淋巴细胞转化试验及小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，以评价各实施例对小鼠免疫功能的影响；实验结果见表1； [0037] 实施结果：各实施结果均与阴性对照组(阴性对照组动物灌胃给予1％CMC‑Na，1次/天，连续30天)相比，有显著差异的结果如下，*表示与阴性对照组相比，p<0.05；**表示与阴性对照组相比，p<0.01。 [0038] 表1.小鼠免疫功能实验结果 [0039] [0040] 从表1实验结果可以看出，本发明嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01，其对小鼠脾淋巴细胞的增殖能力以及巨噬细胞吞噬百分率显著高于已知的嗜酸乳杆菌LGG冻干粉。这说明：本发明提供的全新的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01，具有增强免疫力作用；并且其增强免疫力作用要显著好于已知的嗜酸乳杆菌LGG。 [0041] 从表1实验结果可以看出，γ‑氨基丁酸HCLA01组合物，其对小鼠脾淋巴细胞的增殖能力以及巨噬细胞吞噬百分率进一步大幅高于单独的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01；同时也大幅高于γ‑氨基丁酸；这说明：将嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01与γ‑氨基丁酸组合后得到的组合物；其增强免疫力作用相比于单独的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01或单独的γ‑氨基丁酸，得到了大幅的提高；具有更加显著的增强免疫力作用。 [0042] 从表1实验结果可以看出，γ‑氨基丁酸LGG组合物，其对小鼠脾淋巴细胞的增殖能力以及巨噬细胞吞噬百分率相对于单独的嗜酸乳杆菌LGG冻干粉并未得到提高，同时也大幅小于γ‑氨基丁酸HCLA01组合物；这说明：只有将本发明嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)HCLA01与γ‑氨基丁酸组合后得到的组合物，其增强免疫力作用相比于单独的嗜酸乳杆菌或单独的γ‑氨基丁酸，才能得到大幅的提高；而采用其它嗜酸乳杆菌与γ‑氨基丁酸组合物得到的组合物，其增强免疫力作用相比于单独的嗜酸乳杆菌或单独的γ‑氨基丁酸，并不能够得到大幅的提高。 |
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