| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 驳回; |
| 专利有效性 | 无效专利 | 当前状态 | 驳回 |
| 申请号 | CN201010595797.6 | 申请日 | 2010-12-20 |
| 公开(公告)号 | CN102559617A | 公开(公告)日 | 2012-07-11 |
| 申请人 | 北京清大天一科技有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 张韧; 陈文庆; 王建超; | 第一发明人 | 张韧 |
| 权利人 | 北京清大天一科技有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 北京清大天一科技有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：北京市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：北京市昌平区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：北京市昌平区科技园区白浮泉路11号 | 邮编 | 当前专利权人邮编： |
| 主IPC国际分类 | C12N7/08 | 所有IPC国际分类 | C12N7/08 ; C12N5/071 ; C12N11/00 |
| 专利引用数量 | 2 | 专利被引用数量 | 3 |
| 专利权利要求数量 | 15 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 北京银龙知识产权代理有限公司 | 专利代理人 | 钟晶; 李昆岐; |
| 摘要 | 本 发明 提供一种 生物 反应器 微载体培养人二倍 体细胞 生产病毒 疫苗 的方法。该方法包括以下步骤：复苏人二倍体细胞；扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液；将获得的细胞悬液接种至生物反应器，生物反应器预先加入灭菌的新鲜完全细胞生长培养液及微载体，接种细胞终 密度 为5×104-2×106个细胞/ml，然后在35-39℃、pH6.5-8.0、溶 氧 15％-100％条件下，培养得到微载体 单层 细胞，细胞密度达1×106个细胞/ml以上；接种、繁殖及 收获 病毒。通过本发明方法，不仅使得采用生物反应器培养人二倍体细胞大规模生产病毒疫苗成为可能，并且生产的病毒疫苗产量高、一致性好，可以高效实现病毒疫苗的大规模工业化生产。 | ||
| 权利要求 | 1.一种生物反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法，其包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 生物反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法技术领域[0001] 本发明涉及一种生产病毒疫苗的方法，具体地，本发明涉及一种生物反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法。 背景技术[0002] 人二倍体细胞是指来源于人正常体细胞的、可进行体外传代培养、并对多种病毒具有广泛的敏感性的细胞。人二倍体细胞不是肿瘤细胞，因而具有一定的稳定传代寿命(通常为40～60代)，超过所述传代寿命则可能发生细胞的衰老、退化以及死亡。传代寿命内，人二倍体细胞的任一传代水平细胞的染色体组型保持正常二倍体染色体数目，具二倍体的细胞数，应占所检查分裂中期细胞总数的75％以上。 [0003] 人二倍体细胞株虽然稳定传代寿命有限，但其细胞株在衰老前任一传代水平都可将多余的细胞冻存起来，而在需要时复苏重新培养使用，因此一个细胞株所能供应的使用量也是非常巨大的。例如典型的人二倍体细胞MRC-5细胞系、WI-38细胞系、2BS细胞系、KMB-17细胞系等都在商业上可供，可以从诸如美国模式菌种收集中心(ATCC)、欧洲细胞培养物收藏中心(ECACC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)等细胞种子库(种质库)中购买。 [0004] 用人二倍体细胞制备病毒性疫苗可以克服使用原代细胞在其培养物中可能存在的各种潜在致病因子的危险，是当前病毒性疫苗生产较为理想的细胞基质。人二倍体细胞与原代细胞相比，具有能够充分鉴定和标准化的优点，可实现细胞种子库系统，建立的细胞库可多年用于生产，有利于质量控制。人二倍体细胞与肿瘤传代细胞相比，理论上不存在致肿瘤的潜在危险性。 [0005] 我国已上市的疫苗中，甲型肝炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、风疹减毒活疫苗、水痘减毒活疫苗分别使用了2BS、KMB-17、MRC-5细胞。使用生物反应器微载体培养动物细胞进行生物制品生产是生物制药行业的必然趋势，但由于人二倍体细胞生长缓慢、传代次数有限、对生长环境要求高，一般认为其难以进行大规模细胞培养，尤其是难以使用生物反应器实现大规模培养。 发明内容[0006] 为了解决难以使用生物反应器实现大规模培养人二倍体细胞，发明人经过研究，提供了一种反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法，该方法可以实现用生物反应器培养人二倍体细胞大规模生产病毒疫苗。 [0007] 为了解决上述问题，本发明提供以下技术方案。 [0008] 1.一种生物反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法，其包括以下步骤： [0009] 1)复苏人二倍体细胞； [0010] 2)扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液； [0011] 3)生物反应器微载体培养人二倍体细胞： [0012] 将步骤2)获得的细胞悬液接种至生物反应器，其中，所述生物反应器预先加入灭4 6 菌的新鲜细胞培养液以及微载体，所述接种细胞的终密度为5×10-2×10 个细胞/ml；然后在35-39℃、pH6.5-8.0、溶氧15％-100％的条件下，培养得到微载体单层细胞，细胞密度 6 达1×10 个细胞/ml以上； [0013] 4)病毒的接种、繁殖及收获。 [0014] 2.根据技术方案1所述的方法，其中，所述步骤3)中，所述接种细胞的终密度为5 6 1×10-1×10 个细胞/ml。 [0015] 3.根据上述技术方案所述的方法，其中，所述步骤3)中，在36-38℃、pH 6.8-7.8、6 溶氧20％-80％的条件下，培养得到微载体单层细胞，细胞密度达2×10 个细胞/ml以上。 [0016] 4.根据上述技术方案中任一项所述的方法，其中，步骤4)中所述病毒的接种、繁殖及收获的步骤如下进行： [0018] 密闭、无菌收获病毒。 [0019] 5.根据技术方案4所述的方法，其中，按病毒感染复数MOI为0.001-1的量接种病毒，培养温度为30-37℃、pH为7.0-7.8、溶氧为20％-80％。 [0020] 6.根据上述技术方案中任一项所述的方法，其中，步骤1)中所述复苏人二倍体细胞的步骤如下进行： [0021] 将从液氮中取出的冻存人二倍体细胞立即放入37℃水浴中解冻； [0022] 将所得解冻的冻存细胞液加入到新鲜细胞培养液中，轻轻混匀； [0023] 在800-1000rpm下重复离心2次，每次2-5分钟，弃上清液； [0024] 向细胞沉淀中加入新鲜细胞培养液，轻轻混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞生长液，在36-38℃下培养至细胞生长平铺瓶底。 [0025] 7.根据技术方案6所述的方法，其中，将从液氮中取出的冻存人二倍体细胞立即放入37℃水浴中解冻； [0026] 将1-2体积的冻存细胞液加入到5-10体积的新鲜细胞培养液中，轻轻混匀； [0027] 在800-1000rpm下重复离心2次，每次2-5分钟，弃上清液； [0028] 向细胞沉淀中加入5-10体积新鲜细胞培养液，轻轻混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞生长液至20-30体积，在36-38℃下培养至细胞生长平铺瓶底。 [0029] 8.根据上述技术方案中任一项所述的方法，其中，步骤2)中所述扩增培养并制备细胞悬液时所使用的容器为方瓶、滚瓶、旋转培养瓶、细胞工厂或生物反应器。 [0030] 9.根据上述技术方案中任一项所述的方法，步骤2)中所述扩增培养中细胞传代比例为1∶2-1∶4。 [0032] 11.根据权利要求1～10中任一项所述的方法，其中，所述微载体为Cytodex1和/或Cytodex3，微载体的量为3-25g/L。 [0033] 12.根据上述技术方案中任一项所述的方法，其中，所述步骤2)以流加或灌注方式小规模扩大培养人二倍体细胞。 [0034] 13.根据上述技术方案中任一项所述的方法，其中，所述步骤4)以流加或灌注方式培养接种病毒后的人二倍体细胞。 [0035] 14.根据上述技术方案中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括提前按照以下操作水化微载体以及对承载水化微载体的生物反应器灭菌的步骤： [0036] 将微载体与50-100mL/g的量的无Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室温下开始水化，其间每15min以50-200rpm的转速搅拌2-5分钟，水化4h或过夜后，停止搅拌，自然沉降，弃去上清，完成预处理； [0037] 加入30-50mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50-200rpm的转速搅拌2-5分钟，30min后停止搅拌，自然沉降，弃去上清液，完成洗涤；重复所述洗涤1-5次，弃去用于洗涤的上清液PBS； [0038] 加入30-50mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微载体； [0039] 然后将水化微载体置于反应器罐体；连接反应器各个管路，121℃高压湿热灭菌30min； [0040] 无菌排出无Ca2+和Mg2+的PBS液，加入无菌的新鲜细胞培养液，对灭菌后的水化微载体润洗一次，排出润洗液，再加入培养体积的无菌的新鲜细胞培养液。 [0041] 15.根据上述技术方案1-14中任一项所述的方法，其中，所述人二倍体细胞选自由MRC-5细胞系、WI-38细胞系、2BS细胞系和KMB-17细胞所组成的组中；所述病毒选自由风疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、水痘带状疱疹病毒、狂犬病病毒和乙型脑炎病毒所组成的组中。 [0042] 本发明提供的反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法，通过对以上各个步骤操作条件的严格控制，找到各个步骤操作条件的合理组合，不仅使得采用生物反应器培养人二倍体细胞大规模生产病毒疫苗成为可能，而且使得采用本发明方法生产的病毒疫苗产量高、一致性好，可以高效实现病毒疫苗的大规模工业化生产。附图说明 [0043] 图1显示了实施例5中120升反应器中悬浮培养MRC-5细胞的细胞生长曲线； [0044] 图2显示了实施例6中650升反应器中悬浮培养WI-38细胞的细胞生长曲线； [0045] 图3显示了实施例7中1200升反应器中悬浮培养2BS细胞的细胞生长曲线； [0046] 图4显示了实施例8中1200升反应器中悬浮培养KMB-17细胞的细胞生长曲线。 具体实施方式[0047] 本发明提供了一种生物反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法，其包括以下步骤： [0048] 1)复苏人二倍体细胞； [0049] 2)扩增培养人二倍体细胞并制备细胞悬液； [0050] 3)生物反应器微载体培养人二倍体细胞： [0051] 将步骤2)获得的细胞悬液接种至生物反应器，其中，所述生物反应器预先加入4 6 灭菌的新鲜细胞培养液以及微载体，所述接种细胞的终密度为5×10-2×10 个细胞/ml， 5 6 优选为1×10-1×10 个细胞/ml；然后在35-39℃、优选36-38℃，pH6.5-8.0、优选pH 6.8-7.8，溶氧15％-100％、优选溶氧20％-80％的条件下，培养得到微载体单层细胞，细胞 6 6 密度达1×10 个细胞/ml以上，优选达2×10 个细胞/ml以上； [0052] 4)病毒的接种、繁殖及收获。 [0053] 优选地，在上述本发明的方法中，上述步骤4)中所述病毒的接种、繁殖及收获的步骤如下进行： [0054] 将经步骤3)得到的细胞培养液更换为病毒维持液，按病毒感染复数MOI为0.0001-10、优选0.001-1的量接种病毒，在培养温度30-38℃、优选30-37℃，pH6.5-8.0、优选pH 7.0-7.8，溶氧15％-100％、优选20％-80％的条件下培养病毒；密闭、无菌收获病毒。 [0055] 优选地，在上述本发明的方法中，步骤1)中所述复苏人二倍体细胞的步骤如下进行：将从液氮中取出的冻存人二倍体细胞立即放入37℃水浴中解冻；将所得解冻的冻存细胞液加入到新鲜细胞培养液中，轻轻混匀；在800-1000rpm下重复离心2次，每次2-5分钟，弃上清液；向细胞沉淀中加入新鲜细胞培养液，轻轻混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞生长液，在36-38℃下培养至细胞生长平铺瓶底。 [0056] 更优选地，在上述本发明的方法中，步骤1)中所述复苏人二倍体细胞的步骤如下进行：将从液氮中取出的冻存人二倍体细胞立即放入37℃水浴中解冻；将1-2体积的冻存细胞液加入到5-10体积的新鲜细胞培养液中，轻轻混匀；在800-1000rpm下重复离心2次，每次2-5分钟，弃上清液；向细胞沉淀中加入5-10体积新鲜细胞培养液，轻轻混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞生长液至20-30体积，在36-38℃下培养至细胞生长平铺瓶底。 [0057] 在上述本发明的方法中，步骤2)中所述扩增培养并制备细胞悬液时所使用的容器可以是本领域中扩增培养细胞时常用的容器，例如可以为方瓶(T-flask)、转瓶(Roller)、旋转培养瓶(Spinner flask)、细胞工厂(Cell factory)或生物反应器(Bioreactor)。 [0058] 在上述本发明的方法中，步骤2)中所述扩增培养中细胞传代比例优选为1∶2-1∶4。步骤2)和步骤3)中所述微载体没有特别限定，可为所有能用于人二倍体细胞培养的常用微载体，很多微载体都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。优选所述微载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系列微载体和/或微载体，更优选所述微载体为Cytodex1和/或Cytodex3。微载体的量 优选为：Cytodex系列：3-25g/L；Cytopore系列：2-8g/L；Cytoline：100-300g/L；Disks： 10-40g/L，其中所述Cytodexl和/或Cytodex3微载体的量优选为3-25g/L。另外，本发明中所用细胞工厂为一种细胞培养装置，又名cell factories或cell stack，其材质多为组织培养级聚苯乙烯，有1层到40层的不同规格，具有低污染风险，节省空间、可全面实现细TM 胞培养自动化等优点，可商购获得，具体可以使用例如美国康宁公司的Cell Stack 细胞培TM 养室，赛默飞世尔科技有限公司的EasyFill 细胞工厂。 [0059] 在上述本发明的方法中，优选所述步骤2)以流加或灌注方式小规模扩大培养人二倍体细胞。 [0060] 在上述本发明的方法中，优选所述步骤4)以流加或灌注方式培养接种病毒后的人二倍体细胞。 [0061] 优选地，在上述本发明的方法中，所述方法还包括提前按照以下操作水化微载体以及对承载水化微载体的生物反应器灭菌的步骤： [0062] 将微载体与50-100mL/g的量的无Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室温下开始水化，其间每15min以50-200rpm的转速搅拌2-5分钟，水化4h或过夜后，停止搅拌，自然沉降，弃去上清，完成预处理； [0063] 加入30-50mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50-200rpm的转速搅拌2-5分钟，30min后停止搅拌，自然沉降，弃去上清液，完成洗涤；重复所述洗涤1-5次，弃去用于洗涤的上清液PBS； [0064] 加入30-50mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微载体； [0065] 然后将水化微载体置于反应器罐体；连接反应器各个管路，121℃高压湿热灭菌30min； [0066] 无菌排出无Ca2+和Mg2+的PBS液，加入无菌的新鲜细胞培养液，对灭菌后的水化微载体润洗一次，排出润洗液，再加入培养体积的无菌的新鲜细胞培养液。 [0067] 更具体地，本发明的上述反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法包括以下步骤： [0068] 1)复苏人二倍体细胞： [0069] 将从液氮中取出的冻存人二倍体细胞立即放入37℃水浴中解冻； [0070] 将1-2体积的冻存细胞液加入到5-10体积的新鲜细胞培养液中，优选将1.5体积的冻存细胞液加入到8体积的新鲜细胞培养液中，轻轻混匀； [0071] 在800-1000rpm下离心2-5分钟，优选在900rpm下离心3分钟，弃上清液； [0072] 向细胞沉淀中加入5-10体积新鲜细胞培养液，轻轻混匀； [0073] 在800-1000rpm下再次离心2-5分钟，优选在900rpm下再次离心2分钟，弃上清液； [0074] 向细胞沉淀中加入5-10体积，优选8体积，新鲜细胞培养液，轻轻混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞生长液至20-30体积，优选20体积，在36-38℃，优选36-37℃，更优选37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞生长平铺瓶底； [0075] 2)消化人二倍体细胞： [0076] 倾去培养瓶中培养基，加入胰酶消化液，优选加入培养体积的1/20-1/10含0.02％EDTA的胰酶消化液，在35-38℃下，优选在36-38℃下，更优选在37℃下，消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜细胞培养液后吹打，得到细胞悬液； [0077] 3)预培养人二倍体细胞： [0078] 将步骤2)获得的细胞悬液接种至转瓶，并向转瓶中加入新鲜细胞培养液使所述4 6 5 6 接种细胞的终密度为5×10-2×10 个细胞/ml，优选1×10-1×10 个细胞/ml，更优选 5 5 2×10-5×10 个细胞/ml，；然后在35-39℃、pH 6.5-8.0、转速5-15rph的条件下，优选在 36-38℃、pH 6.8-7.8、转速8-12rph的条件下，更优选在37℃、pH 7.0-7.8、转速10rph的条件下，培养直至形成贴壁单层细胞； [0079] 倾去转瓶中培养基，加入胰酶消化液，优选加入培养体积的1/20-1/10含0.02％EDTA的浓度为0.1％-0.5％的胰酶消化液，在35-38℃下，优选在36-38℃下，更优选在37℃下消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜细胞培养液后吹打，得到预培养的细胞悬液； [0080] 4)小规模扩大培养人二倍体细胞： [0081] 将步骤3)获得的细胞接种至容积为1-15L的小规模生物反应器，其中，所述小规模生物反应器预先加入30-80％容积的灭菌的新鲜细胞培养液以及3-25g/L，优选5-15g/4 6 5 6 L的微载体，所述接种细胞的终密度为5×10-5×10 个细胞/ml，优选1×10-1×10 个细 5 5 胞/ml，更优选2×10-5×10 个细胞/ml；然后在35-39℃、pH 6.5-8.0、溶氧15-100％、湿度90-98％、搅拌转速20-150rpm的条件下，优选在36-38℃、pH 6.8-7.8、溶氧20-80％、湿度90-98％、搅拌转速30-120rpm的条件下，更优选在37℃、pH 7.0-7.8、溶氧30-70％、湿度90-98％、搅拌转速40-80rpm的条件下培养； [0082] 5)制备经小规模扩大培养的人二倍体细胞悬液： [0083] 停止步骤4)所述小规模生物反应器的搅拌，使附着有细胞的微载体自然沉降，泵2+ 2+ 出上清培养液，用pH7.6的含有0.02％(w/v)EDTA的无Ca 、Mg 离子的PBS洗涤2-3遍，优选3遍，所述EDTA-PBS溶液总使用量为一个所述小规模生物反应器的容积； [0084] 然后加入恰可覆盖微载体的胰酶消化液，优选含0.02％EDTA的胰酶消化液，在温度35-38℃、pH 7.0-7.4并且转速20-80rpm下，消化10min-30min，优选在温度36-38℃、pH7.2-7.4并且转速30-70rpm下，消化15min-20min，更优选在温度37℃、pH 7.2-7.4并且转速50rpm下，消化17min； [0085] 消化后通过加入消化时工作体积的1-2倍，优选1.5倍的细胞培养液终止胰酶的消化作用，即得到微载体与细胞分离开来的混合液； [0086] 然后通过孔径大于人二倍体细胞小于微载体的对于动物细胞无毒性的筛网无菌过滤，得到细胞悬液； [0087] 6)大规模扩大培养人二倍体细胞： [0088] 将步骤4)获得的细胞悬液接种至容积在15L以上的大规模反应器，其中，所述大规模反应器预先加入30-80％容积，优选40-60％容积的灭菌的新鲜细胞培养液以及4 6 3-25g/L，优选5-15g/L的微载体，所述接种细胞的终密度为5×10-2×10 个细胞/ml，优选 5 6 5 5 1×10-1×10 个细胞/ml，更优选2×10-5×10 个细胞/ml；然后在35-39℃、pH 6.5-8.0、溶氧15-100％、湿度90-98％、搅拌转速20-150rpm的条件下，优选在36-38℃、pH 6.8-7.8、溶氧20-80％、湿度90-98％、搅拌转速30-120rpm的条件下，更优选在37℃、pH 7.0-7.8、溶氧30-70％、湿度90-98％、搅拌转速40-80rpm的条件下培养，得到微载体单层细胞，细胞 6 密度达到1×10 以上； [0089] 7)病毒的接种、繁殖及收获： [0090] 停止步骤6)所述大规模反应器的搅拌，使附着有细胞的微载体自然沉降，泵出上清培养液； [0091] 按病毒感染复数MOI为0.0001-10，优选0.001-1，更优选0.01-0.5，最优选为0.1的量接种病毒，即向细胞沉淀中加入含有病毒的病毒维持液； [0092] 然后在培养温度30-38℃、pH：6.5-8.0、溶氧15％-100％、湿度90-98％、搅拌转速20-150rpm条件下，优选在培养温度30-37℃、pH：7.0-7.8、溶氧20％-80％、湿度90-98％、搅拌转速30-120rpm条件下培养，更优选在培养温度31-36℃、pH：7.2-7.8、溶氧30-70％、湿度92-98％、搅拌转速40-80rpm条件下培养； [0093] 密闭、无菌收集上清病毒液； [0094] 8)病毒液的保存 [0095] 收获的病毒液检测计数，置-15℃～-20℃保存，优选置-20℃保存。 [0096] 优选地，所述方法还包括提前按照以下操作水化微载体以及对承载水化微载体的生物反应器灭菌的步骤： [0097] 将微载体与50-100mL/g的量的无Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室温下开始水化，其间每15min以50-200rpm的转速搅拌2-5分钟，水化4h或过夜后，停止搅拌，自然沉降，弃去上清，完成预处理； [0098] 加入30-50mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50-200rpm的转速搅拌2-5分钟，30min后停止搅拌，自然沉降，弃去上清液，完成洗涤；重复所述洗涤1-5次，弃去用于洗涤的上清液PBS； [0099] 加入30-50mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微载体； [0100] 然后将水化微载体置于反应器罐体；连接反应器各个管路，121℃高压湿热灭菌30min； [0101] 无菌排出无Ca2+和Mg2+的PBS液，加入无菌的新鲜细胞培养液，对灭菌后的水化微载体润洗一次，排出润洗液，再加入培养体积的无菌的新鲜细胞培养液。 [0102] 其中，步骤4)和步骤6)所述微载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系列微载体和/或 微载体，优选所述微载体为Cytodex1和/或Cytodex3。 [0103] 优选地，上述更具体的本发明的方法中，所述步骤4)以流加或灌注方式小规模扩大培养人二倍体细胞，并收集以所述流加或灌注方式获得的人二倍体细胞培养物进行所述步骤5)；所述步骤6)以流加或灌注方式大规模扩大培养人二倍体细胞，并收集以所述流加或灌注方式获得的人二倍体细胞培养物进行所述步骤7)。优选的流加或灌注的条件包括：首先在装有人二倍体细胞培养基的生物反应器中，接种105-106细胞/ml培养基的人二倍体细胞培养8-24h后，开始连续灌注培养，每天的灌注速率为0.5-3个培养体积的新鲜细胞培养基，随着细胞密度的提高，逐步提高灌注速率达每天1-4个培养体积，直到生物反应器中的活细胞密度达到接种密度的4-50倍。所述步骤7)以流加或灌注方式培养接种病毒后的人二倍体细胞。优选的流加或灌注的条件包括：优选地，步骤7)中采用灌注培养方式培养接种病毒后的人二倍体细胞。即在病毒感染人二倍体细胞一段时间后，比如6-18hr后，可以采用灌注的连续培养方式往生物反应器中添加病毒维持液，灌注速率达每天1-3个培养体积可以长时间维持上述步骤7)的培养条件，不断收获上清病毒液。一般可以持续2-5天，优选持续3天，连续收获上清病毒液。如图4所示，连续收获的病毒液都可以达到很高的病毒滴度，用本发明收获的病毒液制备的病毒疫苗都具有很高的效价。病毒的滴度、效价可以按《中华人民共和国药典》第2010年版三部中记载的方法进行检测。 [0104] 所述细胞流加培养是指在细胞培养过程中，向生物反应器中不断地添加少量新鲜的培养基。例如，在100升的生物反应器中，先仅加入45升培养基培养细胞，培养24小时后，连续少量添加新鲜的细胞培养基(例如1-10升/天)，最多可以加至80升。由于不断添加新鲜的培养基，不仅补充了细胞所需的营养，而且可以稀释代谢副产物，从而提高细胞培养密度和产物生产速率。细胞灌注培养是指在细胞培养过程中，往生物反应器中不断地添加新鲜培养基，同时通过细胞截留装置排出培养上清，而活细胞被继续截留在生物反应器中的一种培养操作方式。培养基的不断流出，可带走代谢副产物如乳酸、氨等，使其维持在低浓度水平，不会成为细胞生长的抑制因素，所以细胞可生长在良好培养环境中，能获得很高的细胞培养密度和产物生产速率。灌注培养具有反应器体积小，回收培养上清体积大，产品在罐内停留时间短，可及时回收产品至低温下保存，有利于保持产品活性等显著特点。 [0105] 本发明的所述方法可以适用于反应器微载体培养多种人二倍体细胞生产病毒疫苗。优选地，所述人二倍体细胞选自由MRC-5细胞系、WI-38细胞系、2BS细胞系和KMB-17细胞所组成的组中；所述病毒选自由风疹病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、甲型肝炎病毒、水痘带状疱疹病毒、狂犬病病毒和乙型脑炎病毒所组成的组中。 [0106] 所述细胞培养液及病毒维持液没有特别限定，可以使用所有能用于人二倍体细胞培养的常用细胞培养基，如基础MEM细胞培养基或改良型MEM细胞培养基。很多细胞培养基都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。如北京清大天一科技有限公司所生产的MD610细胞培养基等。 [0108] 所述收获的病毒液可能含有少量的人二倍体细胞碎片甚至人二倍体细胞，因此，优选所述步骤7)还包括将所述收获的病毒液在-15℃至-70℃下冻融1-2次后过滤细胞碎片。优选在-15℃至-20℃下冻融1-2次。所述过滤可以采用本领域常用的手段进行，比如使用300-400目的尼龙或不锈钢筛网。 [0109] 本发明收获的病毒液既可以用于制备病毒活疫苗，也可以用于制备病毒灭活疫苗。无论是活疫苗还是灭活疫苗，所述方法都包括将步骤7)所得的病毒液与免疫佐剂混合的步骤。所述免疫佐剂可以为本领域常用的各种例如氢氧化铝和油佐剂的免疫佐剂。在制备灭活病毒疫苗时，所述步骤7)所述收获的病毒液可以通过加入甲醛溶液灭活病毒，所述病毒液和甲醛溶液的混合物中甲醛最终浓度为0.01％至0.4％。优选所述步骤7)还包括中空纤维或超滤膜浓缩所述灭活的病毒液。 [0110] 在本发明的各种实施方式中，构成所用的培养基的化学试剂，原则上可以为所有能够用于培养所用的人二倍体细胞和病毒的培养基都可以使用。很多化学试剂都已经是商业化产品，可以通过商业途径获得。 [0111] 本发明的前述及其他特征将在下文中更全面进行描述并在权利要求中特别指出，以下说明书详细阐述本发明的一些示例实施方式，不过，这些实施方式只是表示本发明的原则可以被使用的几个不同的方式。参见下面优选的实施方式，本发明的其他优点和特征对于本领域技术人员来说是显而易见的。 [0112] 实施例 [0113] 实施例用于说明更具体的本发明的生物反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法。 [0114] 实施例1 [0115] 提前按照以下操作水化微载体以及对承载水化微载体的生物反应器灭菌： [0116] 将微载体与50mL/g的量的无Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室温下开始水化，其间每15min以50rpm的转速搅拌2分钟，水化过夜后，停止搅拌，自然沉降，弃去上清，完成预处理； [0117] 加入30mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以50rpm的转速搅拌2分钟，30min后停止搅拌，自然沉降，弃去上清液，完成洗涤；重复所述洗涤1次，弃去用于洗涤的上清液PBS； [0118] 加入30mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微载体； [0119] 然后将水化微载体置于反应器罐体；连接反应器各个管路，121℃高压湿热灭菌30min； [0120] 无菌排出无Ca2+和Mg2+的PBS液，加入无菌的新鲜细胞培养液，对灭菌后的水化微载体润洗2次，排出润洗液，再加入培养体积的无菌的新鲜细胞培养液。 [0121] 水化微载体以及对承载水化微载体的生物反应器灭菌后，进行以下操作。 [0122] 1)复苏MRC-5细胞(购自ATCC)： [0123] 将从液氮中取出的冻存MRC-5细胞立即放入37℃水浴中解冻； [0124] 将1ml的冻存细胞液加入到5ml的新鲜细胞培养液中，轻轻混匀； [0125] 在800rpm下离心2分钟，弃上清液； [0126] 向细胞沉淀中加入5ml新鲜细胞培养液，轻轻混匀； [0127] 在800rpm下再次离心2分钟，弃上清液； [0128] 向细胞沉淀中加入5ml新鲜细胞培养液，轻轻混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞生长液至20ml，在37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞生长平铺瓶底； [0129] 2)扩增培养MRC-5细胞： [0130] 倾去培养瓶中培养基，加入1ml的含0.02％EDTA胰酶消化液，在37℃下消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜细胞培养液后吹打，得到细胞悬液； [0131] 将上述步骤获得的细胞悬液接种至转瓶，并向转瓶中加入新鲜细胞培养液使所述5 接种细胞的终密度为1×10 个细胞/ml；然后在36℃、pH 7.0、转速5rph的条件下培养；以 1∶2的比例连续传代扩增培养，获得布满致密单层细胞的转瓶。 [0132] 倾去转瓶中培养基，加入1ml的含0.25％胰酶和0.02％EDTA胰酶消化液，在37℃下消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜细胞培养液后吹打，获得细胞悬液，混合转瓶中细胞悬液，得到接种生物反应器的细胞悬液； [0133] 3)生物反应器微载体大规模培养MRC-5细胞： [0134] 将步骤2)获得的细胞悬液接种至120L生物反应器中(工作体积100L)，细胞培养体积为80L。其中，预先水化微载体，并在位清洗、灭菌所述生物反应器，所述微载体为4 Cytodex3，微载体量为3g/L，所述接种细胞的终密度为5×10 个细胞/ml；然后在35℃、pH 6 6.5、溶氧15％的条件下，培养获得微载体单层细胞，细胞密度达1×10 个细胞/ml； [0135] 4)病毒的接种、繁殖及收获： [0136] 停止步骤3)所述大规模反应器的搅拌，使附着有细胞的微载体自然沉降，泵出上清培养液； [0137] 按病毒感染复数MOI为0.0001的量接种风疹病毒BRD II，即向细胞沉淀中加入含有病毒的病毒维持液； [0138] 然后在培养温度30℃、pH：6.5、溶氧15％下，连续灌注培养并收集上清病毒液，并按《中华人民共和国药典》第2010年版三部所记载的病毒滴定方法测定病毒滴度平均为6.25lgCCID50/ml。 [0139] 实施例2-4 [0140] 按照表1记载的条件，按照与实施例1相同的操作，进行了实施例2-4，得到上清病毒液。 [0141] 表1 [0142] [0143] 实施例5 [0144] 本实施例用于说明更具体的本发明的生物反应器微载体培养人二倍体细胞生产病毒疫苗的方法。 [0145] 1)复苏MRC-5细胞(购自ATCC)： [0146] 将从液氮中取出的冻存MRC-5细胞立即放入37℃水浴中解冻； [0147] 将1ml的冻存细胞液加入到5ml的新鲜细胞培养液中，轻轻混匀； [0148] 在800rpm下离心5分钟，弃上清液； [0149] 向细胞沉淀中加入5ml新鲜细胞培养液，轻轻混匀； [0150] 在800rpm下再次离心5分钟，弃上清液； [0151] 向细胞沉淀中加入5ml新鲜细胞培养液，轻轻混匀后，转移至培养瓶中，添加细胞生长液至20ml，在37℃，5％CO2培养箱中培养至细胞生长平铺瓶底； [0152] 2)消化MRC-5细胞： [0153] 倾去培养瓶中培养基，加入1ml含0.02％EDTA胰酶消化液，在37℃下消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜细胞培养液后吹打，得到细胞悬液； [0154] 3)预培养MRC-5细胞： [0155] 将步骤2)获得的细胞悬液接种至转瓶，并向转瓶中加入新鲜细胞培养液使所述5 接种细胞的终密度为2×10 个细胞/ml；然后在38℃、pH 6.8、转速12rph的条件下培养； [0156] 倾去转瓶中培养基，加入1ml的含0.02％EDTA细胞培养液的胰酶消化液，在37℃下消化至细胞附着松动、细胞边缘卷起且细胞间的间隔加大，倒去胰酶消化液，加入新鲜细胞培养液后吹打，得到预培养的细胞悬液； [0157] 4)小规模扩大培养MRC-5细胞： [0158] 将步骤3)获得的细胞接种至容积为5L的小规模生物反应器，其中，所述小规模生物反应器预先加入工作体积30％即3L的灭菌的新鲜细胞培养液以及8g/L的微载体，所述5 接种细胞的终密度为1×10 个细胞/ml；然后在36℃、pH 7.0、溶氧30％、湿度90％、搅拌转速20rpm的条件下培养； [0159] 5)制备经小规模扩大培养的MRC-5细胞悬液： [0160] 停止步骤4)所述小规模生物反应器的搅拌，使附着有细胞的微载体自然沉降，泵2+ 2+ 出上清培养液，用pH7.6的含有0.02％(w/v)EDTA的无Ca ，Mg 离子的PBS洗涤3遍，所述EDTA-PBS溶液总使用量为一个所述小规模生物反应器的容积； [0161] 然后加入恰可覆盖微载体的含0.25％胰酶和0.02％EDTA、以细胞培养液为溶剂的胰酶消化液，在温度35℃、pH7.0并且转速20rpm下，消化10min； [0162] 消化后通过加入消化时工作体积的1倍的细胞培养液终止胰酶的消化作用，即得到微载体与细胞分离开来的混合液； [0163] 然后通过孔径大于MRC-5细胞小于微载体的对于动物细胞无毒性的筛网无菌过滤，得到细胞悬液； [0164] 6)大规模扩大培养MRC-5细胞： [0165] 将步骤4)获得的细胞悬液接种至120L的生物反应器(工作体积100L)，其中，所述大规模反应器预先加入工作体积30％即30L的灭菌的新鲜细胞培养液以及3g/L的微5 载体，所述接种细胞的终密度为2×10 个细胞/ml；然后在36℃、pH 7.0、溶氧30％、湿度 6 90％、搅拌转速40rpm的条件下，培养2天，得到微载体单层细胞，细胞密度达2×10 个细胞/ml； [0166] 7)病毒的接种、繁殖及收获： [0167] 停止步骤6)所述大规模反应器的搅拌，使附着有细胞的微载体自然沉降，泵出上清培养液； [0168] 按病毒感染复数MOI为0.01的量接种风疹病毒BRD II，即向细胞沉淀中加入含有病毒的病毒维持液； [0169] 然后在培养温度36℃、pH：7.2、溶氧30％、湿度90％条件下培养； [0170] 密闭、无菌收集上清病毒液； [0171] 8)病毒液的保存 [0172] 收获的病毒液检测计数，置-15℃保存。按《中华人民共和国药典》第2010年版三部所记载的病毒滴定方法测定病毒滴度平均为6.75lgCCID50/ml。 [0173] 在上述步骤1～8之前，提前按照以下操作水化微载体以及对承载水化微载体的生物反应器灭菌的步骤： [0174] 将微载体与50mL/g的量的无Ca2+和Mg2+的PBS液混合，在室温下开始水化，其间每15min以100rpm的转速搅拌2分钟，水化过夜后，停止搅拌，自然沉降，弃去上清，完成预处理； [0175] 加入30mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，然后每15min以100rpm的转速搅拌2分钟，30min后停止搅拌，自然沉降，弃去上清液，完成洗涤；重复所述洗涤3次，弃去用于洗涤的上清液PBS； [0176] 加入30mL/g的量的新鲜无Ca2+和Mg2+的PBS液，得到水化的微载体； [0177] 然后将水化微载体置于反应器罐体；连接反应器各个管路，121℃高压湿热灭菌30min； [0178] 无菌排出无Ca2+和Mg2+的PBS液，加入无菌的新鲜细胞培养液，对灭菌后的水化微载体润洗一次，排出润洗液，再加入培养体积的无菌的新鲜细胞培养液。 [0179] 其中，步骤4)和步骤6)所述微载体为Cytodex3。 [0180] 优选地，所述步骤4)以流加或灌注方式(补充流加或灌注的条件)[0181] 培养8h后，开始连续灌注培养，每天的灌注速率为0.5个培养体积的新鲜细胞培养基，随着细胞密度的提高，逐步提高灌注速率达每天1个培养体积，直到生物反应器中的6 活细胞密度达到2×10 个细胞/ml。 [0182] 实施例6-8 [0183] 按照实施例1的方法培养WI-38细胞系、2BS细胞系和KMB-17(购自ATCC)，不同的条件见下表2。 [0184] 表2 [0185] [0186] 由实施例1-4可以看出，本发明的方法通过对以上各个步骤操作条件的严格控制，找到各个步骤操作条件的合理组合，不仅使得采用生物反应器培养人二倍体细胞大规模生产病毒疫苗成为可能，并且使得采用本发明方法生产的病毒疫苗产量高、一致性好，可以高效实现病毒疫苗的大规模工业化生产。 |
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