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一株茹氏短芽孢杆菌及其应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查; 授权;
专利有效性	有效专利	当前状态	授权
申请号	CN202410725028.5	申请日	2024-06-06
公开(公告)号	CN118291347A	公开(公告)日	2024-07-05
申请人	黄河三角洲京博化工研究院有限公司;	申请人类型	企业
发明人	蔡倩倩; 马韵升; 杨传伦; 张心青; 车树刚; 冉新新; 高保军; 范春苗; 傅英旬; 郭南南; 郭中瑞;	第一发明人	蔡倩倩
权利人	黄河三角洲京博化工研究院有限公司	权利人类型	企业
当前权利人	黄河三角洲京博化工研究院有限公司	当前权利人类型	企业
省份	当前专利权人所在省份：山东省	城市	当前专利权人所在城市：山东省滨州市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：山东省滨州市博兴县经济开发区	邮编	当前专利权人邮编：256500
主IPC国际分类	C12N1/20	所有IPC国际分类	C12N1/20 ; C02F3/34 ; C12R1/08 ; C02F101/36
专利引用数量	2	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	6	专利文献类型	A
专利代理机构	山东祺智知识产权代理有限公司	专利代理人	赵斌;
摘要	本发明属于生物技术领域，提供了一株茹氏短芽孢杆菌及其应用，所述的茹氏短芽孢杆菌，菌株命名为YJY23‑07，保藏编号为CGMCC NO.26981。该菌株能以1,2‑二氯丙烷为唯一的碳源实现其降解，将该菌株或其菌剂投入到含有1,2‑二氯丙烷的海水或土壤或污水中，能够对其进行无害化处理，进而阻断其进入到土壤或者地下水环境引起长期污染，该菌株的应用可以避免采用现有处理方式成本高、易造成二次污染等缺点，对操作人员无副作用，在实际生产中具有良好的应用价值，对于海水、土壤及工业废水中1,2‑二氯丙烷的高效净化具有重要意义。
权利要求	1.一株茹氏短芽孢杆菌（Brevibacillus reuszeri）YJY23‑07，其特征在于：其保藏编号为CGMCC NO. 26981，于2023年3月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 2.一种制备菌剂的方法，其特征在于，采用权利要求1所述茹氏短芽孢杆菌进行制备，具体步骤如下： 1)菌种活化：将茹氏短芽孢杆菌试管菌种移至室温条件下活化4h‑8h； 2)种子液制备：将活化后的试管菌种分别接种到相应液体培养基中，1支试管菌种接种 50‑100mL牛肉膏蛋白胨培养基，振荡培养12‑18h得到种子液，培养条件为：温度32‑37℃，摇床转速100‑200r/min； 3)发酵：将茹氏短芽孢杆菌种子液按体积百分比1％‑5％的接种量接种于相应的发酵培养基中进行液体深层发酵获得发酵液；培养条件为：温度32‑37℃，转速100‑200r/min，培养时间为12‑18h； 8 9 获得发酵液菌量为0.5×10‑8×10cfu/mL； 4)干燥粉碎：将上述发酵得到的发酵液进行吸附、干燥、粉碎，得到单一菌剂，其有效活菌数为100亿/g以上。 3.根据权利要求2所述制备菌剂的方法，其特征在于，步骤（3）中牛肉膏蛋白胨培养基配方为：按重量计百分比计为，5%牛肉膏,10%蛋白胨, 5% NaCl, pH7.0，余量为水；步骤（3）中发酵培养基配方为：按重量计百分比计为，黄豆饼粉1‑3%，葡萄糖1‑3%，玉米浆干粉1‑3%，蛋白胨0.1‑0.5%，硫酸镁0.01‑0.05%，氯化钠0‑0.5%，硫酸铵0.1‑0.6%，磷酸二氢钾0.01‑0.1%，碳酸钙0.1‑1%，pH7.0‑8.0，余量为水。 4.权利要求1所述茹氏短芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述应用为降解1,2‑二氯丙烷，具体包括对含1,2‑二氯丙烷的海水或盐碱地或其他含1,2‑二氯丙烷的废水的生化处理。 5.根据权利要求4所述茹氏短芽孢杆菌的应用，其特征在于：将茹氏短芽孢杆菌发酵液 5 8 或其菌剂投入生化处理中，其初始有效活菌菌量为10‑10cfu/mL。 6.根据权利要求5所述茹氏短芽孢杆菌的应用，其特征在于：将茹氏短芽孢杆菌发酵液 7 或其菌剂投入生化处理中，其初始有效活菌菌量为0.1‑6×10cfu/mL。
说明书全文	一株茹氏短芽孢杆菌及其应用技术领域 [0001] 本发明属于生物工程技术领域，提供了一株茹氏短芽孢杆菌及其应用。背景技术 [0002] 随着现代化学合成技术的发展，大量人工合成的有机氯化物被广泛应用于化工业、制药业、印染业和农业等众多领域。有机氯化物密度大、水溶性低且在土壤中迁移性强，因此这类化合物一旦进入土壤可通过土壤淋溶作用最终进入地表水排入大海，或渗透到地下水环境中。其中，1,2‑二氯丙烷是一种化学性质稳定、具毒性的典型氯代烷类化合物，具致病、致癌等毒性作用，常通过呼吸道、消化道、皮肤等吸收方式进入体内而引起中毒，现在一般会用作土壤熏蒸剂和土壤杀虫剂，因此对它的降解现已得到广泛而深入的研究。 [0003] 对于水中有机污染物，尤其是有机氯代烃类污染物，由于溶解性低，界面张力大，用常规处理方法，如抽提处理方法，很难有效去除，而且不能从根本上治理，基于一般的物理化学方法很难降解；生物降解能够通过微生物作用将有毒物质转化为无毒物质,投资少且无二次污染,因此充分利用微生物降解技术日益重要。 [0004] 为寻找高效环保的治理技术，国内外学者对氯代烃的微生物降解进行了研究。氯代烷烃的厌氧降解主要是通过有机卤呼吸细菌所催化的。目前，已从污染场地分离出多种能够降解氯代烷烃类有机氯的有机卤呼吸细菌，其主要菌属有：Dehalococcoides、Dehalobacter、Desulfitobacterium、Geobacter、Sulfurospirillum等，它们的脱卤反应多为厌氧条件下进行，且都为异养细菌，单一菌种的分离难度比较大，在应用的过程中，针对海水和地下水低碳的特性，常常需要补充碳源进行强化，脱卤微生物种类较少且对1 ,2‑二氯丙烷的降解作用较弱。为了进一步的切断1,2‑二氯丙烷这类污染物对海水和地下水及土壤的污染，通过在这类物质污染的水源或土壤表层及时进行原位修复是一个高效去除地下水氯代烷烃的方法，同时解决了以上有机卤呼吸细菌的缺陷。 [0005] 因此如何获得适应海水、地下水或土壤环境下的1,2‑二氯丙烷高效降解菌株成为本领域亟待解决的问题。发明内容 [0006] 本发明针对上述技术存在的不足，提供了一株茹氏短芽孢杆菌菌株及其应用，所述的茹氏短芽孢杆菌（Brevibacillus reuszeri），菌株命名为YJY23‑07，保藏编号为CGMCC NO. 26981。该菌株能以1,2‑二氯丙烷为唯一的碳源实现其降解，将该菌株或其菌剂投入到含有1,2‑二氯丙烷的海水或土壤或污水中，能够对其进行无害化处理，进而阻断其进入到土壤或者地下水环境引起长期污染，该菌株的应用可以避免采用现有处理方式成本高、易造成二次污染等缺点，对操作人员无副作用，在实际生产中具有良好的应用价值，对于海水、土壤及工业废水中1,2‑二氯丙烷的高效净化具有重要意义。 [0007] 本发明提供的具体技术方案是：首先从山东省滨州市某污水处理厂附近所取的样品中分离出5株可利用1,2‑二氯丙烷为唯一碳源的菌株，并分别进行分离纯化。 [0008] 对5株待选菌株分别在不同浓度的1,2‑二氯丙烷为唯一碳源的培养基中培养，最终筛选出一株降解效率高、生长迅速且有稳定的传代特性的菌株，将其命名为YJY23‑07。 [0009] 该菌株形态特征为：革兰氏阴性短杆菌，在LB培养基上菌落圆形，扁平，边缘整齐，淡黄色，粗糙，不透明，菌落大小约1‑3mm。生长温度15‑45℃，在pH6‑9范围内生长，接触酶阳性，氧化酶、硝酸盐还原、淀粉水解均为阴性，利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖产酸。 [0010] 发明人对其进行了16SrDNA测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上鉴定结果该菌属于茹氏短芽孢杆菌（Brevibacillus reuszeri）。 [0011] 发明人将其进行了生物保藏，于2023年3月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株命名为YJY23‑07，保藏号为CGMCC No. 26981。 [0012] 发明人获得上述菌株后，还提供了对应的制备菌剂的方法，包括如下步骤：1)菌种活化：将茹氏短芽孢杆菌试管菌种移至室温条件下活化4h‑8h。 [0013] 2)种子液制备：将活化后的试管菌种分别接种到相应液体培养基中，1支试管菌种接种50‑100mL牛肉膏蛋白胨培养基，振荡培养12‑18h得到种子液，培养条件为：温度32‑37℃，摇床转速100‑200r/min；其中的牛肉膏蛋白胨培养基配方为：按重量计(w/w)组成为：5%牛肉膏,10%蛋白胨,5% NaCl, pH7.0，余量为水。 [0014] 3)发酵：将茹氏短芽孢杆菌种子液按体积百分比1‑5％的接种量接种于相应的发酵培养基中进行液体深层发酵获得发酵液；培养条件为：温度32‑37℃，转速100‑200r/min，培养时间为12‑18h；8 9 获得发酵液菌量为0.5×10‑8×10cfu/mL。 [0015] 4)干燥粉碎：将上述发酵得到的发酵液进行吸附、干燥、粉碎，得到单一菌剂，其有效活菌数为100亿/g以上。 [0016] 步骤（3）中发酵培养基配方为：按重量计(w/w)组成为：黄豆饼粉1‑3%，葡萄糖1‑3%，玉米浆干粉1‑3%，蛋白胨0.1‑0.5%，硫酸镁0.01‑0.05%，氯化钠0‑0.5%，硫酸铵0.1‑ 0.6%，磷酸二氢钾0.01‑0.1%，碳酸钙0.1‑1%，pH7.0‑8.0余量为水。 [0017] 发明人还要求保护上述茹氏短芽孢杆菌的应用，所述应用为降解1,2‑二氯丙烷，具体应用范围包括对含1,2‑二氯丙烷的海水、土壤或其他含1,2‑二氯丙烷的废水的生化处理。 [0018] 具体应用方法为：将该茹氏短芽孢杆菌发酵液或其菌剂投入到处理系统中，可以有效耐受1,2‑二氯丙烷污染物的冲击，能够利用生化系统中的有机物作为自身生长的营养物质，快速降解有机物。 [0019] 优选的，保证处理系统初始茹氏短芽孢杆菌有效活菌数为105‑108cfu/mL，更进一7 步优选为0.1‑6×10 cfu/mL，能够使菌株迅速适应环境，以1,2‑二氯丙烷为碳源进行代谢生长，有效发挥菌株的1,2‑二氯丙烷降解效果。 [0020] 经应用实验，上述茹氏短芽孢杆菌可在含1,2‑二氯丙烷的海水中连续培养应用，且降解效果稳定。 [0021] 具体应用时可以将上述茹氏短芽孢杆菌发酵液或其菌剂投入到含有1,2‑二氯丙5 8 烷的海水、土壤或污水即可，添加上述菌剂后，体系中初始有效活菌菌量为10‑10cfu/mL ， 7 更进一步优选为0.1‑6×10cfu/mL。 [0022] 优选的，1,2‑二氯丙烷的初始浓度在600mg/L以下，更优选的，生化系统中1,2‑二氯丙烷初始浓度在300mg/L以下。 [0023] 本发明所述菌株的应用条件为：温度28‑37℃，优选33℃；pH6‑9，优选pH7。 [0024] 综上所述，本发明的有益效果如下：利用本发明提供的菌株制备的菌剂应用于含1,2‑二氯丙烷废水、废气及土壤的生物法处理中，对1,2‑二氯丙烷具有非常好的降解特性，在应用中具有简单、高效的特点，利用本发明菌株及方法，显著提高了1,2‑二氯丙烷废水的处理效率。 [0025] 发明人对上述菌株进行了保藏，具体保藏信息如下：保藏时间：2023年3月31日保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号：CGMCC No.26981 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号分类命名: 茹氏短芽孢杆菌（Brevibacillus reuszeri）。附图说明 [0026] 图1为本发明所述菌株在LB培养基上菌落形态照片；图2为实施例4中在1,2‑二氯丙烷污水处理中1,2‑二氯丙烷的降解曲线图；图3为实施例6中在1,2‑二氯丙烷土壤处理中1,2‑二氯丙烷的降解曲线图。具体实施方式 [0027] 以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成，下述实施例中所采用的菌种均为保藏号CGMCC No. 26981的菌种。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。 [0028] 下述各实施例中所涉及的菌剂发酵过程的“溶氧”是指空气饱和度(%)，是发酵行业通用的溶解氧浓度的表示方法。污水处理的曝气过程的“溶氧”是指水中溶解氧的绝对浓度，以mg/L表示，是环保行业污水处理常用溶氧表示方法。 [0029] 实施例1 菌株的获得：从山东省滨州市某污水处理厂附近所取的样品中分离出5株可利用1,2‑二氯丙烷为唯一碳源的菌株，并分别进行分离纯化。 [0030] 对5株待选菌株分别在不同浓度的1,2‑二氯丙烷为唯一碳源的培养基中培养，最终筛选出一株降解效率高、生长迅速且有稳定的传代特性的菌株，将其命名为YJY23‑07。 [0031] 该菌株形态特征为：革兰氏阴性短杆菌，如图1所示，在LB培养基上菌落圆形，扁平，边缘整齐，淡黄色，粗糙，不透明，菌落大小约1‑3mm。生长温度15‑45℃，在pH6‑9范围内生长，接触酶阳性，氧化酶、硝酸盐还原、淀粉水解均为阴性，利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖产酸。 [0032] 发明人对其进行了16SrDNA测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上鉴定结果该菌属于茹氏短芽孢杆菌（Brevibacillus reuszeri）。 [0033] 发明人将其进行了生物保藏，于2023年3月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌株代码为YJY23‑07，保藏号为CGMCC No.26981。 [0034] 实施例2 茹氏短芽孢杆菌菌剂的制备：第一步，将纯化后的茹氏短芽孢杆菌接种于试管斜面培养基上，并将其置于恒温培养箱内，培养至培养基上长出菌落，得到茹氏短芽孢杆菌斜面；第二步，将第一步的得到的单菌落转移至50‑100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基内，于35℃，185r/min的条件下过夜培养，得到一级种子液，将得到的一级种子液按照10%（V/V）接种至LB培养基中，同样条件下培养16h，获得二级种子液，并置于4℃保存；上述牛肉膏蛋白胨培养基配方为：按重量计百分比计为：5%牛肉膏,10%蛋白胨,5% NaCl, pH7.0，余量为水,调节pH值至7.0，121℃灭菌20min后使用；第三步，将第二步获得的二级种子液按照5%(V/V)接种至发酵培养基中进行发酵培养，控制发酵温度为35±1℃，溶氧30%左右，培养16‑24h，溶氧上升，pH下降，停止发酵即得到1,2‑二氯丙烷降解菌剂。 [0035] 在本实施例中所得菌剂的活菌数为7.8×109cfu/mL。 [0036] 上述发酵培养基按重量计(w/w)组成为：黄豆饼粉2%，葡萄糖2%，玉米浆干粉1.5%，蛋白胨0.2%，硫酸镁0.01%，氯化钠0.1%，硫酸铵0.4%，磷酸二氢钾0.03%，碳酸钙0.1%，pH7.0‑7.5，余量为水。 [0037] 实施例3 菌剂在1,2‑二氯丙烷污水处理中的模拟应用：按照实施例2的方法制备1,2‑二氯丙烷降解菌剂，培养温度为33±1℃，得到的菌 8 剂活菌数为5×10cfu/mL。 [0038] 模拟应用：处理水质来源为一农化污水处理厂好氧段进水，处理量为5L，添加1,2‑6 二氯丙烷降解菌剂使体系初始菌量约为1×10cfu/mL，室温下曝气处理使溶氧在2mg/L以上，污水pH6.0‑8.0，原污水COD约6325mg/L，氨氮约439mg/L，添加1,2‑二氯丙烷浓度至 180mg/L，24h后污水1,2‑二氯丙烷含量<1mg/L，降解率达到99.9%以上。 [0039] 实施例4 菌剂在1,2‑二氯丙烷污水处理中的实际应用一：按照实施例2的方法制备1,2‑二氯丙烷降解菌剂，培养温度为33±1℃，控制溶氧 8 为30%，得到的菌剂活菌数为9×10cfu/mL。 [0040] 处理水质来源为油田回注水，添加1,2‑二氯丙烷降解菌剂使体系初始菌量约为7 1.8×10 cfu/mL，处理量为2L，温度33℃，污水pH7.5，COD约807mg/L，氨氮约11mg/L，总氮 41mg/L,人为添加1,2‑二氯丙烷浓度至200mg/L，每4h取样检测体系1,2‑二氯丙烷含量，其降解情况见图2，污染物在28h可以实现完全降解。 [0041] 实施例5 菌剂在1,2‑二氯丙烷污水处理中的实际应用二：按照实施例2的方法制备1,2‑二氯丙烷降解菌剂，培养温度为35±1℃，控制溶氧 9 为30%，得到的菌剂活菌数为5×10cfu/mL。 [0042] 处理水质来源为石化污水处理厂好氧池进水，处理量为10L，添加1,2‑二氯丙烷降7 解菌剂使体系初始菌量约为2.5×10 cfu/mL，室温下曝气处理使溶氧在2mg/L以上，污水pH6.0‑8.0，1,2‑二氯丙烷浓度为5mg/L以下，COD约2200mg/L，挥发酚约240mg/L，氨氮约 100mg/L，硫化物约10mg/L，每24h进出水一次，同时在进水时添加一定量的1,2‑二氯丙烷，检测进水后和出水中1,2‑二氯丙烷的浓度（结果如下表1所示），体系连续使用，根据出水1, 2‑二氯丙烷的含量可以认为该菌剂对1,2‑二氯丙烷污水具有连续的降解能力。 [0043] 表1。 [0044] 实施例6 菌剂在盐碱地土壤处理中的实际应用：试验土壤采自东营黄河口滩涂某蔬菜种植基地，除去石子颗粒等杂质，自然风干后过2mm筛，1,2‑二氯丙烷以100mg/kg的比例加入土壤中，充分混匀，室温下避光平衡3天。 [0045] 设置微生物组和对照组，其中，对照组不做任何处理，微生物组中添加1,2‑二氯丙6 7 烷降解菌剂，使土壤中的1,2‑二氯丙烷降解菌的活菌量达到10‑10CFU/g，土壤pH值为7.8，土壤含水量为10％‑20％，盐含量0.5%；每组处理2kg土壤，每3天采一次样检测1,2‑二氯丙烷的含量，微生物组底物浓度降低至2mg/kg以下时，重新补加1,2‑二氯丙烷并提高添加浓度，将土壤完全混匀，试验共持续21天，定期向土壤中加入去离子水以保持土壤水分，图3为 1,2‑二氯丙烷土壤处理效果，可见其在1,2‑二氯丙烷污染的土壤中具有较为稳定的持续降解能力。 [0046] 实施例7 1,2‑二氯丙烷降解菌剂在海水中降解1,2‑二氯丙烷的模拟应用：按照实施例2的方法再次制备1,2‑二氯丙烷降解菌剂，培养温度为30±1℃，控制 8 溶氧为30%，得到的菌剂活菌数为8×10cfu/mL。 [0047] 模拟应用：水质来源为2023年7月份渤海东营附近浅水域海水，添加1,2‑二氯丙烷7 降解菌剂使体系初始菌量约为6×10 cfu/mL，水质情况：pH7.9、COD约1.1mg/L,氨氮约 0.2mg/L,含盐量32.987g/kg；添加1,2‑二氯丙烷浓度至200mg/L,处理水量为1L，室温下曝气处理使溶氧在2mg/L以上，24h后水中1,2‑二氯丙烷含量＜1mg/L，说明该菌具有一定的耐盐性，在海水中有一定量的1,2‑二氯丙烷情况下，可以实现其高效快速处理。 [0048] 上述实施例便于本领域技术人员更好的理解本发明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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