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一种SOM-ZIF-8-PEG载体固定化酶及其制备方法和应用

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查;
专利有效性	实质审查	当前状态	实质审查
申请号	CN202410907431.X	申请日	2024-07-08
公开(公告)号	CN118652881A	公开(公告)日	2024-09-17
申请人	湖南理工学院;	申请人类型	学校
发明人	张盼良; 李浩; 孙碧珠; 黄美嫒; 唐课文; 郑淑琴; 马英楠;	第一发明人	张盼良
权利人	湖南理工学院	权利人类型	学校
当前权利人	湖南理工学院	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：湖南省	城市	当前专利权人所在城市：湖南省岳阳市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：湖南省岳阳市学院路、金鄂东路	邮编	当前专利权人邮编：414000
主IPC国际分类	C12N11/14	所有IPC国际分类	C12N11/14 ; C12N11/082 ; C12N9/20 ; C12P41/00 ; C12P7/22
专利引用数量	0	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	北京专赢专利代理有限公司	专利代理人	汪豪;
摘要	本发明公开了一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶及其制备方法和应用，其属于生物催化剂技术领域，该制备方法包括以下步骤：将聚苯乙烯模板加入硝酸锌溶液和2‑甲基咪唑溶液，保持真空状态进行反应后，过滤出固体；将得到的固体分散在第一溶剂中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，可以得到SOM‑ZIF‑8；将SOM‑ZIF‑8和聚乙二醇加至第二溶剂中，进行机械搅拌，可以得到SOM‑ZIF‑8‑PEG；将SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在第三溶剂中，然后加入洋葱假单胞菌脂肪酶进行搅拌反应，可以得到固定化酶。上述制备方法具有实施操作简便，选择性高和重复使用次数多等优点，其制备的固定化酶展现了优异的催化性能，提高了脂肪酶的稳定性，以及保持了游离酶高的对映体选择性。
权利要求	1.一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将聚苯乙烯模板加入硝酸锌溶液和2‑甲基咪唑溶液，保持真空状态进行反应后，过滤出固体；将得到的固体分散在第一溶剂中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，经洗涤、干燥处理，得到具有单晶有序大孔结构特征的ZIF‑8材料，命名为SOM‑ZIF‑8；将SOM‑ZIF‑8和聚乙二醇加至第二溶剂中，进行机械搅拌后，再经过滤分离、洗涤和干燥处理，得到SOM‑ZIF‑8‑PEG；将SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在第三溶剂中，然后加入洋葱假单胞菌脂肪酶进行搅拌反应后，再经洗涤、冷冻干燥处理，得到固定化酶。 2.根据权利要求1所述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其特征在于，所述聚苯乙烯模板的制备方法包括以下步骤：将苯乙烯溶于去离子水中，加入十二烷基硫酸钠和过硫酸钾进行聚合搅拌，反应结束后，抽滤得到聚苯乙烯模板。 3.根据权利要求2所述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其特征在于，加入十二烷基硫酸钠和过硫酸钾进行聚合搅拌的温度控制在50‑100℃。 4.根据权利要求1所述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其特征在于，加入洋葱假单胞菌脂肪酶进行搅拌反应的温度为20‑100℃。 5.根据权利要求1所述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其特征在于，所述第一溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺。 6.根据权利要求1所述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其特征在于，所述第二溶剂为甲醇。 7.根据权利要求1所述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其特征在于，所述第三溶剂为去离子水。 8.根据权利要求1所述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其特征在于，所述SOM‑ZIF‑8、聚乙二醇与洋葱假单胞菌脂肪酶的质量比为1:(15‑20):(6‑14)。 9.一种采用权利要求1‑8中任一项所述制备方法制得的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶。 10.一种如权利要求9所述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶在催化拆分1‑苯乙醇中的应用。
说明书全文	一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶及其制备方法和应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物催化剂技术领域，具体是一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶及其制备方法和应用。背景技术 [0002] 脂肪酶是生物催化中应用最广泛的酶种类之一，已广泛应用于有机合成、食品加工、外消旋混合物的分解和化学分析。具体来说，与传统的化学催化剂相比，它们是理想生物催化剂，具有可再生、可生物降解、环保和在温和条件下运行的巨大优势。尽管脂肪酶具有优势，但它们的高成本仍然是其在商业应用的主要障碍。脂肪酶不易回收，难以重复利用；脂肪酶对反应条要求苛刻，容易失活。酶固定化是克服这些缺点的绿色经济策略。固定化策略提高了它们的操作机械强度、存储时间、可重用性和活性恢复。1‑苯乙醇是芳香仲醇的典型药物，是许多手性药物合成中重要的手性药物和合成中间体。1‑苯乙醇与乙酸乙烯酯之间的酯交换反应已被用来作为测试手性分离能力和酶活性的模型反应。 [0003] 近日，MOFs在固定化酶邻域的应用引其人们的关注。金属‑有机框架(MOFs)代表了由金属节点和有机配体组成的广泛的晶体材料。它们具有优良的三维有序均匀孔隙结构和超高孔隙率、结构和功能的可调性以及可设计性，使其在储气分离、生物医学、生物传感、催化等领域具有了广阔的前景。 [0004] 与大多数MOFs相比，沸石咪唑酸盐框架‑8(ZIF‑8)因其低毒、稳定性好、在温和条件下易于合成等优异性能而得到广泛研究、开发成熟和初步商业化。到目前为止，ZIF‑8已经通过越来越广泛的策略来固定化许多酶。然而，微观孔径阻碍了其在扩散限制过程中的应用。利用模板法构建单晶有序的大孔ZIF‑8(SOM‑ZIF‑8)，具有有序互联的大孔和足够暴露的活性表面是一种有效的策略。与大生物分子酶相互兼容，同时显著提高了酶的负载率和传质效率。但是SOM‑ZIF‑8因其大孔特性具有极高的疏水性，很难与水溶液中酶分子充分接触，导致负载量降低。发明内容 [0005] 本发明的目的在于提供一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。 [0006] 为实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案： [0007] 一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其包括以下步骤： [0008] 将聚苯乙烯模板加入硝酸锌溶液和2‑甲基咪唑溶液，保持真空状态进行反应后，过滤出固体； [0009] 将得到的固体分散在第一溶剂中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，经洗涤、干燥处理，得到SOM‑ZIF‑8； [0010] 将SOM‑ZIF‑8和聚乙二醇加至第二溶剂中，进行机械搅拌后，再经过滤分离、洗涤和干燥处理，得到具有单晶有序大孔结构特征的ZIF‑8材料，命名为SOM‑ZI F‑8‑PEG； [0011] 将SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在第三溶剂中，然后加入洋葱假单胞菌脂肪酶进行搅拌反应后，再经洗涤、冷冻干燥处理，得到固定化酶。 [0012] 优选地，所述聚苯乙烯模板的制备方法包括以下步骤： [0013] 将苯乙烯溶于去离子水中，加入十二烷基硫酸钠和过硫酸钾进行聚合搅拌，反应结束后，抽滤得到聚苯乙烯模板。 [0014] 优选地，加入十二烷基硫酸钠和过硫酸钾进行聚合搅拌的温度控制在50‑100℃。 [0015] 优选地，加入洋葱假单胞菌脂肪酶进行搅拌反应的温度为20‑100℃。 [0016] 优选地，所述第一溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺。 [0017] 优选地，所述第二溶剂为甲醇。 [0018] 优选地，所述第三溶剂为去离子水。 [0019] 优选地，所述SOM‑ZIF‑8、聚乙二醇与洋葱假单胞菌脂肪酶的质量比为1:(15‑20):(6‑14)。 [0020] 本发明实施例的另一目的在于提供一种采用上述制备方法制得的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶。 [0021] 本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶在催化拆分1‑苯乙醇中的应用。 [0022] 本发明实施例提供的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，以高度有序的聚苯乙微球三维结构为模板，采用双溶剂诱导的异相成核法制备出有序大孔S OM‑ZIF‑8单晶材料；在去离子水体系内，利用机械搅拌将聚乙二醇(PEG)和S OM‑ZIF‑8结合，加入洋葱假单胞菌脂肪酶使酶分子扩散进入SOM‑ZIF‑8大孔内部并将酶分子活化，以得到固定化酶。 [0023] 其中，在SOM‑ZIF‑8的表面吸附PEG，利用PEG链上的羟基将疏水多孔的SO M‑ZIF‑8改性为亲水材料，可实现载体在水中良好的分散性。PEG可以提供以下几个好处，包括亲水性、高生物相容性和生物降解性。PEG的高生物相容性在固定化酶的过程中，可增加SOM‑ZIF‑8对生物大分子酶的包容性。同时PEG的亲水性也能使得SOM‑ZIF‑8在酶的水溶液中充分分散，大幅度提高酶负载率。在本发明实施例中，通过将廉价的洋葱假单胞脂肪酶(lipase PS)固定在SOM‑ZIF‑8‑P EG上，可将其应用在对映体苯乙醇(PE)的酯交换拆分反应，采用该固定化酶作为催化剂，用于催化酯交换拆分1‑苯乙醇对映体，可以制备光学纯(S)‑1‑苯乙醇和(R)‑1‑苯乙醇乙酸酯。 [0024] 本发明实施例提供的制备方法具有实施操作简便，选择性高和重复使用次数多等优点，其制备的固定化酶展现了优异的催化性能，提高了脂肪酶的稳定性，以及保持了游离酶高的对映体选择性。附图说明 [0025] 图1为本发明实施例提供的PS@SOM‑ZIF‑8‑PEG和PS@ZIF‑8催化1‑苯乙醇对映体和乙酸乙烯酯底物的光学纯度和转化率随时间变化关系图； [0026] 图2为本发明实施例提供的PS@SOM‑ZIF‑8‑PEG和游离Lipase PS的相对活性测试结果图；图中，(a)为PS@SOM‑ZIF‑8‑PEG和游离Lipase PS在高温条件下持续放置不同时间的相对活性测试结果图；(b)为PS@SOM‑ZIF‑8‑PEG和游离Lipase PS在不同溶剂中的相对活性测试结果图； [0027] 图3为本发明实施例提供的固定化酶在不同循环使用次数下相对活性测定结果图。具体实施方式 [0028] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0029] 在本发明的一个实施例中，提供了一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其包括以下步骤： [0030] S1、将聚苯乙烯模板加入硝酸锌溶液和2‑甲基咪唑溶液，保持真空状态进行反应后，过滤出固体； [0031] S2、将得到的固体分散在第一溶剂中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，经洗涤、干燥处理，得到SOM‑ZIF‑8； [0032] S3、将SOM‑ZIF‑8和聚乙二醇加至第二溶剂中，进行机械搅拌后，再经过滤分离、洗涤和干燥处理，得到SOM‑ZIF‑8‑PEG； [0033] S4、将SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在第三溶剂中，然后加入洋葱假单胞菌脂肪酶进行搅拌反应后，再经洗涤、冷冻干燥处理，得到固定化酶。 [0034] 需要说明的是，上述步骤中，机械搅拌的时间可以控制在2‑4天；干燥处理的方法为在50‑70℃的温度下进行真空干燥。 [0035] 在本发明的一个优选实施例中，聚苯乙烯模板的制备方法包括以下步骤： [0036] 将苯乙烯溶于去离子水中，加入十二烷基硫酸钠和过硫酸钾进行聚合搅拌，反应结束后，抽滤得到聚苯乙烯模板。 [0037] 在本发明的一个优选实施例中，加入十二烷基硫酸钠和过硫酸钾进行聚合搅拌的温度控制在50‑100℃。 [0038] 在本发明的一个优选实施例中，加入硝酸锌溶液和2‑甲基咪唑溶液，保持真空状态10‑60min。 [0039] 在本发明的一个优选实施例中，加入洋葱假单胞菌脂肪酶进行搅拌反应的温度为20‑100℃，时间为4‑14h。 [0040] 在本发明的一个优选实施例中，第一溶剂为N,N‑二甲基甲酰胺(DMF)；第二溶剂为甲醇；第三溶剂为去离子水。 [0041] 在本发明的一个优选实施例中，将SOM‑ZIF‑8和聚乙二醇加至第二溶剂中，可小批量(单次添加5‑20mg的SOM‑ZIF‑8)进行。 [0042] 在本发明的一个优选实施例中，SOM‑ZIF‑8、聚乙二醇与洋葱假单胞菌脂肪酶的质量比为1:(15‑20):(6‑14)。 [0043] 在本发明的另一个实施例中，还提供了一种上述的SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶在催化拆分1‑苯乙醇中的应用。具体的，采用该固定化酶作为催化剂，用于催化酯交换拆分1‑苯乙醇对映体，可以制备光学纯(S)‑1‑苯乙醇和(R)‑1‑苯乙醇乙酸酯。 [0044] 下述实施例为本发明在实际应用中的部分具体实施案例，但不局限于此。 [0045] 实施例1：该实施例提供了一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其包括以下步骤： [0046] (1)将52mL苯乙烯溶于360mL去离子水中，加入0.6g十二烷基硫酸钠和0.54g过硫酸钾进行聚合搅拌，反应结束后抽滤得到聚苯乙烯模板； [0047] (2)将聚苯乙烯模板加入5.8g硝酸锌溶液和4.4g的2‑甲基咪唑溶液，将反应体系抽真空并维持真空状态10min，反应结束后过滤出固体； [0048] (3)将得到的固体分散在DMF中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，用甲醇洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8； [0049] (4)将10mg的SOM‑ZIF‑8和150mg聚乙二醇溶于甲醇溶剂，机械搅拌3天，过滤分离得到固体，用甲醇溶剂洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8‑PEG； [0050] (5)将上述SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在适量去离子水中，加入60mg洋葱假单胞菌脂肪酶，室温下搅拌反应4h； [0051] (6)反应结束后，洗涤并冷冻干燥得到固定化酶。 [0052] 实施例2：该实施例提供了一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其包括以下步骤： [0053] (1)将52mL苯乙烯溶于360mL去离子水中，加入0.6g十二烷基硫酸钠和0.54g过硫酸钾进行聚合搅拌，反应结束后抽滤得到聚苯乙烯模板； [0054] (2)将聚苯乙烯模板加入5.8g硝酸锌溶液和4.4g的2‑甲基咪唑溶液，将反应体系抽真空并维持真空状态20min，反应结束后过滤出固体； [0055] (3)将得到的固体分散在DMF中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，用甲醇洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8； [0056] (4)将10mg的SOM‑ZIF‑8和200mg聚乙二醇溶于甲醇溶剂，机械搅拌3天，过滤分离得到固体，用甲醇溶剂洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8‑PEG； [0057] (5)将上述SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在适量去离子水中，加入80mg洋葱假单胞菌脂肪酶，室温下搅拌反应10h； [0058] (6)反应结束后，洗涤并冷冻干燥得到固定化酶。 [0059] 实施例3：该实施例提供了一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其包括以下步骤： [0060] (1)将52mL苯乙烯溶于360mL去离子水中，加入0.6g十二烷基硫酸钠和0.54g过硫酸钾进行聚合搅拌，反应结束后抽滤得到聚苯乙烯模板； [0061] (2)将聚苯乙烯模板加入5.8g硝酸锌溶液和4.4g的2‑甲基咪唑溶液，将反应体系抽真空并维持真空状态30min，反应结束后过滤出固体； [0062] (3)将得到的固体分散在DMF中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，用甲醇洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8； [0063] (4)将10mg的SOM‑ZIF‑8和150mg聚乙二醇溶于甲醇溶剂，机械搅拌3天，过滤分离得到固体，用甲醇溶剂洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8‑PEG； [0064] (5)将上述SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在适量去离子水中，加入100mg洋葱假单胞菌脂肪酶，室温下搅拌反应12h； [0065] (6)反应结束后，洗涤并冷冻干燥得到固定化酶。 [0066] 实施例4：该实施例提供了一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其包括以下步骤： [0067] (1)将52mL苯乙烯溶于360mL去离子水中，加入0.6g十二烷基硫酸钠和0.54g过硫酸钾进行聚合搅拌，反应结束后抽滤得到聚苯乙烯模板； [0068] (2)将聚苯乙烯模板加入5.8g硝酸锌溶液和4.4g的2‑甲基咪唑溶液，将反应体系抽真空并维持真空状态10min，反应结束后过滤出固体； [0069] (3)将得到的固体分散在DMF中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，用甲醇洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8； [0070] (4)将10mg的SOM‑ZIF‑8和150mg聚乙二醇溶于甲醇溶剂，机械搅拌3天，过滤分离得到固体，用甲醇溶剂洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8‑PEG； [0071] (5)将上述SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在适量去离子水中，加入120mg洋葱假单胞菌脂肪酶，室温下搅拌反应14h； [0072] (6)反应结束后，洗涤并冷冻干燥得到固定化酶。 [0073] 实施例5：该实施例提供了一种SOM‑ZIF‑8‑PEG载体固定化酶的制备方法，其包括以下步骤： [0074] (1)将52mL苯乙烯溶于360mL去离子水中，加入0.6g十二烷基硫酸钠和0.54g过硫酸钾进行聚合搅拌，反应结束后抽滤得到聚苯乙烯模板； [0075] (2)将聚苯乙烯模板加入5.8g硝酸锌溶液和4.4g的2‑甲基咪唑溶液，将反应体系抽真空并维持真空状态30min，反应结束后过滤出固体； [0076] (3)将得到的固体分散在DMF中，将聚苯乙烯模板从固体中溶解出来，用甲醇洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8； [0077] (4)将10mg的SOM‑ZIF‑8和200mg聚乙二醇溶于甲醇溶剂，机械搅拌3天，过滤分离得到固体，用甲醇溶剂洗涤，在60℃下真空干燥得到SOM‑ZIF‑8‑PEG； [0078] (5)将上述SOM‑ZIF‑8‑PEG分散在适量去离子水中，加入140mg洋葱假单胞菌脂肪酶，室温下搅拌反应12h； [0079] (6)反应结束后，洗涤并冷冻干燥得到固定化酶。 [0080] 实验例1：取5mmol的外消旋1‑苯乙醇对映体和30mmol乙酸乙烯酯加入至25mL容量瓶中，并加入正己烷溶液定容。用移液管移取2mL反应液，并加入10mg上述实施例5的固定化酶，在600rpm、60℃下加热反应1h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析，分析结果表明：上述固定化酶在正己烷中的催化性能较优，其(R)‑苯乙醇的转化率为98.9％，底物的光学纯度为97.8％。 [0081] 另外，将游离脂肪酶(洋葱假单胞菌脂肪酶，Lipase PS)固定在普通ZIF‑8载体上得到固定化酶PS@ZIF‑8，本发明实施例5制得的固定化酶PS@SOM‑ZIF‑8‑PEG和PS@ZIF‑8催化1‑苯乙醇对映体和乙酸乙烯酯底物的光学纯度(ees)和转化率(Conversion)随时间变化关系如图1所示。 [0082] 实验例2：分别取10mg上述实施例5的固定化酶(PS@SOM‑ZIF‑8‑PEG)以及未进行固化的游离脂肪酶(洋葱假单胞菌脂肪酶，Lipase PS)，置于异辛烷(Isooctane)、正己烷(n‑Hexane)、环己烷(Cyclohexane)、对甲基叔丁基醚(MTBE)、乙腈(ACE)和1,2‑二氯乙烷(DCE)这几种不同的溶剂中，利用测活性方法评价酶的溶剂耐受性，结果如图2的(b)所示。其中，在异辛烷、正己烷、环己烷这三种非极性溶剂中，固定化酶和游离脂肪酶的活性均能保持90％以上；但是，在对甲基叔丁基醚、乙腈和1,2‑二氯乙烷这三种溶剂中，未进行固化的游离脂肪酶的活性严重损失，而固定化后的固定化酶能维持明显优于游离脂肪酶的活性。 [0083] 实验例3：分别称取10mg上述实施例5的固定化酶PS@SOM‑ZIF‑8‑PEG和Lipase PS置于80℃的烘箱中分别保持0h、2h、4h、6h、12h、24h和48h后，进行活性测试。以初始的材料活性为100％，分别计算了固定化酶和Lipase PS的相关活性，结果如图2的(a)所示，图中蓝色线条表示固定化酶PS@SOM‑ZIF‑8‑PEG，红色线条表示游离Lipase PS。实验结果表明，Lipase PS在6h时活性接近全部丧失，此时本发明实施例提供的固定化酶保持96％活性。另外，本发明实施例提供的固定化酶在80℃继续保持到48h，相对活性为68％。 [0084] 实验例4：取5mmol的外消旋1‑苯乙醇对映体和30mmol乙酸乙烯酯加入至25mL容量瓶中，并加入正己烷定容；于25mL的反应管中，用移液管移取2mL反应液，并加入10mg上述实施例5的固定化酶，在600rpm、60℃下加热反应1h；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析；再将反应体系固液分离，固体部分用正己烷洗涤后冷冻干燥后回收固定化酶，再在相同条件下进行催化反应，结果如图3所示；分析结果表明：循环使用前六次，固定化酶性能无下降，循环使用第7次，保持初始活性的97％。 [0085] 实验例5：分别取5mmol的外消旋1‑(4‑甲基苯基)乙醇对映体、外消旋1‑(4‑甲氧基苯基)乙醇对映体、外消旋1‑(4‑氟苯基)乙醇对映体、外消旋α‑萘醇对映体和30mmol乙酸乙烯酯加入至25mL容量瓶中，并加入正己烷定容；于25mL的反应管中，用移液管移取2mL反应液，并加入10mg上述实施例5的固定化酶，在600rpm、60℃下加热反应；反应结束后，利用高效液相色谱仪对底物转化率和产物的光学纯度进行分析；分析结果表明：反应12h后测得1‑(4‑甲基苯基)乙醇的底物转化率为49.7％，剩余底物光学纯度为99.8％；反应6h后测得1‑(4‑甲氧基苯基)乙醇的底物转化率为49.1％，剩余底物光学纯度为97.8％；反应3h后测得1‑(4‑氟苯基)乙醇的底物转化率为49.3％，剩余底物光学纯度为92.9％；反应6h后测得α‑萘醇的底物转化率为49.7％，剩余底物光学纯度为95.6％。说明本发明制备的固定化酶具有很好的通用性，能用于一系列醇类物质对映体的分离。 [0086] 需要说明的是，上述实验例中底物的光学纯度和底物转化率采用美国Water s e2695高效液相色谱仪分析，Daicel Chiralcel IG手性柱(250mm×4.6mm I.D.)；流动相组成为V(正己烷)：V(无水乙醇)＝97:3；流速为1mL/min，UV检测波长为210nm，柱温为25.0℃，进样量10μL；剩余底物光学纯度(eeS)，产物光学纯度(eeP)，(R)‑1‑苯乙醇转化率(cR)和(R)‑1‑苯乙醇产率(YR)分别通过以下公式计算： [0087] [0088] 其中，[R]和[S]分别表示反应后剩余底物中(R)‑1‑苯乙醇和(S)‑1‑苯乙醇的浓度；[R]1和[S]1分别表示反应后产物中(R)‑1‑苯乙醇乙酸酯和(S)‑1‑苯乙醇乙酸酯的浓度；[R]0表示(R)‑1‑苯乙醇的初始浓度。 [0089] 月桂酸与1‑十二醇的标准酯化反应检测固定化酶和游离脂肪酶的活性。反应溶液为含月桂酸(0.2M)及1‑十二醇(0.2M)存于异辛烷中与少量水(20μL)的混合物(10mL)。此后，添加10mg固定化脂肪酶或游离脂肪酶(市售脂肪酶粉末)以启动反应并且在200rpm的搅拌速度下将反应在37℃维持0.5h。取1mL样品与5mL乙醇‑丙酮(1:1，v/v)混合，停止反应。用0.05M氢氧化钠溶液滴定样品中剩余的月桂酸。1个酶活性单位(U)为每分钟消耗1μmol月桂酸的脂肪酶量。 [0090] 以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容。

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