[0001] 本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及一种固定化甲酸脱氢酶突变体及其在电酶催化CO2中的应用。

[0002] 温室气体CO2大量排放造成了全球气温升高、海平面上升、冰川融化、土地沙漠化等不良影响，对人类生存构成严重威胁。目前存在多种解决温室效应的方法，例如推广使用可再生能源、提高能源利用率或植树造林等。现有技术目前关注于如何对CO2重复利用，将CO2回收利用为能源和其他有价值的化学品，不仅有助于降低大气中的二氧化碳含量，而且可以为能源危机提供解决方案。因此，有效捕获和利用CO2是当前亟待解决的技术问题，具有良好的发展前景。

[0003] CO2可以转化为甲酸、甲醛和甲醇等高附加值化学品。甲酸是一种重要的化工原料，广泛应用于化工生产、橡胶制造、纺织、印染和电镀等各个行业。酶促还原CO2为甲酸具有选择性高、效率高、条件温和等特点，优于化学催化、电催化和光电催化。电酶催化利用电作为还原力，在温和条件下促进反应，并实现辅酶再生，解决了辅酶昂贵的问题。然而，目前已报道的甲酸脱氢酶仍存在酶活性低、稳定性差、无法重复利用等问题。并且游离酶面临着环境稳定性差和可回收性有限的挑战。因此，将酶固定在固相载体上可以提高其对操作条件的耐受性，保持催化活性和稳定性。这种方法可以实现酶的重复利用，从而促进其工业应用。

[0004] 为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种固定化甲酸脱氢酶突变体及其在电酶催化CO2中的应用。

[0005] 本发明借助基因工程技术手段，以之前获得的较高活性的甲酸脱氢酶ClFDH为探针，挖掘到了一个新型甲酸脱氢酶基因（CsFDH）通过理性设计手段将该甲酸脱氢酶的预测保守区域的氨基酸残基进行突变，经筛选得到一个具有高催化活性的甲酸脱氢酶突变体[0006] 第一方面，本发明提供一种甲酸脱氢酶突变体，所述甲酸脱氢酶突变体为在梭状芽孢杆菌（Clostridium scatologenes）野生型甲酸脱氢酶的基础上含有如下突变：第269位甲硫氨酸突变为异亮氨酸、第285位丝氨酸突变为丙氨酸以及第637位丝氨酸突变为丙氨酸；所述梭状芽孢杆菌（Clostridium scatologenes）野生型甲酸脱氢酶的NCBI登录号为WP_082085143.1。

[0007] 进一步地，所述甲酸脱氢酶突变体包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

[0008] 如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：MENKVLTVCPYCGAGCNLYLVVEDGKIVRAEPANGRTNEGNLCLKGHYGWDFLNDPKILTARLKKPMI
RKNGQLEEVSWEEAIDFTASKLKEIKEKYGPNSIMGTGCARGSGNEANYIMQKFMRAVIGTNNVDHCARVCHAPSVAGLAYVLGNGAMSNGIHEIDDCDLVFIFGYNGADSHPIVARRIINAKRKGAKIVVTDPRITESARIADLWLPIKNGTNMILVNAFANVLINEGLYNKQYVEEHTVGFEEYKALVEKYTPEYAEKITGVPAKDIRKAMKMYAKAKNAMILYGMGVCQFGQAVDVVKGLASLALLTGNFGRPNVGIGPVRGQNNVQGACDMGALPNVYPGYQSVTNDEIREKFENAWGVKLPNKVGYHLTEVPHLVLKEDKIKAYYIMGEDPVQSDPDAAEVREALDKLELVIVQDIFMNKTALHADVILPATSWGEHEGVYSSADRGFQRFRKAIEPTGDVKPDWQIISEIATAMGYEMNYKSTKEIWDELRNLCPNFKGASYERLEELGGIQWPCPSEDHPGTSYLYKGNKFNTSSGKANLFAAEWRAPMESTDNEYPLVLSTVREVGHYSVRTMTGNCRALQQLADEPGYVQINPEDARNLNILDQQFVRISSRRGSVVAKALVTDRVNKGAVYMTYQWWVGACNELTLNNLDPISKTPEYKYCAVRVENIKDQKSAEQYVKDEYTKIRKKMNINLECCK。

[0009] 以上所述的甲酸脱氢酶突变体具有高催化活性，较突变前的甲酸脱氢酶的活性显著提高，能够更高效地催化二氧化碳转化为甲酸或甲酸盐。

[0010] 第二方面，本发明提供一种核酸，所述核酸用于编码所述的甲酸脱氢酶突变体。

[0011] 根据以上所述的甲酸脱氢酶突变体的氨基酸序列和密码子规则，本领域技术人员能够获得编码所述甲酸脱氢酶突变体的核酸分子的核苷酸序列。基于密码子的简并性，所述核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码所述甲酸脱氢酶突变体的核酸分子均在本发明的保护范围内。

[0012] 所述核酸优选包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

[0013] 如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列如下：ATGGAAAACAAGGTGCTGACTGTATGTCCGTACTGCGGCGCTGGTTGCAACCTGTACCTGGTGGTGGA
AGATGGCAAGATCGTTCGTGCCGAACCGGCAAACGGCCGTACCAACGAAGGTAATCTGTGCCTGAAAGGCCACTACGGTTGGGACTTTCTGAACGACCCGAAAATCCTGACCGCGCGTCTGAAGAAACCGATGATCCGCAAGAACGGTCAGCTGGAGGAAGTCAGCTGGGAAGAAGCGATTGATTTTACGGCAAGCAAGCTGAAAGAAATCAAAGAAAAATACGGCCCGAACTCTATCATGGGCACGGGCTGTGCTCGTGGTAGCGGCAACGAAGCCAACTACATCATGCAAAAATTCATGCGTGCTGTAATTGGTACCAACAACGTGGATCACTGCGCCCGTGTATGTCACGCACCTTCTGTCGCGGGTCTGGCGTACGTTCTGGGTAACGGTGCGATGTCCAACGGTATTCATGAAATCGACGACTGCGACCTGGTTTTCATCTTCGGCTATAACGGTGCTGACTCTCATCCGATTGTGGCCCGCCGTATTATCAACGCTAAGCGTAAAGGCGCAAAAATTGTAGTTACCGACCCGCGTATTACCGAATCCGCCCGCATCGCGGACCTGTGGCTGCCGATCAAAAATGGCACTAACATGATTCTGGTAAACGCATTCGCGAACGTACTGATCAACGAAGGCCTGTACAACAAACAGTACGTAGAAGAACACACTGTTGGCTTCGAGGAATACAAAGCGCTGGTAGAAAAATACACGCCAGAATACGCGGAAAAAATCACCGGTGTGCCAGCTAAAGATATTCGCAAAGCCATGAAAATGTACGCTAAAGCTAAAAACGCCATGATCCTGTACGGTATGGGCGTTTGTCAGTTCGGCCAGGCGGTTGATGTGGTTAAAGGTCTGGCTAGCCTGGCCCTGCTGACCGGTAATTTCGGTCGCCCGAACGTAGGTATTGGCCCGGTTCGTGGTCAGAACAACGTTCAGGGCGCGTGTGATATGGGTGCACTGCCAAACGTTTACCCTGGCTATCAGTCTGTAACCAACGATGAAATCCGTGAGAAATTTGAGAACGCTTGGGGTGTTAAACTGCCGAACAAAGTGGGTTACCACCTGACCGAAGTGCCGCACCTGGTCCTGAAAGAAGATAAAATTAAAGCATACTACATTATGGGCGAAGACCCGGTGCAGTCCGACCCGGATGCGGCGGAGGTCCGTGAAGCGCTGGATAAACTGGAACTGGTAATCGTTCAGGATATCTTCATGAACAAAACTGCACTGCATGCTGATGTCATCCTGCCGGCAACCTCTTGGGGCGAACACGAAGGTGTTTACTCCTCTGCCGACCGCGGTTTCCAGCGCTTCCGCAAAGCGATCGAACCGACCGGCGATGTAAAGCCGGATTGGCAGATCATCTCCGAGATTGCGACTGCCATGGGCTATGAAATGAACTACAAGTCTACCAAAGAGATCTGGGACGAACTGCGTAATCTGTGCCCGAACTTCAAAGGTGCTTCTTACGAACGCCTGGAAGAGCTGGGCGGTATTCAGTGGCCATGTCCGTCCGAAGATCACCCAGGCACCAGCTACCTGTACAAAGGTAACAAATTTAACACCAGCAGCGGTAAAGCCAACCTGTTTGCAGCTGAATGGCGTGCGCCGATGGAGTCCACCGATAACGAATACCCGCTGGTACTGAGCACCGTCCGCGAAGTAGGTCACTATTCTGTTCGTACGATGACTGGCAACTGCCGTGCGCTGCAGCAGCTGGCGGACGAACCGGGCTACGTGCAGATCAACCCGGAAGACGCCCGCAACCTGAACATCCTGGACCAGCAGTTCGTGCGTATCAGCTCTCGTCGTGGTAGCGTGGTTGCTAAAGCCCTGGTCACCGACCGTGTCAATAAAGGTGCAGTATATATGACGTACCAGTGGTGGGTTGGCGCTTGCAACGAACTGACTCTGAATAACCTGGACCCGATCTCCAAAACCCCGGAGTATAAGTACTGCGCAGTACGTGTAGAAAACATCAAAGACCAAAAATCCGCAGAGCAGTATGTTAAAGACGAATACACCAAAATCCGTAAAAAAATGAATATTAACCTGGAATGTTGTAAA。

[0014] 第三方面，本发明提供生物材料，所述生物材料包括所述的核酸；所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。

[0015] 本发明所述表达盒为将所述核酸分子与转录和/或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。

[0016] 本发明所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子等。其中质粒载体包括表达载体、克隆载体。

[0017] 本发明所述转基因细胞不包括具备独立发育成完整个体能力的转基因细胞，也即是不包括动物品种和植物品种。举例而言，可以是埃希氏菌属细菌或酵母，更优选为大肠杆菌。

[0018] 第四方面，本发明提供一种重组基因工程菌，所述重组基因工程菌表达所述的甲酸脱氢酶突变体，或所述的核酸，或者携带包含所述的核酸的载体；优选地，所述重组基因工程菌为大肠杆菌或酵母。

[0019] 在本发明的一些实施方式中提供一种重组大肠杆菌，其表达以上所述的甲酸脱氢酶突变体，可用于生产以上所述的甲酸脱氢酶突变体。

[0020] 第五方面，本发明提供所述的甲酸脱氢酶突变体或所述的核酸或所述的生物材料或所述的重组基因工程菌的以下任意一种应用：（1）在制备固定化甲酸脱氢酶中的应用；
（2）在制备用于电酶催化CO2制备甲酸或甲酸盐的电极材料中的应用；
（3）在催化二氧化碳转化为甲酸或甲酸盐中的应用；
（4）在利用二氧化碳生产甲酸或甲酸盐中的应用；
（5）在构建用于转化二氧化碳生产甲酸或甲酸盐的工程菌中的应用。

[0021] 第六方面，本发明提供一种固定化甲酸脱氢酶，所述固定化甲酸脱氢酶包含所述的甲酸脱氢酶突变体和固定化载体；优选地，所述固定化载体为HOF材料；
和/或，所述固定化载体和甲酸脱氢酶突变体的质量比为1:（0.28‑1.39）。

[0022] 在本发明的一些实施方式中，所述固定化载体为HOF材料。优选为HOF‑101。HOF‑101是一种新型HOF材料，HOF的无金属特性使其比MOF材料具有更好的生物相容性。本发明通过将所述甲酸脱氢酶突变体与HOF‑101固定化结合制备为固定化酶，显著提高了甲酸脱氢酶突变体的稳定性（包括温度稳定性、pH稳定性和储存稳定性），同时解决了游离酶无法回收利用的问题，得到的固定化酶同时具有高催化活性、高稳定性和可重复利用性，对底物‑1 ‑1
的Km值为45 mM，Kcat/Km值为0.15 s ·mM ；对辅酶的Km值为0.4 mM，Kcat/Km值为43 s‑1 ‑1
·mM ；置于PBS缓冲液（100 mM，pH 7.0）中，在4℃条件下保存30天后，仍然可以保持初始活性的90%；经过10次重复利用之后，活性仍然可以保持初始活性的85%。

[0023] 第七方面，本发明提供所述的固定化甲酸脱氢酶的制备方法，所述方法包括：将甲酸脱氢酶突变体与固定化载体混合处理，使得甲酸脱氢酶突变体吸附并被包裹于所述固定化载体的孔径中。例如通过孔道扩散的方法。

[0024] 第八方面，本发明提供一种用于电酶催化CO2制备甲酸或甲酸盐的电极，所述电极包含电极本体以及涂布于电极本体表面的催化剂；所述催化剂包含所述的固定化甲酸脱氢酶。

[0025] 进一步地，所述电极本体为碳布电极或者玻碳电极。

[0026] 在本发明的一些实施方式中提供用于电酶催化CO2制备甲酸的碳布电极，其包括碳布电极和涂布在碳布电极表面的催化剂，所述催化剂为上述固定化甲酸脱氢酶。优选地，2
电极中催化剂的负载量控制在0.6‑1.5 mg/cm。

[0027] 在本发明的另一些实施方式中提供用于电酶催化CO2制备甲酸的玻碳电极，其包括玻碳电极和涂布在玻碳电极表面的催化剂，所述催化剂为上述固定化甲酸脱氢酶。优选2
地，电极中催化剂的负载量控制在0.6‑1.5 mg/cm。

[0028] 第九方面，本发明提供所述的固定化甲酸脱氢酶或所述的电极在催化CO2制备甲酸或甲酸盐中的应用。

[0029] 第十方面，本发明提供一种制备甲酸的方法，所述方法包括：以CO2为底物，利用以上所述的固定化甲酸脱氢酶或所述电极进行电酶催化CO2转化为甲酸。

[0030] 本发明具备如下有益效果：1、本发明在梭状芽孢杆菌（Clostridium scatologenes）野生型甲酸脱氢酶的基础上突变得到了一种甲酸脱氢酶突变体，其具有较高的催化活性，比酶活可达896 mU/mg，是探针ClFDH比酶活的89倍，是突变前梭状芽孢杆菌（Clostridium scatologenes）甲酸脱氢酶比酶活的5倍，能够高效催化二氧化碳转化为甲酸或甲酸盐。

[0031] 2、本发明提供的甲酸脱氢酶突变体与HOF材料结合制备得到的固定化酶的稳定性显著提高，包括温度稳定性显著提高（在30℃‑55℃条件下保存1h后，残留酶活较游离酶显著提高）；在pH 5.0‑11.5范围内，较游离酶表现出更高的稳定性（在pH 6.0条件下保存1h后残留酶活可达100%，在中性及碱性环境中具有更好的适应能力），更有利于吸收及转化CO2的生产实践应用；且固定化酶分子具有更高的结构稳定性，使得固定化酶的储存稳定性大幅提升（在4℃下保存30天后，仍然保持初始活性的90%，而同样条件下，游离酶的活性仅保持了初始活性的40%）；此外，固定化酶解决了游离酶无法回收利用的问题（本发明的固定化甲酸脱氢酶经过10次重复利用后，活性还能保持在初始活性的85%），有利于甲酸脱氢酶的实际应用。

[0032] 3、利用本发明的固定化甲酸脱氢酶以及由此制备的碳布电极或者玻碳电极等电极材料进行酶电耦合催化CO2生产甲酸或甲酸盐，可实现辅酶NADH的循环利用，无需额外使用氢气，极大地降低了生产成本，提高了生产安全性。本发明提供的固定化甲酸脱氢酶具有良好的产业化前景，在可再生能源利用的领域具有重要价值。附图说明

[0033] 为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0034] 图1是本发明实施例4提供的HOF‑101（a）和固定化甲酸脱氢酶突变体CsFDHM@HOF‑101（b）的扫描电子显微镜图。

[0035] 图2是本发明实施例6提供的游离酶和固定化酶CsFDHM@HOF‑101的温度稳定性比较图。

[0036] 图3是本发明实施例6提供的游离酶和固定化酶CsFDHM@HOF‑101的pH稳定性比较图。

[0037] 图4是本发明实施例7提供的游离酶和固定化酶CsFDHM@HOF‑101的储存稳定性比较图。

[0038] 图5是本发明实施例8提供的固定化酶CsFDHM@HOF‑101的重复利用次数图。

[0039] 图6是本发明实施例11提供的CO2转化为甲酸的HPLC检测图谱。

[0040] 图7是本发明实施例11提供的固定化酶CsFDHM@HOF‑101制备得到碳布电极电酶催化CO2生成甲酸的进程图。

[0041] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0042] 以下实施例中所涉及的实验方法，若无特别提及，均为本领域常规方法，例如可参照本领域的实验手册，或按照制造厂商说明书建议的条件。

[0043] 以下实施例中所涉及的实验材料和试剂，如无特殊说明，均可从商业途径得到，例如：本发明的大致研发过程如下：本发明借助基因组挖矿技术，以之前报导的活性较高的甲酸脱氢酶ClFDH的蛋白序列为探针，在各基因组数据中进行BLAST分析，从查询的结果中找出一系列基因组信息来源、且未经表达鉴定的假定甲酸脱氢酶。对这些序列进行进化树的构建和分析，然后选取代表性的基因序列。选定基因经过密码子优化后进行全基因合成，并进行表达筛选。其中从梭状芽孢杆菌（Clostridium scatologenes）的基因组中挖掘到了一个新型高活性的甲酸脱氢酶（CsFDH），以该甲酸脱氢酶（CsFDH）为亲本进行计算机辅助的理性设计。通过AlphaFold 2预测出亲本甲酸脱氢酶（CsFDH）的三维结构，运用Consensus Finder对该蛋白的氨基酸保守性进行分析，运用CAVER对其底物通道进行分析，初步确定突变位点。接着通过Autodock4.2软件对该蛋白（CsFDH）和底物、辅酶进行半柔性分子对接模拟，利用Pymol和Discovery Studio软件对获得的复合体的三维结构进行分析，排除活性中心口袋的关键氨基酸残基。最终将其中第269位甲硫氨酸（Met）突变为异亮氨酸（Ile）、第285位丝氨酸（Ser）突变为丙氨酸（Ala）以及第637位丝氨酸（Ser）突变为丙氨酸（Ala）。突变通过改进的全质粒扩增技术实现，最终成功获得了对CO2具有高催化活性的突M M
变体CsFDH。进一步将突变体与HOF材料HOF‑101固定结合得到固定化酶CsFDH@HOF‑101，增M
强其稳定性和可重复利用性，并通过固定化酶CsFDH@HOF‑101、固定化酶制备的碳布电极或者玻碳电极进行酶电耦合催化CO2生产甲酸。其中使用固定化酶制备的碳布电极催化CO2生产甲酸的产量，在12 h后可达到69 mM。

[0044] 实施例1 甲酸脱氢酶编码基因的基因挖掘及重组载体构建

[0045] 本发明以先前获得的活性较高的甲酸脱氢酶ClFDH的蛋白序列为探针，以各种基因组序列为搜索对象进行BLAST分析，从查询的结果中找出一系列基因组信息来源的、且未经表达鉴定的假定甲酸脱氢酶。对这些序列进行进化树的构建和分析，然后选取3个有代表性的基因序列，经过密码子优化后进行全基因合成。经过比较分析选定了Clostridium senegalense，Clostridium drakei和Clostridium scatologenes来源的3个潜在的甲酸脱氢酶进行下一步研究，并将其分别命名为CseFDH、CdFDH和CsFDH。

[0046] 以E.coliK12菌株密码子使用频率为参照，利用OPTIMIZER服务器对潜在的甲酸脱氢酶基因序列进行密码子优化。在基因上下游分别添加BamH I和NdeI酶切位点后，委托擎科生物科技有限公司进行全基因的合成。将合成的甲酸脱氢酶编码基因连接至pET28a质粒上，分别获得重组载体pET28a‑CseFDH、pET28a‑CdFDH和pET28a‑CsFDH。

[0047] 实施例2 甲酸脱氢酶的理性改造以及突变体重组载体的构建

[0048] 本发明以实施例1中筛选得到的三个甲酸脱氢酶中催化活性最高的CsFDH为亲本进行计算机辅助的理性设计。首先通过AlphaFold 2预测出亲本甲酸脱氢酶（CsFDH）的三维结构，运用Consensus Finder对该蛋白的氨基酸保守性进行分析，运用CAVER对其底物通道进行分析，初步确定突变位点。利用AutoDock 4.2软件依次将CsFDH的三维结构与底物碳酸氢钠和辅酶NADH进行半柔性的分子对接分析，再利用PyMol和Discovery studio软件进行观察分析，确定甲酸脱氢酶的底物通道及其与底物和辅酶作用的关键氨基酸残基及金属离子，排除活性中心口袋的关键氨基酸残基。最终将其中第269位甲硫氨酸（Met）突变为异亮氨酸（Ile）、第285位丝氨酸（Ser）突变为丙氨酸（Ala）以及第637位丝氨酸（Ser）突变为丙氨M酸（Ala），突变后的甲酸脱氢酶（命名为CsFDH）的编码基因如SEQ ID NO.2所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0049] 突变采用改进的全质粒扩增技术，以重组载体pET28a‑CsFDH为模板，在载体克隆位点下游3.2kb左右处设计反向通用引物（R），分别在三个突变位点上下游约15 bp的片段设计正向突变引物F1、F2、F3，先用一对正反向引物进行第一轮的PCR扩增，再以第一轮的产物为大引物进行全质粒的扩增，经过两轮PCR扩增后，再用DpnI消化模板，得到突变一个位点的重组载体；再以突变一个位点的重组载体为模板，用其余两对正反向引物按照上述方M法进行第二次和第三次扩增，即得到突变三个位点的重组载体pET28a‑CsFDH。上述引物序列如表1所示。

[0050] 表1 全质粒扩增获得甲酸脱氢酶突变体的引物

[0051] 实施例3 表达甲酸脱氢酶突变体的重组基因工程菌的构建以及甲酸脱氢酶突变体的诱导表达和分析

[0052] 1、重组载体pET28a‑CsFDHM转化入宿主细胞：将重组载体pET28a‑CsFDHM利用热激转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，添加0.5mL LB液体培养基，在37℃、200 rpm下孵育1h后，涂布于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板上，在37℃下培养12 16h，得到单克~隆菌落。

[0053] 2、重组基因工程菌的筛选与鉴定：挑取单克隆菌落至5 mL含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、220 rpm下培养过夜，次日菌液PCR鉴定，并提取质粒利用BamH I和NdeI进行双酶切鉴定，根据电泳结果判断含有与目的基因大小一致的基因片段，初步鉴定该克隆为阳性克隆；然后将阳性克隆送至上海生工进行序列测定，测序结果进一步表明该克隆菌落即是目的基因工程菌。

[0054] 3、诱导表达：挑选上述获得的经鉴定的重组基因工程菌单菌落接种至5 mL含有50 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、220 rpm下培养过夜；将过夜培养的产物用移液器按2%的接种量接种到100 mL的LB液体培养基中；然后，置于37℃下、200 rpm培养2.5 h，最后加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG诱导，置于16℃下、220 rpm培养20 h，得到经诱导表达的菌液（发酵液）。

[0055] 将上述经诱导表达的菌液分装入50 mL的离心管中，于8000 rpm、4℃离心5 min，收集菌体，各用50 mL去离子水洗涤两次，同样条件下收集菌体。将上述每种菌体用100 mL裂解缓冲液（PBS缓冲液，pH=7.0）悬浮，使用高压均质机在4℃、900bar条件下破碎细胞3分钟。12000 rpm、4℃离心15 min，分别收集上清液和沉淀，上清液经过Ni‑Agarose介质亲和层析纯化，SDS‑PAGE分析目的蛋白的表达形态。

[0056] 4、酶活性测定：用紫外分光光度计在340 nm处测定NADH的吸光值的改变(εNADH, ‑1 ‑1340 nm=6.22 mM cm )。通过加入甲酸脱氢酶引发反应，并监测1分钟。酶活测定的反应体系为1 mL：包含0.1 mM NADH，100mM碳酸氢钠，100 mM PBS缓冲液，pH=7.0，将酶液稀释适当倍数后取100 μL加入于30℃保温2 min的上述反应体系。在340 nm下测定1 min内吸光度的变化值。在该条件下，每分钟消耗1 μmol NADH所需的酶量定义为1U。酶活计算公式为：U= EW·V·1000/6220·L=EW/6.22，其中，EW：1 min下OD340的变化值，V：反应液的体积（mL），‑1 ‑1
6220：摩尔消光系数（L*mol *cm），L：光程距离（cm）。

[0057] 经测定，甲酸脱氢酶突变体CsFDHM纯酶的比活达到896 mU/mg，为探针ClFDH（10 mU/mg）的89倍。同时以突变前的甲酸脱氢酶CsFDH（编码基因序列与SEQ ID NO.2所示序列的区别在于第269位密码子为甲硫氨酸密码子、第285位密码子为丝氨酸密码子，第637位密码子为丝氨酸密码子，重组载体pET28a‑CsFDH的构建如实施例2中所述）作为对照。结果显M示，突变前的甲酸脱氢酶CsFDH的比活为179 mU/mg，甲酸脱氢酶突变体CsFDH的比活（896 mU/mg）为突变前甲酸脱氢酶CsFDH的5倍。

[0058] 实施例4 固定化甲酸脱氢酶突变体CsFDHM@HOF‑101的制备

[0059] 1、使用改良的温和的从头蛋白质定向组装方法合成CsFDHM@HOF‑101。第一步，用MPBS缓冲液（100 mM，pH=7.0）配制浓度为2 mg/ml的甲酸脱氢酶突变体CsFDH溶液。接着将M
20 mg H4TBAPy超声溶解在2 mL DMF中。随后，添加18mLCsFDH 溶液（1 mg/ml），并在25℃下M
恒温连续搅拌20分钟以促进复合材料的形成。搅拌过程完成后，通过离心收集所得CsFDH@HOF‑101复合材料。离心条件为：25℃，12000 rpm，15 min。收集上清液后，用PBS缓冲液（100 mM，pH=7.0）对收集的沉淀物进行三次连续洗涤，同样条件下离心分离，干燥，以除去任何残留溶剂和未反应的前体。得到HOF材料固定化甲酸脱氢酶突变体（简称为固定化甲酸脱氢M
酶）CsFDH@HOF‑101。

[0060] 将所有离心后收集的上清液合并，测定其中CsFDHM的含量，与初始加入的CsFDHM含M量对比即可得到固定于载体HOF‑101上的CsFDH 的量。由此可计算得到固载量。固载量的计算方法如下：

[0061] 其中，Co和Cs分别指固定化酶反应所加入初始酶溶液及固定化酶反应后的混合上M清液中CsFDH 的浓度（mg/ml）；Vo和Vs分别代表固定化酶反应所加入初始酶溶液及固定化酶反应后的混合上清液的体积（mL）；m代表所用载体质量（mg）。

[0062] 图1的a和b分别为HOF‑101和固定化甲酸脱氢酶突变体CsFDHM@HOF‑101的扫描电M子显微镜图。从图中可以看到，初始合成的HOF‑101以及固定化CsFDH后的HOF‑101均有清M
晰的棒状结构，表明HOF‑101的形貌并未因CsFDH的固定化而遭到破坏。

[0063] 2、固定化酶还原活性测定：用紫外分光光度计在340 nm处测定NADH的吸光值的改‑1 ‑1 M变（εNADH, 340 nm=6.22 mM cm ）。通过加入一定质量的固定化甲酸脱氢酶CsFDH @HOF‑
101引发反应，并监测1分钟。酶活测定的反应体系为1 mL：包含0.1 mM NADH，100mM碳酸氢钠，100 mM PBS缓冲液，pH 7.0，于30℃保温2 min，将一定质量的固定化甲酸脱氢酶M
CsFDH @HOF‑101加入上述反应体系。在340 nm下测定1 min内吸光度的变化值。在该条件下，每分钟消耗1 μmol NADH所需的酶量定义为1 U。

[0064]

[0065] EW：1 min下OD340的变化值，V：反应液的体积（mL），6220：摩尔消光系数（L*mol‑1*‑1cm），L：光程距离（cm），m：固定化甲酸脱氢酶质量。

[0066] 实施例5 最佳固定条件的筛选

[0067] 1、最佳载体用量

[0068] 本发明为确定固定化甲酸脱氢酶所用载体HOF‑101的最佳用量，分别将5、10、15、M20和25 mg的H4TBAPy超声溶解在2 mL DMF中，再分别添加18mLCsFDH溶液（1 mg/ml）进行甲M M
酸脱氢酶的固定化，然后测定不同HOF‑101用量下CsFDH的固载量以及CsFDH@HOF‑101的活M
性。最终得到固定化CsFDH所需的最佳HOF‑101用量为20 mg/18mL的1 mg/mL甲酸脱氢酶突变体溶液。此时，载体HOF‑01的固载量为78 mg/g。

[0069] 2、最佳固定化时间

[0070] 本发明将一定量的H4TBAPy超声溶解在2 mL DMF中后，与1 mg/mL的甲酸脱氢酶突变体溶液混合后，分别考察固定时间为10、20、40、60 min时的固载量，以确定最佳固定化时间。最终确定甲酸脱氢酶突变体的最佳固定化时间为20 min。

[0071] 实施例6 固定化酶CsFDHM@HOF‑101的酶学性质表征

[0072] 1、温度稳定性

[0073] 本发明为了评估游离甲酸脱氢酶突变体（CsFDHM）和固定化酶CsFDHM@HOF‑101在不M M同温度下的稳定性，分别将游离CsFDH和CsFDH@HOF‑101在20 55℃（以5℃为间隔）下保温1 ~
h，然后在最适反应温度下测定残留酶活，以冰浴保存1 h后的残余酶活为100%，以此来考察M M
游离CsFDH和CsFDH@HOF‑101的温度稳定性。测定结果如图2所示，在30℃‑55℃条件下保存M M
1h后，CsFDH@HOF‑101的残留酶活均较游离CsFDH得到了较大提高。

[0074] 2、pH稳定性

[0075] 本发明将游离CsFDHM和CsFDHM@HOF‑101分别在pH值2.5‑11.5（以0.5和1为间隔）缓M M冲液中冰浴1 h，然后在游离CsFDH 和CsFDH@HOF‑101的最适条件下测定各自的残留酶活，M M
以未经处理的值为100%，以此来判断游离CsFDH和CsFDH@HOF‑101在不同pH值下的稳定性。
M M
测定结果如图3所示，固定化的CsFDH@HOF‑101在pH 5.0‑11.5的范围内，较游离CsFDH表现出了更好的稳定性。在pH 6.0条件下保存1h后残留酶活仍然达到100%，在中性及碱性环境M
中也有更好的适应能力。因此固定化的CsFDH@HOF‑101更有利于吸收及转化CO2的实际应用。

[0076] 3、米氏常数及相关动力学参数的测定

[0077] 固定碳酸氢钠的终浓度为250 mmol/L，逐步提高辅酶NADH在酶活测定体系中的终M浓度（0.02，0.06，0.08，0.1，0.14，0.18，0.2 mM），加入一定质量的CsFDH@HOF‑101，在测定M
的最适条件下检测CsFDH @HOF‑101在不同辅酶浓度下对应的酶促反应速率。以此完成M
CsFDH @HOF‑101对于辅酶NADH的米氏常数Km及反应速率Kcat值的测定。同样地，固定辅酶NADH的浓度为5 mmol/L，逐步提高碳酸氢钠溶液在酶活测定体系中的终浓度（10，25，50，M M
75，100，150 mM），加入一定质量的CsFDH@HOF‑101，在所测定的最适条件下检测CsFDH@HOF‑101在不同底物浓度下对应的酶促反应初速度。以此完成底物碳酸氢钠的米氏常数Km及反应速率Kcat值的测定。利用Origin 9.0软件对测得的数据进行非线性拟合，获得M M
CsFDH@HOF‑101对不同底物的米氏常数Km及反应速率Kcat值。测得固定化CsFDH@HOF‑101对‑1 ‑1
底物的Km值为45 mM，Kcat/Km值为0.15 s ·mM ；对辅酶的Km值为0.4 mM，Kcat/Km值为43 s‑1 ‑1
·mM 。

[0078] 实施例7 固定化酶CsFDHM@HOF‑101的储存稳定性

[0079] 本发明将CsFDHM@HOF‑101置于PBS缓冲液（100 mM，pH7.0）中，在4℃条件下保存30M天，每隔5天测定一次酶活性的变化，以检测CsFDH@HOF‑101的储存稳定性。图4为经过30天M M
的保存后，游离CsFDH 和CsFDH @HOF‑101的活性变化。可以看出，在4℃下保存30天后，M M
CsFDH@HOF‑101仍然保持了初始活性的90%，而同样条件下，游离CsFDH 的活性仅保持了初M
始活性的40%。结果表明，固定化酶CsFDH@HOF‑101提高了酶分子的结构稳定性，使得游离M
CsFDH的储存稳定性在固定化后得到了大幅度提升。

[0080] 实施例8 固定化酶CsFDHM@HOF‑101的重复利用性

[0081] 本发明为测定CsFDHM@HOF‑101的重复利用性，连续测定CsFDHM@HOF‑101的活性10M次，每次测定后将CsFDH@HOF‑101离心分离，用PBS缓冲液（100 mM，pH7.0）洗涤后，再进行下一次酶活性的测定。在实际应用中，酶分子的水溶性导致其难以回收利用，将FDH固定化M
于载体上可解决该问题。固定化酶CsFDH@HOF‑101的重复利用性如图5所示。经过10次重复M M
利用之后，CsFDH@HOF‑101的活性还能保持在初始活性的85%，表明将CsFDH 固定化于HOF‑M M
101上可以解决游离CsFDH无法回收利用这一问题，使CsFDH的实际应用成为可能。

[0082] 实施例9CsFDHM@HOF‑101碳布电极的制备

[0083] 本发明称取0.1g制备好的固定化酶CsFDHM@HOF‑101置于研钵中，之后加入5mL 50%乙醇溶液，将混合好的浆料充分研磨，然后加入0.5mL Nafion溶液继续充分研磨。用磨刷将研磨充分的浆料均匀涂布在10mm*10mm的碳布的一侧，并置于25 ℃下干燥，即得到固M 2
定化酶CsFDH@HOF‑101制备的碳布电极，电极中催化剂的负载量为0.85 mg/cm。

[0084] 实施例10CsFDHM@HOF‑101玻碳电极的制备

[0085] 本发明将实施例9中的碳布替换为玻碳电极（GCE，d=3 mm），采用与实施例9相同的M方法在玻碳电极表面形成分散固定有固定化酶CsFDH@HOF‑101的薄膜，从而得到固定化酶M 2
CsFDH@HOF‑101制备的玻碳电极，电极中催化剂的负载量为1.0 mg/cm。

[0086] 实施例11 电酶催化CO2转化为甲酸

[0087] 1、使用CsFDHM@HOF‑101碳布电极催化CO2转化为甲酸

[0088] 该催化方法在一个H型电解槽中进行。工作电极为CsFDHM@HOF‑101碳布电极，对电极为铂片（5 mm×5 mm×0.1 mm），参比电极为Ag/AgCl3（3.5 M KCl 6×65 mm，+198 mV vs. NHE）。在阳极室和阴极室之间放置质子交换膜（Nafion115，Φ30 mm，厚0.125 mm）。电化学工作站连接用于进行数据分析的三个电极，并设定电压为‑0.75V。阳极室充满1 mM的硫酸，产生的质子通过质子交换膜进入阴极室。以40 mL/min的流速向阴极室（工作电极和参比电极）中鼓入CO2，阴极室中装入35mL磷酸盐缓冲液（100 mM pH 7.0）和0.1mM NADH，并用磁力搅拌器轻轻搅拌。反应不同时间（2h，4h，6h，8h，10h和12h）从阴极室取样并过滤后，使用高效液相色谱系统（HPLC；岛津LC‑2020），Shim‑pack GIST C18色谱柱（5µm，4.6 mm×250 mm，岛津）和UV检测器进行检测。色谱柱和检测器的温度设置为35℃。流动相为5 mM的硫酸，流速为1 mL/min。反应生成的甲酸在210 nm下检测，在2.3 min时洗脱。HPLC检测图谱如图6所示。

[0089] 采用循环伏安法（CV）检测氧化还原反应在电极表面电荷转移的信息。电压范围为−0.8 0.2V，扫描速度为20 mV/s，分别在添加或者不添加辅酶NADH的情况下进行6个循环，~直到电流稳定。此外，在10、20、50、100和200 mV/s的不同扫描速率下进行循环伏安检测，以研究氧化还原反应的扩散过程。根据循环伏安法的结果，在‑0.75V下进行还原反应生成甲酸。

[0090] 反应12 h后，甲酸产量可以达到69 mM，如图7所示。

[0091] 2、使用CsFDHM@HOF‑101玻碳电极催化CO2转化为甲酸

[0092] 将上述步骤1中所述的催化方法中的CsFDHM@HOF‑101碳布电极替换为CsFDHM@HOF‑101玻碳电极，采用与上述1中相同的方法催化CO2。定性及定量检测方法同上。

[0093] 3、将固定化CsFDHM@HOF‑101加入阴极室催化CO2

[0094] 将上述步骤1中所述的催化方法中的CsFDHM@HOF‑101碳布电极替换为石墨棒(Φ6M×90 mm)，阴极室中另外加入0.5g固定化酶CsFDH@HOF‑101，并用磁力搅拌器轻轻搅拌。其余同上述1的催化方法催化CO2。定性及定量检测方法同上。

[0095] 综上所述，本发明的甲酸脱氢酶突变体CsFDHM具有高催化活性，其固定化酶具有高稳定性。本发明的固定化酶及其制得电极材料可用于电酶催化二氧化碳转化为甲酸，具有良好的应用前景，为缓解全球变暖和促进可再生能源利用提供了一种双赢的战略。

[0096] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。