一种卷曲乳杆菌M58D及其组合物
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202411724987.1 | 申请日 | 2024-11-28 |
| 公开(公告)号 | CN119552773A | 公开(公告)日 | 2025-03-04 |
| 申请人 | 汤臣倍健股份有限公司; | 申请人类型 | 企业 |
| 发明人 | 迮晓雷; 李良; 吕洁; | 第一发明人 | 迮晓雷 |
| 权利人 | 汤臣倍健股份有限公司 | 权利人类型 | 企业 |
| 当前权利人 | 汤臣倍健股份有限公司 | 当前权利人类型 | 企业 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：广东省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：广东省珠海市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：广东省珠海市金湾区三灶科技工业园星汉路19号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：519040 |
| 主IPC国际分类 | C12N1/20 | 所有IPC国际分类 | C12N1/20 ; A23L33/135 ; A61K35/747 ; A61P15/02 ; A61P31/02 ; C11D3/38 ; C11D9/38 ; A61Q19/10 ; A61P31/04 ; C12R1/225 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 13 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 中国贸促会专利商标事务所有限公司 | 专利代理人 | 孔熹; |
| 摘要 | 本 发明 属于 微 生物 技术领域，具体涉及一种卷曲乳杆菌M58D，以及包含其的组合物、药物组合物、培养物、食物产品或膳食补充剂和清洁产品。本发明还涉及所述卷曲乳杆菌以及包含其的组合物在制备药物中的用途。 | ||
| 权利要求 | 1.一种卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，所述卷曲乳杆菌保藏于广东省微生 |
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| 说明书全文 | 一种卷曲乳杆菌M58D及其组合物技术领域[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种卷曲乳杆菌，以及包含其的组合物、药物组合物、培养物、食物产品或膳食补充剂和清洁产品。本发明还涉及所述卷曲乳杆菌以及 包含其的组合物在制备药物中的用途。 背景技术[0002] 细菌性阴道炎(Bacterial vaginosis，BV)是一类由阴道菌群失衡引起的阴道感染疾病，是女性常见的妇科病，已成为全球范围内影响女性日常生活的公共卫生问题。BV产 生的因素主要包括雌激素水平的降低、性行为、抗生素的使用等，其临床表现为外阴瘙痒、 出现烧灼感、异味和白带异常。 [0003] 正常状态下，阴道菌群以乳杆菌作为优势菌，其中以卷曲乳杆菌、格氏乳杆菌、约氏乳杆菌和詹氏乳杆菌为最常见菌种。这些优势菌株产生的过氧化氢、细菌素等物质维持 了阴道酸性、健康的环境；而阴道菌群平衡如果被打破，会导致乳杆菌丰度下降，阴道致病 性菌群明显增加。其中，阴道加德纳菌是细菌阴道炎主要的致病菌，此外，当阴道正常环境 被破坏时，白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌可能大量繁殖造成生殖道感染。 [0004] BV的常规药物治疗主要通过口服或局部使用克林霉素和甲硝唑或替硝唑。但抗生素疗法效果不佳、复发率高；这可能与致病菌及其生物膜对抗生素的耐药，以及施用抗生素 未能恢复阴道酸性环境等有关。近年来，益生菌在治疗细菌性阴道炎方面表现出良好的抗 菌活性，有助于恢复阴道微生态平衡，有证据表明乳杆菌产生的过氧化氢具有抑制细菌感 染的作用，阻止细菌性阴道炎的发生。 [0005] 目前市面上用于治疗或缓解细菌性阴道炎的微生态产品还十分有限，如“定君生”是大连医科大学康白教授从健康女性阴道分泌物中筛选得到的一株德氏乳杆菌DM8909，但 该菌株对细菌性阴道炎治疗作用的探讨存在一定的局限性。因此，开发有效的且源自我国 健康育龄期女性阴道内的益生菌优势菌株尤为必要。 发明内容[0006] 本申请的发明人经过大量实验从100余株健康女性来源的菌株中筛选到了一株具有显著菌株特异益生菌潜能的卷曲乳杆菌。本申请的发明人通过大量实验证实，该卷曲乳 杆菌和包含该卷曲乳杆菌的组合物具有高产酸能力和高产过氧化氢能力，能够维持女性生 殖道酸性和健康的环境，并能够维持女性生殖道微生物群正常化。此外，本申请的卷曲乳杆 菌和包含该卷曲乳杆菌的组合物还能够显著的抑制阴道最主要的致病菌—加德纳杆菌的 生长与生物膜的形成。由此，申请人完成了本发明。 [0007] 卷曲乳杆菌 [0008] 在第一方面，本申请提供了一种卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，所述卷曲乳杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.63705。 [0009] 在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌在有效培养条件下具有产生大于10umol/l的过氧化氢的能力。在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌在有效培养条件下具有产生10umol/ l至12umol/l，12umol/l至15umol/l，15umol/l至20umol/l或更大的过氧化氢的能力。 [0010] 在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌能够降低女性生殖道的pH值。在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌使女性生殖道的pH降低至pH 6.5或更低的pH值，pH 6或更低的pH值， pH 5.5或更低的pH值，pH 5或更低的pH值，pH 4.5或更低的pH值，pH 4或更低的pH值。 [0011] 在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌能够抑制加德纳菌属的菌株生长和/或抑制加德纳菌属的菌株的生物膜形成。在某些实施方案中，所述加德纳菌属的菌株是加德纳杆 菌(Gardnerella vaginalis)。在某些实施方案中，生物膜形成的抑制可以是至少10％的生 物膜抑制，至少15％的生物膜抑制，至少20％的生物膜抑制，至少25％的生物膜抑制，至少 30％的生物膜抑制，至少35％的生物膜抑制，至少40％的生物膜抑制。 [0012] 在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌能够降低促炎因子(例如，TNF‑α、IL‑1β、IL‑6)的水平。在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌降低至少10％，至少15％，至少20％，至少 25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％的TNF‑α、IL‑1β和/或IL‑6的水平。 [0013] 在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌能够提高抑炎因子(例如，IL‑10)的水平。在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌提高10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％的IL‑10的水平。 [0014] 在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌的菌落呈白色、乳白色和/或半透明。 [0015] 在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌为革兰阳性菌。 [0016] 易于理解的是，在微生物的生长和培养中，尤其是细菌的生长和培养中，遗传物质可能发生一定的变化(例如，一个或几个碱基的突变)，这些变化可以是自发发生，也可以是 因化学和/或物理试剂(例如诱变剂)诱变和/或本领域已知的重组DNA技术而导致的结果。 因此，在本文中，本发明的卷曲乳杆菌包括保藏编号为GDMCC No.63705的卷曲乳杆菌的突 变体和/或后代。在某些实施方案中，这些突变体和/或后代仍然保留保藏编号为GDMCC No.63705的卷曲乳杆菌的功能和/或生理生化特性(例如，上述提及的一种至多种功能和/ 或生理生化特性)。 [0017] 组合物 [0018] 在第二方面，本申请提供了一种组合物，其包含如第一方面所述的卷曲乳杆菌。 [0019] 如本文所使用的，术语“益生菌”被定义为任何非致病的微生物，并且将其以活菌形式向宿主施用足够数量时，能够对宿主的健康起到有益影响。 [0020] 在某些实施方案中，所述组合物还包含选自以下的益生菌：细菌，真菌(例如酵母)，或其任何组合。 [0021] 在某些实施方案中，所述细菌选自乳杆菌属，双歧杆菌属，芽孢杆菌属，丙酸杆菌属，链球菌属，乳球菌属，片球菌属，肠球菌属，葡萄球菌属，或其任何组合。 [0022] 在某些实施方案中，所述乳杆菌属的细菌选自：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)，惰性乳杆菌(Lactobacillus iners)，干 酪乳杆菌(Lactobacillus casei)，卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)，弯曲乳杆菌 (Lactobacillus curvatus)，德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)，发酵乳杆菌 (Lactobacillus fermentum)，格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，瑞士乳杆菌 (Lactobacillus helveticus)，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)，植物乳杆菌 (Lactobacillus plantarum)，罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，鼠李糖乳杆菌 (Lactobacillus rhamnosus)，清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei)，唾液乳杆菌 (Lactobacillus salivarius)，或其任何组合。 [0023] 在某些实施方案中，所述副干酪乳杆菌为具有微生物保藏编号GDMCC No.60960的副干酪乳杆菌207‑27。 [0024] 在某些实施方案中，所述酵母选自所述酵母选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，布拉氏酵母(Saccharomyces boulardii)，马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyces marxianus)，或其任何组合。 [0025] 在某些实施方案中，所述双歧杆菌属的细菌选自：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，短双歧杆菌 (Bifidobacterium breve)，婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)，长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)，或其任何 组合。 [0027] 在某些实施方案中，所述丙酸杆菌属的细菌选自：谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)，费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii), 产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidipropionici)，或其任何组合。 [0028] 在某些实施方案中，所述链球菌属的细菌选自：嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，唾液链球菌(Streptococcus salivarius)，或其任何组合。 [0029] 在某些实施方案中，所述乳球菌属的细菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。 [0030] 在某些实施方案中，所述肠球菌属的细菌选自：粪肠球菌(Enterococcus faecalis)，屎肠球菌(Enterococcus faecium)，或其任何组合。 [0031] 在某些实施方案中，所述组合物包含保藏编号为GDMCC No.63705的卷曲乳杆菌、保藏编号为GDMCC No.63707的卷曲乳杆菌和保藏编号为GDMCC No.63872的格氏乳杆菌。在 某些实施方案中，所述组合物由保藏编号为GDMCC No.63705的卷曲乳杆菌、保藏编号为 GDMCC No.63707的卷曲乳杆菌和保藏编号为GDMCC No.63872的格氏乳杆菌组成。 [0032] 在某些实施方案中，所述组合物中包含的保藏编号为GDMCC No.63705的卷曲乳杆菌、保藏编号为GDMCC No.63707的卷曲乳杆菌和保藏编号为GDMCC No.63872的格氏乳杆菌 的比例为1‑10：1‑10：1‑10(例如，1：1：1，10‑1：1：1，1：10‑1：1，1：1：10‑1，10‑1：10‑1：1，10‑ 1：1：10‑1，1：10‑1：10‑1)。 [0033] 在某些实施方案中，所述组合物在有效培养条件下具有产生大于10umol/l的过氧化氢的能力。在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌在有效培养条件下具有产生10umol/l至 20umol/l，20umol/l至30umol/l，30umol/l至40umol/l或更大的过氧化氢的能力。 [0034] 在某些实施方案中，所述组合物能够降低女性生殖道的pH值。在某些实施方案中，所述卷曲乳杆菌使女性生殖道的pH降低至pH 6.5或更低的pH值，pH 6或更低的pH值，pH 5.5或更低的pH值，pH 5或更低的pH值，pH 4.5或更低的pH值，pH 4或更低的pH值。 [0035] 在某些实施方案中，所述组合物能够抑制加德纳菌属的菌株生长和/或抑制加德纳菌属的菌株的生物膜形成。在某些实施方案中，所述加德纳菌属的菌株是加德纳杆菌 (Gardnerella vaginalis)。在某些实施方案中，生物膜形成的抑制可以是至少10％的生物 膜抑制，至少15％的生物膜抑制，至少20％的生物膜抑制，至少25％的生物膜抑制，至少 30％的生物膜抑制，至少35％的生物膜抑制，至少40％的生物膜抑制。 [0036] 在某些实施方案中，所述组合物能够降低促炎因子(例如，TNF‑α、IL‑1β、IL‑6)的水平。在某些实施方案中，所述组合物降低至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％的TNF‑α、IL‑1β和/或IL‑6的水平。 [0037] 在某些实施方案中，所述组合物能够提高抑炎因子(例如，IL‑10)的水平。在某些实施方案中，所述组合物提高10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％的IL‑10的水平。 [0038] 药物组合物 [0039] 在第三方面，本申请提供了一种药物组合物，其包含如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物。 [0040] 在某些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和/或赋形剂、冷冻保护剂、氨基酸、维生素、矿物质、蛋白胨，或其任意组合。 [0042] 在某些实施方案中，所述药学上可接受的载体和/或赋形剂包括：糖(如木糖、蔗糖、果糖、乳糖、海藻糖)，糖醇(如甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇)，多糖(如纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、壳聚糖、树胶、麦芽糊精)，聚醚(如聚丙二醇、聚乙二醇、聚丁二醇)，聚维酮(如聚维酮K30、K60、K90)，油(如菜籽油、葵花籽油、大豆油、芝麻油、橄榄油)，表面活性剂(如Tween20、Tween40、Tween60、Tween80、脂肪酸、聚氧乙烯脂肪醇醚)，无机盐(如磷酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、氯化物、硫酸盐、硼酸盐、枸橼酸盐)，滑石粉，二氧化硅及其衍生物，水解产物，或其任意组合。 [0043] 在某些实施方案中，所述药物组合物还包含冷冻保护剂。 [0044] 在某些实施方案中，所述药物组合物还包含甘油、脱脂乳粉、可溶性淀粉、聚乙二醇、葡聚糖、海藻糖、山梨醇、低聚木糖、谷胱甘肽，或其任意组合。 [0045] 在某些实施方案中，所述药物组合物包括氨基酸。 [0046] 在某些实施方案中，所述药物组合物包括色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸，或其任意组合。 [0047] 在某些实施方案中，所述药物组合物包括维生素。 [0048] 在某些实施方案中，所述药物组合物包括维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K，或其任意组合物。 [0049] 在某些实施方案中，所述药物组合物包括矿物质。 [0051] 在某些实施方案中，所述药物组合物包括蛋白胨。 [0052] 在某些实施方案中，所述药物组合物包括大豆蛋白胨、小麦蛋白胨、乳清蛋白胨，或其任意组合物。 [0053] 本发明的药物组合物可以通过各种途径给予包括人在内的哺乳动物。给药方式可以是本领域常用的任何方式。例如，它可以通过口服，体外，静脉内，肌肉内，皮下等途径给药。在某些实施方案中，所述药物组合物被配制用于口服施用或体外施用。 [0054] 在某些实施方案中，所述药物组合物包含卷曲乳杆菌的制剂。 [0055] 在某些实施方案中，所述药物组合物为丸剂、粉剂、胶囊剂、片剂(例如，泡腾片剂)、油滴剂、盖膜剂、口溶性颗粒剂、液体剂、栓剂、灌肠剂凝胶和/或乳膏的形式。 [0056] 在某些实施方案中，所述药物组合物还包含制剂辅料(例如，用于制备粉剂、片剂、胶囊剂、油滴剂的辅料)。 [0057] 在某些实施方案中，所述药物组合物单独使用，或与其他抗真菌剂、抗病毒剂、止痛药、抗炎药、促愈合剂和/或保湿剂联合使用。 [0058] 在某些实施方案中，所述药物组合物中如第一方面所述的卷曲乳杆菌或如第二方6 12 7 9 面所述的组合物以10至10 CFU/剂量的量存在(例如，10至10CFU/ml)。 [0059] 在某些实施方案中，当所述药物组合物为固体，其每克包含106至1012CFU的如第一7 8 9 方面所述的卷曲乳杆菌或如第二方面所述的组合物(例如，10CFU/g，10CFU/g，10CFU/g)。 [0060] 在某些实施方案中，当所述药物组合物为液体，其每毫升包含106至1012CFU的如第7 8 一方面所述的卷曲乳杆菌或如第二方面所述的组合物(例如，10 CFU/mL，10 CFU/mL， 9 10CFU/mL)。 [0061] 在某些实施方案中，所述药物组合物中卷曲乳杆菌和/或格氏乳杆菌以活菌形式存在或者以死菌形式存在。 [0062] 培养物 [0063] 在第四方面，本申请提供了一种培养物，其包含如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物。 [0064] 在某些实施方案中，所述培养物还包含提供营养的成分(例如，固体或液体培养基，饲养细胞层)。 [0065] 在某些实施方案中，所述提供营养的成分选自蛋白质(例如，酶)，碳水化合物，脂肪，维生素，矿物质，膳食纤维，氨基酸，或其任何组合。 [0066] 在某些实施方案中，所述培养物还包含卷曲乳杆菌和/或格氏乳杆菌的无细胞培养滤液。 [0067] 在某些实施方案中，所述培养物还包含卷曲乳杆菌和/或格氏乳杆菌的衍生物；其中，所述衍生物选自代谢产物，酶，细胞结构成分(例如，细胞壁或其成分)，胞外多糖，细菌素，含有免疫原性成分的化合物，或其任何组合。 [0068] 食物产品或膳食补充剂或保健食品 [0069] 在第五方面，本申请提供了一种食物产品或膳食补充剂或保健食品，其包含如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物或第四方面所述的培养物。 [0070] 在文本中，“食物”一词是广义的，包括人类的食物和饮物，也涵盖动物的食物和饮物(即饲料)。在某些实施方案中，所述食物产品适合于以及设计用于人类进食。在某些实施方案中，所述食物产品选自固体饮料，液体饮料、压片糖果、膨化食品、蛋白棒或坚果，或者，所述食物产品为乳制品(例如，奶粉，奶片，酸奶，风味发酵乳，乳酸菌饮料，奶酪)。 [0071] 在文本中，“膳食补充剂”是指能够向消费者提供有益效果的可食用的产品。其又被称为营养补充剂、营养剂、饮食补充剂等，是作为饮食的一种辅助手段，用来补充人体所 需的氨基酸、微量元素、维生素、矿物质等。 [0072] 在某些实施方案中，所述食物产品或膳食补充剂或保健食品中还包含益生元。 [0073] 在某些实施方案中，所述益生元选自低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖,胡萝含氮多糖，或其任何组合。 [0074] 在某些实施方案中，所述食物产品或膳食补充剂或保健食品还包括额外的添加剂。 [0075] 在某些实施方案中，所述额外的添加剂选自蛋白质(例如，酶)，碳水化合物，脂肪，维生素，矿物质，膳食纤维，氨基酸，或其任何组合。 [0076] 在某些实施方案中，所述碳水化合物选自单糖(葡萄糖，果糖，木糖)，二糖(麦芽糖，乳糖、蔗糖，海藻糖)，糖醇(如甘油、木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇)，多糖(如纤维素及其衍生物、淀粉及其衍生物、壳聚糖、树胶、麦芽糊精)，或其任意组合。 [0077] 在某些实施方案中，所述氨基酸选自色氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、精氨酸，或其任意组合。 [0078] 在某些实施方案中，所述维生素选自维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素B3、维生素B6、维生素B9、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K，或其任意组合物。 [0079] 在某些实施方案中，所述矿物质选自铁、锰、锌、铜、硒，或其任意组合物。 [0080] 在某些实施方案中，所述食物产品或膳食补充剂或保健食品中如第一方面所述的6 12 7 9 卷曲乳杆菌或如第二方面所述的组合物以10至10 CFU/剂量的量存在(例如，10至10CFU/ ml)。 [0081] 在某些实施方案中，当所述食物产品或膳食补充剂或保健食品为固体，其每克包6 12 含10 至10 CFU的如第一方面所述的卷曲乳杆菌或如第二方面所述的组合物(例如， 7 8 9 10CFU/g，10CFU/g，10CFU/g)。 [0082] 在某些实施方案中，当所述食物产品或膳食补充剂或保健食品为液体，其每毫升6 12 包含10 至10 CFU的如第一方面所述的卷曲乳杆菌或如第二方面所述的组合物(例如， 7 8 9 10CFU/mL，10CFU/mL，10CFU/mL)。 [0083] 在某些实施方案中，所述食物产品或膳食补充剂或保健食品中卷曲乳杆菌和/或格氏乳杆菌以活菌形式存在或者以死菌形式存在。 [0084] 清洁产品 [0085] 在第六方面，本申请提供了一种清洁产品，其包含如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物或如第四方面所述的培养物。 [0086] 在某些实施方案中，所述清洁产品选自固体肥皂，液体皂，洗手液，洗发水，液体调理剂，身体清洁剂，或其任意组合。 [0087] 在某些实施方案中，所述清洁产品为阴道灌洗液、阴道凝胶和/或阴道乳膏。 [0088] 用途 [0089] 在第七方面，本申请提供了如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物或如第三方面所述的药物组合物或如第四方面所述的培养物或如第五方面所述的食物 产品或膳食补充剂或保健食品或如第六方面所述的清洁产品在制备药物中的用途，所述药 物用于在受试者中预防和/或治疗女性泌尿生殖道相关的疾病和/或症状。 [0090] 在某些实施方案中，所述女性泌尿生殖道相关的疾病是由生殖道微生物群失衡引起的和/或生殖道pH值异常引起的。 [0092] 在某些实施方案中，所述女性泌尿生殖道相关的疾病与生殖道生态系统中的至少一种属于以下种的微生物的增殖的增加相关：阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis)，白 色念珠菌(Candida albicans)，金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)，阴道阿托波氏 菌(Atopobium vaginae)，或其任意组合。 [0093] 在某些实施方案中，所述女性泌尿生殖道相关的疾病与生殖道生态系统中的至少一种属于以下属的微生物的增殖的增加相关：普雷沃菌属(Prevotella spp.)，巨型球菌属 (Megasphaera spp.)，斯尼斯菌属(Sneathia spp.)，阿托波氏菌属(Atopobium spp.)，戴 阿利斯特杆菌属(Dialister spp.)，厌氧球菌属(Anaerococcus spp.)，埃格氏菌属 (Eggerthella spp.)，嗜蛋白胨菌属(Peptoniphilus spp.)，气球菌属(Aerococcus spp.)，动弯杆菌属(Mobiluncus spp.)，或其任意组合。 [0094] 在某些实施方案中，所述女性泌尿生殖道相关的疾病与生殖道环境中pH升高相关。 [0095] 因此，在某些实施方案中，所述药物用于维持女性生殖道微生物群平衡、降低女性生殖道pH值、提升女性生殖道生态系统中的乳杆菌属细菌菌株的水平和/或降低女性生殖 道中加德纳菌属细菌菌株的水平。 [0096] 在某些实施方案中，所述加德纳菌属的菌株是加德纳杆菌。 [0097] 在某些实施方案中，所述疾病选自：女性泌尿生殖道的感染，生殖器疱疹，淋病，女性泌尿生殖道相关的炎症性疾病(例如，阴道炎，宫颈炎)，或其任意组合。在某些实施方案中，女性泌尿生殖道的感染可包括或引起细菌性阴道病、阴道微生物失衡和/或尿路感染。 [0098] 在某些实施方案中，所述症状选自：月经周期改变，阴道瘙痒，阴道发红，分泌物异常，阴道疼痛，或其任意组合。 [0099] 在某些实施方案中，所述药物通过降低促炎因子的水平和/或提高抑炎因子的水平，以预防和/或治疗女性泌尿生殖道相关的炎症性疾病。 [0100] 在某些实施方案中，所述药物通过降低唾液酸酶活性和/或髓过氧化物酶(MPO)活性，以预防和/或治疗女性泌尿生殖道相关的炎症性疾病。 [0101] 在某些实施方案中，所述促炎因子选自TNF‑α、IL‑1β、IL‑6，或其任何组合。在某些实施方案中，所述抑炎因子是IL‑10。 [0102] 在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是人。 [0103] 在第八方面，本申请提供了如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物或如第三方面所述的药物组合物或如第四方面所述的培养物或如第五方面所述的食物 产品或膳食补充剂或保健食品或如第六方面所述的清洁产品在制备药物中的用途，所述药 物用于抑制加德纳菌属生长和/或减少其量。 [0104] 在某些实施方案中，所述药物通过提高过氧化氢(H2O2)的水平，进而抑制加德纳菌属的菌株的生长。 [0105] 在某些实施方案中，所述药物通过降低所处环境pH的水平，进而抑制加德纳菌属的菌株的生长。 [0106] 在某些实施方案中，所述药物用于抑制加德纳菌属的菌株的生物膜形成，进而抑制加德纳菌属的菌株的生长。 [0107] 在某些实施方案中，所述药物用于抑制女性体内加德纳菌属生长和/或减少其量，或者，用于抑制环境中加德纳菌属生长和/或减少其量。 [0108] 在某些实施方案中，所述女性体内包括粘膜和/或生殖道内。 [0109] 在本文中，术语“粘膜”是指哺乳动物体内各种腔内并覆盖内脏器官表面的膜。它由覆盖一层松散结缔组织的一层或多层上皮细胞组成。它主要是内胚层起源的，并与各种 身体开口处的皮肤连续，例如眼睛、耳朵、鼻子和嘴的内侧、嘴唇、阴道、尿道口和肛门。 [0110] 在某些实施方案中，所述环境包括家庭，工作场所，实验室，工业环境，水生环境，医疗仪器和/或妇科检查用具。 [0111] 方法 [0112] 在第九方面，本申请提供了一种抑制女性体内加德纳菌属生长和/或减少其量的方法，所述方法包括：给有需要的女性受试者施用有效量的如第一方面所述的卷曲乳杆菌 或第二方面所述的组合物或如第三方面所述的药物组合物或如第四方面所述的培养物或 如第五方面所述的食物产品或膳食补充剂或保健食品或如第六方面所述的清洁产品。 [0113] 在某些实施方案中，所述方法包括：将如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物或如第三方面所述的药物组合物植入女性受试者的生殖道中。 [0114] 在某些实施方案中，所述方法包括：将将如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物或如第三方面所述的药物组合物或如第六方面所述的清洁产品外施(例 如，涂抹，喷施)于女性受试者的生殖道和/或会阴部。 [0115] 在某些实施方案中，所述方法包括：使女性受试者内服(例如，口服)第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所述的组合物或如第三方面所述的药物组合物如第五方面所述 的食物产品或膳食补充剂或保健食品。 [0116] 在某些实施方案中，所述加德纳菌属包括加德纳杆菌(Gardnerella vaginalis)。 [0117] 在某些实施方案中，所述女性体内包括生殖道内和/或粘膜。 [0118] 在某些实施方案中，所述如第一方面所述的卷曲乳杆菌或如第二方面所述的组合6 12 7 8 9 10 物以10至10 CFU/日剂量(例如，10CFU/日剂量，10 CFU/日剂量，10CFU/日剂量，10 CFU/ 11 12 日剂量，10 CFU/日剂量，10 CFU/日剂量)的量施用于受试者。 [0119] 在第十方面，本申请提供了一种抑制环境中加德纳菌属生长和/或减少其量的方法，所述方法包括：向所述环境施用有效量的如第一方面所述的卷曲乳杆菌或第二方面所 述的组合物或如第三方面所述的药物组合物或如第四方面所述的培养物。 [0120] 在某些实施方案中，所述环境包括家庭，工作场所，实验室，工业环境，水生环境，医疗仪器和/或妇科检查用具。 [0121] 在某些实施方案中，所述如第一方面所述的卷曲乳杆菌或如第二方面所述的组合6 12 7 8 9 10 物以10至10 CFU/日剂量(例如，10CFU/日剂量，10 CFU/日剂量，10CFU/日剂量，10 CFU/ 11 12 日剂量，10 CFU/日剂量，10 CFU/日剂量)的量施用于环境中。 [0122] 在第十一方面，本申请提供了一种预防和/或治疗女性泌尿生殖道相关的疾病和/或症状的方法，所述方法包括：给有需要的女性受试者施用有效量的如第一方面所述的卷 曲乳杆菌或第二方面所述的组合物或如第三方面所述的药物组合物或如第四方面所述的 培养物或如第五方面所述的食物产品或膳食补充剂或保健食品或如第六方面所述的清洁 产品。 [0123] 在某些实施方案中，所述女性泌尿生殖道相关的疾病是由生殖道微生物群失衡和/或其中生殖道的pH值异常引起的。 [0124] 在某些实施方案中，所述女性泌尿生殖道相关的疾病与生殖道生态系统中的乳杆菌属细菌菌株水平的降低相关。 [0125] 在某些实施方案中，所述女性泌尿生殖道相关的疾病与生殖道生态系统中的至少一种属于以下属的微生物的增殖的增加相关：加德纳菌属，多雷亚菌属，链球菌属，厌氧球 菌属，芬戈尔德菌属，普雷沃菌属，别样斯氏菌属，葡萄球菌属，棒状杆菌属，或其任意组合。 [0126] 在某些实施方案中，所述女性泌尿生殖道相关的疾病与生殖道环境中pH升高相关。 [0127] 在某些实施方案中，所述加德纳菌属的菌株是加德纳杆菌。 [0128] 在某些实施方案中，所述疾病选自：女性泌尿生殖道的感染，生殖器疱疹，淋病，女性泌尿生殖道相关的炎症性疾病(例如，阴道炎，宫颈炎)，或其任意组合。在某些实施方案中，女性泌尿生殖道的感染可包括或引起细菌性阴道病、阴道微生物失衡和/或尿路感染。 [0129] 在某些实施方案中，所述症状选自：月经周期改变，阴道瘙痒，阴道发红，分泌物异常，阴道疼痛，或其任意组合。 [0130] 在某些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在某些实施方案中，所述受试者是人。 [0131] 在某些实施方案中，所述如第一方面所述的卷曲乳杆菌或如第二方面所述的组合6 12 7 8 9 10 物以10至10 CFU/日剂量(例如，10CFU/日剂量，10 CFU/日剂量，10CFU/日剂量，10 CFU/ 11 12 日剂量，10 CFU/日剂量，10 CFU/日剂量)的量施用于受试者。 [0132] 术语定义 [0133] 在本文中，术语“生殖道”包括泌尿道和阴道。阴道包括女性生殖道的弹性肌肉部分。在人类中，阴道从外阴延伸到子宫颈。 [0134] 在本文中，术语“粘膜”是指哺乳动物体内各种腔内并覆盖内脏器官表面的膜。它由覆盖一层松散结缔组织的一层或多层上皮细胞组成。它主要是内胚层起源的，并与各种 身体开口处的皮肤连续，例如眼睛、耳朵、鼻子和嘴的内侧、嘴唇、阴道、尿道口和肛门。 [0135] 在本文中，术语“生殖道微生物群”或“生殖道生态系统”是指这样的微生物组，处于女性泌尿生殖道(优选阴道)中并且在彼此之间以及与容纳它们的生殖道环境平衡地存活的微生物组。因此，术语“生殖道微生物群失衡”包括生殖道微生物群中一种或多种优势 菌的水平下降和/或生殖道中一种或多种致病菌的水平上升。 [0136] 在本发明的上下文中，表述“致病菌”是指能够存在于阴道生态系统中，并具有潜在病原性的微生物。 [0137] 在本文中，术语“治疗有效量”或“有效量”可以是指组合物或药物组合物中的菌株的量，作为所需剂量方案的一部分(向人或动物，优选人)施用时，根据待治疗的受试者的病症或病况的临床可接受标准，例如以适用于任何医学治疗的合理效益风险比，缓解症状、改 善病况或减缓疾病病况的发作。治疗有效量可以根据不同待治疗的受试者的年龄，体重，性 别，剂型，健康状况和疾病的严重程度而变化。此外，频率可根据医生或药剂师决定，每天以固定的时间间隔分剂量给药一至几次。 [0138] 如本文中所使用的，术语“CFU(Colony‑Forming Units)”是指产品中细菌、真菌、酵母等微生物的群落总数，通常用作活菌数计算。 [0139] 如本文中所使用的，术语“CFU/剂量”意指每天或每次向受试者提供的组合物/食物产品或膳食补充剂或保健食品/药物组合物中细菌存在的量。例如，在某些实施方案中， 6 12 所述食物产品或膳食补充剂或保健食品中卷曲乳杆菌以10至10 CFU/剂量的量存在。在此 种实施方案中，如果将卷曲乳杆菌施用在食物产品中(例如，在固体饮料、酸奶中)，则每天 6 12 或每次向受试者提供的食物产品(例如固体饮料、酸奶)可含有约10至10 CFU的卷曲乳杆 菌。当然，可替代地，这种细菌的量的可以分成多次施用，只要受试者在任何特定时间内(例 6 12 如每24小时期间)接受的卷曲乳杆菌的总量是从约10至约10 CFU的细菌，即满足上述的食 6 12 物产品或膳食补充剂或保健食品中卷曲乳杆菌以10至10 CFU/剂量的量存在。 [0140] 如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离 子或者非离子型表面活性剂，例如Tween‑80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。 [0141] 如本文中所使用的，术语“受试者”是动物。动物可以包括但不限于灵长类动物、农场动物、运动动物、啮齿动物和宠物。更具体地，动物可以包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；兔子；狗；猫；羊；猪；仔猪；母猪；家禽；火鸡；肉鸡；水貂；山羊；牛；马；以及非人灵长类动物，例如猿和猴。 [0142] 如本文所用，术语“抑制”是指控制微生物的生长或者杀死所述微。可以通过抑制形成生物膜的微生物的生长来抑制微生物的初始附着或抑制生物膜的进一步形成。在某些 实施方案中，生物膜形成的抑制可以是至少10％的生物膜抑制，至少15％的生物膜抑制，至 少20％的生物膜抑制，至少25％的生物膜抑制，至少30％的生物膜抑制，至少35％的生物膜 抑制，至少40％的生物膜抑制。 [0143] 如本文所用，术语“唾液酸酶”也称为“神经氨酸酶”，其是细菌性阴道病(BV)的病原菌加德纳菌属的主要毒力因子。唾液酸酶可在人类女性的宫颈阴道灌洗液中检测到。大量研究都表明患有BV的女性阴道分泌物中的唾液酸酶活性水平高于未患有BV的女性(例 如，健康的女性)。因此目前的临床诊断中，阴道分泌物中唾液酸酶阳性已作为BV重要的诊 断指标。 [0144] 如本文所用，术语“MPO”是一种存在于白细胞中的酶。MPO常用于评估炎症反应、感染等疾病的诊断和治疗。通常，MPO偏高可能意味着宿主机体存在炎症、感染、自身免疫性疾病等情况。在炎症过程中，白细胞释放大量的MPO来消灭细菌、病毒和其他病原体。因此，细菌性阴道病患者宫颈阴道灌洗液MPO水平通常会升高。 [0145] 发明的有益效果 [0146] 本申请的卷曲乳杆菌和包含其的组合物具有高产酸能力和高产过氧化氢能力，能够维持女性生殖道酸性和健康的环境，并能够维持女性生殖道微生物群平衡。此外，本申请 的卷曲乳杆菌和包含其的组合物还能够显著的抑制生殖道最主要的致病菌—加德纳杆菌 的生长与生物膜的形成。并且，能够显著的降低阴道中唾液酸酶活性与髓过氧化物酶(MPO) 活性、显著降低促炎因子(例如，TNF‑α、IL‑1β和IL‑6)水平，并显著提高抑炎因子(例如，IL‑ 10)水平。因此，本申请的卷曲乳杆菌和包含其的组合物在女性生殖健康(特别是女性阴道 健康)中具有较高的应用价值。 [0147] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据优选实施方案的下 列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。 [0148] 关于生物材料保藏的说明 [0149] 卷曲乳杆菌M58D(Lactobacillus crispatus M58D)已在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC,Guangdong Microbial Culture Collection Center)进行保藏，其具有保藏号GDMCC No.63705，且保藏时间为2023年8月2 日。 [0150] 卷曲乳杆菌X25B(Lactobacillus crispatus X25B)已在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC,Guangdong Microbial Culture Collection Center)进行保藏，其具有保藏号GDMCC No.63707，且保藏时间为2023年8月2 日。 [0151] 格氏乳杆菌M17C(Lactobacillus gasseri M17C)已在位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼的广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC,Guangdong Microbial Culture Collection Center)进行保藏，其具有保藏号GDMCC No.63872，且保藏时间为2023年10月 12日。 具体实施方式[0152] 为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。 [0153] 除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。例如，本发明中所使用的免疫学、生物化学、化学、分子生物学、微生物学、细胞生物学、基因组学和重组DNA等常规技术，可参见萨姆布鲁克 (Sambrook)、弗里奇(Fritsch)和马尼亚蒂斯(Maniatis)，《分子克隆：实验室手册》 (MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL)，第2次编辑(1989)；《当代分子生物学实验手 册》(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.奥苏贝尔(F.M.Ausubel)等人编 辑，(1987))；《酶学方法》(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版公司)：《PCR 2：实用方法》(PCR2:A PRACTICAL APPROACH)(M.J.麦克弗森(M.J.MacPherson)、B.D.黑姆斯 (B.D.Hames)和G.R.泰勒(G.R.Taylor)编辑(1995))，以及《动物细胞培养》(ANIMAL CELLCULTURE)(R.I.弗雷谢尼(R.I.Freshney)编辑(1987))。 [0154] 另外，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓， 实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全 部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。 [0155] 实施例1.菌株的分离与鉴定 [0156] 1、卷曲乳杆菌的分离与鉴定 [0157] 本申请从大连市妇幼保健医院进行体检的60健康女性的阴道拭子中分离出100余株菌，并从中筛选到两株卷曲乳杆菌，并将其命名为卷曲乳杆菌M58D和X25B。其中，样本供 体的纳入标准为：年龄在22‑35岁；月经规律，且取样时未处于月经期；72小时内无性生活，无阴道给药及阴道冲洗；半年内未被诊断患妇科炎症疾病及泌尿系统炎症性疾病；妇科检 查没有发现阳性体征；1个月内未服用任何抗生素，3个月内未服用任何性激素；未受过子宫 切除术或宫颈子宫的创伤性治疗；患者近期未接受免疫抑制治疗；患者无严重的心、肝、肾 功能不全及相关并发症。阴道拭子样本采集完成后立即在‑80℃冰箱储存。 [0158] 菌株的培养采用MRS液体培养基、改良MRS固体培养基(向已配好的MRS液体培养基中添加2％的琼脂和1％碳酸钙，121℃高压灭菌15分钟)、BHI液体培养基、BHI固体培养基 (向已配好的液体培养基中添加2％琼脂，121℃高压灭菌15分钟)。使用前，待温度降至50℃ 左右，向其中添加10％无菌脱纤维绵羊血、乳酸杆菌选择性琼脂。 [0159] 将阴道拭子浸泡在装有生理盐水中，充分混匀5分钟。每个样本吸取100μl液体分别涂布于改良MRS、LBS、BHI固体培养基，37℃厌氧培养48‑72小时，挑取中等大小、凸起、乳白色的圆形菌落进行革兰染色镜检，光学显微镜下观察细菌形态、染色性。选择长杆状或球 杆状的革兰染色阳性菌的单克隆菌落继续纯化，直至确定为纯菌，挑取单克隆进行16S rRNA测序。 [0160] 测序结果显示，本申请分离到的两株菌株均为卷曲乳杆菌。进一步，采用PacBio Sequel2测序平台对卷曲乳杆菌M58D和X25B分别进行全基因组测定，并与NCBI数据库中记 载的卷曲乳杆菌菌株的全基因组序列进行比对。其中，卷曲乳杆菌M58D的基因组长度为 2188407bp，GC含36.86％。染色体基因组含有2264个编码基因，65个tRNA基因，4个rRNA基因(包括5s rRNA、16s rRNA和23s rRNA)，167个其他类型RNA基因。其中，卷曲乳杆菌X25B的基因组长度为2185354bp，GC含36.87％。染色体基因组含有2270个编码基因，66个tRNA基因，4个rRNA基因(包括5srRNA、16s rRNA和23s rRNA)，166个其他类型RNA基因。 [0161] 综合上述PCR鉴定和全基因组测序的实验结果，本申请获得了两株全新的卷曲乳杆菌M58D和X25B，并对其进行了保藏。 [0162] 2、格氏乳杆菌的分离与鉴定 [0163] 本申请从大连市妇幼保健医院进行体检的60健康女性的阴道拭子中分离出100余株菌，并从中筛选到一株格氏乳杆菌，并将其命名为格氏乳杆菌M17C。其中，样本供体的纳 入标准同上述。阴道拭子样本采集完成后立即在‑80℃冰箱储存。 [0164] 菌株的培养采用MRS液体培养基、改良MRS固体培养基(向已配好的MRS液体培养基中添加2％的琼脂和1％碳酸钙，121℃高压灭菌15分钟)、BHI液体培养基、BHI固体培养基 (向已配好的液体培养基中添加2％琼脂，121℃高压灭菌15分钟)。使用前，待温度降至50℃ 左右，向其中添加10％无菌脱纤维绵羊血、乳酸杆菌选择性琼脂。 [0165] 将阴道拭子浸泡在装有生理盐水中，充分混匀5分钟。每个样本吸取100μl液体分别涂布于改良MRS、LBS、BHI固体培养基，37℃厌氧培养48‑72小时，挑取中等大小、凸起、乳白色的圆形菌落进行革兰染色镜检，光学显微镜下观察细菌形态、染色性。选择长杆状或球 杆状的革兰染色阳性菌的单克隆菌落继续纯化，直至确定为纯菌，挑取单克隆进行16S rRNA测序。 [0166] 测序结果显示，本申请分离到的菌株为格氏乳杆菌。进一步，采用PacBio Sequel2测序平台对格氏乳杆菌M17C分别进行全基因组测定，并与NCBI数据库中记载的格氏乳杆菌 菌株的全基因组序列进行比对。其中，格氏乳杆菌M17C的基因组长度为2002365bp，GC含 34.6％。染色体基因组含有1962个编码基因，50个tRNA基因，5个rRNA基因(包括5s rRNA、 16s rRNA和23s rRNA)，56个其他类型RNA基因。 [0167] 综合上述PCR鉴定和全基因组测序的实验结果，本申请获得了一株全新的格氏乳杆菌M17C，并对其进行了保藏。 [0168] 实施例2.菌株体外益生功能测定 [0169] 该实施例中所使用的菌株均来自于汤臣倍健女性来源的益生菌菌库。测试的菌株分别为：阳性对照德氏乳杆菌DM8909(其商品名为“定君生”)，卷曲乳杆菌X25B、M60A、L54H、L54F和M58D，以及格氏乳杆菌M17C(这些乳杆菌均为通过实施例1所描述的方法分离和鉴定 获得的)。 [0170] 2.1菌株生长和产酸能力测定 [0171] 将分离出的乳杆菌按照2％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃恒温厌氧培养，测量生长24小时的OD值。产酸能力测定：测定空白MRS液体培养基的pH值。将分离出的乳杆菌接种于MRS液体培养基中，37℃恒温厌氧培养，24小时测定菌液pH值。ΔpH＝MRS液体培 养基的pH值‑24小时菌液pH值，表示乳杆菌产酸能力的量化指标。 [0172] 2.2菌株产过氧化氢能力测定 [0173] 菌株产生的过氧化氢有利于维持阴道的酸性环境。参考王江团队发表的“健康妇女阴道乳杆菌多样性分析及具有益生菌特征菌株的筛选”的方法，测定乳杆菌产过氧化氢 能力。 [0174] 溶液的配制：配制100mM PIPES(哌嗪N,N’‑二‑乙磺酸)和20mM TMB(四甲基联苯胺)。标准曲线的制作：首先用100mmol/LPIPES将浓度为30％的H2O2标准液稀释成1mol/L，再用100mmol/LPIPES将其分别稀释成0、20、40、60、80、100μmol/L H2O2工作液；分别取100μL工作液与100μL 20mmol/L TMB混合，最后向混合溶液中加入2μL HRP(辣根过氧化物酶，1mg/ mL)并混匀，室温孵育10分钟，使用酶标仪测量OD值并作出相应标准曲线。 [0175] 乳杆菌产H2O2的测定：复苏冻存的待测乳杆菌菌株及阳性对照“定君生”德氏乳杆菌DM8909，接种于液体培养基中，37℃厌氧培养24小时后，离心，吸取上清与同体积的 20mmol/L TMB混合，再加入HRP(1mg/mL)并混匀，室温孵育10分钟，测量OD值，代入上述标准曲线即可得到乳杆菌产H2O2的浓度。 [0176] 2.3菌株抑制阴道加德纳菌生物膜形成能力测定 [0177] 加德纳杆菌(Gardnerella vaginalis)，也称为加德纳菌或者阴道加德纳菌是细菌阴道炎主要的致病菌，生物膜的形成为阴道加德纳菌提供了一个安全的生长环境，使阴 道加德纳菌能够在阴道环境中大量存活，致使阴道酸性环境破坏。本实施例对不同乳杆菌 采用结晶紫染色法测定其对阴道加德纳菌生物膜的抑制作用。 [0178] 以上实施例以阳性药物菌株DM8909为对照，综合考虑菌株的产酸能力、产H2O2能力和抑制阴道加德纳菌生物膜形成能力，初步筛选出益生功能较好的乳杆菌。特别的，卷曲乳 杆菌X25B和M58D的产H2O2能力和抑制阴道加德纳菌生物膜形成能力显著的优于同属于卷曲 乳杆菌的其他菌株。结果如下： [0179] 表1.6株卷曲乳杆菌体外益生功能测定结果 [0180] [0181] [0182] 实施例3.三株混合益生菌对小鼠阴道炎的缓解作用 [0183] 该实施例采用阴道加德纳菌感染的小鼠阴道炎模型。 [0184] 3.1实验菌株重悬液的制备 [0185] 将用50％甘油保藏于‑80℃冰箱的乳杆菌(卷曲乳杆菌X25B、卷曲乳杆菌M58D和格氏乳杆菌M17C)使用MRS培养基进行活化三代后，以6000rpm离心10分钟，弃去上清液，用PBS 8 缓冲液清洗沉淀菌体3次，最终将菌体重悬于PBS缓冲液中，使活菌数量达到1×10CFU/mL， 得到动物实验干预乳杆菌菌液。同理，阴道加德纳菌在BHI液体培养基中活化三代后， 6000rpm离心10分钟，收集活化三代后阴道加德纳菌的菌体，清洗菌体3次，用PBS缓冲液重 9 悬菌体。最终，得到浓度为1×10CFU/mL的阴道加德纳菌菌液，用于动物实验造模期。 [0186] 3.2口服三株混合益生菌对小鼠阴道炎的缓解作用 [0187] 3.2.1动物实验设计 [0188] 7周龄雌性ICR小鼠饲养于温度20～23℃，湿度55±5％，光暗周期为12小时交替循环的SPF动物房中。 [0189] 实验开始之前，小鼠放置于饲养环境适应一周。实验设置空白对照组、BV模型组、德氏乳杆菌DM8909组、卷曲乳杆菌X25B：卷曲乳杆菌M58D：格氏乳杆菌M17C＝1:1:1的混合 菌株组。所有小鼠均采用标准配方商业化饲料喂养，自由采食和饮水方式。 [0190] 细菌性阴道炎模型建立：感染前3天(第‑3天)和感染当天(第0天)，除空白对照组外，其余小鼠均皮下注射100ul苯甲酸雌二醇(0.5mg溶于100ul芝麻油中)。第0天阴道接种 9 活菌数为10CFU/mL阴道加德纳菌菌悬液20ul，连续5天，直至第4天结束阴道加德纳菌接 种。接种后，将小鼠倒置1分钟，防止菌液流出。 [0191] 口服实验：从第5天开始，实验小鼠灌胃108CFU/mL干预乳杆菌菌液100ul，每天灌胃一次，共14天。空白对照组小鼠灌胃100ul PBS缓冲液，一天一次。最后一次灌胃完，所有实验小鼠采用颈椎脱臼被处死。 [0192] 3.2.2小鼠阴道上皮脱落细胞测定 [0193] 最后一天干预前，采集小鼠的阴道灌洗液，取5ul阴道灌洗液转移到载玻片上，用10ul吸头轻轻涂抹至约2厘米直径大小的圆形。使用酒精灯外焰固定后，进行革兰染色。在 40倍镜下随机计数3个显微镜视野内上皮细胞的脱落数作为脱落细胞计数。并在400倍镜、 1000倍镜下观察细胞的形态和细胞内粘附细菌的形态及染色性。结果见表2。 [0194] 3.2.3小鼠阴道组织病理学分析及上皮厚度测定 [0195] 将小鼠阴道组织用4％组织固定液进行固定与保存，经石蜡包埋后切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色。HE染色病理评分标准为：根据组织的完整性(结构清晰，细胞排列整 齐)，给予0‑5分的评分，其中，0分表示组织结构完好，5分表示结构组织完全破坏。切片标本显微镜下400倍放大观察并测定随机3个样本切片的上皮层厚度。 [0196] 表2.小鼠阴道上皮细胞脱落及组织病理结果 [0197] [0198] 注：*表示与空白组有显著性差异，#表示与模型组有显著性差异 [0199] 由表2结果可以看出，BV感染的小鼠阴道上皮细胞大量脱落，阴道上皮厚度显著降低，出现较为严重的病理状态；而阳性药物DM8909和混合菌株的干预显著改善了小鼠的病 理状态，使得阴道上皮细胞脱落量显著减少，阴道上皮厚度显著增加。而卷曲乳杆菌M58D的 干预显著降低了病理评分、使得阴道上皮细胞脱落量显著减少，阴道上皮厚度显著增加。而 卷曲乳杆菌M60A的干预则基本没有展现出作用，各项测试结果均显著的差于卷曲乳杆菌 M58D。 [0200] 与卷曲乳杆菌M58D相比，混合菌株的干预进一步降低了病理评分，甚至对阴道上皮厚度的改善效果优于阳性药物DM8909，显著提升了小鼠阴道的健康状况。 [0201] 3.2.4小鼠阴道灌洗液唾液酸苷酶活性及细胞因子的测定 [0202] 将小鼠阴道灌洗液离心，取10ul上清液用于实验。采用ELISA方法测定唾液酸酶活性，并将OD450 nm值与标准曲线进行比较。 [0203] 将小鼠阴道组织样品(50mg)置于300ul含1％蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液中，用高通量组织研磨仪破碎(70Hz，30s/次，10次)，得到阴道组织匀浆液。在4℃下， 14000rpm离心15分钟，取上清液采用ELISA方法进行髓过氧化物酶(MPO)活性测定和TNF‑α、IL‑1β、IL‑6、IL‑10浓度测定。 [0204] 表3.小鼠阴道组织MPO、炎症细胞因子和阴道灌洗液中的唾液酸酶的测定 [0205] [0206] 注：*表示与空白组有显著性差异，#表示与模型组有显著性差异 [0207] 由表3的结果可以看出，BV感染的小鼠阴道呈现显著的炎症反应，具体表现为阴道中的唾液酸酶活性和MPO酶活性上升，促炎因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的水平上升，以及抑炎因子IL‑10的水平下降；阳性药物DM8909的干预显著降低了阴道中唾液酸酶活性和MPO酶活 性，一定程度上改善了炎症反应。卷曲乳杆菌M58D的干预不仅显著降低了唾液酸酶活性和 MPO酶活性，同时显著降低了促炎因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的水平，很大程度上改善了炎症反应。卷曲乳杆菌M60A的干预则基本没有展现出作用，各项测试结果基本等同于BV模型组，显 著的差于卷曲乳杆菌X25B。 [0208] 与卷曲乳杆菌M58D相比，混合菌株的干预不仅显著降低了唾液酸酶活性和MPO酶活性，同时显著降低了促炎因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的水平，提高了抑炎因子IL‑10的水平，很大程度上改善了炎症反应。其中，混合菌株的干预对促炎因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的降低效果和对抑炎因子IL‑10的提高效果均优于阳性药物组，甚至使促炎因子IL‑1β、IL‑6的水平低于空白对照组。因此，口服混合菌株(卷曲乳杆菌X25B：卷曲乳杆菌M58D：格氏乳杆菌 M17C＝1:1:1)具有较好的改善BV引起的小鼠阴道炎症的作用。 [0209] 3.3外用三株混合益生菌对小鼠阴道炎的缓解作用 [0210] 3.3.1动物实验设计 [0211] 7龄雌性ICR小鼠饲养于温度20～23℃，湿度55±5％，光暗周期为12小时交替循环的SPF动物房中。 [0212] 实验开始之前，小鼠放置于饲养环境适应一周。实验设置空白对照组、BV模型组、德氏乳杆菌DM8909组、卷曲乳杆菌X25B：卷曲乳杆菌M58D：格氏乳杆菌M17C＝1:1:1的混合 菌株组。所有小鼠均采用标准配方商业化饲料喂养，自由采食和饮水方式。 [0213] 细菌性阴道炎模型建立：感染前3天(第‑3天)和感染当天(第0天)，除空白对照组外，其余小鼠均皮下注射100ul苯甲酸雌二醇(0.5mg溶于100ul芝麻油中)。第0天阴道接种 9 活菌数为10CFU/mL阴道加德纳菌菌悬液20ul，连续5天，直至第4天结束阴道加德纳菌接 种。接种后，将小鼠倒置1分钟，防止菌液流出。 [0214] 外用实验：从第5天开始，实验小鼠阴道接种108CFU/mL乳杆菌菌液20ul。将小鼠倒置，使用200ul移液吸头吸取20ul PBS重悬后的菌液打入小鼠阴道中，维持倒置姿势1分钟 避免菌液外流。每天接种一次，共14天。空白对照组小鼠阴道内接种20ul PBS缓冲液，一天 一次。最后一次接种完，所有实验小鼠采用颈椎脱臼被处死。 [0215] 3.3.2小鼠阴道上皮脱落细胞测定 [0216] 最后一天干预前，采集小鼠的阴道灌洗液，取5ul阴道灌洗液转移到载玻片上，用10ul吸头轻轻涂抹至约2厘米直径大小的圆形。使用酒精灯外焰固定后，进行革兰染色。在 40倍镜下随机计数3个显微镜视野内上皮细胞的脱落数作为脱落细胞计数。并在400倍镜、 1000倍镜下观察细胞的形态和细胞内粘附细菌的形态及染色性。结果见表4。 [0217] 3.3.3小鼠阴道组织病理学分析及上皮厚度测定 [0218] 将小鼠阴道组织用4％组织固定液进行固定与保存，经石蜡包埋后切片，并用苏木精和伊红(H&E)染色。HE染色病理评分标准为：根据组织的完整性(结构清晰，细胞排列整 齐)，给予0‑5分的评分，其中，0分表示组织结构完好，5分表示结构组织完全破坏。切片标本显微镜下400倍放大观察并测定随机3个样本切片的上皮层厚度。 [0219] 表4.小鼠阴道上皮细胞脱落及组织病理结果 [0220] [0221] 注：*表示与空白组有显著性差异，#表示与模型组有显著性差异 [0222] 由表4结果可以看出，BV感染的小鼠阴道上皮细胞大量脱落，阴道上皮厚度显著降低，出现较为严重的病理状态。卷曲乳杆菌M58D的干预显著改善了小鼠的病理状态，使得阴 道上皮细胞脱落量显著减少，显著降低了病理评分，阴道上皮厚度显著增加。而卷曲乳杆菌 M60A的干预则基本没有展现出作用，各项测试结果均显著的差于卷曲乳杆菌M58D。 [0223] 与卷曲乳杆菌M58D相比混合菌株的干预进一步改善了小鼠的病理状态，使得阴道上皮细胞脱落量显著减少，显著降低了病理评分，阴道上皮厚度显著增加，且混合菌株对于 改善上皮细胞厚度方面优于阳性药物菌株DM8909，显著提升了小鼠阴道的健康状况。 [0224] 3.3.4小鼠阴道灌洗液唾液酸苷酶活性及细胞因子的测定 [0225] 将小鼠阴道灌洗液离心，取10ul上清液用于实验。采用ELISA方法测定唾液酸酶活性，并将OD450 nm值与标准曲线进行比较。 [0226] 将小鼠阴道组织样品(50mg)置于300ul含1％蛋白酶抑制剂混合物的RIPA裂解液中，用高通量组织研磨仪破碎(70Hz，30s/次，10次)，得到阴道组织匀浆液。在4℃下， 14000rpm离心15分钟，取上清液采用ELISA方法进行髓过氧化物酶(MPO)活性测定和TNF‑α、IL‑1β、IL‑6浓度测定。 [0227] 表5小鼠阴道组织MPO、炎症细胞因子和阴道灌洗液中的唾液酸酶的测定 [0228] 空白组 BV模型组 DM8909组 M60A M58D 混合菌株组 MPO 26.9 34.4* 30.6 35.1 33.0 27.8# TNF‑α 545.3 709.4*** 565.2## 674.6 604.8 616.9 ### # # IL‑1β 74.0 120.2*** 79.6 101.2 99.6 92.7## ## IL‑6 58.1 82.2** 60.7 76.1 70.9 73.5 ### 唾液酸酶 44.5 57.1*** 47.4 57.4 53.7 51.6# [0229] 注：*表示与空白组有显著性差异，#表示与模型组有显著性差异 [0230] 由表5的结果可以看出，BV感染的小鼠阴道呈现显著的炎症反应，具体表现为阴道中的唾液酸酶活性和MPO酶活性上升，促炎因子TNF‑α、IL‑1β、IL‑6的水平上升；阳性药物DM8909和卷曲乳杆菌M58D的干预显著降低了阴道中唾液酸酶活性和促炎因子TNF‑α、IL‑1 β、IL‑6的水平，一定程度上改善了炎症反应。而卷曲乳杆菌M60A的干预则基本没有展现出作用，各项测试结果均显著的差于卷曲乳杆菌X25B。 [0231] 与卷曲乳杆菌M58D相比，混合菌株的干预进一步降低了唾液酸酶活性、MPO酶活性和促炎因子IL‑1β的水平，一定程度上改善了炎症反应。因此，外用混合菌株(卷曲乳杆菌 X25B：卷曲乳杆菌M58D：格氏乳杆菌M17C＝1:1:1)具有潜在改善BV引起的小鼠阴道炎症的 作用。 |
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