专利类型 | 发明授权 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; 未缴年费; |
专利有效性 | 失效专利 | 当前状态 | 权利终止 |
申请号 | CN200480015594.8 | 申请日 | 2004-05-21 |
公开(公告)号 | CN1802434B | 公开(公告)日 | 2011-03-23 |
申请人 | 索尼株式会社; | 申请人类型 | 企业 |
发明人 | 佐藤敦; 池田笃治; 加纳健司; | 第一发明人 | 佐藤敦 |
权利人 | 索尼株式会社 | 权利人类型 | 企业 |
当前权利人 | 索尼株式会社 | 当前权利人类型 | 企业 |
省份 | 当前专利权人所在省份: | 城市 | 当前专利权人所在城市: |
具体地址 | 当前专利权人所在详细地址:日本东京都 | 邮编 | 当前专利权人邮编: |
主IPC国际分类 | C12N11/00 | 所有IPC国际分类 | C12N11/00 ; C12M1/40 ; G01N27/30 ; G01N27/48 ; H01M8/16 |
专利引用数量 | 4 | 专利被引用数量 | 0 |
专利权利要求数量 | 17 | 专利文献类型 | B |
专利代理机构 | 北京市柳沈律师事务所 | 专利代理人 | 宋莉; 贾静环; |
摘要 | 使用包括戊二 醛 和聚-L-赖 氨 酸的具有加到其上的 电子 受体化合物的固定载体,进行在 电极 上的酶和电子受体化合物的同时固定。例如,使用心肌黄酶作为酶,且使用2-氨基-3-羧基-1,4- 萘 醌(ACNQ)作为胺化的电子受体化合物。 | ||
权利要求 | 1.一种包括固定载体和酶的电极,该固定载体包含具有能够与氨基或亚氨基聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物,或者该固定载体具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物,其中当固定载体包含具有能够与氨基或亚氨基聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物时,该固定载体还含有具有氨基的电子受体化合物,以及当该固定载体具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物时,该固定载体还包含具有羧基的电子受体化合物。 |
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说明书全文 | 固定载体、该固定载体的制造方法、电极、该电极的制造方法、电极反应 利用装置及其制造方法 技术领域[0001] 本发明涉及固定载体、其制造方法、电极、其制造方法、电极反应利用装置及其制造方法,其适合应用于跟踪(following)生物代谢且使用该生物代谢作为电极反应的各种电极反应利用装置,例如生物传感器、生物反应器、生物燃料电池等等。 背景技术 [0002] 在生物中的生物代谢为具有高基质选择性和非常高效率的反应机理。其特征在于在保持在室温和中性的相对适中的环境下进行反应。这里的生物代谢其中包括吸尘作用(aspiration)和光合作用,其将氧和各种营养元素如糖、脂肪、油、和蛋白质转化为微生物和细胞生长所必需的能量。 [0003] 这种生物反应很大程度上依赖于由蛋白质构成的生物催化剂,即,酶。使用酶的催化反应的主意从人类历史的早期已开始实行。其应用涉及许多工业领域,包括酿造工业、发酵工业、纤维工业、皮革工业、食品工业和药品工业。最近,其在将催化功能引入电极体系的电子领域如生物传感器、生物反应器、生物燃料电池的应用已进行检验并投入实际应用。 [0004] 酶由蛋白质组成,且通常对于热、强酸、强碱、有机溶剂等是不稳定的。因此,酶仅可用于水溶液中。为了产生酶促反应,迄今为止已使用间歇过程,其将酶溶于水溶液中以使其作用于基质。然而,在从反应后酶未退化(degeneration)的溶液中回收和再利用酶的方面,有极端的技术困难。因此,该方法导致在每次反应后酶的处理,且这肯定是不经济的使用方式。 [0005] 在该背景下,提出水-不可溶固定酶。一旦酶不溶于水,可以与用于普通化学反应的固体催化剂相同的方式处理该高度特定的酶。这是使用酶的非常有用的方法。 [0006] 在将酶应用于电极体系的应用中几乎也是这样。酶在电极上的高密度固定使得可有效地捕捉在电极附近发生的酶促反应作为电信号。对于电极 体系的研究,通常,必须使用在作为酶的蛋白质和电极之间起电子转移介质作用的电子受体化合物,其中不可能发生电子的媒介作用(intermediation)。优选地,该电子受体化合物同样固定到酶上。 [0007] 固定酶的方法粗分为两类,即诱捕法(entrapping method)和结合法。诱捕法进一步分为网格-型法和微胶囊型法。另一方面,取决于结合模式,结合法进一步分为吸收法、共价键法(交联法)、和其他方法。 [0008] 诱捕法用不与酶本身结合的不溶于水的、半渗透聚合物包裹该酶。该方法的优点在于破坏酶活性的可能性低,因为在相对温和的条件下进行固定。另一方面,由于酶通过固定不被洗提,同时酶的反应基质必须具有易于通过的空隙,因此每次当酶和基质的组合变化时,必须选择适当的诱捕剂。 [0009] 吸收法使用酶的离子吸收或物理吸收。虽然该方法使用容易的固定方式,但吸收状态易受使用条件的影响,且酶的吸收和解吸易于变得不稳定。因此,该方法不能成为用于固定的通用技术。 [0010] 共价键法使用酶的氨基、羧基用于通过使用交联剂进行的结合。虽然该方法可稳定地相对容易地固定酶,但经常引起酶的钝化,因为交联剂可对酶活性中心附近的部分进行改性或用于交联的条件对于酶是苛刻的。 [0011] 已提出一种功能电极的制造方法,其用产生导电聚合物和支持电解质的单体浸渍多孔电极,并在支持电解质溶液中引起电解氧化以在多孔电极内部的整个表面上产生导电聚合物涂层(日本专利公开No.JP-H06-271655)。另外,已提出测量旋光异构体如D-乳酸、L-乳酸等的方法(日本专利公开No.JP-H06-121697)。 [0012] 如上评论的,那些传统的固定方法具有各自的缺点,且需要努力去确定用于每个酶-基质组合的最优化的固定方法。此外,经过确定对电极体系的固定,由于作为电子传输介质的电子受体化合物的固定也是如上述所期望的,这里需要能够保持酶、电子受体化合物和基质的各自活性的固定,这使得固定方法的确定更加困难。 [0013] 因此本发明的一个目的是提供适用于通过将酶固定到电极体系或同时固定酶和电子受体化合物来实现引入酶的催化功能的高效率功能电极的固定载体,电极功能利用装置及其制造方法。 发明内容[0014] 作为为克服上述问题的深入研究的结果,本发明人发现使用采用戊二醛和聚-L-赖氨酸作为交联剂的固定载体是有效的。优选除这些交联剂之外,对电子受体化合物(特别是具有氨基的电子受体化合物)进行组合是有效的。进一步的研究产生这样的结果:使用包含具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的两个或多个基团的第一化合物(如上述的戊二醛)和具有氨基或亚氨基的第二化合物(如上述的聚-L-赖氨酸)的固定载体,或包含具有能够与具有羧基的化合物聚合的两个或多个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物的固定载体作为交联剂是有效的。 [0015] 基于那些研究已完成了本发明。 [0016] 即,为了解决那些问题,本发明的第一方面是包括戊二醛和聚-L-赖氨酸的固定载体。 [0017] 本发明的第二方面是包括其中戊二醛和聚-L-赖氨酸通过交联偶合的结构的固定载体。 [0018] 戊二醛(戊-二醛)包括两个醛基以形成席夫碱,且已用作交联剂。然而,单独使用戊二醛的实际的酶固定在酶固定的量方面有限,且酶的自-膜洗提(ex-membrane elution)不完全。另一方面,形成聚-L-赖氨酸(多肽)的L-赖氨酸为一种α-氨基酸且其作为几乎所有蛋白质的构成氨基酸而存在。由于其在侧链上具有伯氨基,其具有充足的正电荷且没有毒性。由于其充足的正电荷,聚-L-赖氨酸有时在聚离子络合法(complex method)中用作固定载体,该方法为与具有负电荷的酶的类-静电作用。但是,其遭受周围电荷平衡,且在酶固定量和对使用条件的稳定性方面大幅变化。另外,只有很少的使用这些固定方案和材料的同时固定酶/电子受体化合物的实际例子,且未报道有同时确保酶/电子受体化合物的可接受量和活性保持且通过酶固定电极不受整个反应的速率控制的高效功能电极。 [0019] 与此相反,在本发明的第一和第二方面,通过使用上述的包含戊二醛和聚-L-赖氨酸的固定载体,可大大改善各自的酶固定性能,且作为固定载体的整体可获得优异的酶固定性能。 [0020] 戊二醛和聚-L-赖氨酸的组成比通常可任意确定,尽管其最优值随着固定的酶和相关的基质而变化。 [0021] 在本发明的第一和第二方面,固定载体优选包含电子受体化合物。基 本上,电子受体化合物可为任意化合物,只要当固定载体在电极中形成时,其可相对容易地与电极交换电子。但是,优选地,电子受体化合物另外含有氨基。当电子受体化合物与包含戊二醛和聚-L-赖氨酸的交联剂相组合时,其可起到支持在戊二醛和聚-L-赖氨酸之间交联的作用。 [0022] 如果必要的话,固定载体可包含除电子受体化合物之外的化合物。 [0023] 本发明的第三方面为包括具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第一化合物,和具有氨基或亚氨基的第二化合物的固定载体。 [0024] 本发明的第四方面为包括其中具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物通过交联偶合的结构的固定载体。 [0025] 本发明的第五方面是包括具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物的固定载体。 [0026] 本发明的第六方面是包括其中具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物通过交联偶合的结构的固定载体。 [0027] 本发明的第七方面是包括含戊二醛和聚-L-赖氨酸的固定载体和酶的电极。 [0028] 本发明的第八方面是包括固定载体和酶的电极,该固定载体包含具有能够与氨基或亚氨基聚合的至少两个基团的第一化合物,和具有氨基或亚氨基的第二化合物。 [0029] 本发明的第九方面是包括固定载体和酶的电极,该固定载体具有其中具有能够与氨基或亚氨基聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物通过交联偶合的结构。 [0030] 本发明的第十方面是包括固定载体和酶的电极,该固定载体包含具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物,和具有羧基的第四化合物。 [0031] 本发明的第十一方面是包括固定载体和酶的电极,该固定载体包含具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物,和具有羧基的第四化合物。 [0032] 本发明的第十二方面是使用含固定载体和酶的电极的电极反应利用装 置,其特征在于该固定载体包括具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第一化合物,和具有氨基或亚氨基的第二化合物。 [0033] 本发明的第十三方面是使用含固定载体和酶的电极的电极反应利用装置,其特征在于该固定载体具有其中具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物通过交联偶合的结构。 [0034] 本发明的第十四方面是使用含固定载体和酶的电极的电极反应利用装置,其特征在于该固定载体包含具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物。 [0035] 本发明的第十五方面是使用含固定载体和酶的电极的电极反应利用装置,其特征在于该固定载体具有其中具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物通过交联偶合的结构。 [0036] 本发明的第十六方面是制造固定载体的方法,包括:使具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物聚合。 [0037] 本发明的第十七方面是制造固定载体的方法,包括:使具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有氨基或亚氨基的第四化合物聚合。 [0038] 本发明的第十八方面是制造电极的方法,包括:将酶固定到固定载体,该固定载体包含具有能够与氨基或亚氨基聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物。 [0039] 本发明的第十九方面是制造电极的方法,包括:将酶固定到固定载体,该固定载体包含具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物。 [0040] 本发明的第二十方面是制造电极的方法,包括:将酶固定到固定载体,该固定载体通过具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物的聚合得到。 [0041] 本发明的第二十一方面是制造电极的方法,包括:将酶固定到固定载体,该固定载体通过具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物的聚合得到。 [0042] 本发明的第二十二方面是制造使用含固定载体和酶的电极的电极反应利用装置的方法,包括以下步骤: [0043] 通过将酶固定到固定载体制造电极,该固定载体包含具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物。 [0044] 本发明的第二十三方面是制造使用含固定载体和酶的电极的电极反应利用装置的方法,包括以下步骤: [0045] 通过将酶固定到固定载体制造电极,该固定载体包含具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物。 [0046] 本发明的第二十四方面是制造使用含固定载体和酶的电极的电极反应利用装置的方法,包括以下步骤: [0047] 通过将酶固定到固定载体制造电极,该固定载体通过具有能够与具有氨基或亚氨基的化合物聚合的至少两个基团的第一化合物和具有氨基或亚氨基的第二化合物的聚合得到。 [0048] 本发明的第二十五方面是制造使用含固定载体和酶的电极的电极反应利用装置的方法,包括以下步骤: [0049] 通过将酶固定到固定载体制造电极,该固定载体通过具有能够与具有羧基的化合物聚合的至少两个基团的第三化合物和具有羧基的第四化合物的聚合得到。 [0050] 在本发明的第三至第二十五方面,第一化合物和第二化合物之间的组成比,与第三化合物和第四化合物之间的组成比,通常可任意确定,虽然它们的最优值随着使用的化合物,固定的酶和相关的基质而变化。本发明的这些方面与本发明第一和第二方面共有的为:固定载体优选另外含有电子受体化合物且如果必要的话,可包含除电子受体化合物之外的化合物。 [0051] 用作交联剂(交联反应物)的第一至第四化合物的实例如下所示。在交联剂的下列实例中,R或R’代表选自脂族烃、环脂族烃、芳族烃、包括α,β,γ-环糊精的环糊精、冠醚、杯芳烃、肽、酶、着色染料等。R和R’可不同或相同。 [0052] 作为可与酶的NH2基团、或电子受体剂的NH2(如果固定载体包含具有NH2的电子受体化合物)交联的化合物,可使用选自下列交联剂实例的一种 或多种化合物。戊二醛为一种醛(R-CHO)。 [0053] 羧酸(R-COOH) [0054] 过酸(R-CO(OOH)) [0055] 硫代羧酸(R-CSOH) [0056] 异氰化物(R-NC) [0057] 氰酸酯(R-OCN) [0058] 异氰酸酯(R-NOC) [0059] 硫氰酸酯(R-SCN) [0060] 醛(R-CHO) [0061] 硫醛(R-CHS) [0062] 酮(R-CO-R’) [0063] 硫酮(R-CS-R’) [0064] 硫醇(R-SH) [0065] 亚胺(R=NH) [0066] 过氧化物(R-OOR’) [0067] 作为可与酶的COOH基团、或电子受体化合物的COOH基团(如果固定载体包含具有COOH基团的电子受体化合物)交联的化合物,可使用选自下列交联剂实例的一种或多种化合物。 [0068] 胺(R-NH2,RR’NH) [0069] 过氧化物(R-CO(OOH)) [0070] 硫代羧酸(R-CSOH) [0071] 酯(R-COOR’) [0072] 卤化物(R-X,X:卤原子) [0073] 酰基卤(R-COX,X:卤原子) [0074] 酰胺(R-CONH2) [0075] 酰肼(R-CO-NHNH2) [0076] 酰亚胺(R-CO-NH-OC-R’) [0077] 脒(R-CNH(NH2)) [0078] 腈(R-CN) [0079] 亚胺(R=NH)(例如聚乙烯亚胺) [0080] 也可使用树枝状大分子(Dendrimer)(例如聚酰胺胺和聚丙烯亚胺)。 [0081] 本发明的酶固定方法可应用于任何酶,该酶优选地具有氨基作为酶蛋白的官能团,虽然其不是必不可少的。可单独使用一种酶,或组合使用两种或多种酶。对一种或多种需要辅酶的酶与一种或多种无需辅酶的酶进行组合使用也是可接受的。酶的实例包括已知+作为NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)/NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的氧化-还原酶的心肌黄酶、葡糖脱氢酶(NAD-依赖酶)等。 [0082] 这里说明酶的分类(IUBMB:国际生物化学和分子生物学联合会/酶命名法委员会)。 [0083] 酶通过酶编码(EC号)分类,且粗分为下列六类(EC1-EC6)。 [0084] EC1;氧化还原酶(氧化-还原酶) [0085] 所有涉及氧化和还原的酶分到此类中。它们占酶表(enzyme table)的约26%。 [0086] [例子]醇脱氢酶(EC1.1.1.1] [0087] 心肌黄酶(EC1.6.99.-](用于本发明后面说明的实施方式的心肌黄酶也可分在此类。) [0088] 随后,它们通过第二和第三个数字进行再分类(sub-classify)。第四个数字为在委员会授权后所给的数。 [0089] 在以上例子中, [0090] [EC1.1.--]:对给体(donor)的CH-OH起作用的酶(在氧化-还原酶中) [0091] [EC1.6.--]:对NADH或NADPH起作用的酶 [0092] EC2;转移酶(转移酶) [0093] 它们对将一个化合物(给体)的某种官能团转移至另一化合物(受体)的反应进行催化。 [0094] [例子]天冬氨酸氨基甲酰转移酶[EC2.1.3.2] [0095] 己糖激酶[EC2.7.1.1] [0097] 它们催化基质的水解。 [0098] [例子]β-淀粉酶[EC3.2.1.2] [0099] 胃蛋白酶A[EC3.4.23.1] [0100] EC4;裂合酶 [0101] 对通过从C-C键、C-O键、C-N键等的消除反应、和相反反应来保持 [0102] 双键的反应进行催化的酶属于这里。 [0103] [例子]草酰乙酸脱羧酶[EC4.1.1.3] [0104] 延胡索酸水合酶[EC4.2.1.2] [0105] EC5;异构酶(异构化酶) [0106] 它们催化异构化反应。 [0107] [例子]丙氨酸消旋酶[EC5.1.1.1] [0108] 磷酸丙糖异构酶[EC5.3.1.1] [0109] EC6;连接酶(合成酶) [0110] 它们催化合成反应。 [0111] [例子]酪氨酸-tRNA连接酶[EC6.1.1.1] [0112] 醋酸酯(acetate)-辅酶A连接酶[EC6.2.1.1] [0113] 为确保酶的功能,除酶和基质之外,有时还需要称作辅酶的低分子有机化合物,该化合物与酶偶合且具有对反应必不可少的作用。优选地,辅酶像酶和电子受体化合物一样+固定。NADH和NAD,以及NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)和NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)是这些辅酶的例子。 [0114] 电极材料可为任意物质,只要其为导电的且不溶于水。这种物质可单独使用或与其他物质组合使用。在其中使用具有大的表面积的材料如碳毡或活性炭作为电极材料的情况下,期望增加每单位体积的酶和电子受体化合物的固定量。 [0115] 其中电极反应利用装置的例子为生物传感器、生物反应器和生物燃料电池。 [0116] 根据具有以上概述构造的本发明,由于包含在固定载体中的第一化合物和第二化合物通过交联偶合,或第三化合物和第四化合物通过交联偶合,即,戊二醛和聚-L-赖氨酸通过交联偶合,因此可能产生可具有足够长和充分自由的三维结构的聚合物。然后,通过使用用于将酶固定到电极的固定载体,可以有利的形式通过聚合物诱捕(entrap)酶。此外,通过使用包含在固定载体内的电子受体化合物,可促进酶和电极之间的电子转移。 附图说明 [0117] 图1为展示在本发明实施方式中通过固定载体在电极上同时固定酶和 电子受体化合物的图像的示意图;图2为展示在其中NADH被电化学氧化的情况下反应机理模型的示意图;图3为展示在其中NADH被电化学氧化的情况下直接氧化波的循环伏安图的示意图;图4为展示在其中NADH通过使用心肌黄酶和ACNQ被电化学氧化的情况下反应机理模型的示意图;图5A和图5B为展示在催化电流中S-型和峰-型循环伏安图的示意图;图6A和图6B为展示VK3和ACNQ的结构的示意图;图7为展示在实施例4中得到的循环伏安图的示意图;图8为展示根据本发明实施方法利用酶-固定电极的酶燃料电池的示意图;图9为以放大比例展示在用于图8所示酶燃料电池中的酶-固定电极的部分的示意图;及图10为展示根据本发明实施方式使用酶-固定电极的生物反应器的示意图 具体实施方式[0118] 下面将参照附图说明本发明的实施方式。 [0119] 该实施方式使用除戊二醛和聚-L-赖氨酸之外还包含电子受体化合物的的固定载体以将酶和电子受体化合物,或酶、辅酶和电子受体化合物同时固定到电极上。该电子受体化合物可包括或不包括氨基。 [0120] 通过固定载体在电极上同时固定酶和电子受体化合物的图像展示在图1中。假定除戊二醛和聚-L-赖氨酸之外固定载体还包含具有氨基的电子受体化合物且酶具有氨基。在图1中,PLL表示聚-L-赖氨酸,且NH2-R表示具有氨基的电子受体化合物。如图1所示,在戊二醛的相对端的两个醛基与聚-L-赖氨酸的氨基交联以形成-N=CH-键,且由此形成足够长且可具有充分自由的三维结构的聚合物。该聚合物的整体诱捕具有氨基的酶(椭圆形的虚线展示了诱捕的图像)。另外,由于酶和电子受体化合物在此同样具有氨基,在戊二醛一端的醛基和聚-L-赖氨酸的氨基可形成-N=CH-键,且在戊二醛另一端的醛基和酶的氨基可同时形成-N=CH-键以交联。可选择地,在戊二醛一端的醛基和聚-L-赖氨酸的氨基可形成-N=CH-键,且戊二醛另一端的醛基和电子受体化合物的氨基可同时形成-N=CH-键以交联。可选择地,在戊二醛一端的醛基和酶的氨基可形成-N=CH-键且戊二醛另一端的醛基和电子受体化合物的氨基可同时形成-N=CH-键以交联。图1所示的结构为聚离子络合物的一个实例。 [0121] 接下来说明一些实施例。 [0122] 实施例1 [0123] 首先评价功能电极的NADH氧化性,在该电极上固定有作为酶的心肌黄酶和作为具有氨基的电子受体化合物的2-氨基-3-羧基-1,4-萘醌(ACNQ)。在不使用心肌黄酶的+反应体系的情况下,如图2所示,NADH在电极上直接氧化成NAD 并释放电子(e-)。从而,其在图3所示循环伏安图(CV)上在0.7V附近作为峰出现。因而,对于在电极上NADH的直接氧化需要大的过电压。因此,酶-固定电极必须具有有效降低过电压和有效氧化NADH的功能。图4展示了通过心肌黄酶(DI)和ACNQ的NADH的氧化机理。NADH通过心肌黄酶-ACNQ氧化。在CV上,观察到其条件作为在ACNQ的氧化-还原电位的-0.3V附近的催化电流,且降低了NADH的氧化过电压。实验条件如下所示。 [0124] 由聚四氟乙烯制成的且具有1ml容量的电解室用作反应容器,且通过施加电压进行NADH的电化学氧化反应。将pH8.0的1ml磷酸缓冲溶液倒入反应容器中作为含水缓冲溶液,并在15分钟氮气置换后,加入足够量的NADH磷酸缓冲溶液(10mM)。将作为对电极的铂丝浸入反应容器中,且将银(Ag)/氯化银(AgCl)电极用作参比电极。之后,将2μl心肌黄酶(Unitika,来自Bacillus stearothermophilus)的磷酸缓冲溶液(47μM)、2.8μl ACNQ乙醇溶液(10mM)、3μl戊二醛水溶液(0.125%)和3μl聚-L-赖氨酸水溶液(1%)倒在玻璃碳电极(BAS,φ=3.0mm)上,并充分混合。然后,在室温下风干后,用蒸馏水冲洗电极,且完成该电极作为心肌黄酶/ACNQ固定电极。为了比较,通过在相同的总量6μl内改变戊二醛和聚-L-赖氨酸的渗入(seeping)量的组成比为2μl和4μl的组合及4μl和2μl的组合,同时保持心肌黄酶和ACNQ的相同的渗入量(2μl和2.8μl)来制备固定电极,且以相同的方式通过单独使用6μl戊二醛和单独使用6μl聚-L-赖氨酸制备其他固定电极。然后,将心肌黄酶/ACNQ固定部分浸入磷酸缓冲溶液中。将这些对电极、参比电极和心肌黄酶/ACNQ-固定电极连接至稳压器,且通过电位扫描法(循环伏安法,CV)扫描的电位电化学地观察反应。扫描电位范围为-0.5~0.1V且在该范围内观察到的最大催化电流值展示在表1中。用于该实验的酶、反应物、装置和实验环境在整个测试中是恒定的,在酶-固定部分的固定量、稳定性、膜性能等方面的相对优点以最大催化电流值的差的形式表现出来。在CV上的曲线的相应形状也展示在表中。通过戊二醛和聚-L-赖氨酸的组合的样品,分 别与仅以相同量使用它们中一个的每个样品相比,可确定是有利的(在表1中(1)和(2)与(4)和(5)相比)。关于在CV上曲线的形状,图5A(S型(表1中的(6)))和图5B(峰型(表1中的(1)))展示了各自实施例。S型催化电流为暗示电极性能界限(电极性能速率控制)的电流,且在0.7V附近出现的直接氧化波表明NADH充分地剩余。与此相反,在通过戊二醛和聚-L-赖氨酸的组合的样品中观察到的峰型催化电流表明作为基质的NADH的供给速度控制。因为在0.7V附近没有观察到NADH的直接氧化波,其暗示在电极附近的NADH完全消耗用于酶反应,且这种电极可有利地作为可用于进一步增加电流值的高-功能电极。 [0125] 表1 [0126] 表中的简写 [0127] GA:戊二醛;PLL:聚-L-赖氨酸;DI:心肌黄酶 [0128] 实施例2 [0129] 通过使用与实施例1相似的测量装置并改变酶-固定电极的条件,进行相同的实验。与根据实施例1的固定电极的制造方法相比,通过单独倒入2μl心肌黄酶且将其固定同时保持戊二醛和聚-L-赖氨酸的相同渗入量(各自为 3μl)制备心肌黄酶-固定电极。那里得到的最大催化电流值示于表1中。没有心肌黄酶和ACNQ固定在电极上。与溶于磷酸溶液的样品(非-固定条件)相比,其表明根据得到的催化电流(表1中(6)与(7)比较),心肌黄酶-固定电极是有利的,且戊二醛和聚-L-赖氨酸的组合使得可单独固定酶。 然而,与实施例1的结果比较,应意识到具有氨基的ACNQ的同时固定对于电极性能来说是更期望的(表1中(1)与(6)比较)。 [0130] 实施例3 [0131] 与根据实施例1的固定电极制造方法相比,通过使用2-甲基-3-羧基-1,4-萘醌(维生素K3,VK3)并组合戊二醛和聚-L-赖氨酸(各自为3μl)来制备样品,和另外,分别使用具有6μl戊二醛和聚-L-赖氨酸之一的VK3-固定电极。然后,在相同的条件下进行那些样品的相似测量。确定倒入的VK3的浓度以产生与ACNQ的情况相同的量。图6A展示了VK3的结构。除了不存在氨基以外,图6A的结构与图6B所示的ACNQ结构相似,且它们的电化学性能倾向于展现相似的趋势。然后得到的最大催化电流值示于表1中。暗示在不具有氨基的VK3中,戊二醛和聚-L-赖氨酸的组合也比分别使用它们中的一种更有利(表1中(8)与(9)和(10)比较)。但是,实施例1的结果还表明使用ACNQ作为电子受体化合物更有利且对于电极性能来说同时固定具有氨基的电子受体化合物更有利(表1中(1)与(8)比较)。而且当葡糖氧化酶用作酶时,已确定有相似的趋势。 [0132] 从实施例1至3应理解,含有戊二醛和聚-L-赖氨酸的固定载体是有用的且可应用于任意酶和任意电子受体化合物。然而,在电极性能和固定位置的稳定性方面,具有氨基的固定载体用于电子受体化合物是有利的。 [0133] 实施例4 [0134] 在根据实施例1的酶-固定电极中,作为酶的心肌黄酶和作为电子受体化合物的ACNQ同时固定。然而,在实施例4中,作为另一种酶的葡糖脱氢酶和作为其辅酶的+NADH(NAD)另外同时固定。已证实葡糖脱氢酶的固定使得能够从葡萄糖(葡萄糖)中提取+ 电流。在这种情况下,电子以葡萄糖→葡糖脱氢酶→NADH(NAD)→心肌黄酶→电子受体化合物→电极的顺序传播。在NADH之后的电子传播已在实施例1中说明。得到的循环伏安图示于图7中。 [0135] 接下来说明根据电极反应利用装置的直接实施方式的酶-固定电极的应 用。 [0136] 图8展示了作为使用酶-固定电极的生物燃料电池的酶燃料电池。 [0137] 如图8所示,在该酶燃料电池中的反应容器11可通过隔板12分为两部分,且每一部分包含反应溶液13。在隔板12的一侧上的反应溶液13中,浸有生物阴极14(负极)。在另外的反应溶液13中,浸有生物阳极15(正极)。在生物阴极14和生物阳极15之间,通过配线16连接负载电阻17。 [0138] 根据该实施方式的酶-固定电极用作生物阴极14和生物阳极15,且例如每个具有图9所示结构。如图9所示,通过在电极基底18上形成酶和电子受体化合物层的固定层19制得生物阴极14和生物阳极15。在图9中,Enzy表示酶,和Med表示电子受体化合物。 [0139] 该酶燃料电池通过用作为燃料的NADH供给生物阴极14和用作为氧化剂的氧等供给生物阳极15来产生电。在这种情况下,在生物阴极14中,在实施例1一起说明的原理下-从NADH供给的电子(e)通过在酶/电子受体化合物层19中的酶和电子受体化合物输送到电极基底18,且这些电子通过配线16电移动到生物阳极15,从而产生电。 [0140] 图10展示了使用酶-固定电极的生物反应器。 [0141] 如图10所示,反应溶液21包含在生物反应器的反应容器20中,且其中浸有工作电极22、参比电极23和对电极24。根据实施方式的酶-固定电极用作工作电极22,且例如,其具有图9所示结构。在参比电极23和对电极24之间连接有恒压发生器,以使参比电压23保持在恒定电位。将工作电极22连接至端子,该端子上连接有恒压发生器25的参比电极。 [0142] 该生物反应器用基质(例如,NADH)供给工作电极25并引起酶促反应以产生所需的产物。 [0143] 如上所述,根据实施方式,由于酶和电子受体化合物同时固定在电极上以通过使用除戊二醛和聚-L-赖氨酸之外还包含电子受体化合物的固定载体形成酶-固定电极,可获得高效率功能电极,该电极的酶固定量增加、几乎能够完全防止酶的洗提、较少受周围电荷平衡的影响、取决于使用条件的酶固定量和稳定性的变化较小、能够保持酶的活性、且通过酶-固定电极不受整体反应速率控制。另外,使用酶-固定电极导致实现高-性能电极反应利用装置如生物燃料电池、生物反应器、生物传感器等。 [0144] 至此,已具体描述了实施方式和实施例。然而,本发明不限于这些实 施方式和实施例,而是基于本发明的技术概念,可以进行各种变化和改进。 [0145] 例如,数值、结构、材料、方法等等不仅仅是实施例,且如果必要的化,可使用任何其他适合的数值、结构、材料、方法等等。 [0146] 根据本发明,现在可通过固定载体高密度地将酶固定到电极上或将酶和电子受体化合物同时固定到电极上,以及可实现能够基质供给速率控制的高效率功能电极。无需作为测量系统的电极性能速率控制,现在可回顾在生物传感器、生物反应器、生物燃料电池等等中的反应体系,详细地,这将很大程度上有助于开发单独的生物装置。此外,本发明可应用于将酶固定到除电极之外的元件或器件上。 |