一种多粘菌素B特异性降解酶及其应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202411835982.6 | 申请日 | 2024-12-13 |
| 公开(公告)号 | CN119570750A | 公开(公告)日 | 2025-03-07 |
| 申请人 | 广州康盛生物科技股份有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 伍道聪; 张海珍; 侯旭峰; 陈鑫威; 杨正根; 陈校园; | 第一发明人 | 伍道聪 |
| 权利人 | 广州康盛生物科技股份有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 广州康盛生物科技股份有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省广州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省广州市黄埔区高新技术产业开发区科学城神舟街8号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：510660 |
| 主IPC国际分类 | C12N9/00 | 所有IPC国际分类 | C12N9/00 ; C12N11/00 ; C12N15/52 ; C07K7/62 ; C07K1/14 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 广州市诺丰知识产权代理事务所 | 专利代理人 | 许飞; |
| 摘要 | 本 发明 属于 生物 领域，公开了一种多粘菌素B特异性降解酶及其应用。多粘菌素B特异性降解酶的 氨 基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明一些实例的多粘菌素B特异性降解酶，能够选择性降解多粘菌素B1‑1与多粘菌素B3，且不影响多粘菌素B1与多粘菌素B2的活性，从而可以用于多粘菌素B制备过程中的纯化；能够耐酸 碱 与 有机 溶剂 ，在多种条件下均可以高效识别多粘菌素B1‑1与B3组分并且将其分解。通过使用多孔微球作为固相载体，保证微球的表面可以容纳更多的酶配基，能够有效提高配基的耐酸碱与 有机溶剂 能 力 ，可以有效提高多粘菌素B纯化的效率。 | ||
| 权利要求 | 1.一种多粘菌素B特异性降解酶，具有选择性降解多粘菌素B1‑1与多粘菌素B3的活性，其依次包括底物识别结构域1、催化结构域1、稳定区域1、底物识别域2、催化域2、稳定区域 |
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| 说明书全文 | 一种多粘菌素B特异性降解酶及其应用技术领域背景技术[0002] 多粘菌素是1947年首次从多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)或产气孢子杆菌(Bacillus aeroballus)中分离出的多肽类抗生素，含有A、B、C、D、E五种成分。多粘菌素B(Polymyxin B，PMB)为脂肽类抗菌肽，对革兰阴性杆菌，如大肠杆菌、绿脓杆菌、副大肠杆菌、肺炎克雷白杆菌、嗜酸杆菌、百日咳杆菌和痢疾杆菌等有抑制或杀菌作用，被认为是临床治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染的“最后一道防线”。PMB临床上主要用于敏感菌引起的感染及绿脓杆菌引起的泌尿系统感染、脑膜炎、败血症、烧伤感染以及皮肤粘膜感染等。虽然PMB对革兰氏阴性细菌具有强烈的杀菌作用，但因其强烈的肾毒性和神经毒性，20世纪八九十年代，其在临床的应用已经停止。但是随着近些年临床中多重耐药性革兰氏阴性细菌菌株导致的重症疾病越来越多，PMB在临床上的应用又被重新重视起来，关于临床的研究也越来越多。 [0003] PMB 分子式结构为C56H98N16O13，分子量1301.56，熔点122‑205℃。PMB由十个氨基酸组成，其中七个氨基酸在N‑端相互链接形成脂肪链，而位于尾部的氨基酸则是散乱的、柔性的，因此在溶液中不存在固定构象。PMB为多组分产品，包括多粘菌素B1、B2、B3和B1‑Ⅰ，其中PMB1（C56H98N16O13）和PMB2(C55H96N16O13)是有效成分，且PMB1含量最多，一般达到50%以上，而PMB3和PMB1‑Ⅰ为主要杂质。PMB1和B2的氨基酸包括L‑2 ,4‑二氨基丁酸、L‑苏氨酸、L‑亮氨酸及D‑苯丙氨酸，而PMB1‑Ⅰ中的L‑亮氨酸由L‑异亮氨酸取代。PMB是发酵产物，在生产过程中可能发生氨基酸的构型转化，氨基酸的改变及D‑/L‑构型的差异会造成其抗菌活性及肾毒性的较大变化，因此必须对其氨基酸及其构型进行监控以保证药品安全。 [0004] PMB产生菌为多粘芽孢杆菌，该菌代谢快、培养周期短，发酵过程难进行精确调控。PMB发酵产物有关物质的控制也是一个难点，USP/EP药典有明确规定：PMB含量 ≥ 80%、最大单杂 ≤ 3.0%、总杂 ≤ 17%、B3 ≤ 6.0%、B1‑Ⅰ≤ 15%。目前国内产品含量最高只能达到 85%左右，含量虽然满足USP/EP药典要求，但与世界最高水平尚有差距。目前公开发表的硫酸多粘菌素B制备工艺均能达到80%以上的含量，但满足单个杂质控制要求的难度相对较大，尤其是最大单杂容易超标。 [0005] 目前的发酵得到的PMB的纯化方法主要为物理法，如CN104327167A公开了一种提取多粘菌素B的工艺，该工艺采用沉淀法，先将多粘菌素B发酵液用草酸进行沉淀，分离沉淀的固体加碱性物质进行溶解，随后用弱酸性阳离子交换树脂进行吸附，纯化水洗涤后，用稀硫酸进行预洗、解析，解析液用碱性物质沉淀，酸性物质溶解，固液分离，液体经脱色纳滤、干燥得到多粘菌素B。CN118146314A公开的多黏菌素B的生产方法，包括以下步骤：将硫酸多粘菌素B发酵液过滤后，过大孔吸附树脂D152柱吸附，收集的D152解析液通过C18树脂分离纯化后，有效部分混合浓缩赶醇后得到纯化液；再将其通过浓缩调节最终pH，最后进行冻干可得到多黏菌素B的成品粉。 [0006] 杨小虎.硫酸多粘菌素B分离纯化工艺研究[D].浙江大学，2020.，采用单因素实验方法对其分离纯化工艺（滤膜法，离子交换法，沉淀法和吸附法）进行了优化研究.经验证，采用新的分离纯化工艺，多粘菌素B1+B2+B3+B1‑1纯度达到95%以上，多粘菌素B3低于3.0%，多粘菌素B1‑1低于2.0%，整个工艺提取收率不低于70%。 [0007] 现有发酵法生产PMB的纯化工艺操作复杂，纯化效果有待进一步提高。 发明内容[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种多粘菌素B特异性降解酶及其应用。 [0009] 本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供： 一种多粘菌素B特异性降解酶，具有选择性降解多粘菌素B1‑1与多粘菌素B3的活性，其依次包括底物识别结构域1、催化结构域1、稳定区域1、底物识别域2、催化域2、稳定区域2、底物识别域3，其中，所述底物识别结构域1的氨基酸序列为QSHVSIQWFDGVVDYT，催化结构域1的氨基酸序列为GSHRIISVGAHESVTVRDIKLAFGAPRT，底物识别域2的氨基酸序列为AVNGTLHDFFKVAAKKGFVIDSIREALDSHCVPYTGKKDLRFEATURINGGRVVGRSGRLEFY，催化域2的氨基酸序列为GQEKTLYVPGCDSAVEYAIKGTSENGIWAPAAQRNISVMGSYWDAVVKQPGIALEAHTAYVVHLGNAPAIKQFGEPVDI，底物识别域3的氨基酸序列为NTLLGTLKAHQWRTYDNTVGGVRVVFPPDVDVPSVSVSNAKGPYTFKN。 [0010] 在一些多粘菌素B特异性降解酶的实例中，其满足如下至少一个特征：1) 其N端具有信号肽，优选的，所述信号肽的氨基酸序列为MKTLLSLALAVFVSAEA； 2) 所述稳定区域1的氨基酸序列为EDGSMHYLAKSEFTGHGTVPSSWVTKGP； 3) 所述稳定区域2的氨基酸序列为SSDGSVYFAVKEKLGRTLAISLGQPDGKRLAETGLPGI YGPSAHAKEHFLDAKAYDFTGKSGAGVSGQLGAWVNRIT。 [0011] 在一些多粘菌素B特异性降解酶的实例中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1具有至少90%同源性。 [0012] 在一些多粘菌素B特异性降解酶的实例中，其至少一端连接有标签序列。 [0013] 本发明的第二个方面，提供：一种多粘菌素B酶促纯化剂，包括本发明第一个方面所述的多粘菌素B特异性降解酶。 [0014] 在一些多粘菌素B酶促纯化剂的实例中，所述多粘菌素B特异性降解酶偶联在固相载体表面。 [0016] 在一些多粘菌素B酶促纯化剂的实例中，所述固相载的孔径为600～800 nm。 [0017] 以上特征在不相冲突的情况下，可以任意组合。 [0018] 本发明的第三个方面，提供：本发明第一个方面所述的多粘菌素B特异性降解酶在多粘菌素B纯化中的应用。 [0019] 具体而言，应用的操作具体包括：S1) 将PMB发酵产物与本发明第一个方面所述的多粘菌素B特异性降解酶接触并 充分反应； S2) 将酶解后的PMB发酵产物进一步分离纯化，得到高纯度的多粘菌素B。 [0020] 本发明的第四个方面，提供：编码本发明第一个方面所述的多粘菌素B特异性降解酶的基因。 [0021] 本发明的第五个方面，提供：一种表达载体，包括本发明第四个方面所述的基因。 [0022] 本发明的有益效果是：本发明一些实例的多粘菌素B特异性降解酶，能够选择性降解多粘菌素B1‑1与多粘菌素B3，且不影响多粘菌素B1与多粘菌素B2的活性，从而可以用于多粘菌素B制备过程中的纯化。 [0024] 本发明的一些实例的多粘菌素B的酶促纯化剂，通过将多粘菌素B特异性降解酶偶联在固相载体上，可以提高发酵液的流量，减少发酵液中杂质引起的填料阻塞现象，能够提高酶分解多粘菌素B1‑1与B3组分的效率。 [0025] 本发明的一些实例的多粘菌素B的酶促纯化剂，通过使用多孔微球作为固相载体，保证微球的表面可以容纳更多的酶配基，能够有效提高配基的耐酸碱与有机溶剂能力，可以有效提高多粘菌素B纯化的效率。附图说明 [0026] 图1是多粘菌素B特异性降解酶的SDS PAGE电泳图，M为marker。 具体实施方式[0027] 本发明的第一个方面，提供：一种多粘菌素B特异性降解酶，具有选择性降解多粘菌素B1‑1与多粘菌素B3的活性，其依次包括底物识别结构域1、催化结构域1、稳定区域1、底物识别域2、催化域2、稳定区域2、底物识别域3，其中，所述底物识别结构域1的氨基酸序列为QSHVSIQWFDGVVDYT，催化结构域1的氨基酸序列为GSHRIISVGAHESVTVRDIKLAFGAPRT，底物识别域2的氨基酸序列为AVNGTLHDFFKVAAKKGFVIDSIREALDSHCVPYTGKKDLRFEATURINGGRVVGRSGRLEFY，催化域2的氨基酸序列为GQEKTLYVPGCDSAVEYAIKGTSENGIWAPAAQRNISVMGSYWDAVVKQPGIALEAHTAYVVHLGNAPAIKQFGEPVDI，底物识别域3的氨基酸序列为NTLLGTLKAHQWRTYDNTVGGVRVVFPPDVDVPSVSVSNAKGPYTFKN。 [0028] 在一些多粘菌素B特异性降解酶的实例中，其满足如下至少一个特征：1) 其N端具有信号肽，优选的，所述信号肽的氨基酸序列为MKTLLSLALAVFVSAEA； 2) 所述稳定区域1的氨基酸序列为EDGSMHYLAKSEFTGHGTVPSSWVTKGP； 3) 所述稳定区域2的氨基酸序列为SSDGSVYFAVKEKLGRTLAISLGQPDGKRLAETGLPGI YGPSAHAKEHFLDAKAYDFTGKSGAGVSGQLGAWVNRIT。 [0029] 在一些多粘菌素B特异性降解酶的实例中，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1具有至少90%同源性。 [0030] 标签序列可以方便酶的纯化，在一些多粘菌素B特异性降解酶的实例中，其至少一端连接有标签序列。标签序列可以是本领域常用的分离标签，包括但不限于His‑tag、GST‑tag、MBP‑tag、Strep‑tag等。 [0031] 本发明的第二个方面，提供：一种多粘菌素B酶促纯化剂，包括本发明第一个方面所述的多粘菌素B特异性降解酶。 [0032] 在一些多粘菌素B酶促纯化剂的实例中，所述多粘菌素B特异性降解酶偶联在固相载体表面。 [0033] 在一些多粘菌素B酶促纯化剂的实例中，所述固相载体选自聚苯乙烯微球、聚甲基丙烯酸甲酯微球、琼脂糖微球、壳聚糖微球、纤维素微球、葡聚糖微球中的至少一种。 [0034] 在一些多粘菌素B酶促纯化剂的实例中，所述固相载的孔径为600～800 nm。 [0035] 以上特征在不相冲突的情况下，可以任意组合。 [0036] 本发明的第三个方面，提供：本发明第一个方面所述的多粘菌素B特异性降解酶在多粘菌素B纯化中的应用。 [0037] 具体而言，应用的操作具体包括：S1) 将PMB发酵产物与本发明第一个方面所述的多粘菌素B特异性降解酶接触并 充分反应； S2) 将酶解后的PMB发酵产物进一步分离纯化，得到高纯度的多粘菌素B。 [0038] 本发明的第四个方面，提供：编码本发明第一个方面所述的多粘菌素B特异性降解酶的基因。 [0039] 本发明的第五个方面，提供：一种表达载体，包括本发明第四个方面所述的基因。 [0040] 下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。以下描述是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。 [0041] 实施例1：多粘菌素B特异性降解酶的表达和纯化使用由能表达L‑氨基酸氧化酶（LAAO）基因的克隆载体构建的大肠杆菌接种于 LB 液体培养基中培养至对数生长期（OD600 = 0.6 0.8），取菌悬液（1 mL），涂布于 LB 琼脂平~ 板。 [0042] 将平板放置于紫外诱变仪下（254 nm），调整为合适的距离与诱变时间。将紫外处理后的菌体从平板刮下，接种于新鲜的 LB 液体培养基中复苏培养。将诱变菌液梯度稀释后涂布于 LB 平板，挑取单克隆接种于 96 孔深孔板。在每孔加入含多粘菌素B的筛选培养基，培养后通过液相测定该诱变细菌能否特异性地氧化多粘菌素B3。将能够特异性地氧化多粘菌素B3的细菌送往测序，并且将得到的序列克隆到pet28‑a载体中。 [0043] 经分析，得到的多粘菌素B特异性降解酶融合蛋白的氨基酸序列如下：MKTLLSLALAVFVSAEA‑QSHVSIQWFDGVVDYT‑GSHRIISVGAHESVTVRDIKLAFGAPRT‑ EDGSMHYLAKSEFTGHGTVPSSWVTKGP‑AVNGTLHDFFKVAAKKGFVIDSIREALDSHCVPYTGKKDLRFEATURINGGRVVGRSGRLEFY‑GQEKTLYVPGCDSAVEYAIKGTSENGIWAPAAQRNISVMGSYWDAVVKQPGIALEAHTAYVVHLGNAPAIKQFGEPVDI‑SSDGSVYFAVKEKLGRTLAISLGQPDGKRLAETGLPGIYGPSAHAKEHFLDAKAYDFTGKSGAGVSGQLGAWVNRIT‑NTLLGTLKAHQWRTYDNTVGGVRVVFPPDVDVPSVSVSNAKGPYTFKN，SEQ ID NO:1。 [0044] 融合蛋白不同的结构域依次如下：信号肽：MKTLLSLALAVFVSAEA，SEQ ID NO:2； 底物识别结构域1：QSHVSIQWFDGVVDYT，SEQ ID NO:3； 催化结构域1：GSHRIISVGAHESVTVRDIKLAFGAPRT，SEQ ID NO:4； 稳定区域1：EDGSMHYLAKSEFTGHGTVPSSWVTKGP，SEQ ID NO:5； 底物识别域2：AVNGTLHDFFKVAAKKGFVIDSIREALDSHCVPYTGKKDLRFEATURINGGRVVGRSGRLEFY，SEQ ID NO:6； 催化域2：GQEKTLYVPGCDSAVEYAIKGTSENGIWAPAAQRNISVMGSYWDAVVKQPGIALEAHTAYVVHLGNAPAIKQFGEPVDI，SEQ ID NO:7； 稳定区域2：SSDGSVYFAVKEKLGRTLAISLGQPDGKRLAETGLPGIYGPSAHAKEHFLDAKAYDFTGKSGAGVSGQLGAWVNRIT，SEQ ID NO:8； 底物识别域3：NTLLGTLKAHQWRTYDNTVGGVRVVFPPDVDVPSVSVSNAKGPYTFKN，SEQ ID NO:9。 [0045] 方便纯化融合蛋白，在蛋白的C端添加分享标签序列，具体的标签序列为6‑His序列，当然，也可以使用其他标签序列。 [0046] 将上述融合蛋白对应的基因序列化学法连接到pET 28a质粒中，42℃，45s条件下，转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于培养皿中过夜。次日挑出单菌落进行扩大培养，收集菌体沉淀并且超声破碎（开1s，停2s，工作时间20 min）后，收集上清液并且使用0.45μm的聚醚砜滤膜进行过滤，通过镍柱进行蛋白纯化，洗脱后即得到多粘菌素B特异性的酶。测定多粘菌素B特异性酶的表达量为20 mg/L。 [0047] 多粘菌素B特异性酶的SDS PAGE纯化结如图1所示，显示其分子量约为45KD。 [0048] 实施例2：多粘菌素B酶促纯化剂的制备S1) 取5mL的Giga PST微球，加入20mL 0.01M的氢氧化钠与3.0ml的环氧氯丙烷溶液，37℃，120rpm反应1h，反应完成后使用十倍体积的纯化水冲洗填料以洗净残留的溶液； S2) 加入5mL的1X PBS溶液，加入5mL的戊二醛溶液，37℃，120rpm反应2h后，使用十倍体积的纯化水冲洗填料以洗净残留的溶液； S3) 在处理后的Giga PST微球中加入多粘菌素B特异性降解酶蛋白溶液轻轻混 合； S4) 使用碳二亚胺（EDC）和N‑羟基琥珀酰亚胺（NHS）进行交联反应，按照EDC：NHS： 蛋白的摩尔比为1:1:10，加入EDC和NHS，混合后在室温下反应2小时，用十倍体积的纯化水冲洗填料以洗净残留的溶液，得到多粘菌素B特异性的酶促纯化剂，保存于20%乙醇中备用。 [0049] Giga AP、Giga DEAE AP与Giga SP AP微球也同样使用该方法制备得到相应的多粘菌素B酶促纯化剂。 [0050] 实施例3：多粘菌素B酶促纯化剂的耐酸碱及有机溶剂测定将等量的多粘菌素B特异性的酶加入到以下试剂中： pH测定： 酸性：0.1 M 柠檬酸缓冲液（pH 3‑6）；中性：0.1 M 磷酸盐缓冲液（pH 6‑ 8）；碱性：0.1 M Tris‑HCl 缓冲液（pH 8‑10）； 有机溶剂：不同体积分数（10%、20%、30%、40%、50%）的甲醇、乙醇、乙腈、DMSO。 [0051] 以上溶剂在加入多粘菌素B特异性的酶后，在 25℃ 温育2h。反应结束后，将酶体系置换为0.01M PBS体系，加入等量的多粘菌素B，25℃中180rpm反应5min后收集样品进行液相检测，记录多粘菌素B3的分解情况以得出酶活性。 [0052] 同样的，将多粘菌素B特异性的酶促纯化剂投入到上述溶液中，记录多粘菌素B3的分解情况以得出酶活性。结果如表1和表2所示。 [0053] 表1、不同pH对酶活的影响 [0054] 表2、不同有机溶剂对酶活的影响 [0055] 由表1和表2的数据可知，搭配超大孔的聚合物微球后，多粘菌素B特异性的酶的耐酸碱与有机溶剂的性能显著提升，在极端情况下仍能保持较高的活性。 [0056] 实施例4多粘菌素B的分离纯化1、取发酵液，按照草酸质量与发酵液体积比5∶1 g/L，加入H2C2O4·2H2O搅拌30 min；后经陶瓷膜过滤处理，收集过滤液。按照试验要求稀释和调整pH； 2、将Giga PST 多粘菌素B特异性的酶促纯化剂装柱，上样滤液。纯化条件为：上柱液的流量为1.0mL/min，洗脱液选择浓度为1mol/L的Gly HCl溶液，Gly HCl洗脱液的流量为 1.0mL/min，收集洗脱液； 3、将洗脱液上柱D 152阳离子吸附柱，上柱液的pH为6.5 7.0，最佳上柱液的流量为1.0mL/min，洗脱液选择硫酸浓度为1 mol/L的溶液，硫酸洗脱液的流量为1.0mL/min。在洗脱后将洗脱液pH调整为7.0，过滤0.22μm滤膜后即得硫酸多粘菌素B溶液。 [0057] 基于Giga AP、Giga DEAE AP与Giga SP AP微球多粘菌素B酶促纯化剂也同样使用该方法进行多粘菌素B的分离纯化试验。多粘菌素B分离纯化后HPLC鉴定流程如下：HPLC 液相色谱条件: 缓冲液：为在900 mL超纯水中加入4.46 g无水硫酸钠，并用磷酸调节pH至2.3，最终用超纯水定容至1000 mL。该缓冲液经过水相过滤膜过滤两次以确保其纯度。 [0058] 流动相：采用色谱纯乙腈，通过有机相滤膜过滤，配比为乙腈与缓冲液为20:80。 [0059] 液相紫外检测的波长设定为215 nm，检测液的进样量为20 μL，流动相流速为1.0 mL/min，柱温保持在25℃，使用的色谱柱为C18硅胶柱，规格为4.6 mm × 25 cm，粒径为5 μm。 [0060] 不同纯化方式的纯化结果如表3所示。 [0061] 表3、不同多粘菌素B酶促纯化剂纯化效果对比 [0062] 由表3可见，不同的多粘菌素B酶促纯化剂对多粘菌素B中的B1‑1与B3组分均有降解效果，且搭配超大孔的聚合物微球均可充分发挥活性，在纯化后均能满足中国药典中的需求。根据纯化的结果，Giga PST 酶促纯化剂对多粘菌素B有良好的纯化效果，为优选酶促纯化剂。 [0063] 以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。 |
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