一种固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202410559166.0 | 申请日 | 2024-05-08 |
| 公开(公告)号 | CN118325976A | 公开(公告)日 | 2024-07-12 |
| 申请人 | 金发科技股份有限公司; 珠海金发生物材料有限公司; 辽宁金发生物材料有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 李震; 陈平绪; 叶南飚; 曾祥斌; 曹民; 姚逸; 张少华; 张佳龙; 张豪; 张毅; | 第一发明人 | 李震 |
| 权利人 | 金发科技股份有限公司,珠海金发生物材料有限公司,辽宁金发生物材料有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 金发科技股份有限公司,珠海金发生物材料有限公司,辽宁金发生物材料有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省广州市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省广州市高新技术产业开发区科学城科丰路33号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：510663 |
| 主IPC国际分类 | C12P7/46 | 所有IPC国际分类 | C12P7/46 ; C12N1/18 ; C12N11/00 ; C07C55/10 ; C07C51/48 ; C07C51/42 ; C12R1/865 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 广州三环专利商标代理有限公司 | 专利代理人 | 宋静娜; |
| 摘要 | 本 发明 涉及一种固定化 发酵 耦合萃取分离生产丁二酸的方法，属于 生物 工程 技术领域。本发明利用萃取剂及时将丁二酸移出发酵体系，降低产物抑制作用，同时将菌 体细胞 固定化，提高了菌体的鲁棒性，加强了对菌体的保护，使菌体可以重复使用。此外，使用疏 水 性 溶剂 ，使酸溶性蛋白大大减少，减轻了分离纯化压 力 ，实现了较高的糖酸转化率、产物产量以及较低的分离成本。 | ||
| 权利要求 | 1.一种固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法技术领域背景技术[0002] 丁二酸(Succinic Acid)又被称为琥珀酸，参与人体生理代谢，是一种重要的四碳化合物，广泛应用在食品、金属、医药、塑料等领域，尤其在可降解塑料领域，其作为单体可以制备聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚丁二酸丁二醇酯(PBS)，市场需求量最大。2010年，美国能源部《生物炼制中生物基产品生产技术发展》认为琥珀酸具备取代石化产品中间体成为新一代生物基化学品中间体的潜力。 [0003] 丁二酸生产方法包括传统化学法和新兴的生物发酵法两种，生物法具有原料可再生且来源广泛、能耗低、碳排放少等优势，其生产成本也在逐渐降低，接近化学法的成本，因此成为研究的热点。第一代丁二酸生产技术所用菌种为细菌，如琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)、大肠杆菌(Escherichia coli)等，均采用中性发酵方式。第二代生产技术利用酵母采用低pH发酵方式，如酿酒酵母、毕赤酵母。发酵过程中，随着丁二酸或丁二酸盐以及其它副产物的不断积累，对菌体产生较强的抑制作用，会降低底物转化率和产物产量，提高发酵成本。现有技术中提高产物耐受性的方法包括菌种驯化、细胞固定化、发酵与分离耦合(产物及时分离出发酵体系)等。中国专利CN107164416B公开了一种以聚丙烯无纺布固定琥珀酸放线杆菌发酵生产丁二酸的方法，以聚丙烯熔喷无纺布在种子液中吸附细菌，然后放入发酵培养基进行反复分批发酵以及反复补料分批发酵，菌种可重复利用12次，转化率最高87.6％，产酸浓度最高为41.5g/L，生产强度最高为2.84g/L/h，该方法能够降低丁二酸盐对菌体的抑制作用，提高产物产量，但是分离过程需要酸化产生固废。专利CN102634442B中将发酵罐、膜过滤设备、结晶设备连接起来，形成一个闭环系统，当发酵罐内丁二酸浓度超过30g/L时，将发酵液过滤，截留的菌体回用，过滤清液去结晶系统调pH降温结晶，母液回用至发酵罐继续发酵，能够及时解除产物的抑制作用，缺陷是菌种中性发酵，发酵液分离及回用时需要频繁地调节pH，酸碱中和剂消耗较多，且结晶效率低。 [0004] 上述方法中所用菌种均需要在中性环境中发酵，分离过程中会产生大量固废，无法处理，目前工业上均采用酵母进行低pH发酵。然而，低pH条件下丁二酸对菌体抑制作用大大增强，同时酸溶性蛋白含量较高，不易去除，影响聚合级丁二酸的质量，需要超滤甚至纳滤以及多次复溶结晶。利用原位萃取分离技术可以将丁二酸及时移出发酵体系，降低产物抑制，但是萃取剂对菌体毒性较大，导致最终的产量提高有限，因此在降低产物抑制的同时保护菌体正常代谢，且有利于下游的精制提纯，对于丁二酸的产业化十分重要。 发明内容[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法。 [0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，包括以下步骤： [0007] (1)细胞固定化：将酵母种子于种子培养基中培养得种子液；取摇瓶种子液接种于发酵罐中培养，当OD达到6时，连通发酵罐和固定化反应器，使发酵液在发酵罐和固定化反应器之间进行循环，当循环液OD不变时，固定化过程结束，通空气压出发酵液； [0008] (2)固定化发酵：发酵罐内更换灭菌后的发酵培养基，进行发酵； [0009] (3)发酵液萃取分离：当发酵液中丁二酸浓度达到45～55g/L时，停止发酵液的循环，将萃取剂加入到发酵罐内，搅拌、分相后取出萃取相，继续发酵罐和固定化反应器之间的循环；当葡萄糖浓度≤5g/L时，抽出发酵液，完成了一次批次发酵；加入灭菌后的新鲜发酵培养基继续下一批次的固定化发酵。 [0010] 优选地，所述酵母为酿酒酵母。 [0011] 更优选地，所述发酵液中丁二酸浓度达到50g/L时，停止发酵液的循环，将萃取剂加入到发酵罐内，搅拌、分相后取出萃取相，继续发酵罐和固定化反应器之间的循环。 [0012] 当发酵液中丁二酸达到一定的浓度时，开始对酵母细胞产生抑制，因此需要及时停止发酵液的循环，但是过早的停止发酵液的循环可能会由于丁二酸浓度低而导致萃取效率低。本申请发明人研究发现，当发酵液中丁二酸浓度达到45～55g/L时，停止发酵液的循环，能够及时防止丁二酸对酵母细胞的抑制。 [0013] 作为本发明所述固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，所述种子培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖40‑50g/L、酵母粉1‑3g/L、KH2PO4 1‑3g/L、(NH4)2SO4 2‑5g/L、MgSO4·7H2O 0.2‑0.5g/L、CaCl2 0.02‑0.05g/L。 [0014] 作为本发明所述固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖100‑130g/L、玉米浆干粉4‑10g/L、KH2PO40.5‑2g/L、(NH4)2SO4 2‑5g/L、MgSO4·7H2O 0.2‑0.5g/L、CaCl2 0.02‑0.05g/L。 [0015] 作为本发明所述固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，所述酵母种子的培养条件为于转速250rpm、温度30‑35℃的摇床中培养10‑15h。 [0016] 作为本发明所述固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，所述发酵罐中培养条件具体为温度30‑35℃，空气通气量0.1‑0.4vvm，转速200‑500rpm。 [0017] 作为本发明所述固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，所述萃取剂包括正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、油醇中的至少一种。 [0018] 更优选地，所述萃取剂为正壬醇。 [0019] 本申请发明人研究发现，当选择正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇、油醇中的至少一种作为萃取剂，其对丁二酸具有较好的萃取效果，其中选择正壬醇时，萃取效果最佳，转化率和生产强度最高。 [0020] 作为本发明所述固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，所述步骤(3)中，萃取剂与发酵液的体积比为(0.2‑2)：1。 [0021] 更优选地，所述步骤(3)中，萃取剂与发酵液的体积比可为0.2：1、0.3：1、0.4：1、0.5：1、0.8：1、1：1、1.5：1、1.8：1、2：1等，在本发明给出的(0.2‑2)：1范围内，都可以取得更为优异的技术效果。 [0022] 本申请发明人研究发现，当选择萃取剂与发酵液的体积比为(0.2‑2)：1时，萃取剂对发酵液中的丁二酸的萃取效果较好，收率较高；当萃取剂的添加量低于上述比值，萃取不完全，收率下降；当萃取剂的添加量高于上述比值，会导致萃取物浓度低，下游分离浓缩成本太高。 [0023] 作为本发明所述固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，所述摇瓶种子液的接种量为5‑10％。 [0025] 本发明还提供所述的固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法在生产丁二酸中的应用。 [0026] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供了一种固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，本发明利用萃取剂及时将丁二酸移出发酵体系，降低产物抑制作用，同时将菌体细胞固定化，提高了菌体的鲁棒性，加强了对菌体的保护，使菌体可以重复使用。此外，使用疏水性溶剂，使酸溶性蛋白大大减少，减轻了分离纯化压力，实现了较高的糖酸转化率、产物产量以及较低的分离成本。 具体实施方式[0027] 为了更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及对比例对本发明作进一步说明，其目的在于详细地理解本发明的内容，而不是对本发明的限制。本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。本发明实施所涉及的实验试剂及仪器，除非特别说明，均为常用的普通试剂及仪器。 [0028] 实施例1 [0029] 本发明实施例提供一种固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法，包括以下步骤： [0030] (1)细胞固定化：将摇瓶酵母种子在摇床中培养10‑15h，转速250rpm，温度30‑35℃得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于发酵罐中(培养基装液量2L)，接种量5％，当OD达到6时，连通发酵罐和固定化反应器，打开蠕动泵，维持培养液流速25mL/min，让发酵液在发酵罐和固定化反应器之间进行循环，当循环液OD不变时，固定化过程结束，通空气压出种子液；所述种子培养基包括以下浓度组分：葡萄糖50g/L、酵母粉2g/L、KH2PO4 2g/L、(NH4)2SO4 3g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2 0.02g/L；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖 120g/L、玉米浆干粉6g/L、KH2PO4 1g/L、(NH4)2SO4 3g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、CaCl2 0.04g。 [0031] (2)固定化发酵：发酵罐内更换灭菌后的发酵培养基，装液量2L，使发酵罐和固定化反应器之间循环流量为100mL/min，进行发酵；所述发酵的温度为32℃、空气通气量0.2vvm、转速350rpm； [0032] (3)发酵液萃取分离：当发酵液中丁二酸浓度达到50g/L时，关泵，停止发酵液的循环，将萃取剂加入到发酵罐内，其与发酵液体积比1:1，250rpm搅拌30s，分相后抽出萃取相，打开泵，继续发酵罐和固定化反应器之间的循环。当葡萄糖浓度为5g/L时，抽出发酵液，完成了一次批次发酵；所述萃取剂为正壬醇。 [0033] 实施例2‑10 [0034] 本发明实施例2‑10除了表1列举的参数不同外，其余与实施例1保持一致。 [0035] 表1 [0036] [0037] 对比例1 [0038] 本对比例提供一种生产丁二酸的方法，该方法采用游离细胞发酵，具体步骤如下：将摇瓶酵母种子在摇床中培养10‑15h，转速250rpm，温度35℃。将摇瓶种子液接种于发酵罐中(培养基装液量2L)，接种量5％，温度35℃，空气通气量0.2vvm，转速200rpm，pH自然。当溶氧开始上升时停止发酵。 [0039] 对比例2 [0040] 本对比例提供一种生产丁二酸的方法，该方法与实施例1的唯一差别是不进行发酵液萃取分离。 [0041] 具体步骤： [0042] (1)细胞固定化：将摇瓶酵母种子在摇床中培养10‑15h，转速250rpm，温度30‑35℃得摇瓶种子液；将摇瓶种子液接种于发酵罐中(培养基装液量2L)，接种量5％，当OD达到6时，连通发酵罐和固定化反应器，打开蠕动泵，维持培养液流速25mL/min，让发酵液在发酵罐和固定化反应器之间进行循环，当循环液OD不变时，固定化过程结束，通空气压出种子液；所述种子培养基包括以下浓度组分：葡萄糖50g/L、酵母粉2g/L、KH2PO4 2g/L、(NH4)2SO4 3g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、CaCl2 0.02g/L；所述发酵培养基包括以下浓度的组分：葡萄糖 120g/L、玉米浆干粉6g/L、KH2PO4 1g/L、(NH4)2SO4 3g/L、MgSO4·7H2O0.4g/L、CaCl2 0.04g。 [0043] (2)固定化发酵：发酵罐内更换灭菌后的发酵培养基，装液量2L，使发酵罐和固定化反应器之间循环流量为100mL/min，进行发酵；所述发酵的温度为32℃、空气通气量0.2vvm、转速350rpm。 [0044] 对比例3 [0045] 本对比例提供一种生产丁二酸的方法，该方法采用游离细胞发酵，具体步骤如下：将摇瓶酵母种子在摇床中培养10‑15h，转速250rpm，温度35℃。将摇瓶种子液接种于发酵罐中(培养基装液量2L)，接种量5％，温度35℃，空气通气量0.2vvm，转速350rpm，pH自然；当发酵液中丁二酸浓度达到50g/L时，将正壬醇加入到发酵罐内，其与发酵液体积比1:1，250rpm搅拌30s，分相后抽出萃取相，继续发酵，当溶氧开始上升时停止发酵。 [0046] 效果例 [0047] 本发明实施例1‑10、对比例1‑3涉及的丁二酸的含量、转化率、生产强度和萃取相蛋白含量的具体检测方法如下： [0048] 1)采用高效液相色谱法检测水溶液中的丁二酸：AminexHPX‑87H色谱柱，300mm x7.8 mm；流动相5mM硫酸；流速0.6mL/min，进样量20μL，柱温65℃，检测时间23min。 [0049] 2)采用NaOH标准溶液进行滴定检测有机溶剂中的丁二酸：取2mL料液于锥形瓶中，加蒸馏水至约20mL，滴加2滴酚酞指示剂，摇匀，此时料液颜色为无色。用0.1mol/L的氢氧化纳滴定至溶液颜色刚好变为紫红色。记录消耗的氢氧化钠的体积为V0。丁二酸浓度CSA＝2.95V0，单位g/L；丁二酸质量： [0050] mSA＝CSA*VSA [0051] 3)葡萄糖含量采用SBA分析仪测定。 [0052] 4)转化率(g/g) [0053] [0054] 5)生产强度(g/L/h [0055] [0057] 检测结果如表3所示。 [0058] 表3 [0059] 组别 丁二酸(g) 转化率(g/g) 生产强度(g/L/h)实施例1 156.8 0.65 1.71 实施例2 144.6 0.60 1.31 实施例3 146.4 0.61 1.92 实施例4 151.2 0.63 1.59 实施例5 144 0.6 1.43 实施例6 151.2 0.63 1.69 实施例7 148.8 0.62 1.50 实施例8 148.8 0.62 1.51 实施例9 163.2 0.68 1.83 实施例10 148.8 0.62 1.56 对比例1 126.3 0.51 1.15 对比例2 138.9 0.55 1.52 对比例3 134.4 0.56 1.39 [0060] 由表3中可以看出，当采用本发明的固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法时，得到的丁二酸的转化率、生产强度较高，转化率达到0.60g丁二酸/g [0061] 葡萄糖以上，最高可达0.68g/g，高于现有技术可实现的水平。由实施例1、4‑7可以看出，萃取剂的种类的选择对丁二酸的萃取效果不同，从而影响收率和生产强度，当选择正壬醇时，其对丁二酸的萃取效果最佳，转化率和生产强度最高。由实施例1、8‑10可以看出，萃取剂与发酵液的体积比会明显影响丁二酸的收率，当选择萃取剂与发酵液的体积比为(0.2‑2)：1时，萃取剂对发酵液中的丁二酸的萃取效果较好，收率较高；当萃取剂的添加量不在上述体积比范围内时，其对丁二酸的分离萃取效果有影响；如当萃取剂的添加量低于上述比值时，萃取不完全，收率下降；当萃取剂的添加量高于上述比值时，会导致萃取物浓度低，下游分离浓缩成本太高。由实施例1与对比例1‑3比较可知，对比例1不进行固定化和萃取分离，仅仅将摇瓶种子液接种于含有2L培养基的发酵罐中进行常规的发酵；对比例2的发酵方法与实施例1相同，但没有进行发酵液萃取分离；对比例3采用游离细胞发酵，但采用与实施例1相同的发酵液萃取分离；对比例1‑3制备的丁二酸含量、转化率及生产强度均低于实施例1。由此说明，本发明采用固定化发酵耦合萃取分离生产丁二酸的方法利用萃取剂及时将丁二酸移出发酵体系，降低产物抑制作用，同时将菌体细胞固定化，提高了菌体的鲁棒性，加强了对菌体的保护，实现了较高的糖酸转化率、产物产量和生产强度。 [0062] 最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。 |
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