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一株桔绿木霉及其在降解鱼蛋白中的应用
申请号	CN202210310897.2	申请日	2022-03-28	公开(公告)号	CN114574372B	公开(公告)日	2023-06-20
申请人	山东省林业科学研究院;			发明人	杨庆山; 张淑静; 王静; 陈迪; 周健; 马安宝; 魏海霞; 王莉莉; 王振猛; 何明明; 孙超;
摘要	本发明公开了一株桔绿木霉及其在降解鱼蛋白中的应用。本发明自马尾松树皮中筛选到对鱼蛋白具有高效降解作用的桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1，该菌株已于2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23215。该菌株不仅能够高效降解鱼蛋白，同时对棉花黄萎病菌和芋头枯萎病菌也具有较好的抑制作用，可开发成以该菌株为功能菌株的新型鱼蛋白功能肥。
权利要求	1.一株桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1，其保藏编号为：CGMCC NO.23215。 2.一种微生物菌剂，其特征是，以权利要求1所述的桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1为主要有效成分。 3.权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征是，采用PDB培养基对桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1进行发酵，将发酵液过滤除去菌丝体，即得到桔绿木霉 0‑1的孢子悬液；孢子悬液为该菌株微生物菌剂。 4.权利要求1所述的桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1或者权利要求2所述的微生物菌剂在降解鱼蛋白方面的应用。 5.权利要求1所述的桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1或者权利要求2所述的微生物菌剂在抑制棉花黄萎病菌方面的应用。 6.权利要求1所述的桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1或者权利要求2所述的微生物菌剂在抑制芋头枯萎病菌方面的应用。 7.权利要求2所述的微生物菌剂在制备鱼蛋白功能肥方面的应用。 8.如权利要求7所述的应用，其特征是，所述的应用是通过降解鱼蛋白以及抑制作物病菌生长来实现的。 9.采用权利要求2所述的微生物菌剂降解鱼蛋白的方法，其特征是，将新鲜的鱼在粉碎机充分粉碎，制成鱼原浆，按照质量比1:0.5～1.5的比例将鱼原浆与水充分混合制成鱼浆；将微生物菌剂按3～10％的质量比加入鱼浆中，发酵降解36～60h。
说明书全文	一株桔绿木霉及其在降解鱼蛋白中的应用技术领域 [0001] 本发明涉及一株桔绿木霉及其在降解鱼蛋白中的应用，属于微生物技术领域。背景技术 [0002] 随着现代农业与绿色农业的急速发展，传统化学肥料已无法满足农业生产要求，农产品生产效率低、农产品安全问题越来越凸显，因此，急需多功能、新型肥料来代替传统化学肥料，促进现代绿色农业向前发展。近年来，新型肥料取得飞速的发展。其中，鱼蛋白类肥料就是当下最受欢迎的一款新型肥料。鱼蛋白降解后产生的多种氨基酸和小肽，对于提高作物品质有明显的促进作用，同时能够螯合中微量元素，有利于养分的吸收利用，进而利于作物的生长和果实品质的提高。 [0003] 目前，鱼蛋白降解方法主要有酸解、碱解和酶解三种方法。酸解与碱解方法虽然简单价廉，但由于反应条件剧烈，生产过程中氨基酸受损严重，且难以按规定的水解程度控制水解过程，故较少采用；酶解法在较温和的条件下进行的，能在一定条件下定位水解分裂蛋白质产生特定的肽，且易于控制水解进程，能够较好的满足肽生产的需要，但生物酶价格昂贵，制取工艺复杂，推广性不足。因此，当下急需降解效率高、生产工艺简单且价格适中的降解工艺。 [0004] 在这一背景下，微生物降解法逐渐成为研究热点。但目前对降解鱼蛋白报道主要中在生物酶类物质与酸解法相互结合上，对高效降解鱼蛋白的微生物菌株鲜有报道。 CN202111306622.3公开了一种甲鱼生物活性肽的制备方法，采用肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株的组合对甲鱼蛋白进行发酵处理，同时添加了适合于肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株发酵的发酵辅料，肉桂色曲霉和乳酸乳球菌乳酸亚种菌株可产生多种不同的蛋白酶，从而使甲鱼蛋白分解成多种不同的小分子肽链，该方法虽然采用菌株降解甲鱼蛋白，但是其制备活性多肽为主的食品，不适合在肥料中使用。发明内容 [0005] 鉴于此，本发明筛选到一株桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)菌株0‑1，该菌株不仅能够高效降解鱼蛋白，同时对棉花黄萎病菌和芋头枯萎病菌也具有较好的抑制作用，可开发成以该菌株为功能菌株的新型鱼蛋白功能肥，为深海鱼资源开发制备功能性鱼蛋白肥料提供了新的途径。 [0006] 本发明自马尾松树皮中筛选到对鱼蛋白具有高效降解作用的桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1，该菌株已于2021年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23215。将该菌株接种在PDA平板上，28℃恒温进行培养，分别在2d、4d观察菌落特征。结果表明，该菌株在PDA平板上菌丝平均生长速度为 18.7mm/d；前期，菌落呈白色，菌丝疏松，柳絮状，在接种处即出现黄绿色分生孢子；后期，菌落形成同心环，在同心环处产生稠密的暗绿色分生孢子，平板背面呈褐色。 [0007] 本发明还提供了一种桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1微生物菌剂，其特征是，采用PDB培养基对桔绿木霉0‑1进行发酵(28±2℃下培养60～72h)，将发酵液过滤除去菌丝体，即得到桔绿木霉0‑1的孢子悬液；孢子悬液即为该菌株微生物菌剂。 [0008] 本发明还公开了上述桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1及其微生物菌剂在降解鱼蛋白方面的应用。 [0009] 本发明还公开了上述桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1及其微生物菌剂在抑制棉花黄萎病菌方面的应用。 [0010] 本发明还公开了上述桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1及其微生物菌剂在抑制芋头枯萎病菌方面的应用。 [0011] 本发明还公开了上述微生物菌剂在制备鱼蛋白功能肥方面的应用。 [0012] 本发明还提供了桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)0‑1降解鱼蛋白的方法，其特征是，将新鲜的鱼在粉碎机充分粉碎，制成鱼原浆，按照质量比1:0.5～1.5的比例将鱼原浆与水充分混合制成鱼浆；将微生物菌剂按3～10％的质量比加入鱼浆中，发酵降解36～60h。 [0013] 本发明的有益效果是： [0014] 1、高效降解鱼蛋白 [0015] 桔绿木霉0‑1具有高效降解鱼蛋白特性；以桔绿木霉0‑1为原料制备的微生物菌剂，处理鱼浆48h后，游离氨基酸的总和为15.37％，是未处理鱼浆游离氨基酸总和10.25倍；说明该菌株具有高效降解鱼蛋白特性； [0016] 2、抗病性 [0017] 该菌株对棉花黄萎病菌和芋头枯萎病菌的生长具有良好的抑制效果，抑制率分别为 77.78％和85.19％。以该菌株为功能菌株可开发成新型鱼蛋白功能肥，该肥料兼具促生长、抗病等功效。 [0018] 3、该菌株采用通常的PDB培养基即可发酵生产，便于推广使用，从而为深海鱼资源开发制备功能性鱼蛋白肥料提供了新的途径。附图说明： [0019] 图1为桔绿木霉0‑1水解鱼蛋白产生的水解圈； [0020] 图2为桔绿木霉0‑1的菌落形态； [0021] 图3为桔绿木霉0‑1对棉花黄萎病菌和芋头枯萎病菌抑制效果。具体实施方式 [0022] 实施例1：菌株的分离与鉴定 [0023] 1.菌株0‑1分离 [0024] 本发明的桔绿木霉菌株0‑1是从山东省烟台长岛马尾松林场马尾松树皮采集，并利用稀释平板法分离获得的。具体方法如下： [0025] 1.1样品处理： [0026] 采集山东省烟台长岛马尾松林场马尾松树皮，将采集的样品用蒸馏水清洗干净，2 取适量称重并将其剪成1mm的组织块；将其浸泡在75％乙醇溶液中40～60s，然后在0.1％的升汞溶液中浸泡约80s后，再放入75％的乙醇浸泡30s；取出后用无菌水冲洗4～6次； [0027] 1.2菌样获取： [0028] 将处理完的样品放入装有10mL无菌水和少许灭过菌的石英砂的无菌研钵内，利用研磨棒充分研磨成匀浆，用移液枪吸取5mL于无菌试管中，即为菌样； [0029] 1.3稀释涂布： [0030] 利用10倍稀释法将菌样依次稀释成10‑1～10‑4稀释度的菌样；分别从10‑2、10‑3和‑410 稀释度的菌样中吸取100μL涂布于含有孟加拉红琼脂培养基平板上，每个梯度涂布三个平行。 [0031] 孟加拉红琼脂培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，无水硫酸镁0.5g，孟加拉红0.033g，氯霉素0.1g，琼脂20g，水1000mL。上述各成分(孟加拉红和氯霉素除外) 加入蒸馏水中溶解后，再将孟加拉红溶液加入培养基中，分装后，121℃灭菌25min。倾注平板前，另用少量乙醇溶解氯霉素加入培养基。 [0032] 1.4培养纯化： [0033] 在28℃培养48h后挑取培养基上的不同形态的真菌菌落于PDA培养基平板上，定时观察菌落生长情况；不断纯化菌株，确认单菌落后编号保存。PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，琼脂15～20g，水1000mL，pH自然。分装，121℃灭菌25min。 [0034] 通过上述方法，共计筛选分离到8株菌，分别编号为0‑1～0‑8。 [0035] 2.菌株0‑1筛选 [0036] 利用水解圈法对筛选分离到的8株菌的降解鱼蛋白活性进行筛选。具体方法： [0037] 2.1菌株活化 [0038] 将分离得到的8株菌于含PDA培养基的平板上28℃恒温培养36h； [0039] 2.2含鱼蛋白筛选培养基制备 [0040] 将新鲜的青鳟鱼(青占鱼)于粉碎机充分粉碎，制成鱼原浆，将鱼原浆按照4％含量加入PDA培养基中制成筛选培养基； [0041] 筛选培养基：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)10～20g，鱼原浆40g，琼脂15～20g，水 1000mL，pH自然。分装，121℃灭菌25min。 [0042] 2.3接种观察 [0043] 用打孔器打取上述活化菌株的菌饼(5mm)，接种于含有筛选培养基的平板中央，28℃恒温培养2d，观察各处理有无水解圈。 [0044] 结果显示，在分离得到的8株菌中，只有菌株0‑1具有水解鱼蛋白能力(表1)；其在含鱼蛋白的培养基上具有明显的水解圈(图1)。 [0045] 表1不同菌株水解鱼蛋白情况汇总表 [0046] [0047] 备注：有水解圈为“+”级，无水解圈为“－”级 [0048] 3.菌株0‑1形态学及分子生物学鉴定 [0049] 3.1形态学特征 [0050] 将菌株0‑1接种在PDA平板上，28℃恒温进行培养，分别在2d、4d观察菌落特征。 [0051] 结果发现，该菌株在PDA平板上菌丝平均生长速度为18.7mm/d；前期，菌落呈白色，菌丝疏松，柳絮状，在接种处即出现黄绿色分生孢子；后期，菌落形成同心环，在同心环处产生稠密的暗绿色分生孢子，平板背面呈褐色(图2)。 [0052] 3.2分子生物学鉴定 [0053] 将菌株0‑1活化后，挑取菌盘接种到含玻璃纸的PDA培养基中，28℃恒温培养48h，收集上层菌丝体，用滤纸压干后，液氮研磨成粉末，用CTAB法提取真菌基因组DNA，将提取基因组送至测序公司进行测序。所述菌株的rDNA基因序列测定结果(ITS1区)如下(SEQ No.1)： [0054] TTTCAGAGTTTGGGGTGTTTTACGGCTGTGGCCGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTG TGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGGCGGC CCGGTGAGGGGCCGATCCCCAACGCCGACCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGA CGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCG ATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATG CCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTCGAGACGCCCGCTAGGG TCGCCGAGAAAGGCTCAGAGCAAAAATAAAACAGAGCCGCGACGTAGGCCGCGACGG AGAGAAAAAAGAGTTTGAGTTGGTCCTCCGGCGGGCGCCATGGGATCCGGGGCTGCGA CGCGCCCGGGGCAGAGAATCCCGCCGAGGCAACAGATTGGTAACGCTTCT。 [0055] 经形态学及分子生物学鉴定菌株0‑1为桔绿木霉(Trichoderma citrinoviride)，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址中国北京，保藏日期：2021年8月20日，保藏编号为CGMCC NO.23215。 [0056] 实施例2：桔绿木霉0‑1微生物菌剂制备 [0057] (1)将桔绿木霉0‑1活化后接种于PDA平板表面，28℃恒温培养48h； [0058] (2)打孔器在活化菌株边缘处打菌饼，接种于种子液培养基中，28℃、120r/min摇瓶培养72h，得到桔绿木霉0‑1的种子液； [0059] 所述种子液培养基即PDB培养基：马铃薯200g，葡萄糖(或蔗糖)15g，水1000mL， pH自然。分装，121℃灭菌25min。 [0060] (3)将步骤(2)制备的种子液接种到发酵培养基中，接种质量比为1:50，发酵培养基同种子液培养基，发酵条件同步骤(2)，得到桔绿木霉0‑1的发酵液。 [0061] (4)将桔绿木霉0‑1的发酵液在无菌条件下进行过滤，除去菌丝体，即得到桔绿木8 ‑1 霉0‑1 的孢子悬液；孢子悬液即为该菌株微生物菌剂；孢子悬液浓度为5×10CFU·mL 。 [0062] 实施例3：桔绿木霉0‑1高效降解鱼蛋白功能验证 [0063] (1)实验方法 [0064] 将新鲜的青鳟鱼(青占鱼)于粉碎机充分粉碎，制成鱼原浆，按照质量比1:1的比例将鱼原浆与水充分混合制成鱼浆；取200mL鱼浆于500mL的无菌三角瓶中，按照质量比5％接种量接入桔绿木霉0‑1的孢子悬液；对照组按照5％接种量接入发酵培养基(即PDB培养基)，每一处理重复三瓶。 [0065] 处理完成后，于28℃、120r/min条件下发酵48h，取样送至中国广州分析测试中心检测游离氨基酸含量。 [0066] (2)结果分析 [0067] 结果分析发现，未经桔绿木霉0‑1孢子悬液处理的样品，游离氨基酸的总和为1.5％(表 2)；经桔绿木霉0‑1孢子悬液处理的样品，游离氨基酸的总和为15.37％(表3)。进一步分析发现，经桔绿木霉0‑1孢子悬液处理后，17种游离氨基酸含量都明显增加，以组氨酸和赖氨酸增加最多。说明，桔绿木霉0‑1能够高效降解鱼肉中所含鱼蛋白，为深海鱼资源开发制备功能性鱼蛋白肥料提供了新的途径。 [0068] 表2对照组的游离氨基酸含量 [0069] [0070] 表3桔绿木霉0‑1孢子悬液处理后游离氨基酸含量 [0071] [0072] [0073] 实施例4：桔绿木霉0‑1对棉花黄萎病菌和芋头枯萎病菌生长抑制效果[0074] 将在PDA平板上活化好的桔绿木霉0‑1、棉花黄萎病菌和芋头枯萎病菌分别打孔(5mm)，备用。在距PDA平板中央4cm两侧分别接种桔绿木霉0‑1与病原菌。每一处理重复3次。处理完后，于28℃恒温培养箱培养2d，观察抑菌情况，计算抑菌率。计算方法：抑菌率＝[(拮抗菌菌落半径‑病原菌菌落半径)/拮抗菌菌落半径]×100％。 [0075] 结果发现，桔绿木霉0‑1能够显著抑制棉花黄萎病菌和芋头枯萎病菌菌丝生长，在菌株接触部位形成明显的拮抗带(图3)。通过计算抑菌率可知，桔绿木霉0‑1对棉花黄萎病菌和芋头枯萎病菌的抑制率分别为77.78％和85.19％(表4)。 [0076] 表4桔绿木霉0‑1对两种病原菌抑菌率统计 [0077] [0078] 以上结果说明，桔绿木霉0‑1具有高效降解鱼蛋白的同时，还具有一定的抑菌效果，这为鱼蛋白新型、多功能肥料的开发奠定了基础。

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