一种多系统微血管共培养微流控芯片及其制备方法

专利类型 发明公开 法律事件 公开; 实质审查;
专利有效性 实质审查 当前状态 实质审查
申请号 CN202510057604.8 申请日 2025-01-14
公开(公告)号 CN119859580A 公开(公告)日 2025-04-22
申请人 中国人民解放军总医院第四医学中心; 申请人类型 其他
发明人 周惠; 迟云飞; 徐成峰; 刘甜; 吴正成; 梁元峤; 曲毅睿; 第一发明人 周惠
权利人 中国人民解放军总医院第四医学中心 权利人类型 其他
当前权利人 中国人民解放军总医院第四医学中心 当前权利人类型 其他
省份 当前专利权人所在省份:北京市 城市 当前专利权人所在城市:北京市海淀区
具体地址 当前专利权人所在详细地址:北京市海淀区阜成路51号 邮编 当前专利权人邮编:100142
主IPC国际分类 C12M3/00 所有IPC国际分类 C12M3/00C12M1/00C12N5/0775C12N5/071B01L3/00
专利引用数量 0 专利被引用数量 0
专利权利要求数量 10 专利文献类型 A
专利代理机构 北京睿智保诚专利代理事务所 专利代理人 田晴晴;
摘要 本 发明 提供了一种多系统微血管共培养微流控芯片及其制备方法,属于 生物 医学工程和微流控技术领域。本发明首次引入脂肪干细胞参与构成芯片中的细胞培养环境,进一步减少了体外微血管网络微流控芯片与人体内微环境间的差异,更好地对体内环境进行了体外模拟。此外本发明通过使用三种不同的具有代表性的血管内皮细胞,即人脑微血管内皮细胞(HBMVEC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人 肺 微血管内皮细胞(HPMVEC),构建了不同的微流控芯片 单体 ,通过将各单体进行连接,实现了可同时了解并对比不同系统间微血管内皮的情况。
权利要求

1.一种多系统微血管共培养微流控芯片,其特征在于,所述多系统微血管共培养微流控芯片包括若干个并联的单元,总的样本进样口分别与每个单元的进样口连通;
每个单元包括微流控芯片载体以及设置在微流控芯片载体上的生物支架,和设置在生物支架上的样品通道;
所述生物支架是由纤维蛋白凝胶混合溶液经基质灌注通道构成的管状结构。
2.根据权利要求1所述的多系统微血管共培养微流控芯片,其特征在于,所述并联的单元的数量为2~4个。
3.根据权利要求1所述的多系统微血管共培养微流控芯片,其特征在于,所述基质灌注通道包括流入与流出道,所述样品通道包括进样口与流出口。
4.根据权利要求1所述的多系统微血管共培养微流控芯片,其特征在于,所述纤维蛋白凝胶混合溶液是由纤维蛋白原与含有凝血酶的完全培养液混合而成。
5.一种多系统微血管共培养微流控芯片的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将质量比为8~12:1的聚二甲基烷预聚物与交联剂混匀,浇筑于带有通道图案的硅板表面,固化,形成带有图案结构的芯片;
(2)将芯片从硅板表面取下,利用打孔器制作基质灌注通道的流入与流出道以及样品通道的进样口与流出口;
(3)利用等离子体使芯片和玻璃通过化学键进行键合,得到微流控芯片载体;
(4)将微流控芯片载体放置于烘箱内恢复疏性后进行紫外线照射灭菌;
(5)利用生物3D打印技术,将打印墨水与血管内皮细胞培养液分别连接生物打印机的不同喷头,共同打印到玻璃缠绕棒上,形成无缝的管状组织;
(6)将管状组织置于步骤(4)获得的微流控芯片载体内,将纤维蛋白凝胶混合溶液从基质灌注通道的流入道注入微流控芯片载体内,孵育,待基质灌注通道内生长为完整的管状结构时,即得到生物支架;
(7)拔出玻璃缠绕棒,形成样品通道,并在样品通道的进样口设置滤过膜,即得到微流控芯片的单元;
(8)将多个微流控芯片的单元进行连接,即可得到多系统微血管共培养微流控芯片。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述固化的温度为60~80℃,固化的时间为30~60min。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述利用等离子体使芯片和玻璃通过化学键进行键合的方法为:将芯片与载玻片置于等离子体清洗机内,抽真空1~5min。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述血管内皮细胞为人脑微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人微血管内皮细胞。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,纤维蛋白凝胶混合溶液中包含间充质
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干细胞、脂肪干细胞以及细胞因子,其中间充质干细胞与脂肪干细胞的含量均为1×10~1
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×10细胞/mL,细胞因子包括Ang‑1、VEGF、S1P1,Ang‑1的浓度为50~100ng/mL,VEGF的浓度为50~200ng/mL,S1P1的浓度为100~500ng/mL。
10.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,所述滤过膜的孔径为0.1~1μm。

说明书全文

一种多系统微血管共培养微流控芯片及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学工程和微流控技术领域,尤其涉及一种多系统微血管共培养微流控芯片及其制备方法。

背景技术

[0002] 随着人们对于微血管研究的深入,使用动物模型进行体内观察已无法满足当今实验的需求,于是在体外搭建模拟体内局部环境的微血管网络成为了人们关注的热点,并延伸出了类组织、类器官的进一步研究。微流控芯片对于体外微血管网络来说是良好的平台,不仅能够为微血管提供附着、生长的环境,还能借助其流控特性模拟血液对于血管的灌注。具有3D结构,且能模仿血流灌注功能的微血管网络微流控芯片,有利于研究人员对于血管生理、病理等的研究,如将该芯片视为开源系统可根据不同使用目的进行个性化改造,如进行肿瘤细胞转移、感染模型构建、药物筛选等研究。除应用于基础研究外,将之用于临床可实现对于患者体内微环境变化的个体化、直观化、动态化的了解和检测,如诊断危重症患者是否存在毛细血管渗漏并对治疗效果进行评估。然而,体外微血管网络微流控芯片的构建与人体内微环境的组成间仍存在较大差异。且目前的血管相关微流控芯片无法实现实时横向对比多系统微血管内皮的情况。如何降低体外微血管网络微流控芯片的构建与人体内微环境的组成间的差异,实现横向对比多系统微血管内皮的情况是现如今亟需解决的问题。

发明内容

[0003] 有鉴于此,本发明的目的在于提供一种多系统微血管共培养微流控芯片及其制备方法,本发明首次引入脂肪干细胞参与构成芯片中的细胞培养环境,可显著改善体外微血管网络微流控芯片的构建与人体内微环境的组成间存在的差异,本发明通过使用三种不同的具有代表性的血管内皮细胞,即人脑微血管内皮细胞(HBMVEC)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人微血管内皮细胞(HPMVEC),构建了不同的微流控芯片单体,将各单体进行连接,实现了同时横向对比多系统微血管内皮的差异和变化。
[0004] 为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
[0005] 本发明提供一种多系统微血管共培养微流控芯片,所述多系统微血管共培养微流控芯片包括若干个并联的单元,总的样本进样口分别与每个单元的进样口连通;
[0006] 每个单元包括微流控芯片载体以及设置在微流控芯片载体上的生物支架,以及设置在生物支架上的样品通道;
[0007] 所述生物支架是由纤维蛋白凝胶混合溶液经基质灌注通道构成的管状结构。
[0008] 作为优选,所述并联的单元的数量为2~4个。
[0009] 作为优选,所述基质灌注通道包括流入与流出道,所述样品通道包括进样口与流出口。
[0010] 作为优选,所述纤维蛋白凝胶混合溶液是由纤维蛋白原与含有凝血酶的完全培养液混合而成。
[0011] 本发明还提供了一种多系统微血管共培养微流控芯片的制备方法,包括以下步骤:
[0012] (1)将质量比为8~12:1的聚二甲基烷预聚物与交联剂混匀,浇筑于带有通道图案的硅板表面,固化,形成带有图案结构的芯片;
[0013] (2)将芯片从硅板表面取下,利用打孔器制作基质灌注通道的流入与流出道以及样品通道的进样口与流出口;
[0014] (3)利用等离子体使芯片和玻璃通过化学键进行键合,得到微流控芯片载体;
[0015] (4)将微流控芯片载体放置于烘箱内恢复疏性后进行紫外线照射灭菌;
[0016] (5)利用生物3D打印技术,将打印墨水与血管内皮细胞培养液分别连接生物打印机的不同喷头,共同打印到玻璃缠绕棒上,形成无缝的管状组织;
[0017] (6)将管状组织置于步骤(4)获得的微流控芯片载体内,将纤维蛋白凝胶混合溶液从基质灌注通道的流入道注入微流控芯片载体内,孵育,待基质灌注通道内生长为完整的管状结构时,即得到生物支架;
[0018] (7)拔出玻璃缠绕棒,形成样品通道,并在样品通道的进样口设置滤过膜,即得到微流控芯片的单元;
[0019] (8)将多个微流控芯片的单元进行连接,即可得到多系统微血管共培养微流控芯片。
[0020] 作为优选,所述固化的温度为60~80℃,固化的时间为30~60min。
[0021] 作为优选,所述利用等离子体使芯片和玻璃通过化学键进行键合的方法为:将芯片与载玻片置于等离子体清洗机内,抽真空1~5min。
[0022] 作为优选,所述血管内皮细胞为人脑微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人肺微血管内皮细胞。
[0023] 作为优选,纤维蛋白凝胶混合溶液中包含间充质干细胞、脂肪干细胞以及细胞因6 8
子,其中间充质干细胞与脂肪干细胞的含量均为1×10 ~1×10 细胞/mL,细胞因子包括Ang‑1、VEGF、S1P1,Ang‑1的浓度为50~100ng/mL,VEGF的浓度为50~200ng/mL,S1P1的浓度为100~500ng/mL。
[0024] 作为优选,所述滤过膜的孔径为0.1~1μm。
[0025] 与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:本发明首次引入脂肪干细胞参与构成芯片中的细胞培养环境,进一步减少了体外微血管网络微流控芯片与人体内微环境间的差异,更好地对体内环境进行了体外模拟。此外本发明通过使用三种不同的具有代表性的血管内皮细胞,即人脑微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人肺微血管内皮细胞,构建了不同的微流控芯片单体,通过将各单体进行连接,实现了可同时了解并对比不同系统间微血管内皮的情况。附图说明
[0026] 图1为多系统微血管共培养微流控芯片的流程图
[0027] 图2为多系统微血管共培养微流控芯片的结构图。

具体实施方式

[0028] 本发明提供一种多系统微血管共培养微流控芯片,所述多系统微血管共培养微流控芯片包括若干个并联的单元,总的样本进样口分别与每个单元的进样口连通;
[0029] 每个单元包括微流控芯片载体以及设置在微流控芯片载体上的生物支架,以及设置在生物支架上的样品通道;
[0030] 所述生物支架是由纤维蛋白凝胶混合溶液经基质灌注通道构成的管状结构。
[0031] 在本发明中,所述并联的单元的数量为2~4个,优选为3个。
[0032] 在本发明中,所述基质灌注通道包括流入与流出道,所述样品通道包括进样口与流出口。
[0033] 在本发明中,所述纤维蛋白凝胶混合溶液是由25mg/mL纤维蛋白原采用磷酸缓冲液稀释至10mg/mL浓度后,与含有6U/mL凝血酶的DMEM完全培养液1:1体积比混合,配制而成。
[0034] 本发明还提供了一种多系统微血管共培养微流控芯片的制备方法,包括以下步骤:
[0035] (1)将质量比为8~12:1的聚二甲基硅氧烷预聚物与交联剂混匀,浇筑于带有通道图案的硅板表面,固化,形成带有图案结构的芯片;
[0036] (2)将芯片从硅板表面取下,利用打孔器制作基质灌注通道的流入与流出道以及样品通道的进样口与流出口;
[0037] (3)利用等离子体使芯片和玻璃通过化学键进行键合,得到微流控芯片载体;
[0038] (4)将微流控芯片载体放置于烘箱内恢复疏水性后进行紫外线照射灭菌;
[0039] (5)利用生物3D打印技术,将打印墨水与血管内皮细胞培养液分别连接生物打印机的不同喷头,共同打印到玻璃缠绕棒上,形成无缝的管状组织;
[0040] (6)将管状组织置于步骤(4)获得的微流控芯片载体内,将纤维蛋白凝胶混合溶液从基质灌注通道的流入道注入微流控芯片载体内,孵育,待基质灌注通道内生长为完整的管状结构时,即得到生物支架;
[0041] (7)拔出玻璃缠绕棒,形成样品通道,并在样品通道的进样口设置滤过膜,即得到微流控芯片的单元;
[0042] (8)将多个微流控芯片的单元进行连接,即可得到多系统微血管共培养微流控芯片。
[0043] 在本发明中,将质量比为8~12:1的聚二甲基硅氧烷预聚物与交联剂混匀,浇筑于带有通道图案的硅板表面,固化,形成带有图案结构的芯片。所述质量比优选为9~11:1,进一步优选为10:1;所述交联剂为甲基氢硅氧烷;在本发明中,交联剂甲基氢硅氧烷与聚二甲基硅氧烷预聚物中的乙烯基或羟基端基发生加成反应,将聚二甲基硅氧烷预聚物从液体状态转变为具有三维交联网络的固体,覆盖于芯片表面;所述固化的温度为60~80℃,固化的时间为30~60min。
[0044] 在本发明中,所述利用等离子体使芯片和玻璃通过化学键进行键合的方法为:将芯片带有通道结构的底面和洁净载玻片的顶面朝上放置于等离子体清洗机内,抽真空1~5min,优选为2~4min,进一步优选为3min,将等离子体模式调节“Mid”,处理1~5min,优选为2~4min,进一步优选为3min后,关闭进气旋钮及“Mid”模式,缓慢放气后取出芯片和载玻片,使得聚二甲基硅氧烷芯片和玻璃通过化学键产生不可逆键合以封闭微流控芯片。
[0045] 在本发明中,所述血管内皮细胞为人脑微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人肺微血管内皮细胞。
[0046] 在本发明中,所述纤维蛋白凝胶混合溶液中包含间充质干细胞、脂肪干细胞以及6 8
细胞因子,其中间充质干细胞与脂肪干细胞的含量均为1×10~1×10细胞/mL,细胞因子包括Ang‑1、VEGF、S1P1,Ang‑1的浓度为50~100ng/mL,VEGF的浓度为50~200ng/mL,S1P1的浓度为100~500ng/mL。
[0047] 在本发明中,所述滤过膜的孔径为0.1~1μm。
[0048] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0049] 实施例
[0050] 多系统微血管共培养微流控芯片的制备
[0051] (1)采用光刻技术制作微流控芯片的阳模,包括旋涂、前烘、曝光、后烘、显影和固膜;
[0052] (2)将质量比为10:1的聚二甲基硅氧烷预聚物(购自道康宁(中国)投资有限公司)与甲基氢硅氧烷混匀,后浇筑于带有通道图案的硅板表面,然后使用干式,真空度设为1毫托,抽真空的时间为25±5min,同时观察气泡去除情况,待气泡完全去除后,在80℃条件下,固化60min;
[0053] (3)从硅板表面揭下固化后的聚二甲基硅氧烷,形成带有图案结构的芯片,并利用打孔器制作所有入口和出口;
[0054] (4)将芯片带有通道结构的底面和洁净载玻片的顶面朝上放置于等离子体清洗机内,抽真空3min后,将等离子体模式调节“Mid”,处理3min后,关闭进气旋钮及“Mid”模式,缓慢放气后取出芯片和载玻片,使得聚二甲基硅氧烷芯片和玻璃通过化学键产生不可逆键合以封闭微流控芯片,得到微流控芯片载体;
[0055] (5)微流控芯片载体放置于80℃烘箱内24h恢复疏水性后进行紫外线照射灭菌30min备用;
[0056] (6)使用生物3D打印技术,将500μL的明胶溶液和500μL的海藻酸钠溶液于37℃条件下,保温25min,混合作为打印墨水,将打印墨水分别与人脑微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和人肺微血管内皮细胞培养液连接生物打印机的不同喷头,共同打印到玻璃缠绕棒上,形成无缝的人脑微血管内皮细胞管状组织、人脐静脉内皮细胞管状组织以及人肺微血管内皮细胞管状组织;
[0057] (7)将管状组织置于步骤(5)获得的微流控芯片载体内,利用移液器将含有间充质干细胞、脂肪细胞以及细胞因子的纤维蛋白凝胶混合溶液从基质灌注通道的流入道注入微流控芯片载体内,于37℃,5%的CO2和95%的空气混合气体,湿度为95%的二氧化培养箱孵育,待基质灌注通道内生长为完整的管状结构时,去掉缠绕棒,即将中空的管状类组织置于芯片内,即得到微流控芯片的单元;
[0058] (8)将多个微流控芯片的单元通过一个总的样本进样口进行连接,即可得到多系统微血管共培养微流控芯片。
[0059] 芯片示意图如图2所示。如暂不使用,则需由样本的进样口5和流出口6加入DMEM完全培养液,每天更换新鲜培养液。在使用芯片时,以蠕动泵为动建立血管通道的循环灌注体系,便于灌注液的收集和检测,可对PH、营养成分、代谢废物、化合物浓度、信号分子、外泌体等十种以上成分进行检测评估。图2中4处分别为无缝的人脑微血管内皮细胞管状组织、人脐静脉内皮细胞管状组织以及人肺微血管内皮细胞管状组织,相当于体内不同血管,3处相当于体内血管外组织。收集6处和2处的液体用于检测,可体现血管的通透性,反映出物质在不同血管中的情况。本芯片可适应于常规微流控芯片的检测手段和实时动态观察,与活细胞成像技术、荧光显成像技术等平台进行整合,可发挥1+1>2的功效。
[0060] 采用本发明所获得的多系统微血管共培养微流控芯片进行分子生物学检测。检测方法:将5mL脓毒症患者待测血液样品通过芯片中样本的进样口注入芯片内,模拟该脓毒症患者体内血脑屏障、肺微血管及其他微血管的状态,测试血脑屏障、肺微血管及其他微血管内皮细胞的功能,在5%二氧化碳,温度37℃,湿度为80%的细胞培养箱中培养24h,收集6处和2处的液体进行分析。
[0061] 通过对血管内皮细胞损伤相关生物标志物(如DNA、RNA、蛋白质等)的检测,可了解血脑屏障、肺微血管及其他微血管的病理生理学改变。采用本发明所获得的多系统微血管共培养微流控芯片能够检测到低至皮克摩尔(pM)级别的目标分子,交叉反应率低(<1%),由此可知,本发明检测的灵敏度高,特异性强。通过检测细胞活性、增殖和凋亡情况,可实时进行体外细胞分析。且使用本发明获得的多系统微血管共培养微流控芯片细胞捕获效率可达到90%以上,能够实现每个微流控通道内细胞的实时计数。在进行化学分析检测溶液中化学物质的浓度(如离子、分子)时,可以达到纳摩尔(nM)甚至更低的浓度检测限(<1nM),且检测可多次重复性,实验的相对标准偏差(RSD)小于5%。
[0062] 以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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