一种淡豆豉肽、优质淡豆豉的发酵工艺和淡豆豉一次发酵设备
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; |
| 专利有效性 | 公开 | 当前状态 | 公开 |
| 申请号 | CN202411214142.8 | 申请日 | 2024-08-31 |
| 公开(公告)号 | CN119899251A | 公开(公告)日 | 2025-04-29 |
| 申请人 | 河北美威药业股份有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 王海洋; 王彦军; | 第一发明人 | 王海洋 |
| 权利人 | 河北美威药业股份有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 河北美威药业股份有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：河北省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：河北省保定市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：河北省保定市安国市河南大路188号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：071200 |
| 主IPC国际分类 | C07K14/415 | 所有IPC国际分类 | C07K14/415 ; C07K1/34 ; C07K1/30 ; C12P21/06 ; C12M1/38 ; C12M1/36 ; C12M1/34 ; C12M1/00 ; A61K38/16 ; A61P11/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 10 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 江苏京科专利代理有限公司 | 专利代理人 | 赵超; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种淡豆豉肽、优质淡豆豉的 发酵 工艺和淡豆豉一次发酵设备。本发明在2020年版《中国药典》规定制法 基础 上优化得到一种优质淡豆豉的制备方法，该制备方法中的发酵工艺参数具体明确，能稳定获得优质淡豆豉；本发明还提供了一种淡豆豉一次发酵设备用于该制备方法中的一次发酵工艺，该一次发酵设备能有效地控制一次发酵的温湿度且可用于大批量生产，克服了 现有技术 的 缺陷 ；淡豆豉可用于感冒，感冒常伴有 呼吸道 感染，严重的下呼吸道感染会诱发 肺 纤维 化，本发明从上述优质淡豆豉中得到一种重均分子量为1000～3000Da、3000～5000Da的多肽，该多肽具有明显的抗肺纤维化的作用。 | ||
| 权利要求 | 1.一种从优质淡豆豉中得到的多肽，其特征在于，制备方法包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种淡豆豉肽、优质淡豆豉的发酵工艺和淡豆豉一次发酵设备 技术领域[0001] 本发明属于医药化学和医药机械领域，涉及中药饮片活性成分的发现、炮制工艺及炮制设备，具体涉及一种淡豆豉肽、优质淡豆豉的发酵工艺和淡豆豉一次发酵设备。 背景技术[0002] 淡豆豉，为豆科植物大豆Glycine max(L.)Merr.的成熟种子(黑豆)的发酵加工品，性苦、辛，凉，归肺、胃经，具有解表、除烦、宣发郁热的功效，可用于感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠等。淡豆豉中含有黄酮、皂苷、蛋白、多糖、氨基酸、纤溶酶等成分，其中黄酮类成分被认为是主要活性成分。淡豆豉具有降血糖、调节肠道菌群、抗菌、抗骨质疏松及抗癌等药理活性(参考文献：曹冬英等，4种市售黑豆及成品淡豆豉中异黄酮含量分析，药学研究，2020年)。羚羊感冒软胶囊、维C银翘片、银翘解毒胶囊等感冒药均含淡豆豉。 [0003] 现市售淡豆豉常用黑豆有黄心小黑豆、黑芸豆、绿心黑豆、黄心大黑豆4种，均为正品黑豆。其中，黄心小黑豆为安国传统习惯所用，福州淡豆豉传统制备方法中原料也以黄心小黑豆为主。在淡豆豉发酵过程中，几种黑豆在洗去表面菌丝时，黄心小黑豆的质地最为坚硬，不易脱皮，更利于保持成品的外观。故以黄心小黑豆为淡豆豉发酵的较优原料(参考文献：曹冬英等，4种市售黑豆及成品淡豆豉中异黄酮含量分析，药学研究，2020年)。 [0004] 传统淡豆豉主要采用自然发酵法，由多菌种参与发酵而成，发酵菌主要来源于空气中。现代学者对自然发酵淡豆豉的菌群进行研究后发现，参与的发酵菌包含曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、青霉、微球菌、球菌等。其中细菌(主要为枯草芽孢杆菌)和霉菌(根霉、曲霉、毛霉)为常见发酵菌种，为优势发酵菌；而球菌、微球菌等对豆豉发酵的作用机制尚不明确，应该不是优势菌群(参考文献：林王敏等，淡豆豉的发酵工艺沿革及过程控制概述，中国实验方剂学杂志，2021年)。 [0005] 在淡豆豉的制作过程中，发酵工艺与过程控制是决定药材成品质量的关键。2020年版《中国药典》规定制法：取桑叶、青蒿各70～100g，加水煎煮，滤过，煎液拌入净大豆1000g中，俟吸尽后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖闷使发酵至黄衣上遍时，取出，除去药渣，洗净，置容器内再闷15～20天，至充分发酵、香气溢出时，取出，略蒸，干燥，即得。可以看出，2020年版《中国药典》以青蒿、桑叶为辅料，使用二次发酵法生产淡豆豉，但对于前酵和后酵(再闷)温湿度无明确规定，现代研究对前酵工艺分歧较少，确定的发酵温度多为25～32℃，相对湿度为80％左右，发酵时间4～7d。但不同研究者、厂商选择的后酵温度差距极大，30～60℃范围内均有，后酵时间为12～20d(参考文献：钟荣荣等，淡豆豉发酵过程中影响因素研究，中成药，2024年)。这就导致市面上淡豆豉的质量参差不齐，药效得不到保障。 [0006] 一次发酵(前酵)是淡豆豉发酵的重要工艺环节之一。目前，现有技术中一次发酵多用竹匾、竹子筐等手工制品，均为手工操作，既无法批间可控地保证曲霉生长状态达到黄衣上遍的要求，又产能较小，限制了淡豆豉的质量和产量。 [0007] 另外，根据记载，黑豆中的蛋白质含量高达36％～40％，以黑豆为原料制备得到的淡豆豉中亦含有高含量的蛋白(参考文献：赵超凡等，不同发酵方式对淡豆豉品质及风味的影响，食品工业科技，2022年)。与黑豆相比，淡豆豉因为经过蒸制发酵处理，蛋白质发生了修饰改变，会产生活性多样的蛋白质、肽。遗憾的是，目前无论是学术界还是产业界的研究重点仍集中在淡豆豉中的黄酮、皂苷等小分子化合物。 [0008] 为了解决上述问题，特提出本发明创造。 发明内容[0009] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种淡豆豉肽、优质淡豆豉的发酵工艺和淡豆豉一次发酵设备。 [0010] 本发明上述目的通过如下技术方案实现： [0011] 一种从优质淡豆豉中得到的多肽，制备方法包括如下步骤： [0012] 步骤1：碱提酸沉提取淡豆豉蛋白 [0013] 取粉碎脱脂的淡豆豉，加入适量纯净水，调节pH＝10.8，水浴加热提取一定时间，冷却，离心，取上清液，调节pH＝4.6，离心，收集沉淀并将其分散于适量纯净水中，调节pH＝7.0，透析脱盐，冷冻干燥，得淡豆豉蛋白； [0014] 步骤2：蛋白酶酶解 [0015] 向淡豆豉蛋白中加入适量纯净水，搅拌溶解，添加适量碱性蛋白酶进行酶解，酶解温度＝50℃，酶解pH＝10.0，酶解时间＝2.5h，沸水浴灭酶，离心，取上清液，透析脱盐，冷冻干燥，得淡豆豉蛋白酶解物； [0016] 步骤3：超滤分离不同分子量的多肽 [0017] 向淡豆豉蛋白酶解物中加入适量纯净水，搅拌溶解，依次用规格为5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜超滤，分别收集1000～3000Da、3000～5000Da的多肽溶液，冷冻干燥。 [0019] 优选地，离心参数均为4000r/min离心20min。 [0020] 优选地，1g淡豆豉蛋白加4000U碱性蛋白酶。 [0021] 优选地，所述高质量淡豆豉的制备方法包括：取桑叶、青蒿各70～100重量份，加水煎煮，滤过，煎液拌入1000重量份黑豆中，煎液与黑豆的重量比为1～1.2:1，煎液与黑豆拌匀，俟其吸尽后，置蒸制容器内，103～108℃蒸透，取出，稍凉，再置发酵容器内，保持发酵温度26～29℃，湿度80～85％，发酵2～3天，至黄衣上遍时，取出，洗净，置发酵容器内50‑55℃再闷15～20天，至充分发酵、香气溢出时，取出，100～105℃略蒸，烘干，即得。 [0022] 更优选地，所述蒸透为103～108℃蒸40min。 [0023] 更优选地，所述略蒸为100～105℃蒸25min。 [0024] 一种淡豆豉一次发酵设备，用作上述发酵温度26～29℃的发酵设备，包括上料机构和发酵机构；其中： [0025] 所述上料机构包括用于将蒸透的黑豆均匀上料至发酵机构的上料机和用于将蒸透的黑豆均匀布料至上料机的布料机； [0026] 所述发酵机构包括箱体、设于箱体内用于控制发酵湿度的加湿器和排湿风机、设于箱体内用于控制发酵温度的热泵主机，以及设于箱体内匀速转动承接来自上料机的黑豆直至铺满的发酵板连，发酵板连的一端位于所述上料机的下方。 [0027] 优选地，所述发酵机构内还设有摄像设备和照明设备。照明设备可以为箱体内提供照明，摄像设备可以采集发酵板连上黑豆是否铺满的图像，以用于决定发酵板连的转动与停止。 [0029] 有益效果： [0030] 1、本发明在2020年版《中国药典》规定制法基础上优化得到一种优质淡豆豉的制备方法，该制备方法中的发酵(一次发酵、二次发酵)工艺参数具体明确，能稳定获得优质淡豆豉；本发明还提供了一种淡豆豉一次发酵设备用于该制备方法中的一次发酵工艺，该一次发酵设备能有效地控制一次发酵的温湿度且可用于大批量生产，克服了现有技术的缺陷； [0031] 2、淡豆豉是一种具有解表、除烦、宣发郁热的中药，可用于感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠等，其所含有的黄酮类成分被认为是主要活性成分。感冒常伴有呼吸道感染，严重的下呼吸道感染会诱发肺纤维化，本发明从上述优质淡豆豉中得到一种重均分子量为1000～3000Da或3000～5000Da的多肽，该多肽具有明显的抗肺纤维化的作用。 附图说明 [0032] 图1为本发明提供的淡豆豉一次发酵设备的结构示意图；其中，1、箱体；2、热泵主机；3、加湿器；4、排湿风机；5、发酵板连；6、上料机；7、布料机。 具体实施方式[0033] 下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。 [0034] 实施例1：优质淡豆豉的制备工艺 [0035] 2020年版《中国药典》淡豆豉规定制法：取桑叶、青蒿各70～100g，加水煎煮，滤过，煎液拌入净大豆1000g中，俟吸尽后，蒸透，取出，稍晾，再置容器内，用煎过的桑叶、青蒿渣覆盖闷使发酵至黄衣上遍时，取出，除去药渣，洗净，置容器内再闷15～20天，至充分发酵、香气溢出时，取出，略蒸，干燥，即得。 [0036] 本发明制法在2020年版《中国药典》规定制法基础上优化得到，具体为：取桑叶、青蒿各70～100g，加水煎煮，滤过，煎液拌入净黑豆1000g中，煎液与黑豆的比例为1～1.2:1(重量比)，煎液与黑豆拌匀，俟其吸尽后，置蒸制容器内，蒸透(103～108℃蒸40min)，取出，稍凉，再置发酵容器内(一次发酵，又称前酵)，保持发酵温度26～29℃，湿度80～85％，发酵2～3天，至黄衣上遍时，取出，洗净，置发酵容器内再闷15～20天(50‑55℃，二次发酵，又称后酵)，至充分发酵、香气溢出时，取出，略蒸(100～105℃蒸25min)，烘干，即得。 [0037] 上述制法采用的黑豆为黄心小黑豆，优选理由见背景技术。 [0038] 上述制法中的重量、体积与《中国药典》一样都是为了阐述简洁、方便，本领域技术人员应当明白实际操作中并不局限于具体的重量、体积数值，而是根据上述具体的重量、体积数值确定不同物料的比例关系。 [0039] 上述制法中各参数用范围表示时，代表该参数在范围内均能获得高质量的淡豆豉。 [0040] 实施例2：优质淡豆豉的一次发酵设备 [0041] 如背景技术记载，现有技术中一次发酵多用竹匾、竹子筐等手工制品，均为手工操作，既无法批间可控地保证曲霉生长状态达到黄衣上遍的要求，又产能较小，限制了淡豆豉的质量和产量。该实施例提供一种一次发酵设备，用于实施例1中一次发酵。 [0042] 如图1所示的一种淡豆豉一次发酵设备，用作上述发酵温度26～29℃的发酵设备，包括上料机构和发酵机构；其中： [0043] 所述上料机构包括用于将蒸透的黑豆均匀上料至发酵机构的上料机6和用于将蒸透的黑豆均匀布料至上料机6的布料机7； [0044] 所述发酵机构包括箱体1、设于箱体1内用于控制发酵湿度的加湿器3和排湿风机4、设于箱体1内用于控制发酵温度的热泵主机2，以及设于箱体1内匀速转动承接来自上料机6的黑豆直至铺满的发酵板连5，发酵板连5的一端位于所述上料机6的下方。所述发酵机构内还设有摄像设备和照明设备。照明设备可以为箱体内提供照明，摄像设备可以采集发酵板连上黑豆是否铺满的图像，以用于决定发酵板连的转动与停止。 [0045] 工作原理：将蒸透的黑豆通过布料机在上料机上均匀布料，发酵板连在匀速转动情况下均匀接收来自上料机的黑豆，待黑豆均匀铺满发酵板连后停止上料；通过热泵主机将箱体内的温度控制在工艺规定的温度范围内，通过加湿器和排湿风机将箱体内的湿度控制在工艺规定的湿度范围内，使黑豆在工艺规定的温湿度条件下发酵；待黑豆发酵至黄衣上遍时取出。箱体内通过照明设备提供照明，通过摄像设备采集发酵板连上是否已经铺满黑豆的图像以传输给控制机构控制停止上料。该一次发酵设备能有效地控制一次发酵的温湿度且可用于大批量生产，克服了现有技术的缺陷。 [0046] 实施例3：优质淡豆豉中活性肽的发现 [0047] 一、材料 [0048] 以优质淡豆豉为原料，该原料按实施例1的制备工艺参数制得，涉及范围的参数选择中间值(范围内的不同参数区别不明显)。将原料粉碎后用食品级95％乙醇(体积百分浓度)热回流脱脂处理(1kg:10L，每次2.5h，重复2次)后用于活性肽的制备。 [0049] 碱性蛋白酶(20万U/g)，北京索莱宝科技有限公司。 [0050] 透析袋(截留分子量＞500Da)，上海吉至生化科技有限公司。 [0052] 二、方法 [0053] 1、活性肽的制备 [0054] (1)碱提酸沉提取淡豆豉蛋白 [0055] 取粉碎脱脂的淡豆豉，加入纯净水(娃哈哈，1g:20mL)，用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节pH＝10.8，65℃水浴条件下提取3.5h，冷却，4000r/min离心20min，取上清液，用盐酸溶液(1mol/L)调节pH＝4.6，4000r/min离心20min，收集沉淀并将其分散于适量纯净水中，用氢氧化钠溶液(1mol/L)调节pH＝7.0，透析脱盐，冷冻干燥，得淡豆豉蛋白。 [0056] (2)蛋白酶酶解 [0057] 向淡豆豉蛋白中加入纯净水(娃哈哈，1g:20mL)，搅拌溶解，添加碱性蛋白酶(1g淡豆豉蛋白加4000U碱性蛋白酶)进行酶解(温度＝50℃，pH＝10.0，时间＝2.5h)，沸水浴10min灭酶，4000r/min离心20min，取上清液，透析脱盐，冷冻干燥，得淡豆豉蛋白酶解物。 [0058] (3)超滤分离不同分子量的多肽 [0059] 向淡豆豉蛋白酶解物中加入纯净水(娃哈哈，1g:30mL)，搅拌溶解，依次用规格为5000Da、3000Da、1000Da的超滤膜超滤，得到4个重均分子量(Mw)组分(＜1000Da、1000～ 3000Da、3000～5000Da、＞5000Da)多肽溶液，冷冻干燥。 [0060] 2、活性肽的抗肺纤维化活性 [0061] (1)细胞培养 [0062] 将人胚肺成纤维细胞MRC‑5复苏后用含10％胎牛血清、2mmol/L L‑谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100mg/L链霉素的MEM培养液于37℃、饱和湿度、5％CO2条件下培养、传代，选择生长状态良好的MRC‑5细胞用于后续试验。 [0063] (2)实验分组 [0064] MRC‑5细胞分为空白对照组、模型组(20μg/LTGF‑β1)、多肽组(20μg/mL、40μg/mL不同重均分子量的多肽+20μg/LTGF‑β1)。 [0065] (3)CCK‑8检测细胞活性 [0066] 将生长状态良好的MRC‑5细胞按每孔5000个细胞/100μL培养液接种于96孔板中，培养24h，按照上述分组处理细胞，空白对照组加入100μL新鲜的完全培养基，模型组加入100μL含有TGF‑β1的完全培养基使得TGF‑β1终浓度为20μg/L，多肽组加入100μL含有TGF‑β1和不同重均分子量多肽的完全培养基使得TGF‑β1终浓度为20μg/L、多肽终浓度20μg/mL或 40μg/mL，37℃、饱和湿度、5％CO2条件继续培养48h后，每孔加10μL CCK‑8溶液，孵育4h，置于酶标仪中在450nm波长下读取吸光度(OD)值，以空白对照组细胞活性为100％，计算模型组和多肽组细胞活性。 [0068] 数据以平均值±SD表示，组间比较采用t检验，P<0.05代表具有显著性差异。 [0069] 三、结果 [0070] 肺成纤维细胞异常增殖是肺纤维化的重要特点，抑制肺成纤维细胞异常增殖是治疗肺纤维化的重要手段。各组细胞活性如表1所示，与空白对照组相比，模型组人胚肺成纤维细胞MRC‑5的细胞活性显著升高(P<0.05)，说明TGF‑β1诱导肺纤维化造模成功；与模型组相比，1000～3000Da、3000～5000Da多肽组细胞活性显著降低(P<0.05)，说明1000～3000Da、3000～5000Da多肽能剂量依赖性地抑制MRC‑5细胞异常增殖。另外两种重均分子量的多肽对MRC‑5细胞的增殖抑制作用不明显。 [0071] 表1MRC‑5细胞活性 [0072] [0073] *代表与空白对照组相比P<0.05，#代表与模型组相比P<0.05。 [0074] 淡豆豉是一种具有解表、除烦、宣发郁热的中药，可用于感冒、寒热头痛、烦躁胸闷、虚烦不眠等，其所含有的黄酮类成分被认为是主要活性成分。感冒常伴有呼吸道感染，严重的下呼吸道感染会诱发肺纤维化，上述试验证明淡豆豉中得到的重均分子量为1000～3000Da、3000～5000Da的多肽具有明显的抗肺纤维化的作用。 [0075] 上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。 |
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