[0001] 相关申请的相互参照

[0002] 本专利申请要求于2006年1月31日递交的美国临时专利申请系列号60/763,783的权益。发明领域

[0003] 本发明涉及在药学或化妆品可接受载体中的将会刺激Na/K-ATP酶信号传导的Na-K-ATP酶配体的药物组合物。在一个实施方式中，所述组合物可以用于预防皮肤疾病的发展或治疗皮肤疾病。在另一个实施方式中，所述组合物可以用于抑制组织纤维化。我们同时也发现本发明对高血压的治疗和伤口闭合的治疗有益。

[0004] 发明背景

[0005] 化合物可以通过局部或全身施用来用作药剂。用于这一目的的制剂可以包括载体、保护剂、抗氧化剂(例如维生素C或E)以及其它药学和药理学试剂。同时也希望这些化合物可以在包括将化合物传递至靶区的分子识别的递药系统中使用(口服、局部应用、注射或植入)。在其它方法中，这些递药系统可以包括脂质体技术或免疫方法。天然的或合成的那些可以调节受体和大分子的产生或细胞作用的化学药物在例如皮肤病的反常的治疗中有用。

[0006] 在过去的几十多年中，为了鉴别和证实那些可以参与Na.sup.+、K.sup.+-ATP酶酶系统调节的因子的存在，众多研究者已经投入很大的精力去研究哺乳动物组织和体液的提取物。现在，已经提出大量的证据来支持这些内源性因子或因子家族的存在，它被认为可以抑制Na.sup.+，K.sup.+-ATP酶系统。此外，这些抑制特性暗示着所述因子参与数种生理学作用。然而，虽然这些早期研究者提出了多方面的数据，但是存在关于它们作用机理的很多争论，因此所述因子在生理学上很重要。

[0007] 发明简述

[0008] 本发明一般涉及利用某些化合物对一定疾病的控制。我们使用了药物组合物，其包括：药理有效量的在药学可接受载体中的至少一种将会刺激Na/K-ATP酶信号传导的Na-K-ATP酶配体。

[0009] 这一组合物诱导传导信号的Na-K-ATP酶与脂质、蛋白激酶、磷酸酶、离子通道、转运蛋白以及其它可溶性蛋白和膜蛋白的相互作用以形成各种被称为Na/K-ATP酶信号体的信号传导复合物。该方法维持了正常的皮肤结构和功能。因此，向患者给予有效剂量的本发明的药物组合物来预防和治疗需要所述预防和治疗的患者的皮肤疾病及其发展。该方法包括通过局部给予或注射给予药物组合物来增强皮肤成纤维细胞胶原的生成以与预防或逆转老化相关的皮肤张力(tone)丧失的步骤。该方法同样也可以包括将药物组合物用作对伤口闭合的局部或全身增强作用的步骤。

[0010] 我们已经证明了Na/K-ATP酶与不同脂质和蛋白质的相互作用。这些相互作用导致构成Na/K-ATP酶信号体的多功能复合物的形成。Na/K-ATP酶可以不依赖于其泵功能来调节许多重要的细胞功能和传导CTS信号的认识已经促使我们确定Na/K-ATP酶信号体的分子组成和该信号体行使功能的分子机制。这些研究已经给我们提供了几个新的对分子功能进行分子介入的靶点，从而有新的治疗方法和诊断方法。在一个实施方式中，我们公开了那些与预防或逆转老化相关的皮肤张力丧失以及加速伤口愈合的应用的其中之一。

[0011] 我们发现了强心类固醇、海蟾蜍毒素(MBG)的高循环水平和由肾部分切除术(PNx)诱导的实验性肾衰竭中的心肌纤维化之间的关系。简而言之，我们观察到PNx动物有实质性的心肌纤维化。同时也可以通过给予MBG来诱导这一纤维化而达到相类似的血中浓度。可以通过在PNx手术前对进行动物针对MBG的免疫来减弱这一纤维化。典型的免疫组织化学影象被显示如下，用以举例说明。

[0012] 本发明的其它目的和优点对于本领域技术人员来说，在回顾下面优选实施方式的详述和相应附图后将会变得显而易见。

[0013] 附图简述

[0014] 图1表示Na/K-ATP酶信号体的作用途径；

[0015] 图2表示海蟾蜍毒素(MBG)对收缩压的作用；

[0016] 图3表示MBG在心脏、肾脏和肝纤维化中的作用；

[0017] 图4表示MBG加速伤口愈合的作用；

[0018] 图5(a)和图5(b)表示MBG在溶胶原蛋白表达中的作用；

[0019] 图6(a)表示dP/dt数据；

[0020] 图6(b)表示dP/dt数据；

[0021] 图6(c)表示LVEDP数据；

[0022] 图6(d)表示MSEC数据；

[0023] 图7(a)表示HW/BW数据；

[0024] 图7(b)表示用蛋白质斑迹法(Western blot所展示的溶胶原蛋白表达；

[0025] 图7(c)表示用蛋白质印迹所展示的溶胶原蛋白表达；

[0026] 图7(d)表示用蛋白质印迹所展示的溶胶原蛋白表达；

[0027] 图7(e)表示用蛋白质印迹所展示的溶胶原蛋白表达；

[0028] 图7(f)表示用蛋白质印迹所展示的Na/K-ATP酶表达；

[0029] 图7(g)表示用蛋白质印迹所展示的SERCA表达；

[0030] 图7(h)表示用蛋白质印迹所展示的SERCA表达；

[0031] 图8(a)表示纤维化积分数据；

[0032] 图8(b)表示纤维化数据；

[0033] 图8(c)表示纤连蛋白表达的数据。

[0034] 发明详述

[0035] 在一个实施方式中，所述组合物诱导各种被称为Na/K-ATP酶信号体的信号传导复合物的形成。在另一个实施方式中，所述药物组合物是在药学可接受载体中的药学有效量的至少一种Na/K-ATP酶信号传导的抑制剂。该组合物作为通过Na/K-ATP酶信号转导的抑制剂来行使功能。优选地，对需要所述治疗的患者的皮肤病的治疗包括向患者给予治疗有效量的所述药物组合物的步骤。

[0036] 更特别地，所述治疗包括将该药物组合物用作局部或注射给药工具以逆转或预防过度的皮肤疤痕形成。在另一个实施方式中，所述治疗是抑制需要所述治疗的患者的心肌纤维化，该治疗包括向所述患者给予治疗有效量的药物组合物的步骤。该药物组合物可以是选自片剂、丸剂、混悬液片剂、粉剂、锭剂、囊剂、扁胶囊、酏剂、悬浮剂、乳液、溶液、糖浆、气雾剂、油膏、软胶囊、和硬胶囊、栓剂、霜剂、洗剂、溶液、凝胶和糊剂的剂型。

[0037] Na/K-ATP酶配体包括但不限于一般被称为强心类固醇的一组化合物(例如卡烯内酯和蟾二烯羟酸内酯)，它们来自植物或动物或是半合成的。抑制剂包括但不限于那些中断Na/K-ATP酶同它的信号传导偶配体如EGF受体、Src激酶和小窝蛋白-1的相互作用的物质。需要治疗的受试者可以包括(但不限于)那些有系统性纤维化病症例如硬皮病以及那些有局部性纤维化病症例如肝硬化的患者，其是由于病毒或酒精性肝炎、同肾脏疾病和/或动脉粥样硬化有关的进行性心力衰竭以及来自于肾小球肾炎(glomerlonephritis)、糖尿病和高血压的进行性肾脏疾病所引起的。

[0038] Na/K-ATP酶属于P-型ATP酶家族，它对于生物将ATP转化为横跨细胞膜的电和化学梯度是必要的。Na/K-ATP酶在几乎所有的哺乳动物细胞中都有表达并且用通过水解ATP产生的能量来泵送Na+和K+穿越细胞膜。在最近的几年内，我们的实验室已经获得Na/K-ATP酶也可以作为重要的细胞信号传导蛋白来行使功能的证据。我们现在提出至少有两个分离的Na/K-ATP酶的库，其中一库作为离子泵行使功能而另外一库参与同脂质、蛋白激酶、磷酸酶、离子通道、转运蛋白以及其它可溶性蛋白和膜蛋白的相互作用以形成各种被称为Na/K-ATP酶信号体的信号传导复合物。

[0039] 图1是描述钠泵在心肌细胞中信号传导的示意图。在强心类固醇的存在条件下，Na/K-ATP酶变为信号转导蛋白，该蛋白同Src和表皮生长因子受体相络合。开始一个信号级联，它依赖于Ras并导致活性氧物质(ROS)的产生和ERK的活化。这随后导致改变的基因表达，包括SERCA表达的减少以及钙循环的变化。

[0040] 图2显示MBG产生了与心脏肥大相一致的功能和解剖学的变化。(a)在假手术(假的，n＝8)、肾部分切除术(PNx，n＝8)、MBG输注(MBG，n＝10)或肾部分切除术前针对MBG进行免疫(PNx-IM，n＝8)4周后的收缩压。(b)4组大鼠典型的超声心电图，(c)后壁厚度，(d)左心室舒张末期的直径，(e)收缩末期左室内径，和(f)假的(n＝8)、PNx(n＝10)、MBG(n＝9)、或PNx-IM(n＝16)4周后的FS值。*P＜0.05对PNx；##P＜0.01对PNx。

[0041] 图3显示MBG在心脏、肾脏和肝脏纤维化中的作用。

[0042] 图4显示MBG加速伤口愈合的作用；

[0043] 图5(a)和图5(b)显示MBG在溶胶原蛋白表达中的作用；

[0044] 图6(a)、(b)、(c)和(d)MBG引起与舒张期功能障碍相一致的血液动力学变化。(a)最大的血压变化率(+dP/dt)，(b)+dP/dt与最小的血压变化率(也就是最大的负血压变化率，-dP/dt)的比，(c)左心室舒张末期的血压(LVEDP)，和(d)假手术(假的，n＝14)，肾部分切除术(PNx，n＝15)，MBG输注(MBG，n＝12)，或肾部分切除术前对MBG进行免疫(PNx-IM，n＝14)4周后等容弛缓的时间常数。*P＜0.05对假的；**P＜0.01对假的；#P＜0.05对PNx；##P＜0.01对PNx。

[0045] 图7(a)到(h)MBG引起的与实验性尿毒症相一致的心脏形态和蛋白表达变化。(a)假手术(假的，n＝18)、肾部分切除术(PNx，n＝20)、MBG输注(MBG，n＝20)或肾部分切除术前针对MBG进行免疫(PNx-IM，n＝18)4周后心脏重量/身体重量(HW/BW)比。(b)假的(n＝15)、PNx(n＝14)、MBG(n＝7)或PNx-IM(n＝7)4周后在左心室组织匀浆中的胞外信号相关激酶(ERK-1，p44)活化。将50-μg左心室组织匀浆蛋白加载于凝胶中。公开了典型的活性和所有ERK印迹。(c)假的(n＝15)、PNx(n＝13)、MBG(n＝10)或PNx-IM(n＝418
6)4周后在左心室组织匀浆中的Src(Src pY )活化。将75-μg左心室组织匀浆蛋白加载于凝胶中。公开了典型的活性和所有Src印迹。(d)骨骼肌肌动蛋白(skACT)，(e)Na/K-ATP酶a1，(f)Na/K-ATP酶a2，和(g)假的(n＝15)，PNx(n＝13)，MBG(n＝10)，或PNx-IM(n＝6)4周后的SERCA2a表达。将20μg左心室组织匀浆蛋白加载于用于d到g的凝胶中。
(h)假的(n＝8)，PNx(n＝6)，MBG(n＝8)，或PNx-IM(n＝8)4周后的左心室组织匀浆中的SERCA2a酶活性。关于蛋白质印迹的条形图概述了该印迹的密度测定。**P＜0.01对假的；*P＜0.05对假的；#P＜0.05对PNx；##P＜0.01对PNx。

[0046] 图8(a)和(b)表示MBG引起心肌纤维化。(a)假手术(假的)，肾部分切除术(PNx)，MBG输注(MBG)，或肾部分切除术前对MBG进行免疫(PNx-IM)4周后左心室组织典型的Masson三色法染色切片。(b)半定量等级和(c)假的(n＝8)，PNx(n＝10)，MBG(n＝10)，或PNx-IM(n＝10)4周后关于三色染色的左心室切片载片的定量形态测定的纤维化积分。(d)来自假的(n＝9)，PNx(n＝9)的纤连蛋白表达和定量数据。将50μg左心室匀浆组织蛋白加载于凝胶中。*P＜0.05，**P＜0.01对假的，#P＜0.05，##P＜0.01对PNx。

[0047] 强心类固醇(CTS)包括来自于植物的洋地黄药物如地高辛和G毒毛旋花，以及来自于脊椎动物的苷原如布阿林和海蟾蜍毒素。虽然CTS自它们被发现以来就仅仅被认为是药品，但是最近的研究已经将G毒毛旋花和海蟾蜍毒素鉴定为内源性类固醇，它们的产生和分泌被包括促肾上腺皮质激素(ACTH)和血管紧张素II在内的多种病理学或生理学刺激物所调节。G毒毛旋花和海蟾蜍毒素对于血压的作用现在已经被证明。此外，我们和其他人也已经证明了低剂量的这些类固醇不但引起大鼠的高血压，而且引起不依赖于心血管对高血压作用的显著心血管重塑。此外，这些类固醇调节细胞生长和包括胶原的细胞外基质蛋白的细胞生产。

[0048] 已经确定CTS是Na/K-ATP酶的特异性配体和抑制剂。早先的研究已经表明CTS调节基因表达和细胞生长。来自我们实验室的最近工作已经在Na/K-ATP酶介导的信号传导和CTS-诱发的细胞功能变化之间建立了联系，这表明Na/K-ATP酶可以通过不依赖于胞内Na+和K+浓度变化的机制来传导胞外CTS信号。该传递信号的Na/K-ATP酶存在于细胞膜穴样凹陷中并且与酪氨酸激酶Src形成受体复合物。CTS如G毒毛旋花表现为激动剂并且刺激受体，导致与传导信号的Na/K-ATP酶/Src复合物有关或相近似的蛋白酪氨酸磷酸化。随后，反式作用于受体酪氨酸激酶比如EGFR并开始蛋白激酶级联途径。该已鉴定的途径包括P13K、Ras/Raf/ERKs和PLC/PKC同工酶的活化。它也增加了活性氧物质(ROS)的线粒体生产。与其它复合物类似，CTS引起的该复合物活化诱发该活性复合物的细胞内吞作用，因此终止了该活性复合物或将其靶向于特定的胞内层。与一些受体酪氨酸激酶(RTKs)不同，传导信号的Na/K-ATP酶也能作为支架行使功能，能够与其它膜转运蛋白和通道(图1)相互作用。例如，我们已经证明了传导信号的Na/K-ATP酶的骨架和激酶调控能力使得G
2+
毒毛旋花在培养的LLC-PK1细胞系中诱导Ca 瞬变成为可能。

[0049] 对大鼠进行假手术(假的)，实验性肾衰竭(PNx)，通过微泵的MBG补充给药(MBG)，并且在PNx外科手术前针对MBG对大鼠进行免疫，再对获得自这些大鼠的心脏组织进行免疫组织化学研究。我们注意到了蛋白的存在(前胶原在板左侧，平滑肌肌动蛋白在板右侧)(未给出)。获得波形蛋白或纤连蛋白的类似图片。蛋白质印迹数据证实了上述的视觉趋向(数据未给出)。

[0050] 基于这些数据，我们然后选择去检查MBG对细胞培养系统中的成纤维细胞(fribroblasts)是否有直接作用。下列数据说明了我们迄今为止的发现。

[0051] 前胶原表达作为MBG浓缩物的一个功能。顶部为蛋白质印迹，底部为10个实验的均值+/-SEM。**p＜0.01相对于对照组，经由成心肌纤维细胞将脯氨酸掺入进胶原，该过程以剂量依赖的方法被MBG所诱导。数据表示为6个实验的均值+/-SEM，**p＜0.01相对于对照组(1中的水平条)。

[0052] 我们然后检查皮肤成纤维细胞系是否有同样的反应。该实验是用Bashar Kahaleh博士友情提供的皮肤成纤维细胞完成的。如下所示，使用这些在培养物中培育的人类细胞，我们注意到皮肤成纤维细胞对MBG有显著的反应。通过与最大剂量的作为纤维化“经典的”刺激物TGFβ相比来说明该反应的强度(见下文)。此外，我们观察到永生成纤维细胞系对MBG、G毒毛旋花和地高辛有相类似的反应。

[0053] 皮肤成纤维细胞对MBG的反应与对TGFβ的反应相比较。注意到用5或10nM的MBG时在MBG中胶原表达增加了大约10倍。使用蛋白质印迹证明了G毒毛旋花、MBG和地高辛对成纤维细胞系中前胶原表达相当的影响。

[0054] 概括这些数据，我们观察到例如MBG的强心类固醇极大地增加了前胶原表达。在另外一些没有在此展示的研究中，我们观察到这些通过Na/K-ATP酶的信号传导对于促纤维化作用显得必不可少。而且，我们观察到通过ROS清除、Src抑制或EGFR转录激活的预防的级联途径引起的信号传导的拮抗作用预防了对胶原合成的诱导作用。

[0055] 由MBG所诱导的前胶原表达可以被Src抑制作用(PP2)、非特异酪氨酸激酶抑制作用(除莠霉素)或EGFR转录激活预防作用(AG178)所减弱。顶部为典型的蛋白质印迹，底部为6个实验的平均值+/-SEM。**p＜0.01相对于对照组。MBG增加了通过脯氨酸掺入法所测定的胶原合成。然而，N-乙酰半胱氨酸(NAC)和PP2预防了该作用。

[0056] 然后，我们检查伤口愈合是否可以被强心类固醇有利地影响。我们培育了大鼠成纤维细胞系，让该SYF+Src细胞系进行融合并用吸管端划出一条横行无细胞刮除带的划痕。我们在该体外划痕模型中观察到用MBG的12小时预处理极大地加速了该实验性损伤的闭合(参见下面)。

[0057] 划痕实验3、7和12小时后来自成纤维细胞的代表性影象。来自成纤维细胞培养的定量伤口闭合。数据代表N＝6的独立实验，它们各自包括在每个时间点的3次测定。数据表示平均值+/-SEM，**＜0.01。我们提出通过局部或注射给予强心类固醇来增强皮肤成纤维细胞胶原的生成，并预防或逆转与老化相关的皮肤张力丧失。

[0058] 我们同时也提出开发局部或全身的对皮肤闭合的增强作用。

[0059] 最后，我们提出发展局部或注射工具通过拮抗这一过程来逆转或预防过度的皮肤瘢痕形成(例如瘢痕疙瘩)。

[0060] 在另一个实施方式中，我们最近已经观察到大鼠体内的实验性肾衰与强心类固醇、海蟾蜍毒素(MBG)循环浓度增加和实质性心肌纤维化相关联。我们完成如下研究去检查MBG是否可直接刺激心成纤维细胞的胶原生成。通过使用实验性肾衰竭(PNx)、MBG输注(MBG)、对MBG进行免疫后的PNx和并发的PNx和肾上腺切除术的5/6肾切除的模型，进行了体内试验。完成了使用Millar导管和免疫组织化学方法的生理学测量。在体外试验中随后使用培养隔离的成心肌纤维细胞。我们观察到PNx和MBG提高了MBG水平、血压、心脏尺寸，削弱舒展期功能，并引起心肌纤维化。对MBG进行免疫后的PNx和并发性PNx以及肾上腺切除术如同PNx相类似的血压水平，但是较少有心脏肥大、舒张期功能障碍和心肌纤维化。MBG于1nM的浓度诱导培养的成心肌纤维细胞的前胶原-1表达增加。这些前胶原的增加与胶原翻译和前胶原-1的mRNA增加相关联，而没有任何前胶原-1蛋白稳定性的可证明的增加。用MBG对成纤维细胞的刺激可以通过给予酪氨酸磷酸化、Src活化、表皮生长因子受体转录激活的抑制剂和N-乙酰半胱氨酸来预防。基于这些发现，我们提出MBG直接诱导成纤维细胞中胶原表达的增加，并且我们提出从试验性肾衰中可以看到该作用可能在心肌纤维化中十分重要。

[0061] 我们先前已经证明了通过Na/K-ATP酶传导信号的强心类固醇海蟾蜍毒素(MBG)对大鼠内的肾部分切除术(PNx)诱导的许多试验性尿毒症特征有直接的责任。具体地，我们注意到所有接受过PNx以及通过微泵补充给予MBG的大鼠在4周后发生显著的心脏肥厚和纤维化，然而对MBG进行免疫随后接受PNx的大鼠的这些变化减弱。从这些数据，我们形成了这样的假设：MBG可能直接诱导成心肌纤维细胞生成胶原，因此从实验性肾衰中看到许多心肌纤维化的产生。为了检验该假说并测定它所发生的分子基础，进行了如下试验。实施例

[0062] 方法

[0063] 动物

[0064] 将雄性斯普拉-道来(-Sprague-Dawley)大鼠用于所述的所有研究。所有在本文中描述的动物试验操作同国立卫生研究院有关照料和使用试验动物的指南相一致，使用Medical University of Ohio Institutional Animal Use and Care Committee所认可的实验协议。

[0065] 试验组

[0066] 简而言之，在手术时让称重≈250g的Sprague-Dawley大鼠接受没有MBG输注的假手术(假的)、配置一个微泵以每天10μg/kg剂量给予MBG的假手术(MBG)、PNx、和对MBG免疫后的PNx(PNx-IM)中任一手术。非常高纯度的MBG(＞99％)被Kennedy等人从海蟾蜍的毒液中分离获得。除了这些操作以外，一组PNx动物也接受了肾上腺切除术(PNx-ADx)。

[0067] 在手术4周后评定体重规格化的心脏重量、左心室心脏血流动力学(如T值，下腔静脉闭塞产生的舒展末期血压同舒展末期容积拟合的回归线斜率，所有都是用Millar导管测定)、血浆浓度[MBG](如前所述，使用DELPHIA的C-18柱提取后来测定)、醛甾酮(用Cayman Chemical公司的ELISA试剂盒10004377进行测量)和心脏的免疫组织化学(vida infra)。

[0068] 分离的成心肌纤维细胞

[0069] 用Brilla等人先前所描述的并经过修改的方法完成成年大鼠的成心肌纤维细胞制备。

[0070] 蛋白质印迹分析

[0071] 如前所述，对分离自组织匀浆、细胞培养全细胞溶胞产物或核提取物的蛋白进行蛋白质印迹分析。

[0072] 胶原合成

[0073] 用经过修改的Nishida等人的方法测定胶原合成率。

[0074] 胶原-1的mRNA的定量测定

[0075] 如先前报道的方法，利用用作持家基因的GAPDH转录物使用标准化的逆转录PCR技术(RT-PCR)测量基因的表达。

[0076] 结果

[0077] 实验性肾衰和MBG对血压、心脏血流动力学和纤维化的作用

[0078] 在最近的体内试验中，我们观察到PNx-和MBG-处理的大鼠同假手术对照组大鼠相比，MBG水平得到提高。我们也看到PNx和MBG大鼠比对照组大鼠有更高的收缩压，并且如同PNx中看到的，PNx-IM大鼠具有统计学上相类似的收缩压值。使用Millar压力/容积传感器导管而不是我们先前报告中的超声心动图，我们观察到同假手术对照组大鼠相比，PNx诱导收缩期末容积和舒展期末容积减小，以及射血分数的增加。同PNx相比，PNx-IM中的收缩期末容积和舒展末期容积扩大，并且射血因素值降低。同假手术对照组大鼠相比，发现测得的主动放松被PNx和MBG所削弱，并且PNx-IM比PNx示更低值。使用在腔静脉闭塞期间产生的压力-容量环，我们注意到同对照组大鼠相比，PNx-和MBG-处理过的动物的舒展末期血压容积相关性(一种被动顺应性的逆测量)增加，然而PNx大鼠同PNx组相比具有更低的舒展末期压容积相关性。同假手术对照组大鼠相比，所有PNx和MBG治疗增加了心脏重量/体重比，然而PNx-IM动物比PNx有更低的值。检查三色染色法图象测定的心室肌细胞横断面积，我们注意到PNx和MBG输注都诱导了显著的增大，然而PNx-IM中的肌细胞横断面积比单独用PNx所看到的横断面积有相当大的缩小。

[0079] PNx、MBG和PNx-IM对血流动力学和MBG血浆浓度的影响。

[0080]

[0081] 4周后对假手术(假的，n＝20)、肾部分切除术(PNx，n＝20)、MBG输注(MBG，n＝20)或在肾部分切除术前针对MBG的免疫作用(PNx-IM，n＝8)进行分析，结果以平均值±SEM报告。

[0082] 分析该免疫组织化学结果，来自接受了MBG和PNx的大鼠心脏组织的胶原-1和染色的平滑肌肌动蛋白表现出显著的增加。对MBG的免疫削弱了这些增加。蛋白质印迹分析确证了同假实验对照组的大鼠比较可以看到PNx和MBG有2到2.5倍的前胶原-1和平滑肌肌动蛋白的表达，然而PNx-IM前胶原-1和平滑肌肌动蛋白的表达大体上少于对于PNx所看到的。

[0083] 为了确定纤维化作用所潜在的分子机制，我们检查了几种在纤维形成活化作用中重要的蛋白的表达。具体地，我们检查了转化生长因子(TGF)-β、Smad2/3、和Smad 4、以及pSmad 2/3的组织水平。我们并未发现这些实验组在心脏表达这些蛋白方面有显著性差异。

[0084] 一个独立组的动物(N＝11)也接受PNx-ADx，该实验中糖皮质激素和醛固酮进行生理学的替代。与PNx相比，这些动物发展为相类似的高血压水平，但是我们注意到它们有非常低的MBG血浆浓度和醛固酮水平，以及同单独使用PNx比较大体上更低的心脏重量体重比(表格)。此外，基于对胶原-1或平滑肌肌动蛋白的三色法染色或免疫组织化学染色，这些接受PNx-ADx的动物几乎没有关于心肌纤维化的证据。

[0085] 强心类固醇对成纤维细胞胶原表达的作用

[0086] 为了进一步检查所述心肌纤维化的分子基础，让分离出来的成心肌纤维细胞接受-10 -9 -8 -9 -8加大剂量的MBG(10 、10 和10 M)。使其接触10 和10 M的MBG 24小时后，通过蛋白质印迹检测到前胶原内含物增加≈2倍(两者都为P＜0.01；图3a)。这种现象并不是MGB特有，其它强心类固醇也诱导相类似的前胶原内含物增加(图3b)。有意思的是，MBG作用-10 -9
的阈值似乎是在10 和10 之间，然而对于在尿毒症大鼠中以相似浓度循环的G毒毛旋花，该阈值大约比MBG高10倍(即，在10-9和10-8M之间)。对于MBG和G毒毛旋花，诱导胶
86
原表达的阈值低于必须剂量的对数单位，该剂量对这些细胞中 Rb摄取可检测作用是必需-9 -8
的。在检测放射标记的脯氨酸掺入胶原中的平行试验中，我们观察到10 和10 M的MBG诱导了脯氨酸掺入总蛋白的显著增加，在基质和上清液中都有。利用胶原酶消化作用，我们观察到绝大多数的脯氨酸掺入胶原。使用标准化的逆转录PCR技术，我们观察到作为对10nM的MBG的响应，胶原-1的mRNA在24小时内倍增。然而，我们并未发现任何前胶原稳定性的提高(在接触放线菌酮后经检查前胶原-1的表达来确定)来作为对MBG这一浓度的响应。

[0087] Na/K-ATP酶信号传导的抑制对MBG-激发的胶原表达的作用

[0088] 为了检查强心类固醇是否经通Na/K-ATP酶的信号传导来诱导胶原合成，我们进行了下述研究。首先，我们在Na/K-ATP酶级联途径的几个步骤中使用药理性拮抗作用。具体地，我们利用PP2对Src激活作用的药理性拮抗作用、除莠霉素的非特异性酪氨酸激酶抑制作用、AG1478对EGFR转录激活的抑制作用和N-乙酰半胱氨酸的非特异性抗氧化剂的施用。这些操作各自预防了胶原合成的MBG激发作用，为了确证这些数据，我们也检查了在PP2或N-乙酰半胱氨酸存在或不存在时放射标记的脯氨酸掺入对MBG的反应。作为前胶原表达的实例，PP2和N-乙酰半胱氨酸都预防脯氨酸在成纤维细胞培养初期掺入胶原的增加。然后，我们完成了SYF和SYF+细胞中的试验(详情可以在在线补充内容中获得)。在成心肌纤维细胞培养初期关于前胶原的表达上调，SYF+细胞以十分类似的方式对MBG和G毒毛旋花进行应答，然而SYF细胞对MBG或G毒毛旋花基本上没有反应。

[0089] TGF-β和MBG-激发的胶原生产之间的关系

[0090] 为了进一步检查强心类固醇在成纤维细胞中诱导胶原产生的分子机制，我们检查了MBG对TGF-β表达以及Smad2/3、Smad4和pSmad2/3表达的作用。作为早先描述的体内试验实例，我们没有观察到TGF-β、Smad 2/3、Smad 4或pSmad2/3在体外表达的显著变化。然后，我们检查了TGF-β是否诱导胶原生成以及TGF-β和MBG之间是否有协同作用。在原代培养的细胞中，我们看到TGF-β(5ng/mL)对前胶原表达的作用类似于在强心类固醇中观察到的作用；然而，我们没有注意到任何TGF-β(5ng/mL)和MBG(10nM)之间的协同作用。然而，需要重点指出的是，我们没有对原代培养物进行完全的血清饥饿，并且因为血清始终存在，一些TGF-β始终存在。

[0091] 为了对其进行进一步的探寻，我们也检查了TGF-β受体拮抗剂SB431542对MBG激发的胶原生成的作用。有意思的是，SB431542在100-μmol/L浓度时没有引起在我们的蛋白质印迹基线以下的前胶原表达，但减少放射标记的脯氨酸掺入低于用对照组细胞所看到的情况。SB431542完全阻断了TGF-β和MBG(10nM)激发的胶原表达和放射标记的脯氨酸掺入。

[0092] 心肌纤维化是许多心脏疾病的重要组成部分，并且它正是尿毒症的心肌病的特征部分。我们团队以及其他人已经观察到MBG和其它强心类固醇通过存在于细胞膜穴样凹陷的质膜Na/K-ATP酶诱导的信号转导级联，导致Src的激活、EGFR的转录激活、活性氧物质的产生，并且最终引起p42/44有丝分裂素-活化的蛋白激酶的活化。有趣的是，许多同心肌纤维化相关的除肾衰竭之外的临床表现与随着提高的强心类固醇循环浓度相关联(例如，高血压、原发性醛固酮过多症、和充血性心力衰竭)。虽然初步讨论了我们的发现同除肾衰竭之外的心肌疾病之间可能的关系，我们需要指出的是Ferrandi等人已经观察到内源性强心类固醇同PST 2238的拮抗作用改善了Milan高血压大鼠中的高血压以及心脏肥大。

[0093] 在最近的研究中，我们确证了PNx和MBG的治疗在血液动力学和心脏形态学方面诱导了相似但是并不相同的表型改变。很有可能的是除MBG之外的一些因子对在PNx中看到的表型改变有促成作用。也就是说，减少MBG循环的PNx-IM和PNx-ADx大体上都减少了心脏功能和形态学改变而对血压并没有显著影响。我们需要指出的是，在PNx-ADx模型中进行该实验是因为我们判断由于在培养基中的肾上腺细胞生长产生MBG，很有可能该过程可以降低所述激素的循环水平。然而，我们在PNx-ADx动物中的数据支持肾上腺是MBG体内生成的主要(但不是唯一)位点的这一概念，在肾上腺中生成的其它激素可能调节MBG在别处的生成。需要进一步的工作来准确阐明在正常和病理学的条件下MBG于何处产生。

[0094] 因为这些涉及MBG在心肌纤维化发病机理中作用的发现，我们对纤维化所潜在的分子机理特别感兴趣。有意思的是，增加TGF-β或通过Smad蛋白的信号传导的证据并不明显。我们强调的是这些数据并不排除TGF-β在这些过程中的作用，因为这些蛋白的初期增加、Smads易位和/或通过该途径(Vida infra)传导信号的允许作用肯定是存在的。

[0095] 基于这些体内试验的数据，我们继续对分离出来的成心肌纤维细胞进行研究。我们观察到MBG于生理学浓度直接刺激成纤维细胞产生更多的胶原。尽管在欠缺MBG比欠缺G毒毛旋花苷更甚之前阈浓度似乎是≈1对数单位，采用其它强心类固醇中也观察到了所述胶原生成的增加。我们强调的是，激发胶原表达所必需的MBG和G毒毛旋花这两个物质的浓度比可感知地抑制Rb摄取所需要的它们的浓度要低。关于依赖于通Na/K-ATP酶传导信号的现象的进一步证据为活性氧物质清除、拮抗作用、或Src的敲除以及EGFR转录激活的预防作用防止了所述的增加，这些是我们先前已经证明过的通过Na/K-ATP酶信号体阻断信号转导的策略。我们也观察到胶原生成的增加与脯氨酸掺入的增加以及胶原-1的mRNA的增加相关联。并没有证明在响应MBG时前胶原-1稳定性得到提高。

[0096] 虽然TGF-β或Smad蛋白的增加也不存在于用MBG处理过的成纤维细胞中，但是需要特别注意的是，从未真正地我们研究的成纤维细胞进行血清饥饿。甚至当在缺乏血清的(1％FBS)培养基中培养时，让所述成纤维细胞暴露于≥0.12ng/mL的TGF-β。这可以部分地解释为什么SB431542对预防MBG-激发的胶原生成有效。使用相似的药剂进行工作，Lijnen和Petrov注意到长时间培育(48小时)和高浓度的TGF-β(15ng/mL)对诱导胶原生成的最大增加(2倍)是必需的。当用蛋白质印迹测量时，我们也需要注意到甚至在MBG合成的条件下，用SB431542阻断TGF-β实际上减少脯氨酸掺入使其低于基线，虽然同样的药理学操作仅仅减少了前胶原表达使其至基线。我们怀疑当TGF-β途径被阻断时其它调节胶原合成的机制(例如，前胶原稳定性)可能会参与进来，虽然我们在当前研究中没有进一步探究这一点。总而言之，我们的数据初步地反对TGF-β或Smad蛋白的上调在强心类固醇诱导的成纤维细胞生成增加中起主要作用这一观点。

[0097] 在我们用于实验的啮齿动物模型中，我们的数据显示MBG与心肌纤维化的发病机理相牵连，并且在该环境下所发展出来的MBG以及其它强心类固醇的浓度具有体外作用，这同所述观察结果相一致。随后马上考虑的一个问题是是否洋地黄的临床应用可以有相似的作用。对于这个问题，我们将提出以下几种可能。首先，在体内出现的地高辛游离浓度可能不足以诱导实质的心肌纤维化。在用地高辛治疗过的病人中，地高辛总的血液水平有代表性地保持在＜2ng/mL，所给地高辛浓度同≈2.5-nM的浓度相对应。然而仅有70％到80％血浆中的地高辛是游离的，并且这些游离浓缩物可能落入地高辛激发人体心脏(或其它组织)纤维化所必需的阈值水平以下。可能更相关的，关于一旦到达作用阈值就有成纤维细胞胶原生成的刺激作用，我们观察到很平坦的MBG和G毒毛旋花剂量响应曲线。我们提出在心力衰竭(已知的与MBG和其它强心类固醇增加相关的一种病症)的环境下，以治疗剂量加入地高辛可能不会有可发觉的作用。最后，我们想指出的是，虽然已经对这些试剂在治疗心力衰竭中的临床效能进行了广泛的检查，但是对地高辛是否诱导或影响人的心肌纤维化的系统检查并未研究彻底。特别需要注意的是，人类形成心肌纤维化的速度看起来比啮齿类动物的要慢很多，这个可能进一步使地高辛在受试者中是否具有促纤维化作用变得模糊。

[0098] 总之，我们观察到类似于在实验性肾衰中产生的MBG浓度引起在原代成心肌纤维细胞中的合成增加，所述原代成心肌纤维细胞是以依赖于通过Na/K-ATP酶-Src-EGFR-活性氧物质信号级联放大进行信号传导的方式在培养物中培育的。这些数据将在人中进行确证，这一看法可以在临床的尿毒症心肌病中提供一种有用的治疗靶点。

[0099] 结论

[0100] 在许多种疾病状况中看到，心肌纤维化是心脏疾病的重要组成部分。我们在实验性肾衰模型中的数据提示，在这一条件下可以看到强心类固醇，例如MBG，在心肌纤维化中可能起着非常重要的作用。因为MBG的增加很可能伴随着各种容积扩张的情况，我们观察结果的含意可以扩展至并发于心肌纤维化的其它情形。

[0101] 其它数据包括在腔静脉闭塞期间获得的典型的压力-容量环，它来自于接受了假手术(假的)、PNx、MBG输注(MBG)和针对MBG-白蛋白结合物进行免疫后进行的PNx(PNx-IM)的大鼠。回归线拟合于收缩期末压容积关系(ESPVR，虚线)以及舒展期末压容积关系(EDPVR，实线)。B，心室横断层面面积是通过三色染色法染色的获得自假的、PNx、MBG、和PNx-IM动物的组织来确定的(每一组：N＝8个动物，对≈100测量结果求平均值来确定每个动物的平均值；数据以8个动物的平均值±SEM表示)。针对(c)胶原-1和(d)平滑肌肌动蛋白(aSMA)对有代表性的心脏组织的免疫组织化学影象进行染色。用于c和d的复染剂都是苏木精。蛋白质印迹和相应的密度计被分析用于(e)前胶原-1和(f)aSMA的分析。我们注意到同假的相比，胶原-1和aSMA染色在PNx和MBG组中更浓密，然而PNx-IM染色类似于假的。相类似地，同假的相比，前胶原和aSMA表达在PNx和MBG动物中大体上更高，然而对MBG的免疫(PNx-IM)削弱了用PNx所看到的变化。e和f数据来自于在每一组中N＝6的实验并以平均值±SEM表示。假的指的是分离自对照组动物的心脏，PNx指的是PNx，MBG指的是MBG补给，以及PNx-IM指的是在PNx手术前针对MBG进行免疫的动物。*P＜0.05，**P＜0.01相对于假的，#P＜0.01相对于PNx。

[0102] 典型的蛋白质印迹和定量的密度数据是关于(a)TGF-β1，(b)Smad 2/3，(c)Smad4，和(d)pSmad2/3。数据来自于每组中N＝6的实验并且以平均值±SEM表示。我们注意到在所有的4组实验组中有相类似的这些蛋白的表达。

[0103] 典型的关于前胶原的蛋白质印迹和定量的密度数据来自于响应不同剂量的(a)MBG(所有N＝10)，(b)MBG 10nM，与不同剂量的G毒毛旋花(0.1到100nM)和地高辛(10nM，所有N＝8)相对照。c，G毒毛旋花敏感的Rb摄取是MBG和G毒毛旋花浓度的函数(在MBG和G毒毛旋花的每个浓度下N＝4；数据表示为占对照组的分数)。d，在即将进行以及不进行胶原酶消化的基质和上清液中掺入相关脯氨酸(完整组)。每一组(对照组和不同剂量的MBG)包括N＝7份复制样品。总的组和胶原酶消化后的实验组之间的区别即为胶原。基质是除去上清液并且刮除培养皿后得到的样品。e，在MBG-处理过(10nM；N＝8)或对照组(N＝8)的成纤维细胞中的胶原1的mRNA。f，在放线菌酮处理后的前胶原的稳定性。时间0为用放线菌酮培育1小时后(20μg/mL)。密度计的数据以对数尺度表示。最小二乘方回归线拟合于对照组(CTL)和MBG数据。条状数据图表示平均值±SEM。*P＜0.05和**P＜0.01相对于对照组。

[0104] 我们也已经发现了PP2(1μmoI/L)、除莠霉素(1μmoI/L)、AG1478（250nM)和N-乙酰半胱氨酸(2.5mmol/L)作用于MBG(10nM)对前胶原表达的激发。在给予PP2、除莠霉素、AG1478(250nM)和N-乙酰半胱氨酸2小时后，加入MBG并继续进行24小时的MBG培育(总共26小时)。每个条状图代表n＝8的实验的平均值±SEM。b，PP2(1μmoI/L)和N-乙酰半胱氨酸(2.5mmol/L)作用于MBG-激发的脯氨酸掺入胶原。再一次，在暴露于MBG 2个小时前，加入PP2和N-乙酰半胱氨酸。每个条状图代表n＝5的实验的平均值±SEM。c，MBG 10nM对SYF和SYF+细胞中的前胶原含量的影响。典型的蛋白质印迹被显示在定量数据之上。SYF印迹加载了15μg蛋白和SYF+印迹加载了10μg蛋白。每个条形图代表在每一组中N-6次测定的平均值±SEM。**P＜01.10相对于对照组。

[0105] 利用蛋白质印迹测定MBG(1和10nM)对TGF-β、Smad2/3、Smad4和pSmad2/3表达 的24小时 作用。b和c，MBG(10nM)、TGF-11(5ng/mL) 和TGF-β受体 拮抗 剂SB431542(100(1μmol/L)对前胶原-1表达（蛋白质印迹)以及放射标记的脯氨酸掺入的24小时作用也各自被进行。在暴露于TGF-β或MBG2小时前加入SB431542(总共暴露26小时)。每个条形图代表6到8次的测定值的平均值±SEM。*P＜0.05，**P＜0.01相对于对照组。

[0106] 上述的本发明详述是为了解释本发明而给出的。对于本领域的技术人员来说显而易见地，在没有脱离本发明的范围内可以进行很多变化和修改。相应地，上述的整个说明书是为了分析说明而并没有限定的意思。本发明的范围仅仅由所附权利要求书确定。