[0001] 本发明涉及一株产木糖醇的酵母菌及其应用。

[0002] 木糖醇是一种五碳糖醇，在自然界，它存在于许多水果和蔬菜中。木糖醇的甜度是蔗糖的1.05倍，热量与蔗糖相当，其代谢不需胰岛素。因此可作为糖尿病患者食用的甜味剂。木糖醇不被细菌发酵，因此在口香糖中作为甜味剂，不仅有防龋齿的功能，而且在口中有清凉感。此外。木糖醇还有降低肝脏转氨酶和防止呼吸道感染等功能。因此，木糖醇不仅是甜味剂，还可作为一种辅助治疗药物。

[0003] 由于木糖醇在水果和蔬菜中的含量都很低，直接提取困难而不经济。目前工业上生产木糖醇采用化学法，即木糖化学催化加氢的方法。该方法需要单独制氢，在高温高压下反应，工艺复杂、安全性差、成本较高，因此，用生物法取代化学法已成为木糖醇生产的发展趋势。用于发酵法制备木糖醇的微生物几乎都是酵母菌，既有自然菌种，也有基因工程菌。自然菌种发酵以木糖为底物，一部分木糖将用于辅酶再生，理论转化率为0.887g/g，即0.875mol木糖醇/mol木糖(厌氧条件下)和0.917g/g，即0.905mol木糖醇/mol木糖(半厌氧条件下)(ParajóJ C，DOMINGUEZ H，DOMINGUEZ J M.Biotechnological production of xylitol，Part 1.Interest of xylitol and fundamentals of its biosynthesis[J].Biore Technol，1998，65(3)：191-201.)。基因工程菌发酵的底物除木糖外，另有其它碳源用于辅酶再生，对木糖的理论转化率为1.013g/g，即1mol木糖醇/mol木糖。自然菌种的生产水平为：转化率0.56～0.74克(木糖醇)/克(木糖)，产率0.2～0.5克(木糖醇)/升·小时；基因工程菌的生产水平为：转化率可接近理论值，产率0.6～1.0克(木糖醇)/升·小时(Leathers：FEMS Yeast Research，3133-140，2003)。在木糖醇的生产中，虽然基因工程菌优于自然菌种，但需要添加葡萄糖、乙醇、乙酸、甘油等作为辅底物来再生辅酶，从而提高了成本。无论是基因工程菌或自然菌种，其综合生产水平仍不能满足产业化的要求。

[0004] 本发明的一个目的是提供一株产木糖醇的酵母菌及其应用。

[0005] 本发明所提供的产木糖醇的酵母菌是麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)，其菌株号为XU316，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5695。该菌种已于2012年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。

[0006] 现有的能培养麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)的培养基均可用于培养麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695，其培养温度可为24-37℃，培养时间可为4-48h；最适培养温度为28-32℃。培养基中的碳源可为木糖和/或葡萄糖；氮源可为蛋白胨和/或酵母提取物和/或牛肉膏和/或玉米浆和/或铵盐。

[0007] 将麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695固定后得到的固定化酵母细胞也属于本发明的保护范围。

[0008] 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695或其固定化酵母细胞在将木糖转化为木糖醇中的应用也属于本发明的保护范围。

[0009] 本发明的另一个目的是提供一种低成本且具有较高产率的木糖醇生产方法。

[0010] 本发明所提供的木糖醇生产方法，以含木糖的物质作为反应底物，利用麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695或其固定化酵母细胞将木糖转化为木糖醇。所述含木糖的物质不限于下述1)-3)，还可包括其它含木糖的液体：1)木糖溶液；2)木糖母液；3)含半纤维素物质的水解物，所述含半纤维素物质的水解物中含有木糖。

[0011] 木糖母液是木糖生产过程中木糖结晶后残留的含糖液体，其主要成分为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖等。

[0012] 含半纤维素物质包括(但不限于)：玉米芯、甘蔗渣、碎木、木屑、各种秸秆、米糠等。所述水解物包括酸水解物、酶水解物以及酸酶联合水解物。

[0013] 上述方法还可包括如下步骤：麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695或其固定化酵母细胞按照如下配比接入所述含木糖的物质的水溶液中：0.3-0.5g干细胞/克木糖(其中木糖浓度为50-250g/L)。其中，所述将木糖转化为木糖醇的反应温度可为为25℃-40℃，如30℃-35℃、30℃或35℃。所述将木糖转化为木糖醇的反应时间可为12-500小时，如52-480小时、52-66小时、52小时、66小时、65小时或480小时。

[0014] 本发明的麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695不仅能用纯木糖为原料生产木糖醇，还能利用木糖生产过程中的水解液作为主要原料生产木糖醇。转化率可接近理论值，最高达0.90克(木糖醇)/克(木糖)，产率最高可达3克(木糖醇)/升·小时以上，木糖醇浓度最高可达200克/升以上，可使生产成本大幅度降低，具有很好的应用前景。

[0015] 下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。

[0016] 保藏说明

[0017] 菌种名称：麦芽糖假丝酵母

[0018] 拉丁名：Candida maltosa

[0019] 菌株编号：XU316

[0020] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0021] 保藏机构简称：CGMCC

[0022] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

[0023] 保藏日期：2012年01月09日

[0024] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No.5695

[0025] 下述实施例中的方法如无特别说明均为常规方法。

[0026] 下述实施例3-5中的木糖和木糖醇均按照如下方法测定：仪器为HPLC(Waters，USA)，色谱柱为Aminex HPX-87H(BioRad，CA，USA)，检测器为RI@8X detector(Waters，USA)。流动相为5mM H2SO4水溶液，流速0.6ml/min，柱温为60℃。以外标法定量测定木糖和木糖醇的浓度。采用的木糖标准品购自sigma公司，纯度＞99％，采用的木糖醇标准品购自sigma公司，纯度＞99％。在该色谱条件下，木糖标准品的保留时间是10.627分钟，木糖醇标准品的保留时间是13.293分钟。在该色谱条件下，木糖的标准曲线是y＝1452.004x，其中y为峰面积，x为浓度，其单位是g/L，进样量为10ul；木糖醇的标准曲线是y＝1538.614x，其中y为峰面积；x为浓度，其单位是g/L，进样量为10ul。

[0027] 下述实施例4-5中的葡萄糖和阿拉伯糖均按照如下方法测定：仪器为HPLC(Waters，USA)，色谱 柱 为Aminex HPX-87H(BioRad，CA，USA)，检 测 器 为RI@8X detector(Waters，USA)。流动相为5mM H2SO4水溶液，流速0.6ml/min，柱温为60℃。以外标法定量测定葡萄糖和阿拉伯糖的浓度。采用的葡萄糖标准品购自sigma公司，纯度＞99％，采用的阿拉伯糖标准品购自sigma公司，纯度＞99％。在该色谱条件下，葡萄糖标准品的保留时间是9.898分钟，阿拉伯糖标准品的保留时间是11.689分钟。在该色谱条件下，葡萄糖的标准曲线是y＝1359.440x，其中y为峰面积，x为浓度，其单位是g/L，进样量为10ul；阿拉伯糖的标准曲线是y＝1490.792x，其中y为峰面积，x为浓度，其单位是g/L，进样量为10ul。

[0028] 下述实施例5中的总糖使用糖度计测定(折光法)。

[0029] 实施例1、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695的分离及鉴定[0030] 1、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695的分离[0031] 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695是从中国北京地区含木材腐烂物的样品中提取、分离、筛选、纯化得到的。具体的方法如下：用无菌水浸泡样品，过滤除去不溶物，涂布于含木糖的固体平板培养基中，至于30℃温箱中培养至长出单菌落，对单菌落逐个进行木糖转化实验，选取性状优良的菌株，得到麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695。

[0032] 2、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695的鉴定[0033] 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695，菌株呈卵形、椭圆形、柱形，大小为2-5.5×3.5-12μm，有菌环和醭膜形成；有假菌丝产生；菌落奶酪状、乳白色，表面平滑至粗糙，不反光，边缘树根状或流苏状。PCR扩增26SrDNA/D1，D2序列，所用的PCR引物为：上游GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG，下游GGTCCGTGTTTCAAGACGG；扩增到的序列为序列表中的序列1。

[0034] 实施例2、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695的细胞培养[0035] 麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695保存于麦芽汁琼脂斜面培养基中，培养基组成为：麦芽提取物100g/L，琼脂20g/L，溶剂为水。用YPD液体培养基培养麦芽糖假丝酵母XU316CGMCC No.5692，培养基组成为：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖50g/L，溶剂为水，pH为5.0。培养方法如下：接一环斜面菌种于250ml三角摇瓶中，内装50ml液体培养基，置于旋转摇床上，于30℃、250rpm培养过夜至饱和作为一级种子。按10％(体积比)接种量转一级种子于500ml液体培养基中，分装于5只500ml三角摇瓶中，每瓶100ml培养基，于30℃、250rpm培养过夜至饱和作为二级种子。按10％(体积比)接种量转二级种子于3000ml液体培养基中，培养基置于6L NBS BIOFLO III自控台式发酵罐中，并加0.3ml聚醚类消泡剂，培养条件如下：搅拌转速为500rpm、温度为30℃、通气量为
0.5vvm、溶氧控制在30％以上，培养时间为9小时至溶氧回升，细胞干重为100g/L发酵液。
细胞干重测定方法如下：取10ml发酵液以13000rpm离心5分钟，弃上清，10ml水洗一次，同样离心，弃上清，90℃烘箱烘干至恒重，测定重量后折算为每L发酵液的干重。培养结束后用Backman J2-HS离心机收集细胞，离心条件为：6管(每管500ml)，转速5000rpm，时间
30分钟。离心后弃上清，细胞用于木糖转化。

[0036] 实施例3、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695转化木糖水溶液生产木糖醇。

[0037] 1、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695细胞单次转化木糖水溶液生产木糖醇

[0038] 称取600g木糖(购自山东福田药业有限公司，纯度＞99％)溶解于水中，定溶于3L，配成木糖水溶液用于细胞转化。将该3L木糖水溶液置于6L NBS BIOFLO III自控台式发酵罐中，将实施例2中用1.8L发酵液收集的麦芽糖假丝酵母XU316CGMCCNo.5692细胞重悬于木糖水溶液中，使麦芽糖假丝酵母XU316CGMCC No.5692细胞与木糖水溶液中木糖的配比为0.3g干细胞/克木糖，进行木糖的细胞转化反应。转化条件如下：温度为30℃、搅拌转速为300rpm、通气量为0.05vvm，反应于57小时结束，取样，每管1ml于台式离心机中以
13000rpm离心5分钟，上清液用于测定木糖和木糖醇浓度。

[0039] 上述实验重复3次，结果表明转化反应57小时的木糖醇浓度为170.5g/L，木糖浓度为8.2g/L，消耗的木糖为191.8g/L，转化率0.89克(木糖醇)/克(木糖)，产率为3克(木糖醇)/升·小时。其中，上述上清液中木糖的保留时间是10.630分钟，木糖醇的保留时间是13.295分钟。

[0040] 2、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695细胞重复转化木糖水溶液生产木糖醇

[0041] 称取600g木糖(购自山东福田药业有限公司，纯度＞99％)溶解于水中，定溶于3L，配成木糖水溶液用于细胞转化。将该3L木糖水溶液置于6L NBS BIOFLO III自控台式发酵罐中，将实施例2中用1.8L发酵液收集的麦芽糖假丝酵母XU316CGMCCNo.5692细胞重悬于木糖水溶液中，使麦芽糖假丝酵母XU316CGMCC No.5692细胞与木糖水溶液中木糖的配比为0.3g干细胞/克木糖，进行木糖的细胞转化反应。转化条件如下：温度为30℃、搅拌转速为300rpm、通气量为0.05vvm，反应于57小时结束。转化反应结束后，用Backman J2-HS离心机离心分离反应液的清液和细胞，离心条件为：6管(每管500ml)，转速5000rpm，时间
30分钟。上清液用于分离纯化木糖醇，细胞再按照步骤1的方法用于木糖水溶液的生物转化，除转化反应时间不同外，其它条件均与步骤1的转化反应条件相同。细胞共重复转化9次，重复使用9次，其中第6、8次转化分别补加150g木糖，作为反应底物的木糖共计5700克，累计消耗木糖5409克，生成木糖醇4599克，共用时480小时，细胞仍具有转化能力。9次的平均转化率为0.85(木糖醇)/克(木糖)，平均产率为3.2克(木糖醇)/升·小时，平均木糖醇浓度170g/L。其中，第2-9次的转化反应时间分别为50、48、50、53、54、55、56和
57小时。

[0042] 3、上清液中木糖醇的提取。

[0043] 将步骤2中得到的含有木糖醇的上清液(共含木糖醇610g)，用氢型732强酸型阳离子交换树脂除去上清液中的阳离子，再用氢氧根型D-301R弱碱型阴离子交换树脂除去上清液中的阴离子，使上清液pH为5.5-6.5。用中空纤维超滤器对除离子后的上清液进行超滤除去大分子，超滤膜平均截留分子量为5000。用旋转真空蒸发器浓缩去除离子和大分子的反应液，温度为55℃，浓缩至木糖醇浓度为753g/L。把浓缩液置于烧杯中，用程序降温仪缓慢降温并缓慢搅动液体，降温速度为2℃/小时，至出现晶体，继续缓慢搅拌至降温到18℃，再搅拌1小时，使结晶充分。用布氏漏斗真空抽滤分离晶体和母液，劲量抽干，于40℃干燥后得到木糖醇晶体385g。母液与另一次上清液合并浓缩后再结晶。

[0044] 实施例4、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695转化玉米芯水解液生产木糖醇。

[0045] 将玉米芯与1％(质量百分含量)稀硫酸按1∶5的质量比混合，在120-130℃保温2-3小时水解后，通过中和脱酸、活性炭脱色、减压蒸发浓缩、经离子交换脱离子后得到玉米芯水解液。该水解液含木糖160g/L、葡萄糖16g/L、阿拉伯糖15g/L，不含木糖醇。将该3L玉米芯水解液置于6L NBS BIOFLO III自控台式发酵罐中，将实施例2中用1.8L发酵液收集的麦芽糖假丝酵母XU316CGMCC No.5692细胞重悬于3L玉米芯水解液中，使麦芽糖假丝酵母XU316CGMCC No.5692细胞与玉米芯水解液中木糖的配比为0.375g干细胞/克木糖，进行木糖的细胞转化反应。转化条件如下：温度为25℃、搅拌转速为300rpm、通气量为
0.05vvm，反应于52小时结束，取样，每管1ml于台式离心机中以13000rpm离心5分钟，上清液用于测定木糖、木糖醇、葡萄糖和阿拉伯糖浓度。实验重复3次，结果表明转化反应52小时，木糖醇浓度为135.3g/L，木糖浓度为9.2g/L，消耗的木糖为150.8g/L，葡萄糖浓度为
0.15g/L，阿拉伯糖浓度14.5g/L，转化率0.90克(木糖醇)/克(木糖)，产率为2.6克(木糖醇)/升·小时。其中，上述上清液中木糖的保留时间是10.629分钟，木糖醇的保留时间是13.296分钟，葡萄糖的保留时间是9.901分钟，阿拉伯糖的保留时间是11.690分钟。

[0046] 实施例5、麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)XU316CGMCC No.5695转化木糖母液生产木糖醇。

[0047] 木糖母液是木糖生产中将木糖结晶液通过固液分离分出晶体木糖后的废弃液体，颜色为深褐色，总糖为660g/L，其中含木糖340g/L、葡萄糖150g/L、阿拉伯糖170g/L，不含木糖醇。用水将母液稀释一倍，加3％(W/V)的活性碳60℃脱色2小时，过滤除去活性炭，得到处理后木糖母液。处理后木糖母液中含木糖165gL、葡萄糖70g/L、阿拉伯糖82g/L。将实施例2中用1.8L发酵液收集的麦芽糖假丝酵母XU316CGMCCNo.5692细胞重悬于3L处理后木糖母液(含木糖165g/L)中，使麦芽糖假丝酵母XU316CGMCC No.5692细胞与处理后木糖母液中木糖的配比为0.364干细胞/克木糖，进行木糖的细胞转化反应。转化条件如下：温度为35℃、搅拌转速为300rpm、通气量为0.05vvm，反应于65小时结束，取样，每管1ml于台式离心机中以13000rpm离心5分钟，上清液用于测定木糖、木糖醇、葡萄糖和阿拉伯糖浓度。实验重复3次，结果表明木糖醇浓度为136.7g/L，木糖浓度为10.1g/L，消耗的木糖为154.9g/L，葡萄糖浓度为0.21g/L，阿拉伯糖浓度81.1g/L，转化率为0.88克(木糖醇)/克(木糖)，产率为2.1克(木糖醇)/升·小时。其中，上述上清液中木糖的保留时间是
10.631分钟，木糖醇的保留时间是13.298分钟，葡萄糖的保留时间是9.897分钟，阿拉伯糖的保留时间是11.691分钟。