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一种用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法

专利类型	发明公开	法律事件	公开; 实质审查; 驳回;
专利有效性	无效专利	当前状态	驳回
申请号	CN201210400907.8	申请日	2012-10-19
公开(公告)号	CN102942248A	公开(公告)日	2013-02-27
申请人	深圳大学;	申请人类型	学校
发明人	杨缜; 徐大友;	第一发明人	杨缜
权利人	深圳大学	权利人类型	学校
当前权利人	深圳大学	当前权利人类型	学校
省份	当前专利权人所在省份：广东省	城市	当前专利权人所在城市：广东省深圳市
具体地址	当前专利权人所在详细地址：广东省深圳市南山区南海大道3688号	邮编	当前专利权人邮编：
主IPC国际分类	C02F3/00	所有IPC国际分类	C02F3/00 ; C12N11/00 ; C02F101/34
专利引用数量	1	专利被引用数量	0
专利权利要求数量	10	专利文献类型	A
专利代理机构	深圳市恒申知识产权事务所	专利代理人	陈健;
摘要	本发明提供了一种用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法,该方法利用一种酚类污染物处理剂处理酚类污染物，酚类污染物处理剂含有无载体固定化酪氨酸酶，酚类污染物含有酚类化合物，酚类污染物处理剂利用无载体固定化酪氨酸酶将酚类化合物催化反应生成对应的醌类化合物，以去除酚类化合物。本发明用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法能非常有效地从含酚污水中把酚类化合物除去，其处理效果和重复利用率相对于其他酶法处理酚类污染物有显著的提升。本发明方法成本低廉,且能大大降低含酚污水的生物毒性。
权利要求	1.一种用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法,其特征在于，所述方法是利用一种酚类污染物处理剂处理酚类污染物，所述酚类污染物处理剂含有无载体固定化酪氨酸酶，所述酚类污染物含有酚类化合物，所述酚类污染物处理剂利用所述无载体固定化酪氨酸酶将所述酚类化合物催化反应生成对应的醌类化合物，以去除所述酚类化合物。 2.如权利要求1所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，所述酚类化合物包括如下化合物中的一种或多种：苯酚、甲基酚、硝基酚、对氯苯酚、壬基酚、辛基酚、氨基酚及双酚A。 3.如权利要求1所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：利用高效液相色谱法检测所述酚类化合物的残留情况以及处理率。 4.如权利要求1所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，所述方法还包括如下步骤：利用水螅对经所述方法处理后的酚类污染物的毒性进行检测。 5.如权利要求1所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，制备所述无载体固定化酪氨酸酶的方法包括如下步骤：获取酪氨酸酶酶液；室温下对所述酪氨酸酶酶液进行搅拌并加入硫酸铵固体，使所述酪氨酸酶酶液的硫酸铵饱和度在0℃时达到50%，并进行沉淀反应10分钟，以获取部分沉淀的酪氨酸酶酶液；将重量比为12.5%的戊二醛逐滴加入所述部分沉淀的酪氨酸酶酶液中，并在4℃下搅拌反应以获取交联悬浊液，其中，所述12.5%的戊二醛与所述酪氨酸酶酶液的体积比为 1:50；将所述交联悬浊液离心并获取不溶于水的颗粒，用磷酸缓冲液清洗所述颗粒至少一次，所述颗粒即为无载体固定化酪氨酸酶；将清洗后的所述颗粒冷冻干燥后并研磨粉碎以获取粉末状的无载体固定化酪氨酸酶。 6.如权利要求5所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，所述获取酪氨酸酶酶液的步骤包括如下步骤：将酪氨酸酶原料物与摩尔浓度为50毫摩尔每升，pH值为6.0的磷酸缓冲液混合捣碎得到混合液，将所述混合液过滤并获取滤液；将所述滤液低温冷藏，以获取活性较高的酪氨酸酶粗提液；将所述酪氨酸酶粗提液进行低温离心并去除沉淀，以获取所述酪氨酸酶酶液。 7.如权利要求6所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，所述将滤液低温冷藏的步骤包括：将所述滤液置于-20℃的冰箱中保存至少1个月。 8.如权利要求6所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，所述酪氨酸酶原料物包括如下物质的一种或多种：马铃薯、香蕉、苹果、山芋、芋艿、蚕豆及蘑菇。 9.如权利要求5所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，所述 4℃下搅拌反应的时间为16小时。 10.如权利要求5所述的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，其特征在于，所述用磷酸缓冲液清洗颗粒的步骤包括：用摩尔浓度为50毫摩尔每升，pH值为6.0的磷酸缓冲液清洗所述颗粒。
说明书全文	一种用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法技术领域 [0001] 本发明属于酚类污染物的处理领域，尤其涉及一种用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法。背景技术 [0002] 酚类污染物是一种危害大且污染范围广的环境污染物，是一种原生质毒物，在低浓度时就会致癌、致畸、致突变，其广泛存在于工业和农业生产活动中，当其被排放到环境中，会在土壤以及水环境中累积。水中酚的质量浓度达到0.1mg/L时，鱼肉即有异味，不能食用；达到1mg/L时，会影响鱼类产卵；达到5mg/L时，鱼类则会大量死亡；饮用水中含有酚会影响人类健康，即使浓度只有0.002mg/L，用氯消毒也会产生氯酚恶臭。低浓度的酚水溶液会影响农作物的生长，不能用于灌溉。而且酚由于其毒性还会抑制微生物的生长，破坏生态平衡。因此，酚类污染物的处理越来越受到社会的重视。 [0003] 目前，有关酚类污染物的处理主要包括：化学法、物理法和生物法。化学法处理效果好，但成本较高，而且容易造成二次污染。物理法操作复杂，成本较高，而且只适用于较高浓度的酚类污染物处理。而生物法则相对应用范围更广，操作简便，成本较低。生物法主要包括用微生物处理和酶催化法处理酚类污染物。微生物处理相对较复杂，且其处理速率较慢，周期长。而酶催化法处理酚类污染物处理速率较快，成本较低，并且酶经固定化后还可以反复使用。 [0004] 目前，酶催化法处理酚类污染物存在酶的来源局限、分离提纯复杂、价格昂贵等问题。另外，传统的酶固定化方法都需要用到大量载体，将酶通过共价交联、物理吸附或包埋法等方式固定到载体上，这存在下列几个缺点：（1）需要用纯化和半纯化的酶，导致制备工艺较复杂；（2）大量的载体稀释了酶的浓度；（3）交联或包埋法会导致酶失活，而物理吸附容易使酶分子脱落，导致催化剂的重复利用率低；（4）制备酶制剂的成本较高。 [0005] 酶催化法所用到的酶主要包括漆酶、过氧化物酶及酪氨酸酶。当用漆酶和过氧化物酶处理酚类污染物时通常需要添加其他辅助性物质，这增大了处理成本，并且可能带来二次污染，处理效果也不够理想。而有关酪氨酸酶处理含酚污水的研究普遍的处理效果不佳，重复利用性差。发明内容 [0006] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法，旨在解决现有技术用于处理酚类污染物的酶的重复利用率低，对酚类污染物的处理效果不理想，且酶的固定化方法工艺复杂，制备成本高昂的问题。 [0007] 本发明是这样实现的，一种用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法,该方法是利用一种酚类污染物处理剂处理酚类污染物，酚类污染物处理剂含有无载体固定化酪氨酸酶，酚类污染物含有酚类化合物，酚类污染物处理剂利用无载体固定化酪氨酸酶将酚类化合物催化反应生成对应的醌类化合物，以去除酚类化合物。 [0008] 根据本发明的一优选实施例，酚类化合物包括如下化合物中的一种或多种：苯酚、甲基酚、硝基酚、对氯苯酚、壬基酚、辛基酚、氨基酚及双酚A。 [0009] 根据本发明的一优选实施例，该方法还包括如下步骤：利用高效液相色谱法检测酚类化合物的残留情况以及处理率。 [0010] 根据本发明的一优选实施例，该方法还包括如下步骤：利用水螅对经该方法处理后的酚类污染物的毒性进行检测。 [0011] 根据本发明的一优选实施例，制备无载体固定化酪氨酸酶的方法包括如下步骤：获取酪氨酸酶酶液；室温下对酪氨酸酶酶液进行搅拌并加入硫酸铵固体，使酪氨酸酶酶液的硫酸铵饱和度在0℃时达到50%，并进行沉淀反应10分钟，以获取部分沉淀的酪氨酸酶酶液；将重量比为12.5%的戊二醛逐滴加入部分沉淀的酪氨酸酶酶液中，并在4℃下搅拌反应以获取交联悬浊液，其中，12.5%的戊二醛与酪氨酸酶酶液的体积比为1:50；将交联悬浊液离心并获取不溶于水的颗粒，用磷酸缓冲液清洗颗粒至少一次，颗粒即为无载体固定化酪氨酸酶；将清洗后的颗粒冷冻干燥后并研磨粉碎以获取粉末状的无载体固定化酪氨酸酶。 [0012] 根据本发明的一优选实施例，获取酪氨酸酶酶液的步骤包括如下步骤：将酪氨酸酶原料物与摩尔浓度为50毫摩尔每升，pH值为6.0的磷酸缓冲液混合捣碎得到混合液，将混合液过滤并获取滤液；将滤液低温冷藏，以获取活性较高的酪氨酸酶粗提液；将酪氨酸酶粗提液进行低温离心并去除沉淀，以获取酪氨酸酶酶液。 [0013] 根据本发明的一优选实施例，将滤液低温冷藏的步骤包括：将滤液置于-20℃的冰箱中保存至少1个月。 [0014] 根据本发明的一优选实施例，酪氨酸酶原料物包括如下物质的一种或多种：马铃薯、香蕉、苹果、山芋、芋艿、蚕豆及蘑菇。 [0015] 根据本发明的一优选实施例，4℃下搅拌反应的时间为16小时。 [0016] 根据本发明的一优选实施例，用磷酸缓冲液清洗颗粒的步骤包括：用摩尔浓度为50毫摩尔每升，pH值为6.0的磷酸缓冲液清洗颗粒。 [0017] 本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法能非常有效地从酚类污染物中除去酚类化合物，其处理效果和重复利用率相对于其他酶法处理酚类污染物有显著的提升，所采用的无载体固定化酪氨酸酶既避免了二次污染又节约了处理成本，且由于该无载体固定化酪氨酸酶的来源广泛且制备工艺简单，因而本发明的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法成本低廉,且经过本发明方法处理过的酚类污染物的生物毒性被大大降低。附图说明 [0018] 图1是本发明实施例提供的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法的反应原理图； [0019] 图2是本发明实施例提供的无载体固定化酪氨酸酶的制备方法的流程图； [0020] 图3是本发明的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法的第一实施例的处理结果示意图； [0021] 图4是本发明的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法的第四实施例的处理结果示意图； [0022] 图5是本发明的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法的第五实施例中水螅对本发明方法处理后的酚类污染物水样毒性检测的结果示意图。具体实施方式 [0023] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。 [0024] 本发明提供了一种用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法,该用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法是利用一种酚类污染物处理剂处理酚类污染物，该酚类污染物处理剂含有无载体固定化酪氨酸酶，该酚类污染物含有酚类化合物，该酚类污染物处理剂利用本发明的无载体固定化酪氨酸酶将酚类化合物催化反应生成对应的醌类化合物，以去除酚类化合物。 [0025] 其中，酚类污染是指酚类化合物对环境造成的污染。酚类污染物主要来源于焦化厂、煤气厂、石油化工厂、绝缘材料厂等工业部门以及石油裂解制乙烯、合成苯酚聚酰胺纤维、合成染料、合成有机农药和酚醛树脂生产过程。酚类化合物包括如下化合物中的一种或多种：甲基酚(间甲基苯酚、邻甲基苯酚及对甲基苯酚)、硝基酚、苯酚、对氯苯酚、壬基酚、辛基酚、氨基酚、五氯酚及双酚A等对环境产生污染的各种酚类化合物，但不限于此，此处不再一一例举。 [0026] 图1是本发明实施例提供的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法的反应原理图，如图1所示，酚类化合物经本发明的无载体固定化酪氨酸酶催化反应后氧化会生成邻苯酚并进一步氧化生成对应的醌类化合物，醌类化合物在自然条件下会通过一系列的非酶促反应生成黑色素并自动聚集而沉淀下来，从而达到对酚类污染物进行处理的目的。 [0027] 本发明中，无载体固定化酪氨酸酶的用量和处理时间根据酚类化合物的种类和浓度而定,在利用本发明用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法处理酚类污染物后，优选再利用高效液相色谱法（HPLC）检测酚类化合物的残留情况以及处理率，并优选用水螅对处理后的酚类污染物的毒性进行检测。 [0028] 本发明实施例还进一步提供了一种制备本发明的无载体固定化酪氨酸酶的方法。图2是本发明实施例提供的无载体固定化酪氨酸酶的制备方法的流程图。如图2所示，本发明的实施例的无载体固定化酪氨酸酶的制备方法包括步骤S1、步骤S2、步骤S3、步骤S4及步骤S5。 [0029] 其中，步骤S1：获取酪氨酸酶酶液。其中，酪氨酸酶酶液可以是目前可获取的无需完全纯化的各种来源的酪氨酸酶酶液。例如，在本实施例中，步骤S1包括如下步骤： [0030] 步骤S11：将酪氨酸酶原料物与摩尔浓度为50毫摩尔每升，pH值为6.0的磷酸缓冲液混合捣碎得到混合液，将混合液过滤并获取滤液； [0031] 步骤S12：将滤液低温冷藏，以获取活性较高的酪氨酸酶粗提液； [0032] 步骤S13：将酪氨酸酶粗提液进行低温离心并去除沉淀，以获取酪氨酸酶酶液。 [0033] 本发明中不对酪氨酸酶的来源进行限制，酪氨酸酶原料物可以包括如下物质的一种或多种：马铃薯、香蕉、苹果、山芋、芋艿、蚕豆及蘑菇等含有丰富的酪氨酸酶的原料物，但不限于此，此处不再一一例举。本实施例中，步骤S11中例如可以采用100g的酪氨酸酶原料物与200ml摩尔浓度为50毫摩尔每升，pH值为6.0的磷酸缓冲液进行混合捣碎，并可以采用食物加工器等设备捣碎酪氨酸酶原料物。本实施例中，步骤S12中将滤液低温冷藏的步骤包括如下步骤：将滤液置于-20℃的冰箱中保存至少1个月。当采用-20℃的冰箱将滤液低温冷藏后，在4℃的冰箱中对冻存的滤液解冻，以方便进行之后的制备步骤。 [0034] 步骤S2：室温下对酪氨酸酶酶液进行搅拌并加入硫酸铵固体，使酪氨酸酶酶液的硫酸铵饱和度在0℃时达到50%，并进行沉淀反应10分钟，以获取部分沉淀的酪氨酸酶酶液。本实施例中，步骤S2中可以采用磁力搅拌的方式对酪氨酸酶酶液进行搅拌，沉淀反应的时间则优选为10分钟。 [0035] 步骤S3：将重量比为12.5%的戊二醛逐滴加入部分沉淀的酪氨酸酶酶液中，并在4℃下搅拌反应以获取交联悬浊液，其中，12.5%的戊二醛与酪氨酸酶酶液的体积比为1:50。本实施例中，步骤S3中的4℃下搅拌反应的时间优选为16小时。 [0036] 步骤S4：将交联悬浊液离心并获取不溶于水的颗粒，用磷酸缓冲液清洗颗粒至少一次，该颗粒即为无载体固定化酪氨酸酶。本实施例中，步骤S4中用磷酸缓冲液清洗颗粒的步骤包括如下步骤：用摩尔浓度为50mM的pH值为6.0的磷酸缓冲液清洗所述颗粒。清洗颗粒的次数优选为数次，更优选清洗至清洗液中不含有酪氨酸酶活性为止。 [0037] 步骤S5：将清洗后的颗粒冷冻干燥并研磨粉碎以获取粉末状的无载体固定化酪氨酸酶。本实施例中，将不溶于水的颗粒经冷冻干燥并研磨后得到棕褐色的粉末状的酶粉即为无载体固定化酪氨酸酶（Cross-Linked Enzyme Aggregates）的粉末，当然，在其他实施例中还可以采取其他既不会破坏酶活性同时干燥效果好的干燥方式获取粉末状的无载体固定化酪氨酸酶，此处不再赘述。 [0038] 应当指出的是，本发明实施例提供的无载体固定化酪氨酸酶不仅限于本实施例的方法，使用其他无载体固定化固定化酪氨酸酶的方法并使用本发明构思处理酚类污染物的方案，皆应视为被本发明的权利要求所覆盖。 [0039] 下面结合具体实施例更进一步说明本发明的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法。 [0040] 第一实施例： [0041] 分别在100ml的苯酚（浓度为2.5mM）、100ml的对甲基苯酚（浓度为2.5mM）、100ml的对氯苯酚（浓度为2.5mM）、100ml的双酚A（浓度为0.022mM）中加入50mg的无载体固定化酪氨酸酶并混合，各混合液在恒温摇床（30℃,250r/min）中反应，每隔一定时间取1ml各混合液检测其中酚类化合物浓度的变化情况。如图3所示，双酚A经无载体固定化酪氨酸酶处理1小时后可以被完全处理，对甲基苯酚经无载体固定化酪氨酸酶处理1.5小时后的处理率为99.6%，对氯苯酚经无载体固定化酪氨酸酶处理2小时后的处理率为99.6%，苯酚经无载体固定化酪氨酸酶处理3小时后的处理率为99.5%。所有酚类污染物经无载体固定化酪氨酸酶处理4小时后均能被完全处理。 [0042] 第二实施例: [0043] 将50mg的无载体固定化酪氨酸酶加入100ml的混合酚（含浓度皆为2.5mM的苯酚、对甲基苯酚及对氯苯酚）中，并将混合液置于恒温摇床（30℃,250r/min）中反应。结果显示，经无载体固定化酪氨酸酶处理6小时后，对甲基苯酚能完全去除，对氯苯酚的处理率为99.3%，而经过11小时处理后苯酚的处理率为75.9%。 [0044] 第三实施例 [0045] 将30mg的无载体固定化酪氨酸酶分别用于重复处理20ml的苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚溶液（浓度均为5mM），每次处理时间为2小时，经过5次重复使用后，苯酚、对甲基苯酚、对氯苯酚的处理率分别为51.3%、97.7%、78%。 [0046] 第四实施例 [0047] 将45mg的无载体固定化酪氨酸酶分别用于重复处理20ml的双酚A（浓度为0.022mM）溶液，每次处理时间为0.5小时，经过10次重复使用，酚处理率仍然达78%（如图 4所示）。 [0048] 第五实施例 [0049] 用水螅对无载体固定化酪氨酸酶处理后的酚类污染物水样毒性进行检测。用吸管取普通水螅（Hydra vulgaris）置于载波片上，用吸水纸吸去水后立即滴加2-3滴下列待测水样至水螅上：无污染水样、无载体固定化酪氨酸酶处理前的对氯苯酚水样、无载体固定化酪氨酸酶处理后的对氯苯酚水样、无载体固定化酪氨酸酶处理前的混合酚水样、无载体固定化酪氨酸酶处理后的混合酚水样，并以滴加无污染水样的水螅组为对照组，每隔1小时用正置荧光显微镜观察水螅的生活状态并拍照记录，结果如图5所示。水螅在经本发明处理后的含酚水样中的生活状态明显优于处理前的水样，与在无酚类物质污染的水样中的生活状态相同。这表明酚类污染物经本发明方法处理后，生物毒性大大降低。 [0050] 本发明的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法能非常有效地从酚类污染物中除去酚类化合物，其处理效果和重复利用率相对于其他酶法处理酚类污染物有显著的提升，所采用的无载体固定化酪氨酸酶既避免了二次污染又节约了处理成本，且由于该无载体固定化酪氨酸酶的来源广泛且制备工艺简单，因而本发明的用无载体固定化酶去除酚类污染物的方法成本低廉,且经过本发明方法处理过的酚类污染物的生物毒性能被大大降低。 [0051] 此外，本发明的无载体固定化酪氨酸酶的制备方法采用无载体固定化方法对酪氨酸酶进行固定化，该制备方法无需纯化的酶，只需粗酶液即可进行制备，整个制备过程工艺简单，所选用的酪氨酸酶在处理过程中无需引入添加剂，既避免了二次污染又节约了处理成本，且酶的来源广泛，成本低廉。 [0052] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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