一种具有功能性的双超分子相互作用水凝胶、制备方法及应用
| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; 授权; |
| 专利有效性 | 有效专利 | 当前状态 | 授权 |
| 申请号 | CN202210121032.1 | 申请日 | 2022-02-09 |
| 公开(公告)号 | CN114605665A | 公开(公告)日 | 2022-06-10 |
| 申请人 | 复旦大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 陈国颂; 姚琳通; 丁澦; 胡榕婷; | 第一发明人 | 陈国颂 |
| 权利人 | 复旦大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 复旦大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：上海市 | 城市 | 当前专利权人所在城市：上海市杨浦区 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：上海市杨浦区邯郸路220号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：200433 |
| 主IPC国际分类 | C08J3/075 | 所有IPC国际分类 | C08J3/075 ; C08L5/16 ; C08L89/00 ; C08L87/00 ; C07K19/00 ; C12N5/0786 |
| 专利引用数量 | 2 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 14 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 上海正旦专利代理有限公司 | 专利代理人 | 王洁平; |
| 摘要 | 本 发明 公开了一种具有功能性的双超分子相互作用 水 凝胶、制备方法及应用。水凝胶是由 荧光 蛋白‑高分子 聚合物 结合体、纳米 抗体 多聚体和α‑环糊精反应得到，荧光蛋白‑高分子聚合物结合体由修饰有反应位点的绿色荧光蛋白GFP和 马 来酰亚胺‑聚乙二醇反应得到，修饰有反应位点的绿色荧光蛋白GFP的序列如SEQ ID NO：1所示，纳米抗体多聚体的序列如SEQ ID NO：2所示。本发明的水凝胶通过双超分子相互作用实现很高的 弹性模量 和粘性模量，并且无毒 副作用 ，可用于 生物 材料 ；其可形貌转变，可以有效地招募和活化巨噬细胞，表现出 肿瘤 免疫 治疗 的前景；可用于细胞成像，具有优异的推广应用价值和潜 力 。 | ||
| 权利要求 | 1.一种具有功能性的双超分子相互作用水凝胶，其特征在于，其由荧光蛋白‑高分子聚合物 |
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| 说明书全文 | 一种具有功能性的双超分子相互作用水凝胶、制备方法及应用 技术领域背景技术[0002] 聚合物水凝胶是由三维网络结构的聚合物和大量的水组成。特别是近几年来，人们对它的研究兴趣日益浓厚，因为水凝胶中含有大量的水和少量的有机物，是一种绿色的软材料。然而，采用化学交联剂交联的水凝胶存在一些缺陷，例如：力学强度差和易脆等。目前研究最多的准聚轮烷(PPR)水凝胶是由PEG和α‑环糊精(α‑CD)组成，串在PEG上的α‑CD之间可以形成结晶微区，成为物理交联点，但是其强度较低限制了其生物应用。为了解决这个问题，目前利用蛋白质多聚体作为聚合物水凝胶的交联点，可以极大地改善水凝胶的强度，但是这种水凝胶功能应用范围小，限制了其生物应用。 [0003] 纳米抗体(Nanobody，NB)是一类新型抗体，它以结构稳定、分子量小、易于表达纯化、免疫原性低为典型特征，近年来迅速发展为颇具潜力的治疗性蛋白质。但是纳米抗体结构自身并不存在天然的结构域进行二聚或多聚，为了将纳米抗体多聚化，一个简便的办法是将其与能够多聚化的蛋白质序列表达成融合蛋白质，从而赋予纳米抗体多聚化的能力。卷曲螺旋(Coiled‑coils，CC)是一种在天然蛋白质中广泛存在的超二级结构或结构域，特指2‑5条α‑螺旋卷曲在一起，成类似绳索的结构，并具有Cn或Dn对称性。近年来，卷曲螺旋已经发展称为一种较为成熟的对蛋白质进行理性设计的手段，通过卷曲螺旋可以很方便地把相同或不同的蛋白质结构域整合在一起，从而赋予其新的功能。在上述研究基础的启发下，将纳米抗体多聚化作为构筑基元引入自组装体系，并且取代化学交联剂交联实现功能性水凝胶的制备具有广阔的发展空间。遗憾的是，这方面研究目前文献中还没有关注。因此，研发基于纳米抗体多聚体为主体的功能性水凝胶用于生物医药领域具有重要意义与价值。 发明内容[0004] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有良好的生物相容性的双超分子相互作用水凝胶、制备方法及其应用。本发明通过构筑卷曲螺旋(Coiled‑coils，CC)与荧光蛋白纳米抗体(NBGFP)的融合蛋白质，得到纳米抗体多聚体(NBGFP‑CC)，利用纳米抗体与其荧光蛋白GFP之间的特异性作用为水凝胶提供稳定的交联部分，同时，通过串在GFP‑PEG链上的α‑环糊精(α‑CD)之间形成结晶微区，成为物理交联点。本发明水凝胶基于纳米抗体多聚体与其蛋白质为主体同时具有形貌转变、荧光成像、招募与活化巨噬细胞的特点，能为基于纳米抗体多聚体水凝胶制备和生物应用提供新的思路。 [0005] 本发明的技术方案具体介绍如下。 [0006] 本发明公开了一种具有功能性的双超分子相互作用水凝胶，其由荧光蛋白‑高分子聚合物结合体、纳米抗体多聚体在pH 7.2的PBS缓冲液中，4℃的温度下先反应10‑30h，再加入α‑环糊精反应10‑30h制备得到；其中： [0007] 所述荧光蛋白‑高分子聚合物结合体通过融合表达巯基的荧光蛋白、高分子聚合物和还原剂三(2‑羧乙基)膦TCEP在pH 7.2的PBS缓冲液中亲核加成反应得到；融合表达巯基的荧光蛋白的尾部有暴露出巯基SH的半胱氨酸残基，其由绿色荧光蛋白GFP在蛋白质序列的C端添加一段甘氨酸柔性链，并最后添加半胱氨酸Cys获得；高分子聚合物为马来酰亚胺‑聚乙二醇PEG‑MAL，其化学结构式如下： [0008] [0009] 所述纳米抗体多聚体通过卷曲螺旋蛋白单向融合纳米抗体，并在卷曲螺旋蛋白与纳米抗体之间通过一段短肽连接获得，短肽的作用是为了提供卷曲螺旋蛋白有足够空间来卷曲，所述卷曲螺旋蛋白为二聚体， [0010] 本发明中，荧光蛋白‑高分子聚合结合体、纳米抗体多聚体和α‑环糊精的摩尔比为2：1：(100‑200)。 [0011] 本发明中，融合表达巯基的荧光蛋白制备时，绿色荧光蛋白GFP在蛋白质序列的C端添加的一段甘氨酸柔性链的序列为GGGGGGG。 [0012] 本发明中，融合表达巯基的荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 [0013] 本发明中，高分子聚合物PEG‑MAL中，修饰马来酰亚胺MAL的聚乙二醇PEG的分子量在2000‑10000之间。 [0014] 本发明中，纳米抗体多聚体制备时，用于连接卷曲螺旋蛋白与纳米抗体的一段短肽的序列为GGSGGGSGGGSG。 [0015] 本发明中，纳米抗体多聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。 [0016] 本发明还提供一种上述具有功能性的双超分子相互作用水凝胶的制备方法，其由荧光蛋白‑高分子聚合物结合体、纳米抗体多聚体在pH 7.2的PBS缓冲液中，4℃的温度下先反应10‑30h，再加入α‑环糊精反应10‑30h制备得到；其中： [0017] 所述荧光蛋白‑高分子聚合物结合体通过融合表达巯基的荧光蛋白、高分子聚合物和还原剂三(2‑羧乙基)膦TCEP在pH 7.2的PBS缓冲液中亲核加成反应得到；融合表达巯基的荧光蛋白的尾部有暴露出巯基SH的半胱氨酸残基，其由绿色荧光蛋白GFP在蛋白质序列的C端添加一段甘氨酸柔性链，并最后添加半胱氨酸Cys获得；高分子聚合物为马来酰亚胺‑聚乙二醇PEG‑MAL，其化学结构式如下： [0018] [0019] 所述纳米抗体多聚体通过卷曲螺旋蛋白单向融合纳米抗体，并在卷曲螺旋蛋白与纳米抗体之间通过一段短肽连接获得，所述卷曲螺旋蛋白为二聚体；短肽的作用在于提供卷曲螺旋蛋白有足够空间来卷曲； [0020] 所述α‑环糊精的化学结构式如下： [0021] [0022] 本发明中，荧光蛋白‑高分子聚合结合体、纳米抗体多聚体和α‑环糊精的摩尔比为2：1：(100‑200)。 [0023] 本发明中，制备荧光蛋白‑高分子聚合物结合体时，融合表达巯基的荧光蛋白、高分子聚合物和三(2‑羧乙基)膦TCEP的摩尔比为1：(10‑20)：(5‑10)，反应结束后，使用Ni‑NTA亲和层析柱及阴离子交换柱除去多余的原料和提纯；荧光蛋白‑高分子聚合结合体制备时增大高分子聚合物的比例有利于增加荧光蛋白‑高分子聚合物结合体的产率。 [0024] 本发明中，融合表达巯基的荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。 [0025] 本发明中，纳米抗体多聚体的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示， [0026] 进一步的，本发明还提供一种上述的双超分子相互作用水凝胶在免疫细胞成像和活化免疫细胞方面的应用。优选的，免疫细胞是巨噬细胞。 [0027] 和现有技术相比，本发明的有益效果在于： [0028] 本发明的水凝胶通过双超分子相互作用实现很高的弹性模量和粘性模量，并且无毒副作用，可用于生物材料；另一方面由于其可形貌转变，可以有效地招募和活化巨噬细胞，表现出肿瘤免疫治疗的前景，同时绿色荧光蛋白GFP可以用于细胞成像，实现了荧光成像和免疫活化于一体的新型生物医用材料，具有优异的推广应用价值和潜力。附图说明 [0029] 图1为NBGFP‑CC蛋白SDS‑PAGE图。 [0030] 图2为NBGFP‑CC蛋白分子体积排阻色谱SEC图。 [0031] 图3为GFP‑SH蛋白与不同分子量PEG复合物SDS‑PAGE图。 [0032] 图4为mCherry‑SH蛋白与10000分子量PEG复合物SDS‑PAGE图。 [0033] 图5为GFP与NBGFP‑CC蛋白结合ITC图。 [0034] 图6为GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶图。 [0035] 图7为GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶流变数据图。 [0036] 图8为GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶形貌转变TEM图。 [0037] 图9为GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶XRD图。 [0038] 图10为GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶对巨噬细胞毒性实验结果图。 [0039] 图11为GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶促进巨噬细胞迁移图。 [0040] 图12为GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶促进巨噬细胞活化。 具体实施方式[0041] 以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。 [0042] 表1为GFP‑SH、NBGFP‑CC、mCherry‑SH蛋白的氨基酸序列。 [0043] [0044] 实施例中，具有荧光成像与免疫活化的GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶，荧光蛋白GFP、卷曲螺旋与荧光蛋白纳米抗体(NBGFP‑CC)通过大肠杆菌表达，基于化学修饰合成聚合物修饰的荧光蛋白GFP‑PEG10000，α‑CD为环糊精。 [0045] 实施例中，同时合成对照组，采用红色荧光蛋白mCherry，所述红色荧光蛋白mCherry的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，基于化学修饰合成聚合物修饰的荧光蛋白mCherry‑PEG10000。 [0046] 实施例1 [0047] 1、卷曲螺旋(Coiled‑coils，CC)构筑纳米抗体多聚体NBGFP‑CC [0048] 我们将荧光蛋白质纳米抗体(NBGFP)与二聚化的卷曲螺旋单向融合，具体实施步骤如下： [0049] (1)原核表达载体的构建。参考NCBI中已发表的相关序列信息，全基因合成两端分别带有BamH I和Xho I酶切位点的NBGFP‑CC碱基序列，通过对该目的片段和表达载体(pET28a‑sumo)的双酶切处理，并使用凝胶电泳纯化回收双酶切产物，再利用T4连接酶连接NBGFP‑CC和pET28a‑sumo。将连接产物转化至DH5α感受态，挑选单克隆经测序验证后获得pET28a‑sumo‑NBGFP‑CC质粒； [0050] (2)重组蛋白NBGFP‑CC的诱导表达及纯化。sumo‑NBGFP‑CC质粒经测序检验正确后，转化至BL21(DE3)感受态中过夜培养，待菌液浑浊后取4‑5mL转入1L含0.1mg/mL抗生素的LB培养基大规模诱导表达。37℃培养至OD600为0.6‑0.8后，将温度降至20℃诱导培养20h。将表达菌在1000bar的高压下破碎，以18000rpm/min的转速离心1h，收集上清。采用5mL的Ni‑NTA亲和层析柱进行纯化，用含咪唑的缓冲溶液梯度竞争洗脱，检测UV280吸光值并收集出峰位置的洗脱样品。我们纯化的样品是带sumo标签的融合蛋白sumo‑NBGFP‑CC，为了得到无标签的NBGFP‑CC进行后续组装实验，使用ULP1酶过夜切除sumo标签，再将酶切后的产物反挂Ni‑NTA层析柱，平衡缓冲液为20mM Tris‑HCl(pH 8.0),500mM NaCl和10mM咪唑，洗脱缓冲液为平衡缓冲液加500mM咪唑得到的混合液。收集洗脱峰对应的洗脱液最终得到无标签的荧光融合蛋白NBGFP‑CC。纯化样品用十二烷基硫酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PAGE)测试纯度，并用分光光度计法(NanoDrop 2000)测定蛋白浓度。实验结果如图1所示。 [0051] (3)分子体积排阻色谱SEC验证NBGFP‑CC蛋白为螺旋二聚体。本实验选用Cytiva公司的Superdex200increase 10/300，Superdex 75increase 10/300以及Biorad公司的SEC 650分子筛，连上GE AKTA Purifier的管路并用缓冲液平衡至UV280基线稳定，将流速设为 0.8mL/min，报警压力设为3.0Mpa。设置程序平衡约0.2倍柱体积，上样200μL，冲洗1.2个柱体积，每管收集1.5mL，选取UV280出峰位置的流出液进行取样，SDS‑PAGE电泳验证分析。实验结果如图2所示。 [0052] 从图1的SDS‑PAGE结果图可以看出，我们构建的纳米抗体多聚体NBGFP‑CC的分子量为30kDa，与理论分子量一致。图2SEC实验结果表明，箭头所示的二聚体NBGFP‑CC主要以单峰形式存在，其主峰的中心位置在14.3mL处，根据标准分子量蛋白质在同一分子筛出峰位置进行计算，NBGFP‑CC出峰位置的分子量约为60kDa，主要以二聚体的形式存在。 [0053] 实施例2 [0054] 1、荧光蛋白质‑聚合物缀合物的设计与制备 [0055] 我们对本发明中所使用的荧光蛋白质序列进行设计，通过分子克隆技术，在荧光蛋白的C端添加一段甘氨酸柔性链GGGGGGG，并在尾部设计有半胱氨酸残基以暴露出巯基反应基团(‑SH)。具体实施步骤如下： [0056] (1)原核表达载体的构建，具体实施步骤如实施例1(1)所示； [0057] (2)荧光蛋白的诱导表达与纯化，具体实施步骤如实施例1(2)所示； [0058] (3)GFP‑SH分别与分子量为2000、5000、10000的PEG修饰的马来酰亚胺或者mCherry‑SH与分子量为10000的PEG修饰的马来酰亚胺按照1:10当量，与三(2‑羧乙基)膦TCEP按照1:5当量，在pH 7.2的PBS缓冲液中，4℃过夜反应，利用通过SDS‑PAGE蛋白质电泳验证蛋白质的后修饰效率，并使用Ni‑NTA亲和层析柱，阴离子交换柱去除未反应的PEG，最终得到组分单一的荧光蛋白‑高分子聚合物结合体。实验结果如图3、4所示。 [0059] 从图SDS‑PAGE胶图可以看出，图3实验结果表明我们GFP‑SH的分子量为25kDa，与理论分子量一致，同时，GFP‑SH可以与不同分子量PEG‑MAL成功连接，结果表现为分子量变大；图4结果的表明mCherry‑SH的分子量为25kDa，与理论分子量一致，同时，mCherry‑SH可以与不同分子量PEG‑MAL成功连接。 [0060] 实施例3 [0061] 1、等温量热滴定法(ITC)验证GFP与NBGFP‑CC的结合 [0063] (1)在注射器和样品池中加入样品，样品池加入样品200μL，20nM GFP‑PEG10000，注射器加入60μL，350nM NBGFP‑CC蛋白，参照池中需加入PBS缓冲液； [0064] (2)设置实验参数，总注射次数为19次，测试温度为25±0.01℃，实验开始至第一次滴定的间隔时间，通常设60秒。然后点击Start即可开始实验； [0065] (3)仪器自动缓冲液清洗。 [0066] 实验结果如图5所示。从图5的结果可以看出，20nM GFP‑PEG10000滴定350nM NBGFP‑CC蛋白，结果表明两个蛋白的结合产生更高的放热量，并且存在着相互作用和较强的相互作用力，摩尔结合比接近1:1，本发明制备的GFP‑PEG10000复合物可以与NBGFP‑CC蛋白以相当于共价键的作用力结合，结合力常数KD为19nM。 [0067] 实施例4 [0068] 1.GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶制备 [0069] 将纯化浓缩好的GFP‑PEG10000复合物，NBGFP‑CC蛋白和α‑CD在反应体系中按照2mM：1mM：100mM的比例在4℃条件下反应过夜搅拌，即可得到GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶。为了验证GFP‑PEG10000与NBGFP之间的结合对于GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶的形成发挥重要作用，同时，本发明使用mCherry‑PEG10000替换掉GFP‑PEG10000，该复合物体系mCherry/NBGFP‑CC/α‑CD为流动液体，无法成为水凝胶。实验结果如图6所示。 [0070] 2.GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶强度检测 [0071] 本实验在旋转流变仪(Haake MARS III)上测试，设置温度梯度为18‑38℃，距离大小为1mm，动态频率为1Hz。实验结果如图7所示。 [0072] 从图6的结果可以看出，我们制备的GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶可以在玻璃瓶底部倒放不动，进一步地，我们用旋转流变仪检测该凝胶的流变数据，从图7的结果可以看出G'储能模量高于G”损耗模量，表明我们成功制备GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶，模4 量高于10Pa，表现出良好的生物材料应用前景。 [0073] 实施例5 [0074] 1.透射电子显微镜(TEM)验证GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶形貌转变[0075] 本实验在Tecnai G2(200KV)透射电子显微镜上测试。水凝胶样品从24μM倍比稀释为8μM(GFP蛋白浓度)，再滴在普通300目铜栅格上，2min后用滤纸吸干，自然风干，滴加5μL 2wt％磷酸钨染色液(pH调至中性)，30秒后用滤纸吸干，再自然风干1min。使用Image J软件统计纳米粒子的直径。实验结果如图8所示。 [0076] 从图8的结果可以看出，我们制备的GFP/NBGFP‑CC/α‑CD超分子水凝胶在PBS倍比稀释的情况下，形貌从大块聚集体转变为纳米球形粒子，出现明显的形貌转变。 [0077] 实施例6 [0078] 1.X射线衍射分析(XRD)验证GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶PPR效应 [0079] XRD实验在Bruker D2型X射线多晶粉末衍射仪上进行，采用Cu Ka为激发源管压为30KV，管流为40mA，扫描速率为3°/min。所有样品为冻干状态。实验结果如图9所示。 [0080] 从图9的XRD结果表明，只有GFP/NBGFP‑CC/α‑CD凝胶在2θ＝20°处出现了强特征峰，代表的是α‑CD和PEG形成的管道型络合物。 [0081] 实施例7 [0082] 1.CCK8实验验证GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶细胞毒性 [0083] 细胞毒性实验是利用CCK‑8试剂盒检测细胞脱氢酶活性，评估不同稀释比例的GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶(以GFP蛋白浓度为主，设置2.5μM–0.63μM)对巨噬细胞RAW 264.7的细胞毒性。不同稀释比例的GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶与RAW 264.7共孵育24小时，之后向其中加入10％的CCK‑8试剂再孵育2小时，利用吸收光酶标仪检测450nm下的吸光度。同时用激光共聚焦显微镜(CLSM)检测巨噬细胞RAW 264.7对稀释后GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶的吞噬和成像作用。实验结果如图10所示。 [0084] 图10(a)的OD450值表明：稀释后GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶对巨噬细胞RAW 264.7的毒性作用在GFP蛋白浓度为2.5μM时没有细胞毒性，表现出良好的生物相容性。图10(b)CLSM实验结果表明，RAW 264.7细胞显示出明显的GFP的绿色荧光，表明RAW 264.7可以吞噬稀释后的GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶并用于荧光成像。 [0085] 实施例8 [0086] 1.GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶招募巨噬细胞 [0087] (1)RAW264.7细胞调整细胞密度为1×107个/mL，Transwell小室上室加入100μL，24孔板加入750μL完全培养基，同时加入GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶(以GFP浓度为主，浓度为 2.5μM)； [0089] (3)光学显微镜拍摄成像图片。 [0090] 实验结如图11所示。 [0091] 2.ELISA验证GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶转变为纳米颗粒对巨噬细胞的影响[0092] 稀释后的GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶，同时设置对照组，(以GFP蛋白浓度为主，2.5μM)刺激巨噬细胞RAW 264.7 24小时，收集上清液，用TNF‑α、IL‑6ELISA试剂盒检测TNF‑α、IL‑6的分泌，具体实验过程如下： [0093] (1)TNF‑α、IL‑6包被抗体在4℃条件下孵育过夜； [0094] (2)PBST洗3遍，每孔体积200μL； [0095] (3)ELISA稀释液封闭2小时，加入标准品或检测样品孵育2小时； [0096] (4)PBST洗3遍，每孔体积200μL； [0097] (5)加入检测抗体孵育1小时，加入HRP‑avidin孵育30分钟，TMB显色； [0098] (6)利用酶标仪检测450nm下的吸光度。用IL‑12标准品的吸光度拟合曲线，计算样品中TNF‑α、IL‑6浓度。实验结果如图12所示。 [0099] 从图11的实验结果可以看出，对比对照组，稀释后GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶可以招募RAW 264.7细胞迁移到下室，表现出明显的差异；从图12的实验结果可以看出，对比其他对照组：脂多糖(LPS)、GFP‑PEG10000与α‑CD混合(GFP+α‑CD)、mCherry与NBGFP和α‑CD三组分混合(mCherry/NBGFP/α‑CD)、mCherry与α‑CD混合(mCherry+α‑CD)、NBGFP与PEG10000和α‑CD三组分混合(mCherry+PEG+α‑CD)、Ctl为空白对照组，RAW 264.7细胞吞噬稀释后的GFP/NBGFP‑CC/α‑CD水凝胶(GFP‑Nano)可以激活巨噬细胞RAW 264.7分泌炎症因子TNF‑α和IL‑6，表现出良好的肿瘤免疫治理应用前景。 |
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