[0001] 本发明涉及2‑苯乙醇生物合成技术领域，具体而言，涉及一种P450单加氧酶及合成2‑苯乙醇的方法。

[0002] 2‑苯乙醇是一类非常重要的化合物,可作为药物中间体、香料以及催化剂,在有机合成和药物合成中有广泛的应用。现有的2‑苯乙醇合成技术还存在着过度氧化、副产物多、反应条件苛刻等不足。

[0003] 生物酶的高效和高选择性，使得生物催化技术可望发展成为工业化绿色制备2‑苯乙醇的新途径。目前，高活性和高区域选择性的2‑苯乙醇合成酶还十分匮乏，无法满足绿色工业化生产的需求，获得高催化效率的生物酶和相应的生物催化合成方法，仍然是2‑苯乙醇生物催化制备发展过程中的难点和瓶颈。

[0004] 鉴于此，特提出本发明。

[0005] 本发明的目的在于提供一种P450单加氧酶及合成2‑苯乙醇的方法以解决上述技术问题。

[0006] 本发明是这样实现的：

[0007] 第一方面，本发明提供了一种P450单加氧酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

[0008] 本发明从NCBI数据库中基于公开的Alphaproteobacteria bacterium菌种的信息，克隆获得了编码P450单加氧酶的基因，将其构建到基因工程菌上，经过诱导表达，获得了P450单加氧酶。对该P450单加氧酶进行功能性研究，发现该P450单加氧酶具有生物合成2‑苯乙醇的功能。相对于现有的2‑苯乙醇的制备方法，使用本发明提供的P450单加氧酶进行生物合成2‑苯乙醇，具有反应速率高，耗时短的技术优势；本发明提供的P450单加氧酶在合成2‑苯乙醇时，可在常温、常压及水相环境中进行，反应条件温和；此外，本发明提供的P450单加氧酶在合成2‑苯乙醇时，不需使用强氧化剂或有毒试剂，因此，本发明提供的P450单加氧酶具有较高的催化活性，对环境友好，操作简便。

[0009] 本发明中P450Ab，与P450单加氧酶、P450单加氧酶复合体同义。上述P450单加氧酶中含有血红素单元。

[0010] SEQ ID No.2所示的氨基酸序列如下：

[0011] MSQAAFAVQSAVEEAYATPLDQIDVSQPRLFKENAIWPFFERL

[0012] RAEDPVHYCATSPFGPYWSVTKYNDIMAVDTNHKVFSSESGLGGI

[0013] TIRDPIADFRLPMFIAMDQPKHDEQRKVVSPIVAPNNLAALEGLIR

[0014] ERAGAILDGLPRNETFNWVDRVSIELTTQMLATLFDFPWEDRRKL

[0015] TYWSDVATADINGGLISSMDERREILMQCAEYFTRLWNERVNEKE

[0016] PKGDLISMLAHGEATRNMDPLEYLGNIILLIVGGNDTTRNSISGGL

[0017] LALNEFPDQYDKLLADPSLVETMVPEIIRWQTPLAHMRRTALEDV

[0018] ELGGKLIKKGDKVVMWYVSGNRDGEVIDRPDEFIIDRARPRQHL

[0019] SFGFGIHRCVGNRLAEMQLRVLWEEILKRFGKIEVVGAPGRVLSN

[0020] FVKGFDNLPVRIPG。

[0021] 第二方面，本发明还提供了一种分离的核酸分子，其编码上述的P450单加氧酶。

[0022] 在本发明提供了上述P450单加氧酶的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据密码子的简并性容易获得编码上述P450单加氧酶的核酸序列，这对本领域技术人员来说是容易实现的。

[0023] 术语“编码P450单加氧酶的核酸分子”可以是包括编码本发明P450单加氧酶的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

[0024] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的P450单加氧酶的功能。

[0025] 目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明P450单加氧酶(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

[0026] 应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE‑cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

[0027] 例如，分离的核酸分子具有如下SEQ ID No.1所示的核苷酸序列：

[0028] atgagcattgcaaccctggaagccggcaccgcccagagtgttccgctggataaaattgatgttagcaatccggatctgtttgttaatgataccgttggcgaatattttgcacgtctgcgtaaagaagatccggtgcattattgtaccgaaagtgcctatggtccgtattggagtattaccaaatataatgatatcatggcggtggataccaatcatcaggtttttagtagcgaagcaggtgtgggcggcattattattgatgataataatgtgcgtagcgaaggtctgccgctgcgtagctttattaccatggatccgccggaacatgatgcacagcgtaaaaccgttagtccgattgtggcaccgagtaatctgatggtgctggaaaaaaccattcgtgaacgtatgcagaatattctggatcgtctgccggttggcgaagcatttgattgggttgataaagttagtattgagctgaccacccagatgctggcaaccctgtttgattttccgtttgatgaacgtcgtaaactgacccgttggagcgatgtgaccaccgccgaaccgggcagcggcattattgatagttgggaacagcgtgcaaccgaactgcaggaatgcgcagcaagctttatgaccctgtggaatgaacgtgtgaataaaaaagaaccgggtaatgatctgattagcatgctggcccatagtccggcaacccgcaatatgccgccggaagaatttctgggtaatattctgctgctgattgtgggcggcaatgataccacccgtaatagcatgaccggcggtgttctggccctgaatcgttttccggaagaattcgaaaaactgaaagcaaatcatgcactggttgaaaccatggttccggaaattattcgttggcagaccccgctggcacacatgcgtcgtaccgccctgcaggatcatgaagttggcggtaaagtgattaaaaaaggcgataaagtggtgatgtggtatctgagcggtaatcgcgatgatgatgttattgatcagccggaagaactgattattgatcgcgcccgtccgcgtcagcatctgagctttggttttggcattcatcgttgtgtgggcaatcgtctggcagaaatgcagctgaaaattctgtgggaagaaattctggcccgttttagtcatattgaagttctgaaagaaccggaacgtgtgcgcagtaattttgttcgcggctatgcatatatgccggtgcgcctgcatgcataa。

[0029] 在其他实施方式中，本发明还提供了一种表达盒，其包括上述的核酸分子，启动子和终止子。

[0030] 第三方面，本发明还提供了一种载体，其包括上述的核酸分子。

[0031] 载体包括不限于表达载体、穿梭载体和整合载体。

[0032] 本发明中，术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

[0033] 在一种可选的实施方式中，表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

[0034] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

[0035] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

[0036] 载体包括不限于细菌表达载体、真菌表达载体等，只要能实现上述核酸分子的表达、实现上述核酸分子的穿梭的载体均可行。包括不限于，质粒等。细菌表达载体如大肠杆菌表达载体、链霉菌或分枝杆菌表达载体。真菌表达载体例如酵母载体。

[0037] 第四方面，本发明还提供了一种重组菌，其包括上述的载体。

[0038] 在本发明应用较佳的实施方式中，重组菌为细菌或真菌；

[0039] 在本发明应用较佳的实施方式中，细菌为大肠杆菌、农杆菌、链霉菌或分枝杆菌。

[0040] 真菌为里氏木霉或酵母。

[0041] 在本发明应用较佳的实施方式中，重组菌是指重组菌的休止细胞、重组菌的活细胞、重组菌的死菌和重组菌的细胞破碎物中的至少一种。

[0042] 上述重组菌(或基因工程菌)，由通过本领域常规方法将重组表达载体转化至宿主微生物中制得；宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的P450单加氧酶基因可被有效表达即可；较佳地，可通过下述方法制得:将重组载体pET‑28a(+)‑P450Ab转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。

[0043] 休止细胞，也称为静息细胞，是一种特殊的细胞状态。在这种状态下，细胞不进行生长繁殖，但仍含有各种酶系，并具有氧化和发酵能力。在适宜的条件下，休止细胞可以重新恢复生长。休止细胞的特点包括：a.细胞保持生长潜力：尽管处于休眠状态，但在给予适当刺激时，这些细胞可以重新进入细胞周期并恢复增殖能力。b.专一性强：休止细胞在反应中的专一性较强，可以提高底物转化率。c.不易染杂菌：由于其特性，休止细胞在使用过程中可以减少产物对菌体生长及酶合成的抑制。

[0044] 重组菌的死菌包括不限于通过热、压力、辐射等方式灭活后获得的菌。

[0045] 细胞破碎物是指：包括不限于通过超声、机械、化学、生物等方式使得细胞膜通透性改变，致使细胞内容物外泄，由此获得细胞破碎物。

[0046] 在本发明应用较佳的实施方式中，死菌选自死菌的沉淀物和死菌的无细胞上清中的至少一种。死菌的无细胞上清是指去除死菌体外壳，剩余的“渗出内容物”。

[0047] 第五方面，本发明还提供了一种重组细胞，其包括上述的载体，重组细胞为昆虫细胞。

[0048] 昆虫细胞例如选自昆虫卵巢细胞(如Sf9细胞等)。

[0049] 第六方面，本发明还提供了一种固定化酶，通过载体或无载体的方法将上述的P450单加氧酶固定制得；

[0050] 在本发明应用较佳的实施方式中，通过载体进行固定的方法选自吸附法、交联法和包埋法中的至少一种。

[0051] 吸附法包括不限于物理吸附和离子吸附的方式将酶吸附到载体上。可作为吸附的载体为：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、离子交换树脂和塑料等。

[0052] 交联法是采用双功能或多功能试剂与酶表明的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)反应，从而使得酶被固定。

[0053] 包埋法可以采用微胶囊法或凝胶包埋法获得固定化酶。微胶囊法例如使用半透性聚合物薄膜将酶包裹起来，形成微型胶囊；凝胶包埋法是将酶与胶溶液混合，经造粒而成。

[0054] 第七方面，本发明还提供了一种固定化细胞，将上述的重组菌或上述的重组细胞进行固定制得；

[0055] 在本发明应用较佳的实施方式中，通过载体进行细胞固定的方法选自吸附法、共价结合法、交联法和微胶囊法中的至少一种。

[0056] 吸附法包括不限于物理吸附和离子吸附的方式将细胞吸附到载体上。可作为吸附的载体为：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、离子交换树脂和塑料等。

[0057] 共价结合法是利用细胞表面的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)与活化的无机或有机载体反应，形成共价键将细胞固定。

[0058] 交联法是采用双功能或多功能试剂与细胞表明的反应基团(如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等)反应，从而使得细胞被固定。

[0059] 包埋法可以采用微胶囊法或凝胶包埋法获得固定化细胞。微胶囊法例如使用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊；凝胶包埋法是将细胞与胶溶液混合，经造粒而成。

[0060] 在本发明应用较佳的实施方式中，固定化细胞是活菌或死菌的固定化细胞。

[0061] 第八方面，本发明还提供了P450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞在2‑苯乙醇生物合成中的应用。

[0062] P450单加氧酶包括不限于纯化后的重组P450单加氧酶蛋白，含P450单加氧酶的粗酶液。

[0063] 采用上述P450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞能够高效、快速、简便的在常温、常压及水相环境中实现2‑苯乙醇生物合成，整个合成过程对环境友好，具有广阔的应用前景。

[0064] 在本发明应用较佳的实施方式中，2‑苯乙醇生物合成的底物为苯乙烷。

[0065] P450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞的形态包括不限于液体、半固体和固体。

[0066] 第九方面，本发明还提供了一种生物合成2‑苯乙醇的方法，采用上述的P450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞与底物反应。

[0067] 在本发明应用较佳的实施方式中，反应的温度是25‑35℃；反应温度例如是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或上述任意两两温度之前的任一点值。在上述反应温度下，具有较高的2‑苯乙醇生物合成效率。

[0068] 在本发明应用较佳的实施方式中，每10‑50mM的底物与5‑25mL的P450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞的混合。

[0069] 例如每10‑20mM、20‑40mM、或35‑50mM的底物与5‑25mL的P450单加氧酶、菌、细胞、固定化酶或固定化细胞的混合。

[0070] 在本发明应用较佳的实施方式中，将P450单加氧酶、重组菌、重组细胞、固定化酶或固定化细胞置于缓冲液中，与底物混合后在200‑250rpm摇床上进行反应。

[0071] 在本发明应用较佳的实施方式中，反应时间为12‑24h。

[0072] 在本发明应用较佳的实施方式中，将反应产物用有机溶剂进行萃取，经柱层析分析获得2‑苯乙醇。在一种可选的实施方式中，上述有机溶剂选自容易与2‑苯乙醇相溶的有机溶剂，例如酯类、醇类。酯类例如乙酸乙酯。通过柱层析以获得纯化后的2‑苯乙醇。

[0073] 在本发明应用较佳的实施方式中，缓冲液为50mM浓度、pH 6‑9的磷酸钠缓冲液。

[0074] 采用本发明提供的P450单加氧酶催化苯乙烷和苯丙烷底物制备2‑苯乙醇的反应过程为:

[0075]

[0076] 本发明具有以下有益效果：

[0077] 本发明提供了一种P450单加氧酶，该P450单加氧酶具有生物合成2‑苯乙醇的功能。相对于现有的2‑苯乙醇的制备方法，使用本发明提供的P450单加氧酶进行生物合成2‑苯乙醇，具有反应速率高，耗时短的技术优势。

[0078] 本发明提供的P450单加氧酶在合成2‑苯乙醇时，可在常温、常压及水相环境中进行，反应条件温和。

[0079] 此外，本发明提供的P450单加氧酶在合成2‑苯乙醇时，不需使用强氧化剂或有毒试剂，因此，本发明提供的P450单加氧酶具有较高的催化活性，对环境友好，合成过程操作简便，合成2‑苯乙醇的方法可以满足绿色工业化生产的需求，具有广阔的应用前景。附图说明

[0080] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0081] 图1为本发明的P450单加氧酶重组表达质粒的示意图；

[0082] 图2为限制性内切酶NdeI和XhoI对含有P450Ab基因序列的DNA片段及载体pET‑28a(+)‑P450Ab进行双酶切后的回收片段和载体图；

[0083] 图3为2‑苯乙醇标准品图谱；

[0084] 图4为P450Ab催化苯乙烷生成2‑苯乙醇的GC图。

[0085] 现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

[0086] 除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》，第二版(Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。

[0087] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0088] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0089] 实施例1

[0090] 本实施例针对单加氧酶基因进行合成验证,包括以下步骤:

[0091] 以基因组DNA为模板，使用引物进行PCR扩增获得P450Ab基因目的条带。PCR反应体系如下:2XTaq PCR Master Mix 10uL、公司合成的基因组DNA(基因序列号：MBO6542797.1)1μL、上下游引物各0.5μL、ddH2O 8.0uL。PCR反应条件:95℃10min；98℃10s，58℃30s，72℃
30s，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳验证是否获得符合目的基因大小的片段。

[0092] 上游引物序列如下：5'‑CATGAGCATTGCAACCCTGGAA‑3'；

[0093] 下游引物序列如下：5’‑TGCATGCAGGCGCACCGGCAT‑3'。

[0094] 经过验证，PCR产物符合目的基因大小的片段，长度为1254bp。

[0095] 实施例2

[0096] 单加氧酶复合体基因工程菌的构建，包括以下步骤:

[0097] 用限制性内切酶NdeI和XhoI对含有P450Ab基因序列的DNA片段及载体pET‑28a(+)‑P450Ab进行双酶切，酶切回收的目的片段和载体，结果如图2。泳道1表示双酶切条带，泳道2表示重组质粒条带，M为Marker。

[0098] 用T4DNA连接酶，16℃连接4h后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后，挑取长出的单克隆菌落，摇菌并提取质粒。重组的质粒图参照图1所示。

[0099] 然后将获得的质粒共转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中保存于‑80℃冰箱。

[0100] 共转化步骤：在冰浴条件下，将2μL质粒加入到感受态细胞中，在冰浴条件下放置30min，取出转入42℃水浴中热激90s，再置冰浴2min，超净台内吸取600μL TB液体培养基加入EP管中，于37℃，150rpm恒温摇床中培养1h，随后在超净台内将其全部均匀涂在相应抗性的TB固体培养基平板上，于37℃恒温箱中培养16‑18h，获得含重组质粒的基因工程菌BL21(DE3)。

[0101] 实施例3

[0102] P450单加氧酶复合体重组蛋白的获得，包括以下步骤:

[0103] 将保存于甘油中含重组质粒的基因工程菌BL21(DE3)划平板活化后，挑单菌落于2ml含相应抗生素的液体LB培养基中，37℃振荡培养12h，次日以2％接种量转接于新鲜的含抗生素的100mL LB液体培养基中，37℃250rpm振荡培养0D600为0.6(约3h)，加入终浓度为
0.2mM的IPTG，25℃160rpm诱导培养8h。诱导结束后5000rpm/min离心5min收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液中。

[0104] 实施例4

[0105] 利用实施例3中含重组P450单加氧酶的基因工程菌制备2‑苯乙醇，该基因工程菌催化苯乙烷底物制备2‑苯乙醇的反应过程为:

[0106]

[0107] 具体包括如下步骤：

[0108] 1)基因工程菌的培养:挑取构建好的基因工程菌单菌落于2mL LB培养基，于37℃摇床180rpm的转速下培养12h后，转入含有50mL LB培养基的250mL的大摇瓶，培养至OD600＝0.6时加入终浓度为0.2uM的IPTG，继续培养14h后，于5000rpm的条件下离心去除上清液，获得菌株的湿细胞备用；

[0109] 2)生物转化(合成2‑苯乙醇)：将所培养菌株的湿细胞，以10g/L的细胞浓度悬浮于5mL、pH为7.5的PBS缓冲液中，将10mM浓度的底物苯乙烷加入上述5mL反应体系中，放入摇床于30℃，250rpm条件下反应16h后，加入乙酸乙酯萃取，收集15瓶萃取后的有机相，用无水硫酸钠干燥，离心去除硫酸钠并过滤。加压蒸去溶剂，硅胶柱层析分离，获得2‑苯乙醇。

[0110] 对分离的产物进行GC分析，GC分析条件：Agilent 7890B气相色谱仪，G‑TA色谱柱，初始温度100℃，保持6min，以10℃/min升至180℃，保持10min。

[0111] 经过GC分析，结果显示，上述方法制备2‑苯乙醇的产率为56％，纯度为99％，2‑苯乙醇的标准对照图谱参照图3所示，P450单加氧酶催化合成2‑苯乙醇的GC图参照图4所示。

[0112] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。