一种多不饱和化合物的分子、合成方法及用途 |
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| 申请号 | CN202010875784.8 | 申请日 | 2020-08-27 | 公开(公告)号 | CN111960968A | 公开(公告)日 | 2020-11-20 |
| 申请人 | 北京大学深圳研究生院; | 发明人 | 卢菲; 李洋; 许正双; 李旺; 张涛; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供一种多不饱和化合物的分子、合成方法及用途。本发明产物对细胞的毒性不明显。与二甲双胍相比，本发明的化合物促进细胞糖代谢的能 力 均增强。本发明产物在200uM浓度下，对细胞生长没有明显影响。与二甲双胍相比，本发明产物促进细胞糖代谢的药物浓度显著降低，有效药物浓度比二甲双胍低20倍左右。本发明的系列化合物具有比二甲双胍更强的促进糖消耗的作用，且作用浓度显著降低。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种多不饱和化合物的分子，其特征在于：具有以下结构通式的化合物： |
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| 说明书全文 | 一种多不饱和化合物的分子、合成方法及用途技术领域[0001] 本发明属于化学领域，具体为一种多不饱和化合物的分子、合成方法及用途。 背景技术[0002] 葡萄糖是人类生命活动所需能量的重要来源，为生物体新陈代谢必需的营养物质。葡萄糖也是生物大分子的重要组成成分。分布于细胞膜上的糖脂和糖蛋白，形成膜表面抗原和受体分子，在细胞识别和信号传导中起决定性作用。同时，糖脂和糖蛋白还是神经组织的重要成分，对于维持神经细胞的正常功能必不可少。蛋白质分子的糖基化修饰，可以形成抗体、酶和激素等具有重要生物活性的物质。葡萄糖还具有加强记忆、刺激钙质吸收等作用。此外，由于肿瘤细胞主要通过糖酵解途径获得能量，从而其对葡萄糖的依赖性也远高于机体的正常细胞。因此，调节细胞对葡萄糖的吸收能力，无论是促进，还是抑制细胞吸收葡萄糖，都将具有广泛的生物学应用潜力。 发明内容[0003] 本发明提供一类具有非共轭多烯烃的衍生物具有调节细胞对葡萄糖吸收能力的分子。具体如下： [0004] 一种多不饱和化合物的分子，具有以下结构通式的化合物： [0005] [0007] X为O或NH。 [0008] Y为NH2或NHR。R为C(＝O)Z或C(＝NH)Z。Z为NHAr、NHR1或OR2。补充地说，这里的C(＝O)Z、C(＝NH)Z则是双键的意思。 [0010] R1和R2均为C1-C8直链或支链烷基、酰基、胍基、脲基、硫脲基。 [0011] 进一步说，所述取代的苯环，是指取代基为任意位置的卤素、C1-C8的直链或支链烷基、氨基、羧基、酰胺、磺酸基、磺酰氨基或芳杂环。 [0012] 进一步说，磺酰氨基是指：氨基为伯胺、取代的氨基。芳杂环是指：吡啶、噻吩、噻唑、噁唑、咪唑、吲哚或喹啉。 [0013] 进一步说，R1和R2也可为C1-C8直链或支链烷基、酰基、胍基、脲基、硫脲基的取代形式。 [0014] 本发明所述的一种多不饱和化合物的分子的合成方法之一，按如下步骤进行： [0016] 步骤2：氮气保护下在圆底烧瓶中加入1,4-二氧六环，随后依次加入化合物1和正丁醇，加热至回流反应10小时。冷却至室温后减压蒸馏除去溶剂，残留物加乙酸乙酯稀释随后依次使用饱和氯化铵溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤旋干并用硅胶柱色谱分离得淡黄色油状化合物，即为最终产物。 [0017] 本发明所述的一种多不饱和化合物的分子的合成方法之二，按如下步骤进行： [0018] 步骤1：将EPA溶解于30mL无水四氢呋喃中，冰浴下分批加入氢化铝锂并反应3小时至原料完全反应。加入饱和酒石酸钾钠溶液淬灭反应后加入乙酸乙酯稀释，随后依次使用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化氨溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤旋干得淡黄色油状化合物3直接投入下一步反应。 [0019] 步骤2：将化合物3溶解于无水四氢呋喃中，氮气保护下依次加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺、三苯基膦、偶氮二甲酸二乙酯，室温下搅拌3小时后加入乙酸乙酯稀释随后依次使用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化氨溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤旋干并用硅胶柱色谱分离得淡黄色油状化合物。将前述油状化合物溶解于四氢呋喃和甲醇的混合溶液中，剧烈搅拌下缓慢滴加水合肼溶液并持续反应2个小时。反应完全后减压蒸馏除去溶剂，残留物用硅胶柱色谱分离得淡黄色油状化合物即为最终产物。 [0020] 本发明所述的一种多不饱和化合物的分子的用途，该多不饱和化合物对葡萄糖代谢起到调节作用。 [0021] 进一步说，该多不饱和化合物对葡萄糖代谢进行抑制性的调节。 [0022] 进一步说，在相同抑制效果下，本多不饱和化合物的使用剂量为二甲双胍的0.01至0.10。 [0023] 进一步说，本多不饱和化合物可用在二型糖尿病的糖代谢抑制或肿瘤细胞糖代谢抑制等领域。 [0024] 有益的技术效果 [0025] 本发明产物对细胞的毒性不明显。 [0026] 与二甲双胍相比，本发明的化合物促进细胞糖代谢的能力均增强。 [0027] 本发明产物在200uM浓度下，对细胞生长没有明显影响。 [0028] 与二甲双胍相比，本发明产物促进细胞糖代谢的药物浓度显著降低，有效药物浓度比二甲双胍低20倍左右。 [0030] 图1为PUFA化合物对细胞生长的影响的示意图。 [0031] 图2为PUFA化合物对葡萄糖吸收的调节作用的示意图。 [0032] 图3为PUFA-13和二甲双胍对细胞生长的影响的示意图。 [0033] 图4为短时间处理下，PUFA-13对细胞吸收葡萄糖的影响的示意图。 [0034] 图5为高浓度下，PUFA-12和PUFA-13对细胞代谢葡萄糖的影响的示意图。 [0036] 图7为实施例2的合成流程图。 [0037] 图8为实施例3的合成流程图。 [0038] 图9为实施例4的合成流程图。 [0039] 图10为实施例5的合成流程图。 [0040] 图11为实施例6的合成流程图。 [0041] 图12为实施例7的合成流程图。 [0042] 图13为实施例8的合成流程图。 [0043] 图14为实施例9的合成流程图。 [0044] 图15为实施例10的合成流程图。 [0045] 图16为实施例11的合成流程图。 [0046] 图17为实施例12的合成流程图。 [0047] 图18为实施例13的合成流程图。 [0048] 图19为实施例1至13(图6至18)产物的化学式及编号的对照图。 具体实施方式[0049] 现结合附图详细说明本发明的技术特点。 [0050] 实施例1 [0051] 参见图6，化合物1的合成： [0052] 将omega-3二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic acid，EPA)(2.0g,6.6mmol)溶解于10mL甲苯中，室温下加入三乙胺(2.2mL，15mmol)及叠氮磷酸二苯酯(DPPA)(2.75g, 10mmol)，搅拌6个小时后减压蒸馏除去溶剂，剩余物使用硅胶柱色谱分离得淡黄色油状化合物1(1.62g，75％)。 [0053] 氮气保护下在圆底烧瓶中加入1,4-二氧六环10mL，随后依次加入化合物1(327mg，1mmol)和正丁醇(0.91mL，10mmol)，加热至回流反应10小时。冷却至室温后减压蒸馏除去溶剂，残留物加50mL乙酸乙酯稀释随后依次使用饱和氯化铵溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤旋干并用硅胶柱色谱分离得淡黄色油状化合物PUFA-003(246mg，66％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.41–5.12(m,10H),4.61(s,1H),4.07–3.89(m,2H), 3.16–3.00(m,2H),2.80–2.65(m,8H),2.07–1.90(m,4H),1.56–1.40(m,4H),1.36–1.19(m, 2H),0.95–0.75(m,6H)-ppm；HRMS C24H39NO2Na+[M+Na]+理论值：396.2873，实测值：396.2873。 [0054] 实施例2 [0055] 参见图7，以omega-3二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)为原料合成路线如上，实验操作参考实施例1合成得到PUFA-004。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.50–5.13(m,12H),4.64(s,1H),3.94(t,J＝6.7Hz,2H),3.19–3.01(m,2H),2.83–2.64(m,11H),2.25– 2.10(m,2H),2.07–1.88(m,2H),1.58–1.38(m,2H),1.36–1.20(m,2H),0.97–0.74(m,6H)ppm；HRMS C26H41NO2Na+[M+Na]+理论值：422.3030，实测值：422.3030。 [0056] 实施例3 [0057] 参见图8，利用中间体1与对甲基苯胺反应，实验操作参考实施例1合成得到PUFA-1 005。HNMR(300MHz,CDCl3)δ7.56(s,1H),7.05(d,J＝8.4Hz,2H),6.93(d,J＝8.3Hz,2H), 5.75(t,J＝5.7Hz,1H),5.40–5.14(m,10H),3.13–2.97(m,2H),2.84–2.59(m,8H),2.17(s, 3H),2.10–1.85(m,4H),1.47–1.29(m,2H),0.89(t,J＝7.5Hz,3H)ppm；HRMS C27H38N2ONa+[M+Na]+理论值：429.2876，实测值：429.2876。 [0058] 实施例4 [0059] 参见图9，利用中间体2与对甲基苯胺反应，实验操作参考实施例1合成得到PUFA-006。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.09–6.95(m,4H),6.21(s,1H),5.51–5.10(m,12H),4.73(t,J＝5.8Hz,1H),3.19(td,J＝6.7,5.6Hz,2H),2.73(dt,J＝10.5,5.7Hz,10H),2.22(s,3H), 2.21–2.15(m,2H),2.06–1.90(m,2H),0.88(t,J＝7.5Hz,3H)ppm；HRMS C29H41N2O+[M+H]+理论值：433.3213，实测值：433.3202。 [0060] 实施例5 [0061] 参见图10，利用中间体1与糠胺反应，实验操作参考实施例1合成得到PUFA-007。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.24(dd,J＝1.9,0.8Hz,1H),6.21(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.11(dd,J＝3.2,0.9Hz,1H),5.80(s,1H),5.39–5.12(m,11H),4.32(d,J＝5.5Hz,2H),2.79–2.63(m,10H),2.10(dd,J＝8.3,6.9Hz,2H),2.06–1.91(m,5H),1.69–1.56(m,2H),0.87(t,J＝ 7.5Hz,3H)ppm；HRMS C25H36N2O2Na+[M+Na]+理论值：419.2669，实测值：419.2668。 [0062] 实施例6 [0063] 参见图11，利用中间体2与糠胺反应，实验操作参考实施例1合成得到PUFA-008。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.21(d,J＝1.8Hz,1H),6.18(dd,J＝3.2,1.9Hz,1H),6.07(d,J＝3.2Hz,1H),5.46–5.20(m,12H),5.20–5.07(m,1H),4.90(t,J＝5.7Hz,1H),4.21(d,J＝ 5.7Hz,2H),3.09(td,J＝6.8,5.6Hz,2H),2.85–2.64(m,12H),2.24–2.06(m,2H),2.06–1.90(m,2H),0.88(t,J＝7.5Hz,3H)ppm；HRMS C27H39N2O2+[M+H]+理论值：423.3006，实测值： 423.3007。 [0064] 实施例7 [0065] 参见图12，利用中间体2与甘氨酸乙酯反应，实验操作参考实施例1合成得到PUFA-012。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.49–5.22(m,12H),4.14(q,J＝2.5Hz,2H),3.93(d,J＝5.5Hz, 2H),3.25–3.14(m,2H),2.82–2.64(m,10H),2.29–2.17(m,2H),2.12–1.96(m,2H),1.24(t,J＝3.5Hz,3H),0.93(t,J＝7.5Hz,3H)ppm；HRMS C26H41N2O3+[M+H]+理论值：429.3112，实测值： 429.3115。 [0066] 实施例8 [0067] 参见图13，将EPA(3.1g，10mmol)溶解于30mL无水四氢呋喃中，冰浴下分批加入氢化铝锂(380mg，10mmol)并反应3小时至原料完全反应。加入饱和酒石酸钾钠溶液(10mL)淬灭反应后加入100mL乙酸乙酯稀释，随后依次使用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化氨溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤旋干得淡黄色油状化合物3直接投入下一步反应。将化合物3(2.5g，8.7mmol)溶解于30mL无水四氢呋喃中，氮气保护下依次加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺(1.6g，10mmol)、三苯基膦(2.6g，10mmol)、偶氮二甲酸二乙酯(1.7g，10mmol)，室温下搅拌3小时后加入70mL乙酸乙酯稀释随后依次使用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化氨溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用无水硫酸钠干燥后，过滤旋干并用硅胶柱色谱分离得淡黄色油状化合物(2.35g，62％)。将前述油状化合物(2.35g，5.4mmol)溶解于四氢呋喃和甲醇的混合溶液(70mL，THF:MeOH＝2:5)中，剧烈搅拌下缓慢滴加水合肼溶液并持续反应2个小时。反应完全后减压蒸馏除去溶剂，残留物用硅胶柱色谱分离得淡黄色油状化合物PUFA-010(1.5g，91％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.41–5.22(m,10H),3.64–3.49(m,2H),2.74(dt,J＝10.9,5.3Hz,8H),1.98(p,J＝8.0,7.6Hz,4H),1.60–1.42(m,2H), 1.42–1.25(m,2H),0.88(t,J＝7.5Hz,3H)ppm；HRMS C20H34NO+[M+H]+理论值：304.2635，实测值：304.2634。 [0068] 实施例9 [0069] 参见图14，利用DHA为原料，实验操作参考实施例8合成得到PUFA-011。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.39–5.12(m,12H),3.56(t,J＝6.5Hz,2H),2.82–2.64(m,10H),2.09–1.87(m,4H),1.62–1.46(m,2H),0.87(t,J＝7.5Hz,3H)ppm；HRMS C22H35NONa+[M+Na]+理论值：330.2791，实测值：330.2791。 [0070] 实施例10 [0071] 参见图15，将化合物PUFA-010(303mg，1mmol)和N-氰基-N’,N’-二甲基胍(120mg,1.1mmol)依次溶解于10mL正丁醇溶液中，室温下加入浓盐酸溶液(100uL)，随后加热至回流反应12小时，待原料完全消失后冷却至室温并减压蒸馏除去溶剂，残留物使用制备薄层色谱板进行分离得到油状化合物PUFA-001(15mg，3.6％)。1HNMR(500MHz,Chloroform-d)δ 5.49–5.25(m,10H),3.86(t,J＝6.6Hz,2H),2.96(s,6H),2.89–2.77(m,8H),2.16–2.02(m, 4H),1.70–1.61(m,2H),1.51–1.39(m,2H),0.98(t,J＝7.5Hz,3H)ppm；MS-ESI C24H42N5O++ [M+H]理论值：416，实测值：416。 [0072] 实施例11 [0073] 参见图16，利用PUFA-011为原料，实验操作参考实施例11合成得到PUFA-002。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ5.50–5.23(m,12H),3.88(t,J＝6.5Hz,2H),3.22(s,6H),2.90–2.75(m,10H),2.24–2.02(m,4H),1.76–1.62(m,2H),0.97(t,J＝7.5Hz,3H)ppm；MS-ESI C26H44N5O+[M+H]+理论值：442，实测值：442。 [0074] 实施例12 [0075] 参见图17，利用PUFA-010和双精胺为原料，实验操作参考实施例11合成得到PUFA-009。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.51–5.27(m,10H),3.89(t,J＝6.6Hz,2H),2.83(dt,J＝17.2,5.7Hz,8H),2.15–2.05(m,2H),1.64(h,J＝6.3Hz,4H),1.41(dq,J＝24.5,7.5Hz, 2H),1.04–0.93(m,3H)ppm；MS-ESI：C22H38N5O+[M+H]+理论值：388，实测值：388。 [0076] 实施例13 [0077] 参见图18，利用中间体1与甘氨酸乙酯反应，实验操作参考实施例1合成得到PUFA-015。1H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ5.57–5.24(m,10H),5.15(t,J＝5.4Hz,1H),4.89(t,J＝5.8Hz,1H),4.21(q,J＝7.1Hz,2H),4.00(d,J＝5.4Hz,2H),3.19(td,J＝7.4,5.8Hz,2H), 2.84(dt,J＝10.5,5.3Hz,8H),2.19–2.00(m,4H),1.68–1.49(m,2H),1.29(t,J＝7.2Hz, 3H),0.98(t,J＝7.5Hz,3H).HRMS：C24H38N2O3Na+[M+Na]+理论值：425.2775，实测值： 425.2785。 [0078] 实施例14 PUFA化合物的细胞毒性测试 [0079] 参见图1，将HepG2细胞按照每孔1.5*10^5接种于24孔板中，24小时后，每孔加入50uM或者100uM PUFA1-PUFA15化合物，继续培养48小时后，胰酶消化细胞，计数细胞数量，以DMSO为对照，其细胞数量设为100％，化合物处理孔的细胞数量与DMSO孔对比，获得相对细胞数量。如图1所示，1，2，3，4，8，9，14号化合物的细胞毒作用较强，在50uM和100uM时，均引起细胞明显死亡，13号化合物在100uM时对细胞的毒性较明显，其余化合物在100uM浓度下，对细胞的毒性不明显。 [0080] 实施例15 PUFA化合物对细胞吸收葡萄糖的影响 [0081] 参见图2，将HepG2细胞按照每孔5*10^3接种于96孔板中，24小时后，弃去孔中原有的培养液，更换成含有预期浓度小分子化合物的培养基。小分子化合物处理48小时后，每孔取20μL培养液加入到180μL葡萄糖检测试剂中，37度反应15分钟，505nm波长读数，计算葡萄糖的相对消耗量。以DMSO为药物空白对照，二甲双胍为药物阳性对照。如图2所示，与DMSO相比，100uM小分子处理下，细胞对葡萄糖的消耗均有所增加。与二甲双胍相比，PUFA系列化合物促进细胞糖代谢的能力均增强。 [0082] 二甲双胍是一种双胍类口服降血糖药，为目前临床使用最为普遍的口服降血糖药物之一，可通过无氧酵解促进葡萄糖的利用，适用于单纯饮食控制及体育锻炼治疗无效的2型糖尿病，尤其是肥胖和伴高胰岛素血症糖尿病患者的治疗。细胞水平，PUFA系列化合物表现出比二甲双胍更强的促糖消耗能力，但其降糖效果，仍需在动物水平进行进一步验证。 [0083] 图19为实施例1至13(图6至18)产物的化学式及编号的对照图。 [0084] 实施例16高浓度下，PUFA-13和二甲双胍的细胞毒性作用检测 [0085] 参见图3，将HepG2细胞按照每孔5*10^3接种于96孔板中，24小时后，弃去孔中原有的培养液，更换成含有预期浓度小分子化合物的培养基。小分子化合物处理46小时后，每孔加入CCK8检测试剂20uL，37度孵育1小时后，于495nm波长下读板，计算细胞的相对生长速度。以二甲双胍作为阳性对照。如图3所示，PUFA-13在200uM浓度下，对细胞生长没有明显影响，而二甲双胍在2mM浓度下，对细胞生长亦无明显影响。 [0086] 实施例17短时间处理下，PUFA-13对细胞吸收葡萄糖的影响 [0087] 参见图4，将HepG2细胞按照每孔5*10^3接种于96孔板中，24小时后，弃去孔中原有的培养液，更换成含有预期浓度小分子化合物的培养基。小分子化合物处理24小时后，每孔取20μL培养液加入到180μL葡萄糖检测试剂中，37度反应15分钟，505nm波长读数，计算葡萄糖的相对消耗量。以DMSO为药物空白对照，二甲双胍为药物阳性对照。如图4所示，与二甲双胍相比，PUFA-13促进细胞糖代谢的药物浓度显著降低，有效药物浓度比二甲双胍低20倍左右。 [0088] 实施例18高浓度下，PUFA-12和PUFA-13对细胞代谢葡萄糖的影响 [0089] 参见图5，将HepG2细胞按照每孔5*10^3接种于96孔板中，24小时后，弃去孔中原有的培养液，更换成含有预期浓度小分子化合物的培养基。小分子化合物处理48小时后，每孔取20μL培养液加入到180μL葡萄糖检测试剂中，37度反应15分钟，505nm波长读数，计算葡萄糖的相对消耗量。以DMSO为药物空白对照，二甲双胍为药物阳性对照。如图5所示，PUFA-12和PUFA-13均比二甲双胍具有更强的促进糖代谢作用，其中PUFA-12比PUFA-13具有更强的促葡萄糖消耗的作用。但是在高浓度药物处理条件下，细胞生长状态明显变差，代谢能力也相应减弱，其中PUFA-13比PUFA-12对细胞的生长影响更明显。 [0090] 以上结果提示，PUFA系列的化合物具有比二甲双胍更强的促进糖消耗的作用，且作用浓度显著降低，但最大使用浓度不宜超过200uM。 |
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