分离核酸的方法

专利类型 发明公开 法律事件 公开; 实质审查; 撤回;
专利有效性 无效专利 当前状态 撤回
申请号 CN201880063328.4 申请日 2018-07-25
公开(公告)号 CN111465692A 公开(公告)日 2020-07-28
申请人 星技术有限公司; 申请人类型 企业
发明人 E·J·H·威; W·安德森; Y·S·格雷瓦尔; 第一发明人 E·J·H·威
权利人 星技术有限公司 权利人类型 企业
当前权利人 星技术有限公司 当前权利人类型 企业
省份 当前专利权人所在省份: 城市 当前专利权人所在城市:
具体地址 当前专利权人所在详细地址:澳大利亚,昆士兰 邮编 当前专利权人邮编:
主IPC国际分类 C12N15/10 所有IPC国际分类 C12N15/10C12Q1/6806B33Y99/00
专利引用数量 10 专利被引用数量 1
专利权利要求数量 53 专利文献类型 A
专利代理机构 北京戈程知识产权代理有限公司 专利代理人 程伟; 程云;
摘要 本公开涉及一种从含有核酸的样品中分离核酸的方法,该方法包括:(a)在允许样品中的核酸可逆地结合至基质的条件下,将样品暴露于热塑性 聚合物 基质;(b)在优先除去结合至所述基质的非核酸杂质的条件下,洗涤(a)中结合核酸的基质;以及(c)将(b)中洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液,从而从基质中回收核酸。
权利要求

1.一种从含有核酸的样品中分离核酸的方法,所述方法包括:
(a)在允许样品中的核酸可逆地结合至基质的条件下,将样品暴露于热塑性聚合物基质;
(b)在优先除去结合至所述基质的非核酸杂质的条件下,洗涤(a)中结合核酸的基质;

(c)将(b)中洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液,从而从基质中回收核酸;
其中,所述热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述热塑性聚合物基质选自聚酰胺、聚乳酸、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、和前述任何一种的复合材料合金
3.根据权利要求2所述的方法,其中所述复合材料或合金包含聚乳酸。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和金属的合金。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述金属选自
6.根据权利要求3所述的方法,其中所述热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和的复合材料。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述样品是生物样品。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述生物样品选自血液、血清、血浆、尿液、精液、和脊髓液。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述生物样品是细胞裂解物。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述样品包括离液盐。
11.根据权利要求10所述的方法,其中所述样品包含离液盐,所述离液盐的量为约
375mM至约6M。
12.根据权利要求11所述的方法,其中(a)中细胞裂解物包含离液盐,所述离液盐的量为约1.5M。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的方法,其中所述离液盐是盐酸胍。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中所述热塑性聚合物基质具有平均直径为约1mm至约3mm的细长结构。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法,其中所述热塑性聚合物基质具有长度为约1至约30mm的细长结构。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述热塑性聚合物基质具有约10mm至约15mm的长度。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法,其中步骤(a)包括将样品暴露于所述热塑性聚合物基质约0.5秒至约5分钟的时间。
18.根据权利要求17所述的方法,其中步骤(a)包括将样品暴露于所述热塑性聚合物基质约0.5秒至约1分钟的时间。
19.根据权利要求17所述的方法,其中步骤(a)包括将样品暴露于所述热塑性聚合物基质约0.5秒至约30秒的时间。
20.根据权利要求17所述的方法,其中步骤(a)包括将样品暴露于所述热塑性聚合物基质约0.5秒至约1秒的时间。
21.根据权利要求17至20中任一项所述的方法,其中将样品暴露于所述热塑性聚合物基质包括将所述热塑性聚合物基质浸入所述样品中。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法,其中步骤(b)包括在水中洗涤结合核酸的基质。
23.根据权利要求22所述的方法,其中步骤(b)包括在水中洗涤结合核酸的基质约5秒至约1分钟的时间。
24.根据权利要求22所述的方法,其中步骤(b)包括将结合核酸的基质浸入水中。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法,其中所述洗脱缓冲液是PCR缓冲液。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的方法,其中步骤(c)包括将洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液约0.5秒至约5分钟的时间。
27.根据权利要求26所述的方法,其中步骤(c)包括将洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液约0.5秒至约1分钟的时间。
28.根据权利要求26所述的方法,其中步骤(c)包括将洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液约0.5秒至约1秒的时间。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法,其中将洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液细胞包括将所述洗涤的结合核酸的基质浸入洗脱缓冲液中。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法,进一步包括从步骤(c)中回收的核酸扩增靶核酸序列。
31.根据权利要求30所述的方法,其中在所述热塑性聚合物基质的存在下,在反应容器中扩增靶核酸。
32.一种组合物,其包含通过权利要求1至29中任一项所述的方法回收的核酸。
33.一种用于从细胞裂解物中分离核酸的试剂盒,所述试剂盒包含:
(a)热塑性聚合物基质;
(b)洗脱缓冲液;和
(c)任选地,细胞裂解缓冲液;
其中所述热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
34.根据权利要求33所述的试剂盒,其中所述热塑性聚合物基质选自聚酰胺、聚乳酸、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、和前述任何一种的复合材料或合金。
35.根据权利要求34所述的试剂盒,其中所述复合材料或合金包含聚乳酸。
36.根据权利要求35所述的试剂盒,其中所述热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和金属的合金。
37.根据权利要求36所述的试剂盒,其中所述金属选自铜和铝。
38.根据权利要求35所述的试剂盒,其中所述热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和碳的复合材料。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的试剂盒,其中所述试剂盒包含细胞裂解缓冲液。
40.根据权利要求39所述的试剂盒,其中所述细胞裂解缓冲液包含离液盐。
41.根据权利要求40所述的试剂盒,其中所述细胞裂解缓冲液包含离液盐,所述离液盐的量为约375mM至约6M。
42.根据权利要求41所述的试剂盒,其中所述细胞裂解缓冲液包含离液盐,所述离液盐的量为约1.5M。
43.根据权利要求39至42中任一项所述的试剂盒,其中所述离液盐是盐酸胍。
44.根据权利要求33至43中任一项所述的试剂盒,其中所述热塑性聚合物基质具有平均直径为约1mm至约3mm的细长结构。
45.根据权利要求33至44中任一项所述的试剂盒,其中所述热塑性聚合物基质具有长度为约1至约30mm的细长结构。
46.根据权利要求45所述的试剂盒,其中所述热塑性聚合物基质具有约10mm至约15mm的长度。
47.根据权利要求33至46中任一项所述的试剂盒,其中所述洗脱缓冲液是PCR缓冲液。
48.一种热塑性聚合物基质,其用于根据权利要求1至29中任一项所述的方法从含有核酸的样品中分离核酸,其中所述热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
49.根据权利要求48所述的热塑性聚合物基质,其中所述热塑性聚合物基质选自聚酰胺、聚乳酸、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯、和前述任何一种的复合材料或合金。
50.根据权利要求49所述的热塑性聚合物基质,其中所述复合材料或合金包含聚乳酸。
51.根据权利要求50所述的热塑性聚合物基质,其中所述热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和金属的合金。
52.根据权利要求51所述的热塑性聚合物基质,其中所述金属选自铜和铝。
53.根据权利要求49所述的基质,其中所述热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和碳的复合材料。

说明书全文

分离核酸的方法

技术领域

[0001] 本发明总体上涉及一种分离核酸的方法,特别是一种从例如细胞裂解物的生物材料中分离核酸的方法。

背景技术

[0002] 核酸(NA)的分离并非不重要,因为任何DNA/RNA测定法的性能都取决于NA输入的质量8。在医疗点(POC)应用中,由于现场可用资源的限制,NA分离过程更加复杂。例如,大多数常规的基于实验室的NA分离方案(基于Boom方法9)通常都需要使用离心机(例如,基于旋转柱的方法9,10)。但是,在偏远地区或基于家庭的NA测定法中,可能无法使用离心11
机。因此,已经提出了各种策略来规避这种资源限制。一个示例是固相可逆的固定(SPRI)方法,该方法最近得到普及11-15。SPRI通常基于NA在表面(例如微粒)上的沉淀,然后在酒精洗涤后可以将其重新悬浮在相容的缓冲液中。SPRI需要最少的设备,因此更适合POC应用。
然而,常规的SPRI受到需要多个样品/液体操纵的限制。此后,已经开发出了各种策略使
16 13,17-19
SPRI自动化 ,但是大多数定制的POC方法都需要某种形式的微设备 ,这对于低资源的配置并不适合。其他现代的NA分离方法20包括使用电脉冲来操纵细胞裂解、NA分离和浓缩。但是,这些方法仍在很大程度上是概念验证和/或需要非常专业的设备,
[0003] 在SPRI的某些迭代中,已经探索了各种形式的微粒表面修饰。这些修饰包括羧酸11、纤维素14,15、二氧化硅(Boom方法的扩展)和壳聚糖13。通常,具有正电荷(阳离子)官能团的生物相容性基质可用于NA分离。另外,一些利用DNA功能化塑料表面的策略包括非特异性的物理吸附21。但是,NA的物理吸附通常在NA测定法中起相反的作用,因为它减少了生物分析靶标的可用性。
[0004] 本公开通过提供与低资源和/或POC应用相容的更简单的核酸固相可逆固定方法来解决或至少部分缓解了这些问题。

发明内容

[0005] 在本文公开的一个方面,提供了一种从含有核酸的样品中分离核酸的方法,所述方法包括:
[0006] (a)在允许样品中的核酸可逆地结合至基质的条件下,将样品暴露于热塑性聚合物基质,
[0007] (b)在优先除去结合至所述基质的非核酸杂质的条件下,洗涤(a)中结合核酸的基质;和
[0008] (c)将(b)中洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液,从而从基质中回收核酸;
[0009] 其中热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
[0010] 在另一方面,提供了一种包含通过本文公开的方法回收的核酸的组合物。
[0011] 在另一方面,提供了一种用于从含有核酸的样品中分离核酸的试剂盒,所述试剂盒包含:
[0012] (a)如本文所述的热塑性聚合物基质;
[0013] (b)如本文所述的洗脱缓冲液;和
[0014] (c)任选地,如本文所述的细胞裂解缓冲液;
[0015] 其中热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
[0016] 在另一方面,提供了如本文所述的热塑性聚合物基质,其用于根据本文公开的方法从含有核酸的样品中分离核酸,其中当暴露于样品时,热塑性聚合物基质具有净负电荷。附图说明
[0017] 图1A显示了使用基于PLA的3D打印的DipStix从裂解物质中分离核酸(DNA)的一般方法和步骤。图1B是通过HeLa细胞基因组DNA(LINE1靶序列)的等温重组酶聚合酶扩增(RPA)制备的DNA扩增产物(扩增子)的凝胶图像,显示不同的热塑性3D打印基质能够从裂解物质中分离DNA,用于随后的DNA扩增。图B的顶部提供了所使用的热塑性3D打印基质的类型及其制造商,(+):阳性样品。(-):无DNA对照。DNA条带大小如所示。
[0018] 图2显示了DipStix在复合样品中的性能和应用。(A)使用BRAF和LINEl引物的qPCR Ct值作为DNA浓度的函数。顶部线代表BRAF扩增子(DNA扩增产物),而底部线代表LINE1扩增子;误差条表示SD(n=2)。(B)从7个独立的DipStix分离的DNA的可重复qPCR Ct值,其中使用10ng/μL召唤(call)裂解物;误差条表示SD(n=7)。(C)通过RPA从粗细胞裂解物中扩增的LINE1和BRAF序列的凝胶图像。(D)与Trizol提取的总RNA相比,来自粗细胞裂解物的miRNA和mRNA靶标的RT-qPCR图谱;从左至右:miR200a、miR15a、RNU6b、肌动蛋白和Her3。(E)从颊拭子和全血细胞的粗裂解物中通过RPA扩增的LINE1序列的凝胶图像(NoT=无靶标对照)。(F)比较DipStix分离的DNA和直接添加到PCR反应中的1μL粗植物裂解物之间PCR性能的凝胶图像。使用了拟南芥和番茄叶。
[0019] 图3A显示了在将Dipstix暴露于含DNA的裂解缓冲液中1秒至5分钟的时间后,产生的RPA扩增子的代表性凝胶图像。图3B显示了将Dipstix暴露于含DNA的裂解缓冲液5分钟的时间、在中浸入1秒洗涤5次、并通过快速(瞬时)浸入(t=-0)至120分钟洗脱至PCR缓冲液中一段时间后,产生的RPA扩增子的平均Ct值(右图);包括已知量的DNA标准品,以估算可用于PCR的DNA量(参见左图)。图3C显示了将Dipstix暴露于含DNA的裂解缓冲液5分钟、并在水(左柱)或PCR缓冲液(右柱)中洗涤约0.1分钟至60分钟的时间、然后洗脱至PCR缓冲液中5分钟后,生成的RPA扩增子的平均Ct值。图3D显示了将Dipstix暴露于含有递增浓度的盐酸胍(GuHCl)的含DNA裂解缓冲液后生成的RPA扩增子的平均Ct值。图3E显示了作为表面积的函数的DNA结合至热塑性聚合物基质的效率,将打印的直径为1、2、3mm的DipStix浸入含DNA的溶液中生成的RPA扩增子的代表性凝胶图像(左图),和平均直径为2mm的DipStix浸入含DNA的溶液中5、2.5和1.25mm时生成的RPA扩增子的代表性凝胶图像。图3F显示了将热塑性聚合物基质的打印分辨率提高到高达400μm之后产生的RPA扩增子的平均Ct值,注意到增加的打印分辨率增加了热塑性聚合物基质的表面积。图3G显示了在60x(顶部图)和5000x(底部图)的放大倍数下,二氯甲烷(DCM)处理的和未处理的DipStix的扫描电子显微镜(SEM)图像;显示了比例尺。图3H是来自图3G中所示的白框的放大的SEM图像(参见未处理的,60x放大倍数;顶图),其显示了打印层之间的结构。图3I显示了使用由两台不同的3D打印机(打印1,打印2)制造的经DCM处理的和未处理的DipStix,从含DNA的裂解物中分离的DNA的RPA扩增子的代表性凝胶图像;DNA标记物显示在最左侧,而阴性对照(无DNA)显示在最右侧。图3J显示了位于热塑性聚合物基质的打印层之间的Cy5-寡核苷酸(oligo)的荧光成像。(H)图3K显示了在DNA分离步骤中Dipstix的荧光成像:(i)浸入具有Cy5-寡核苷酸的含DNA的裂解缓冲液后;(ii)用水洗涤后,和(iii)浸入PCR洗脱缓冲液后。(I)图3L是浸入水(左)或包含蓝色染料的裂解缓冲液(右)中的DipStix的照片,显示溶液沿DipStix的吸收(wicking)。
[0020] 图4是提出的核酸可与热塑性聚合物基质结合的机制的示意图,显示由于在提取(分离)、洗涤和洗脱阶段改变缓冲液条件而产生的核酸分子(卷曲线)和抑制剂(点)的结合常数和解离常数(κ)。
[0021] 图5显示了几种热塑性聚合物基质的流式(zeta;ζ)电位:从左上开始到底部:PLA Bilby 3D(天然)、ABS Esun(白色)、尼龙Taulman 910、PLA ColorFab和PLA ProtoPasta导电材料。数据表明,所有测试的热塑性聚合物基质在很宽的pH值范围内在盐溶液中都带负电荷。使用Anton Paar SurPASS流式电位计(德国)在1mm热塑性聚合物基质材料膜上、在1mM NaCl溶液中进行测量。使用1M NaOH溶液进行pH滴定。使用Fairbrother-Mastin方法分析测量结果。
[0022] 图6显示了从包含GuHCl和100ng BT474衍生的DNA的细胞裂解物中,通过Dipstix分离的DNA生成的扩增子的定量PCR(qPCR)的图(靶向LINE1序列)。通过将BT474人乳腺癌细胞暴露于裂解缓冲液来制备细胞裂解物。检查了在水中洗涤DipStix的效果,以确定盐裂解缓冲液是否可以从DipStix中有效去除,从而不干扰通过qPCR扩增DNA。这些数据表明,洗涤可有效去除任何抑制PCR的GuHCl的量,而洗涤失败会导致PCR扩增受到抑制。
[0023] 图8显示了从包含GuHCl裂解缓冲液和100ng BT474衍生DNA的细胞裂解物中,通过Dipstix分离的DNA所生成的扩增子的熔融分析。在将DipStix浸入含DNA的裂解缓冲液之后、并且在将其放入PCR扩增缓冲液之前,用水洗涤DipStix,从而分离DNA,对于DNA扩增是最佳的。
[0024] 图9显示了从包含Tris-HCl、EDTA、SDS、蛋白酶K和100ng BT474衍生DNA的细胞裂解物中,通过Dipstix分离的DNA产生的扩增子的qPCR图。通过将BT474人乳腺癌细胞暴露于裂解缓冲液中来制备细胞裂解物。检查了在水中洗涤DipStix的效果,以确定是否可以从DipStix中有效去除基于Tris的裂解缓冲液,从而不干扰通过qPCR扩增DNA。基于Tris的裂解缓冲液似乎抑制了DNA的PCR扩增,这可能是由于水洗不足以去除SDS和蛋白酶K所致,已知这二者均干扰PCR扩增。
[0025] 图10显示了从包含Tris-HCl、EDTA、SDS、蛋白酶K裂解缓冲液和100ng BT474衍生的DNA的细胞裂解物中,通过Dipstix分离的DNA产生的扩增子的熔解分析。数据表明,除了阳性对照(250ng DNA)外,任何样品均未产生扩增子。
[0026] 图11显示了从包含RIPA裂解缓冲液和100ng BT474衍生的DNA的细胞裂解物中,通过Dipstix分离的DNA生成的扩增子的qPCR图。通过将BT474人乳腺癌细胞暴露于RIPA缓冲液中来制备细胞裂解物。检查在水中洗涤DipStix的效果,以确定是否可以从DipStix中有效去除盐裂解缓冲液,从而不干扰通过qPCR扩增DNA。这些数据表明,洗涤可有效去除任何抑制PCR的RIPA缓冲液的量,洗涤失败将导致PCR扩增受到抑制。
[0027] 图12显示了从包含RIPA缓冲液和100ng BT474衍生的DNA的细胞裂解物中,通过Dipstix分离的DNA生成的扩增子的熔融分析。在将DipStix浸入含DNA的裂解缓冲液之后、并且在将其放入PCR扩增缓冲液之前,用水洗涤DipStix,从而分离DNA,对于DNA扩增是最佳的。未经洗涤的样品产生不同的熔融曲线,这表明洗涤对于去除RIPA很重要。
[0028] 图13显示了从细胞裂解物中,通过Dipstix分离的DNA产生的扩增子的qPCR图,该细胞裂解物包含100ng BT474衍生的DNA和不同的GuHCl盐浓度的裂解缓冲液,范围为375mM至6M。这些数据表明较低的盐浓度更好地发挥作用,注意到DNA扩增的循环数(CT)随着盐浓度的降低而降低。较高的盐浓度(例如6M)仍然发挥作用,但是CT值因此增加。CT的增加可能会对DNA扩增的下限产生负面影响。
[0029] 图14显示了从细胞裂解物中,通过Dipstix分离的DNA产生的扩增子的熔融分析,该细胞裂解物包含100ng BT474衍生的DNA和不同的GuHCl盐浓度的裂解缓冲液,范围为6M至375mM。发现与较高的盐浓度相比,较低的盐浓度对于DNA扩增是最佳的,尽管在所有盐浓度下都产生扩增子。这些数据还表明,用水洗涤DipStix可以消除盐对qPCR扩增的抑制作用。

具体实施方式

[0030] 在整个说明书中,除非上下文另有要求,否则词语“包括”或其变形如“包含”或“含有”,将被理解为暗示包括陈述的元件或整数或一组元件或整数,但不排除任何其他元件或整数或一组元件或整数。
[0031] 本说明书中对任何先前出版物(或从其衍生的信息)或任何已知事项的引用均不是,也不应该被认为是承认或认可或以任何形式暗示该先前出版物(或从其衍生的信息)或已知事项构成本说明书所涉及的研究领域中的公知常识的一部分。
[0032] 要注意的是,如在本说明书中所使用的,单数形式“一种”、“一”和“该”包括复数个方面,除非上下文另外明确指出。例如,提及“一种核酸”包括单个核酸分子以及两个或更多个核酸分子。
[0033] 本发明至少部分地基于以下令人惊讶的发现而被提出:核酸分子能够可逆地结合至热塑性聚合物基质,例如用于3D打印的那些基质,并且可以利用这种特性来简单而快速地分离核酸,并与下游分析兼容,包括靶核酸序列的扩增和检测。
[0034] 因此,在本文公开的一个方面,提供了一种从含有核酸的样品中分离核酸的方法,所述方法包括:
[0035] (a)在允许样品中的核酸可逆地结合至基质的条件下,将样品暴露于热塑性聚合物基质;
[0036] (b)在优先除去结合至所述基质的非核酸杂质的条件下,洗涤(a)中结合核酸的基质;和
[0037] (c)将(b)中洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液,从而从基质中回收核酸;
[0038] 其中热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
[0039] 热塑性聚合物基质
[0040] 术语“热塑性聚合物基质”应理解为是指热软化的塑料材料,其在高于特定温度时变得柔韧并在冷却时固化。合适的热塑性聚合物基质是本领域技术人员熟悉的,其说明性示例包括用于3D打印的那些,例如聚酰胺(例如尼龙)、聚乳酸(PLA)、聚苯乙烯(例如丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS))及其复合材料合金。合适的热塑性聚合物基质的其他说明性示例包括用于注塑和真空成型的那些。
[0041] 合适的热塑性聚合物基质可商购,其说明性示例包括PLA Bilby 3D(天然)、PLA ColorFab(白色)、ABS Esun(白色)、尼龙Taulman 910、PLA Bilby 3D樱桃木、PLA ColorFab铜、PLA Bilby 3D铜、PLA Bilby 3D、PLA ProtoPasta纤维和PLA ProtoPasta导电材料。
[0042] 在本文公开的实施方案中,热塑性聚合物基质选自聚酰胺、聚乳酸、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯和前述任何一种的复合材料或合金。热塑性聚合物基质的合适的复合材料和合金对本领域技术人员而言是熟悉的。在一个实施方案中,复合材料或合金包含聚乳酸。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和金属的合金。用于热塑性聚合物合金中的合适的金属对于本领域技术人员将是熟悉的,其说明性示例包括铜、铝和。在一个实施方案中,金属选自铜和铝。
[0043] 热塑性聚合物基质的合适的复合材料也是本领域技术人员所熟悉的,其说明性示例包括包含聚乳酸和导电材料例如碳的复合材料。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和碳的复合材料。
[0044] 如本文其他地方所述,热塑性聚合物基质将在溶液中合适地具有净负电荷。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质将在一定pH值范围内显示负流(zeta;ζ)电位。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质将在约5至约11的pH范围内显示负流电位。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质的特征在于当暴露于盐溶液时,其为净负电荷。如本文其他地方所述,当暴露于1mM NaCl溶液时,热塑性聚合物基质将适当地具有净负电荷。然而,应注意,使热塑性聚合物基质适合根据本文公开的方法使用的特性不限于将基质暴露于包含1mM NaCl的含核酸样品。如本文其他地方所述,热塑性聚合物基质将能够从含核酸溶液中分离核酸,所述含核酸溶液包含除NaCl以外的盐,且盐浓度不是1mM。在一个实施方案中,如本文其他地方所述,热塑性聚合物基质在包含离液盐(例如,盐酸胍)的溶液中将具有净负电荷。
[0045] 如本文其他地方所指出的,热塑性聚合物具有允许基质形成几乎任何合适的尺寸和形状的优点。热塑性聚合物基质的尺寸和形状通常取决于预期的用途。例如,在细胞裂解物包含在0.5mL Eppendorf管中的情况下,可以使基质形成为细长形状,其具有(i)能够延伸到管中并与其中的细胞裂解物接触的长度,和(ii)小于或等于管底部直径的平均直径,使得细长的基质能够插入管中并与细胞裂解物材料接触。
[0046] 在一个实施方案中,热塑性聚合物基质具有细长结构,其平均直径为约1mm至约3mm。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质具有细长的结构,其长度为约1至约30mm,优选长度约10mm至约15mm。
[0047] 应当理解,热塑性聚合物基质不必具有均匀的细长形状。例如,如本文其他地方所述,基质可以具有第一部分和第二部分,其中第一部分的平均直径大于第二部分的平均直径。具有两个不同尺寸部分的基质的说明性示例在图1中示出(在本文中也称为“DipStix”)。
[0048] 在另一个实施方案中,热塑性聚合物基质具有基本上圆柱形的结构或构造,例如通道或管(例如,毛细管)。这样的构造可以使其自身用于微流体应用,从而可以引导含核酸的样品通过微流体阵列中的管或通道,随后是洗涤溶液,然后是洗脱缓冲液以回收结合至基质的核酸。在另一个实施方案中,热塑性聚合物基质构成管并且应用到抽吸装置(如注射器)的尖端。管状基质可以连接到抽吸装置的尖端,或者可以在装置的尖端一体地形成。然后可以将管状基质插入到含核酸的样品中,并且通过抽吸将样品抽吸通过管状基质,从而样品中的核酸结合到管状基质的内表面。然后可以将管状基质插入洗涤溶液中,然后通过抽吸将洗涤溶液抽吸通过管状基质,从而洗涤基质以除去非核酸杂质。然后可以将管状基质插入洗脱缓冲液中,然后通过抽吸将洗脱缓冲液抽吸通过管状基质,从而从基质中洗脱核酸并将洗脱的核酸回收到收集室中。或者,可以在洗涤步骤后无限期地保存管状基质,用于随后洗脱结合的核酸。热塑性聚合物基质可以具有可见的光滑表面,或者可以具有不平坦或有纹理的表面,其说明性示例包括凹痕图案(例如,如在高尔夫球表面上所看到的)、纵横交错的图案、鱼鳞图案和棕榈鳞图案。
[0049] 在另一个实施方案中,热塑性聚合物基质具有长度和宽度大于其厚度的平板结构(例如,片)。平板结构可以形成为热塑性聚合物材料的实心片或编织束片。在一些实施方案中,由编织的热塑性聚合物束形成的基质具有柔韧的特性;也就是说,它们保持可塑性,从而可以塑模成一种或多种理想的形状。在一些实施方案中,热塑性聚合物基质例如通过并入允许液体通过的孔而包含多孔结构。替代地或另外,多孔基质包括热塑性聚合物材料的束,其被编织以形成网状结构。在一个实施方案中,具有多孔结构的热塑性聚合物基质可以用作过滤器。例如,可以使含有核酸的样品(例如细胞裂解物)、洗液和洗脱缓冲液通过多孔热塑性聚合物基质,从而样品中的核酸结合至基质上,随后通过根据本文公开的方法中的洗脱缓冲液回收。
[0050] 在另一个实施方案中,热塑性聚合物基质包含一个或多个用于携带溶液的容器。合适的容器的说明性示例包括管和孔。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质具有多孔构造(例如96孔板)。这种构造允许同时或连续地根据本文所述的方法处理多个样品。在热塑性聚合物基质是容器的情况下,可以将含核酸的样品放置在容器中一段时间,以使核酸结合至基质。然后将样品从容器中移出(例如,通过抽吸),洗涤容器,以从基质上除去非核酸杂质。然后可以将洗脱缓冲液放入容器中,从而从基质中洗脱核酸。然后可以从容器中回收含有洗脱的核酸的洗脱缓冲液,用于随后的储存或分析(例如,靶核酸扩增)。或者,可以将洗脱缓冲液保存在容器中,用于储存和/或随后的分析。例如,靶核酸扩增可以在热塑性聚合物容器中进行。其优点是当样品从一个容器转移到另一个容器时,最小化交叉污染的险。
[0051] 含核酸的样品
[0052] 如本文所用,术语“样品”应理解为是指包含核酸的任何溶液。术语“核酸”应理解为是指核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA),其说明性示例包括信使RNA(mRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转运RNA cDNA和基因组DNA,并且包括真核生物以及原核生物核酸、线粒体DNA、叶绿体DNA(cpDNA)、循环中的游离DNA(cfDNA)和循环中的肿瘤DNA(ctDNA)。术语“核酸”还包括人工核酸类似物、肽核酸、吗啉代和核酸、乙二醇核酸和苏阿糖核酸,与天然存在的核酸不同,其通常是通过修饰核酸分子的主链来实现。
[0053] 在一个实施方案中,样品是生物样品。生物样品的说明性示例包括血液、血清、血浆、尿液、精液、羊水、支气管灌洗液(BAL)、痰和脊髓液。样品可以是从生物体(例如原核生物或真核生物)获得的未经进一步处理的天然存在的生物样品(例如尿液、精液、脊髓液、羊水),或者可以是从生物体获得并经过处理步骤(例如纯化以除去至少一些杂质)的生物样品。在一个实施方案中,样品包含小于20重量%(w/w)的核酸。“小于20%w/w”是指19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、
1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0.0001%等。
[0054] 在一个实施方案中,样品是细胞裂解物。应当理解,细胞裂解物是通过破坏一个或多个细胞的细胞膜和核膜以释放细胞的内容物而形成的,特别是通过释放细胞的核酸内容物而形成。制备细胞裂解物的合适方法是本领域技术人员熟悉的,其说明性示例包括渗透压冲击裂解、离液盐(例如GuHCl)裂解、酶消化、去污剂裂解(例如非离子表面活性剂如Triton X100)和机械均质化。在一个实施方案中,通过将细胞悬浮在裂解缓冲液中来制备细胞裂解物。合适的裂解缓冲液是本领域技术人员熟知的,其说明性示例包括NP-40裂解缓冲液、放射免疫沉淀测定法(RIPA)裂解缓冲液和基于非离子表面活性剂的裂解缓冲液。
[0055] 在一个实施方案中,样品包含离液盐。合适的离液盐对于本领域技术人员而言是熟悉的,其说明性示例包括盐酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸锂。在一个实施方案中,离液盐是盐酸胍(GuHCl)。如本文其他地方所述,热塑性聚合物基质能够在一定裂解缓冲盐浓度范围内从包含核酸的样品中结合和回收核酸。因此,在一个实施方案中,样品包含约375mM至约6M(例如375mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1.0M、1.5M、2M、2.5M、3M、3.5M、4M、4.5M、5M、5.5M和6M)的盐浓度。在一个实施方案中,样品包含约375mM至约3M的盐浓度。
在一个实施方案中,样品包含约375mM至约1.5M的盐浓度。在一个实施方案中,样品包含约
1.5M的盐浓度。
[0056] 如本文其他地方所指出的,发明人惊奇地发现,例如,当仅将基质浸入含有核酸的溶液中不超过1秒的时间,核酸几乎立即结合至热塑性聚合物基质。而且,暴露更长的时间(例如,长达5分钟)并不会导致从溶液中回收的核酸量的可辩别的增加。这些数据表明,将样品暴露于热塑性聚合物基质非常短的时间足以使样品中的核酸与基质结合,以用于随后的回收。在一个实施方案中,步骤(a)包括将样品暴露于热塑性聚合物基质约0.5秒至约5分钟的时间,优选约0.5秒至约1分钟的时间,更优选地约0.5秒至约30秒的时间,甚至更优选约0.5秒至约1秒的时间。在一个实施方案中,将细胞裂解物暴露于热塑性聚合物基质包括将热塑性聚合物基质浸入样品中:例如,将至少一部分基质浸入样品中,然后立即从样品中移除基质。在另一个实施方案中,可以将包含核酸的样品(例如,细胞裂解物)施加到基质上;例如,通过将样品浸入基质上并允许样品从基质表面流出。
[0057] 洗涤
[0058] 如本文其他地方所述,步骤(b)包括在优先去除结合至基质的非核酸杂质的条件下,洗涤(a)中结合核酸的基质。优先去除结合到固体基质的非核酸杂质的合适条件是本领域技术人员熟悉的,其说明性示例包括缓冲溶液(例如Tris-缓冲盐水,磷酸盐缓冲盐水)、盐溶液(例如,NaCl、盐酸胍)和低EDTA TE缓冲液,0.5%Tween溶液、0.5%Triton溶液、70%乙醇和水。在一些实施方案中,(a)中结合核酸的基质可以用裂解缓冲液洗涤,所述裂解缓冲液用于制备在步骤(a)中暴露于基质的细胞裂解物。
[0059] 在一个实施方案中,步骤(b)包括在水中洗涤结合核酸的基质。如本文其他地方所指出的,发明人惊奇地发现,在水中洗涤结合核酸的基质0.1至约5分钟的时间足以去除不希望的非核酸杂质,如否则会抑制随后的靶序列扩增的那些非核酸杂质。发明人还惊奇地发现,将水的洗涤步骤最小化至少于约5分钟的时间对于核酸回收和随后的靶序列扩增是最佳的。因此,在一个实施方案中,步骤(b)包括洗涤结合核酸的基质约5秒至约5分钟的时间。在另一个实施方案中,步骤(b)包括洗涤结合核酸的基质约5秒至约1分钟的时间。在另一个实施方案中,步骤(b)包括将结合核酸的基质浸入洗涤溶液中;例如,将至少一部分结合核酸的基质浸入洗涤溶液(例如水)的溶液中,然后立即从洗涤溶液中移除基质。在一个优选的实施方案中,步骤(b)包括将结合核酸的基质浸入洗涤溶液中多于一次,优选两次至约5次。在其他实施方案中,步骤(b)包括将结合核酸的基质连续浸入多次洗涤溶液中。例如,将结合核酸的基质浸入包含洗涤溶液的第一容器中,然后浸入包含相同或不同洗涤溶液的第二容器中,然后浸入包含与第一和/或第二容器的洗涤溶液相同或不同的洗涤溶液的第三容器中,等等。
[0060] 在另一个实施方案中,可以通过将洗涤溶液施加到与结合核酸的基质表面来洗涤结合核酸的基质;例如,通过使一定量的洗涤溶液(例如水)流过结合核酸的基质表面。
[0061] 洗脱液
[0062] 如本文所用,术语“洗脱缓冲液”应理解为是指一种溶液,其能够在洗涤步骤(b)之后从结合核酸的基质中洗脱(即,解离)核酸。合适的洗脱缓冲液是本领域技术人员熟悉的,其说明性示例包括PCR缓冲液和TE缓冲液。在一个实施方案中,洗脱缓冲液是PCR缓冲液。合TM适的PCR缓冲液是本领域技术人员熟悉的,其说明性示例包括Kapa2G  缓冲液A或Kapa2G TM缓冲液M(Sigma-Aldrich)。
[0063] 如本文其他地方所指出的,发明人惊奇地发现,核酸几乎可以立刻从基质上洗脱下来;例如,将结合核酸的基质仅浸入含有核酸的溶液中不超过1秒的时间。而且,暴露更长的时间(例如,长达120分钟)不会导致从基质回收的核酸量的可辨别的增加。这些数据表明,将结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液非常短的时间足以使核酸从基质上洗脱并回收到洗脱缓冲液中。
[0064] 在一个实施方案中,步骤(c)包括将洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液约0.5秒至约5分钟的时间,优选约0.5秒至约1分钟的时间,更优选约0.5秒至约1秒的时间。在一个实施方案中,将洗涤的结合核酸的基质暴露于洗脱缓冲液包括将洗涤的结合核酸的基质浸入洗脱缓冲液中;例如,将(b)中至少一部分洗涤的结合核酸的基质浸入洗脱缓冲液中,然后立即从洗脱缓冲液中除去基质。
[0065] 在另一个实施方案中,可以通过将洗脱缓冲液施加到结合核酸的基质表面上,从洗涤的结合核酸的基质中洗脱并回收核酸;例如,通过将一定量的洗脱缓冲液浸入到结合核酸的基质表面上,然后收集洗脱缓冲液。
[0066] 在一个实施方案中,洗脱缓冲液包含一种或多种用于进行核酸扩增的组分和/或试剂。用于进行核酸扩增的合适的组分和/或试剂是本领域技术人员熟悉的,其说明性示例包括与感兴趣的靶核酸序列特异性杂交的引物和/或探针、适合于扩增核酸的酶,包括各种聚合酶(例如,逆转录酶、Taq、SequenaseTMDNA连接酶等,取决于所采用的核酸扩增技术)、脱氧核糖核苷酸和缓冲液,以提供扩增所必须的反应混合物,和标记有可检测部分(例如,荧光部分)的捕获探针。包含用于进行核酸扩增的一种或多种组分和/或试剂的洗脱缓冲液的优点在于,核酸扩增可在核酸洗脱后立即进行,因此,无需向洗脱缓冲液添加其他组分和/或试剂,从而使交叉污染和非特异性核酸扩增的风险降到最低。图1展示了这种方法的一个示例。
[0067] 在另一方面,提供了一种包含通过本文公开的方法回收的核酸的组合物。
[0068] 靶核酸扩增
[0069] 如本文其他地方所述,发明人惊奇地发现,热塑性聚合物基质能够可逆地结合核酸分子,同时允许优先去除非核酸杂质,例如核酸扩增的抑制剂。结果,热塑性聚合物基质可用于从可能存在于样品中的非核酸杂质中分离核酸分子,否则这些杂质将抑制随后的核酸扩增和/或分析。因此,在一个实施方案中,本文所述的方法进一步包括从步骤(c)中回收的核酸扩增靶核酸序列。合适的扩增核酸的方法是本领域技术人员熟悉的,其说明性示例包括在Green和Sambrook(2012;“Molecular cloning:a laboratory manual”;第四版;Cold Spring Harbor,N.Y.)和Ausubel等人(2003;“Current Protocols in Molecular Biology”;John Wiley&Sons,Inc)中公开的。当靶核酸序列是RNA时,可能需要将RNA转化为互补DNA。在一些实施方案中,通过模板依赖性核酸扩增技术扩增核酸。许多模板依赖性方法可用于扩增靶序列。一种说明性的核酸扩增技术是聚合酶链反应(PCR),其详细描述于美国专利申请号4,683,195、4,683,202和4,800,159,Ausubel等人(同上),和Innis等人("PCR Protocols",Academic Press,Inc.,San Diego Calif.,1990)。可以进行逆转录酶PCR扩增程序,以便定量扩增的mRNA的量。将RNA逆转录为cDNA的方法是众所周知的,并且描述于Sambrook等人,2012,同上。逆转录的替代方法利用了热稳定的、RNA依赖性DNA聚合酶。这些方法在WO90/07641中描述。聚合酶链反应方法是本领域众所周知的。
[0070] 在一个实施方案中,模板依赖性扩增包括实时定量转录本。例如,可以使用实时PCR技术(Higuchi,1992,等人,Biotechnology 10:413-417)对RNA或DNA进行定量。通过确定完成相同数目的循环并在其线性范围内的PCR反应中靶DNA的扩增产物的浓度,可以确定原始DNA混合物中特定靶序列的相对浓度。如果DNA混合物是从不同组织或细胞分离的RNA合成的cDNA,则可以针对各个组织或细胞确定衍生靶序列的特定mRNA的相对丰度。PCR产物的浓度和相对mRNA丰度之间的这种直接比例通常在PCR反应的线性范围内是正确的。通过反应混合物中试剂的可利用性确定曲线的平台部分中靶DNA的最终浓度,并且与靶标DNA的原始浓度无关。在其他实施方案中,可以采用多重串联PCR(MT-PCR),其使用两步法从少量RNA或DNA进行基因表达谱,例如在美国专利申请公开号20070190540中所述。在第一步骤中,将RNA转化为cDNA,并使用多重基因特异性引物扩增。在第二步骤中,通过实时PCR对每个单独的基因进行定量。
[0071] 在一些实施方案中,可以使用本领域技术人员众所周知的印迹技术对靶核酸进行定量。Southern印迹涉及使用DNA作为靶标,而Northern印迹涉及使用RNA作为靶标。每种都提供不同类型的信息,尽管在许多方面cDNA印迹与RNA种类(species)的印迹相似。简而言之,使用探针靶向已固定在合适基质上的DNA或RNA种类,该基质通常是硝酸纤维素过滤器。不同的种类应在空间上分开,以利于分析。这通常通过核酸种类的凝胶电泳,然后“印迹”到过滤器上来完成。随后,在促进变性和再杂交的条件下,将印迹的靶标与探针(通常是标记的)一起孵育。因为探针被设计为与靶标配对,所以探针将在复性条件下结合靶序列的一部分。然后去除未结合的探针,并如上所述完成检测。在检测/定量之后,可以将在指定受试者中看到的结果与如本文所定义的对照反应或统计学显著的参照组或对照受试者群体进行比较。以此方式,可以将检测到的生物标记核酸的量与受试者处于癌症进展风险的可能性相关联。
[0072] 本文还考虑了基于生物芯片的技术,例如Hacia等人(1996,Nature Genetics 14:441-447)和Shoemaker等人(1996,Nature Genetics 14:450-456)所描述的技术。简而言之,这些技术涉及用于快速、准确地分析大量基因的定量方法。通过用寡核苷酸标记的基因或使用固定的探针阵列,人们可以采用生物芯片技术将靶分子分离(segregate)为高密度阵 列 ,并在杂交的基 础上筛选这些分子。还参见 Pease等人 (1994 ,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:5022-5026);Fodor等人(1991,Science 251:767-773)。简而言之,如本文概述的,制备针对靶序列的核酸探针并将其连接至生物芯片以用于筛选和诊断方法。连接至生物芯片的核酸探针被设计为,例如在夹心测定法中与特异性表达的靶序列基本互补,使得靶序列与本发明的探针发生杂交。这种互补性不一定是完美的;可能存在任何数量的碱基对错配,这将干扰靶序列与本发明的核酸探针之间的杂交。但是,如果错配的数目很大,以至于即使在最不严格的杂交条件下也不发生杂交,则该序列不是互补的靶序列。在某些实施方案中,每条序列使用多于一个的探针,使用重叠的探针或针对靶标不同区段的探针。即,使用两个、三个、四个或更多个探针,其中三个是理想的,用于为特定靶标建立冗余。探针可以重叠(即,具有一些共同序列)或分开。
[0073] 在说明性生物芯片分析中,在有利于特异性杂交的条件下,将生物芯片上的寡核苷酸探针暴露于疑似含有一种或多种生物标志物多核苷酸的核酸样品,或与其接触。
[0074] 核酸一旦通过本文公开的方法分离,其可以例如通过超声处理或通过用限制性核酸内切酶处理而片段化。适当地,可以将cDNA片段化,使得所得DNA片段的长度大于固定的寡核苷酸探针的长度,但是足够小以允许在合适的杂交条件下快速接近这些片段。备选地,可以使用合适的核苷酸扩增技术来选择并扩增cDNA的片段,例如,如上文所述,包括合适的随机或特异性引物。
[0075] 可以扩增核酸的方法的其他说明性示例包括环介导的等温扩增(LAMP)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增和引物生成-滚环扩增(PG-RCA)。
[0076] 在一个实施方案中,在热塑性聚合物基质的存在下,在反应容器中扩增靶核酸。
[0077] 试剂盒
[0078] 在另一方面,提供了用于从细胞裂解物中分离核酸的试剂盒,该试剂盒包含:
[0079] (a)如本文所述的热塑性聚合物基质;
[0080] (b)如本文所述的洗脱缓冲液;和
[0081] (c)任选地,如本文所述的细胞裂解缓冲液;
[0082] 其中热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
[0083] 在一个实施方案中,试剂盒可包含一种或多种用于进行本文公开的方法的组分和/或试剂和/或装置。试剂盒可以包含组分和/或试剂,其用于分析通过本文公开的方法回收的核酸中靶核酸序列的表达。
[0084] 用于进行本发明方法的试剂盒还可以在合适的容器中包含(i)一种或多种用于检测一个或多个靶核酸序列的试剂,(ii)一个或多个特异性结合靶核酸序列的核酸引物和/或探针,(iii)一个或多个能够检测和/或测量一个或多个靶序列表达的探针,(iv)一个或多个用于检测探针存在的标记物,和/或(iv)如何测量一个或多个靶序列表达水平的说明书。还包括适合扩增核酸的酶,包括各种聚合酶(逆转录酶、Taq、SequenaseTMDNA连接酶等,取决于所用的核酸扩增技术),以及脱氧核苷酸和缓冲液,以提供扩增所需的反应混合物。这样的试剂盒还可以以合适的方式包括用于每种单独的组分和/或试剂的不同容器,以及用于每种引物和/或探针的不同容器。该试剂盒还可以具有用于进行本文所述的任何一种方法的各种装置(例如,一个或多个);和/或使用该试剂盒检测和/或定量一个或多个靶核酸序列表达的印刷说明书。试剂盒的容器装置通常包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其他容器,其中放置或适当地分装了一种或多种试剂。在提供第二和/或第三和/或附加组分的情况下,试剂盒通常还将包含可以放置这些组分的第二、第三和/或其他附加容器。或者,根据需要,容器可以包含多于一个试剂的混合物。试剂盒还可包括用于密闭包含一个或多个试剂(例如引物或探针)的装置,用于商业销售。这样的容器可以包括注射和/或吹塑的塑料容器,其内装有期望的小瓶。
[0085] 根据本文公开的方法,试剂盒可进一步包括阳性和阴性对照,包括参考样品,以及其中含有的试剂盒组分的使用说明书。
[0086] 试剂盒还可任选地包括用于检测标记物的合适的试剂、阳性和阴性对照、洗涤溶液、印迹膜、微量滴定板、稀释缓冲液等。
[0087] 在一个实施方案中,试剂盒包含:
[0088] (a)如本文所述的热塑性聚合物基质;
[0089] (b)如本文所述的洗脱缓冲液;和
[0090] (c)如本文所述的细胞裂解缓冲液;
[0091] 其中热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
[0092] 在一个实施方案中,热塑性聚合物基质选自聚酰胺、聚乳酸、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯和包含任何前述物质的合金或复合材料。在一个实施方案中,合金或复合材料包含聚乳酸。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和金属的合金。在一个实施方案中,金属选自铜和铝。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质是包含聚乳酸和碳的复合材料。
[0093] 在一个实施方案中,热塑性聚合物基质具有细长的结构,其平均直径为约1mm至约3mm。在一个实施方案中,热塑性聚合物基质具有细长的结构,其长度为约1至约30mm,优选约10mm至约15mm。
[0094] 在一个实施方案中,细胞裂解缓冲液包含离液盐。在一个实施方案中,细胞裂解缓冲液包含离液盐,其量为约375mM至约6M,优选地量为约1.5M。在一个实施例中,离液盐是氯化胍。
[0095] 在一个实施方案中,洗脱缓冲液是PCR缓冲液。
[0096] 在一个实施方案中,试剂盒进一步包括根据本文所述的方法使用试剂盒的组分从细胞裂解物中分离核酸的说明书。
[0097] 在另一方面,提供了如本文所述的热塑性聚合物基质,其用于根据本文所述的方法从细胞裂解物中分离核酸,其中当暴露于细胞裂解物时,热塑性聚合物基质具有净负电荷。
[0098] 在另一方面,提供了如本文所述的热塑性聚合物基质,当用于根据本文所述的方法从细胞裂解物中分离核酸时,其中当暴露于细胞裂解物时,热塑性聚合物基质具有净负电荷。
[0099] 在另一方面,提供了如本文所述的热塑性聚合物基质在制备用于根据本文所述的方法从包含核酸的样品中分离核酸的装置中的用途,其中所述热塑性聚合物基质在溶液中具有净负电荷。
[0100] 实施例
[0101] 材料和方法
[0102] A.3D打印的“DipStix”
[0103] DipStix是使用熔融沉积成型方法3D打印的。3D打印主要是在带有0.4mm打印喷嘴的开源Makerfarm i3v(美国)平台上进行,但是适当的Up Plus 2(中国)和Up Mini(中国)平台也被用来成功打印DipStix。使用Simplify3D软件(美国)对在Maskerfarm i3v上的3D打印进行DipStix 3D模型切片。针对不同的3D丝材料,对Simplify 3D中的3D打印参数,包括打印速度、温度、回缩设置等,进行了优化,从而在每种材料之间保留了相似的打印质量。
[0104] B.通用核酸(NA)分离方案
[0105] 简而言之,为进行特性研究,含有100ng纯化的HeLa细胞gDNA(New England Biolabs)或100ng纯化的BT474细胞gDNA和10μg BSA的100μL离液裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH8.0,1.5M盐酸胍和1%v/v Triton-X.Sigma Aldrich),模拟粗生物裂解物。对于复合样品,将100μl裂解缓冲液添加到50μL细胞悬液(约106个细胞)、单个5mm叶片切片、100μL全血或100μl奶中。除非另有说明,否则将DipStix保留在粗裂解物中5分钟。随后是五次浸入水中1秒的洗涤步骤。然后将DipStix转移到含有用于NA扩增的重组酶聚合酶扩增(RPA)22或定量聚合酶链反应(qPCR)反应的试管中。对于RPA,从柄中折断棒区段并留在反应中。对于qPCR,将DipStix在20μL的1x PCR缓冲液(2X GoTaq Clear,5mM MgCl2、0.1mM dNTP、4μM SYTO-9(50μM)、0.05U/μL Hot Start)中孵育,然后将其移除,因为不透明的结构干扰了荧光的采集。随后添加5μL的含有DNA聚合酶、dNTP、引物和嵌入染料的1x PCR缓冲液,之后进行热循环。除非另有说明,否则在所有实验中均使用用Bilby 3D天然PLA打印至直径2mm版本的DipStix。
[0106] C.DNA检测
[0107] 对于等温RPA,按照制造商的建议使用Twist Amp Basic试剂盒(TwistDx)进行,并进行了一些改动。简而言之,RPA在37℃下在12.5μl反应液中进行15分钟,反应液中补充有250nM各引物和14mM MgAc(乙酸镁)。
[0108] 所有qPCR实验均在ABI 7500qPCR平台(Life Technologies)上进行。对于DNA的qPCR定量,根据造商的指示使用Kapa2G Robust HotStart试剂盒(Kapa Biosystems)进行,并进行了一些改动。简而言之,每种25μL反应液包括缓冲液A(缓冲液A是Kapa2G Robust HotStart试剂盒的一部分,包含1.5mM MgCl2;Sigma-Aldrich)、250nM各引物、25μg BSA(New England Biolabs)和100nM Syto9(Life Technologies)。热循环方案为95℃ 2分钟;40个循环的95℃ 15秒,57℃15秒,72℃ 30秒。
[0109] D.RNA检测
[0110] 对于mRNA和miRNA实验,根据制造商的指示,使用miScript逆转录试剂盒(Qiagen)生成cDNA。miScript系统的好处是基于polyA/oligo dT方法从所有RNA种类生成cDNA。简要地,将携带来自ZR75-1乳腺细胞裂解物的RNA的DipStix浸入25μL的1x miScript HiFlex缓冲液中5分钟,然后取出。然后将5μL的含有逆转录酶的1x HiFlex缓冲液和所需的核酸加入反应中。在37℃下进行60分钟逆转录,然后在95℃下进行5分钟灭活。然后将cDNA用100μL无RNA酶的水稀释,取0.5μL加入每个qPCR实验。下表1中提供了Her3和肌动蛋白mRNA的引物序列。对于miRNA,使用了miScript miR200a、miR15a和RNU6b测定法。
[0111] 表1:
[0112]
[0113] 作为与DipStix方法的比较,还根据制造商的推荐使用了基于TRIzol试剂(Invitrogen)的总RNA提取方法。此处,然后,如上所述,在miScript系统中使用了100ng纯化的RNA。
[0114] E.荧光成像
[0115] 使用Nikon Eclipse Ni荧光显微镜在黑色PLA/碳纤维DipStix上对Cy5标记的短寡核苷酸进行荧光和明视野成像,放大4倍。
[0116] F.扫描电子显微镜
[0117] 为了制备用于扫描电子显微镜(SEM)的DipStix,将样品在45℃下孵育过夜以去除任何污染物,然后使用25mm碳导电片固定在25mm SEM样品架上,然后使用Evactron Model 25等离子清洁器(XIE Instruments)进一步净化。DipStix样品的边缘用碳漆涂覆(dagged)以增加导电性。然后使用Baltek Med 020样品涂层机将20nm铂涂在样品上,然后将其保存在真空干燥器中直至使用。在分析之前,使用Evactron 25型等离子清洁器再次对样品进行净化。使用Jeol JSM-7001F场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)以二次电子检测模式在8kV或
5kV下检查样品的表面细节。
[0118] G.流式电位
[0119] 使用Anton Paar SurPASS流式电位计(德国)在3D打印的热塑性材料薄膜上在NaCl(1mM)溶液中进行流式电位测量。使用NaOH溶液(1M)进行pH滴定。使用Fairbrother-Mastin方法对测量进行分析26。
[0120] 实施例1:使用热塑性材料分离核酸
[0121] 偶然地,令人惊讶地发现3D打印材料可以分离DNA,这与下游扩增方案相容。为了确定此现象是否是其他消费类3D打印基质的共同特征,设计了一种简单的工具进行方便的实验(图1A)。这种概念验证的3D打印工具(在本文中称为“DipStix”)设计为匹配0.2mL的管,并由连接到方形支架上的直径3mm的1.5cm延伸部分(棒)组成。简而言之,将DipStix浸入粗细胞裂解溶液中、移除并通过将其浸入水中5次来快速洗涤。然后将DipStix放入核酸扩增反应混合物中。DipStix工具的一个特点是,可以轻易地将狭窄的“棒”部分折断并将尖端密封在反应管中,从而降低使用过程中交叉污染的风险。DipStix设计强调了3D打印机的多功能性,其可用于快速制作原型,还可以通过促进设备定制来辅助研究。
[0122] 实施例2:3D打印热塑性聚合物作为核酸分离的基质
[0123] 用各种3D打印基质打印DipStix,以测试其从普通裂解液制备的细胞裂解物中分离核酸的效率以及对于随后扩增的效率(图1B)。在这项研究中测试的材料包括各种基于PLA、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯(ABS)和尼龙的热塑性聚合物基质。
[0124] 图1B中的数据表明,所测试的所有基质均能够从细胞裂解物中分离出足够量的DNA(含有约1ng/μL的DNA),用于随后通过等温RPA进行的核酸扩增。在该初始研究中选择RPA是因为其具有医疗点(POC)应用的潜。因此,热塑性聚合物基质是RPA和其他基于等温系统用于核酸分离和扩增应用的理想材料。
[0125] 在所测试的10种材料中,含木材的PLA基质导致最差的扩增效率。尽管需要进一步研究,但该结果可能至少部分归因于木材中残留的酚类化合物,它们可能抑制RPA的核酸扩增。最后,由于扩增发生在使用DipStix的所有情况下,而不发生在离液裂解缓冲液对照的DNA中,因此该数据表明该方法可以除去通过RPA进行核酸扩增的抑制剂。
[0126] 这些数据表明,热塑性聚合物基质适合用于基于实验室的NA分离。另外,由于只需要用于洗涤的水容器,DipStix策略特别适合POC应用。
[0127] 为简单起见,除非另有说明,否则使用PLA基质“PLA Bilby 3D(天然)”进行以下研究。
[0128] 实施例3:低的样品要求
[0129] 进行该实验以确定获得可检测的NA扩增所需的样品量。简而言之,将qPCR应用至DipStix分离的DNA上,所述DNA来自包含100ng至1pg细胞系衍生的DNA的30μl细胞裂解物质。在该研究中使用了高拷贝基因(LINE1)和低拷贝基因(BRAF)。如图2A所示,检测LINE1仅需要低至1pg的DNA,而对于BRAF检测的限度为10pg。数据还表明,该方法从细胞裂解物中去除了足够量的任何核酸扩增抑制剂,因此可具有接近单个基因组拷贝的敏感性(假设1个人基因组拷贝约为3pg)。对于已知DNA浓度的样品,用DipStix分离的DNA量在7个单独的DipStix中也是一致的(参见图2B),如相似的qPCR循环阈值(Ct)值所示。这表明该方法具有很高的再现性(CV=3.1%,N=7)。
[0130] 实施例4:潜在的DipStix应用
[0131] DipStix方法已扩展到潜在的基于NA的应用反应,从研究到诊断应用,以证明其作为NA分离工具的可行性。为此,分别使用RPA和qPCR成功地从粗哺乳动物细胞系裂解物中分离并扩增了DNA(见图2C)、mRNA和miRNA(见图2D)。使用RPA成功地从颊拭子和全血中分离并检测了DNA(参见图2E),并且使用PCR从植物粗提取物中成功分离和检测了DNA(参见图2F)。这些数据表明对一系列NA应用的潜能以及与各种常用NA扩增方案的相容性。
[0132] 实施例5:快速NA捕获和释放
[0133] 进行实验以确定DNA结合至热塑性聚合物基质和随后释放的动力学(参见图3A-C)。简要地,将DipStix暴露于细胞裂解物质一段时间,其范围从快速浸入细胞裂解物中(0秒)到浸入5分钟,然后进行RPA。如图3A所示,在所有时间点观察到相似的扩增产率,表明所有可扩增的DNA至少在所研究的时间范围内迅速结合至热塑性聚合物基质。
[0134] 同样地,DNA可以立即或在一段时间内释放到扩增缓冲液中,释放的DNA量将通过扩增的产率反映出来。在此实验中,使用qPCR是因为RPA不适合在预期的研究时间范围内进行定性测量。简而言之,将加载DNA的DipStix浸入qPCR缓冲液中一段时间,该一段时间的范围从快速浸入(0秒)到浸入120分钟,以使结合到基质的DNA洗脱到缓冲液中。然后进行qPCR。还包括已知量的DNA标准品,以估算可用于PCR的DNA量。代表存在的DNA量的Ct值用于评估扩增产率。如图3B所示,在所有时间点都观察到了相似的Ct值,这表明至少在研究的时间范围内,所有可扩增的DNA都从热塑性聚合物基质中快速洗脱出来。从1ng/μL样品中估计释放的可扩增DNA量约为0.28±0.04ng。
[0135] 然后考虑洗涤步骤以确定缓冲液的类型(H2O或PCR缓冲液)和洗涤时间长度是否会影响随后的NA扩增。如图3C所示,用水或PCR缓冲液洗涤热塑性聚合物基质对随后的NA扩增影响最小,因为观察到相当的Ct值。但是,在0.1至≥5分钟的洗涤时间长度,观察到平均增加的Ct为7.8,这表明DNA迅速大量损失,与图3B中所示的快速解吸一致。另外,在进行大于5分钟的洗涤时所观察到的相似的Ct值表明,DNA损失与缓冲液中的结合之间达到了平衡。数据还表明,即使经过60分钟的洗涤后,仍然可以从热塑性聚合物基质中回收到足够的DNA,用于随后的扩增和检测。
[0136] 实施例6:部分静电驱动的DNA结合
[0137] 进行该实验以确定热塑性聚合物基质的表面电荷是否可以解释其从细胞裂解物中分离DNA的能力。在基于PLA的热塑性聚合物基质上进行流式电位测量。令人惊讶地,发现基于PLA的热塑性聚合物基质带负电(参见图5),因此排除了直接的表面电荷相互作用。该假设得到了以下观察的部分支持:水中的DNA可以与DipStix结合并导致阳性PCR扩增(参见图3C和图3D),这表明至少部分依赖于热塑性聚合物基质的物理结构。此外,随着盐酸胍(GuHCl)浓度的增加,分离的DNA的量也增加了(如较低的Ct值所示)(参见图3D),这表明类似于Boom方法9的盐桥/筛选现象可能至少部分地有助于DNA的分离。
[0138] 实施例7:核酸分离效率是表面积的函数
[0139] 考虑了结合到热塑性聚合物基质表面上的NA的量是否是基质表面积的函数。这是通过控制暴露于含有DNA的细胞裂解物质的DipStix的长度和直径来进行评估的。如图3E所示,令人惊讶地发现,随着浸入长度和直径的减小(即,随着表面积的减小),RPA扩增的产率增加了,而其他条件不变。还发现将打印分辨率提高到200μm(这增加了表面积),降低了扩增产率(参见图3F)。然而,在100μm的3D打印分辨率下,Ct值改善,表明扩增产率增加。不受理论或特定应用模式的束缚,100μm分辨率的有效表面积(在显微镜水平,视觉上更平滑)可能类似于300μm分辨率打印基质的有效表面积。
[0140] 这些观察与预期不符,因为预期随着表面积的增加会有更多的DNA,从而获得更大的扩增产率。但是,观察到相反的效果。该观察结果可能至少部分地归因于更多残留的NA扩增抑制剂(例如离液盐)与更大的表面积结合,导致随后的酶促扩增效率降低,尽管存在更多的结合至基质的DNA。
[0141] 实施例8:核酸的分离效率取决于宏观粗糙度
[0142] 基于以上实施例7中的打印分辨率数据,考察了改变热塑性聚合物基质的表面粗糙度是否会影响其从细胞裂解物中分离NA的能力。简而言之,用有机溶剂二氯甲烷(DCM)处理基于PLA的热塑性聚合物基质(PLA Bilby 3D,天然),以使凹槽平滑,否则凹槽通过逐层3D打印而产生(参见图3G)。在扫描电子显微镜(SEM)下,DCM处理的基质在视觉上更平滑(参见图3G;左图)。但是,在更高的放大倍数下,与未经处理的基质相比,DCM处理的基质在视觉上是多孔的,而未经处理的基质在显微镜下更为光滑(参见图3G,右图)。在打印层之间更近检查时(参见图3H),观察到的孔的范围为1-10微米。随后比较了DCM处理和未处理基质的性能(参见图31),表明多孔的DCM处理的基质(具有更高的表面积)比未处理的基质性能稍差,与图3E-图3F中显示的数据一致。排除了可能的DCM对酶的抑制作用,因为DCM处理的基质在真空下过夜放置,以蒸发掉任何残留的DCM。因此,这些数据表明,由热塑性聚合物基质的逐层打印导致的宏观粗糙度有助于NA分离。
[0143] 还评估了使用两种不同型号的3D打印机制备的热塑性聚合物基质的性能,但未观察到显著差异(参见图3I)。
[0144] 实施例9:核酸位于打印层之间的凹槽中
[0145] 通过将DipStix尖端放置在含有10μM Cy5荧光团标记的短寡核苷酸的裂解缓冲溶液中,观察到DNA与热塑性聚合物基质表面之间的相互作用(参见图3J-图3K)。黑色PLA/碳纤维热塑性聚合物基质被用于该实验,以避免自发荧光的影响。仅在打印层之间观察到荧光,表明DNA优先位于凹槽之间(参见图3J)。
[0146] 将荧光DNA标记的DipStix用于NA分离方案中,对DipStix成像:(1)从裂解缓冲液中移除后立即进行;(2)在水中的洗涤步骤后立即进行;和(3)将其浸入PCR缓冲液中5分钟后立即进行(参见图3K)。如预期的那样,在从含DNA的细胞裂解液中移除后,立即在DipStix的尖端看到了强的荧光,表明DNA与基质结合。洗涤步骤后,荧光水平显著降低,表明已除去过量的DNA。经仔细检查,在洗涤步骤之后残留的结合DNA几乎全部存在于热塑性聚合物基质的打印层之间的凹槽中。最后,将DipStix留在PCR缓冲液中后,看到极少的荧光,这表明几乎所有剩余的DNA都被洗脱到PCR缓冲液中,可用于后续扩增。这与qPCR的数据(参见图3B)一致,其中几乎所有可扩增的DNA几乎立即被洗脱到PCR缓冲液中。
[0147] 进行了进一步的研究,以确定裂解缓冲液如何与DipStix相互作用。使用裂解缓冲液或补充了食用色素的水,观察到染色的裂解缓冲液在DipStix轴上迅速吸收(参见图3L)。相反,染色的水位于与溶液接触的DipStix的表面。染色后的裂解缓冲液的快速吸收可能是由于裂解缓冲液中存在表面活性剂(1%Tween 20),其可能至少部分有助于增强NA的捕获。
[0148] 实施例10:热塑性聚合物基质的流式电位
[0149] 进行这项研究是为了测量几种热塑性聚合物基质的流式(zeta;ζ)电位。该方法使用Anton Paar SurPASS流式电位计(德国)在1mM NaCl溶液中的1mm热塑性聚合物基质膜上进行。使用1M NaOH溶液进行pH滴定,并使用Fairbrother-Mastin方法分析测量值。如图5所示,流式电位数据表明基于PLA的基质(PLA Bilby 3D(天然),PLA ColorFab铜和PLA ProtoPasta导电材料)、基于苯乙烯的基质(ABS Esun(白色))和基于尼龙的基质(尼龙Taulman 910)在很宽的pH值范围内都带负电。本发明人观察到盐浓度没有将热塑性聚合物基质的净电荷从负改变为正。盐浓度的变化只改变对电荷测量的强度的影响(例如,较弱的负电荷变为较强的负电荷,反之亦然)。发明人在测试的pH范围内没有在基质上观察到任何正电荷:如Kirby&Hasselbrink Jr(2014,Electrophoresis,25(2),187-202)的开创性论文所述,在本文公开的实验中所用裂解缓冲液中存在的较高离子强度下,预期所测试的热塑性聚合物基质的ζ电位(有效表面电荷)将保持净负电荷,相比之下,本实验使用较低的离子强度(1mM NaCl)。不受理论或特定的应用方式的束缚,这可能是由于预期单价离子(盐酸胍和Tris-HCl)不吸收到表面,因此不影响热塑性聚合物基质的表面电荷密度。可能影响ζ电位标识的因素是溶液的pH,其将决定热塑性聚合物的质子化/去质子化程度。由于文中测试的裂解缓冲液的pH介于pH 5和pH 11之间,并且所有热塑性聚合物在该pH范围内均产生负的ζ电位值,因此可以很容易地推断出,本文公开的较早实验的裂解缓冲液中的热塑性聚合物基质的ζ电位由于离子筛选效应,也保留了净负电荷。
[0150] 实施例11:裂解缓冲液和洗涤对NA分离和随后的PCR扩增的影响
[0151] 进行实验以确定不同的裂解缓冲液对使用热塑性聚合物基质分离核酸以及随后对分离的DNA的PCR扩增的影响。进行这项研究是因为已知某些裂解缓冲液干扰PCR扩增。简而言之,使用三种不同的裂解缓冲液裂解BT474人乳腺癌细胞:(i)基于GuHCl的裂解缓冲液,该缓冲液包含50mM Tris-HCl pH 8.0、1.5M盐酸胍和1%v/v Triton-X Sigma Aldrich,(ii)包含20mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.5%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)和800单位/mL蛋白酶K的SDS提取缓冲液,以及(iii)包含50mM Tris-cl pH 7.4、150mM NaCl、1mM EDTA pH 8.0、1%Triton X 100、1%脱氧胆酸钠盐和0.1%SDS的RIPA缓冲液。如图6-图14所示,GuHCl和RIPA裂解缓冲液对随后的靶DNA的PCR扩增没有明显的抑制作用,而SDS提取缓冲液抑制了靶DNA的PCR扩增。
[0152] 对于GuHCl和RIPA裂解缓冲液,背景产物的非特异性扩增是明显的,如“无DNA”阴性对照样品中存在的扩增子所示。然而,数据显示,仅在从阳性对照样品产生扩增子之后的10个或更多个循环,阴性对照样品中的扩增子才变得明显。因此,可以使用少于30个循环的截止值来排除背景扩增,但仍允许扩增靶核酸。
[0153] 实施例12:盐浓度对NA分离和随后的PCR扩增的影响
[0154] 进行实验以确定细胞裂解物中盐浓度的变化是否对核酸分离和随后的PCR扩增有任何影响。如图13-图14所示,较低的盐浓度更好地发挥作用,值得注意的是,随着裂解缓冲液中盐浓度的降低,DNA扩增的循环数(CT)减少。较高的盐浓度(例如6M)仍然发挥作用,尽管CT值因此增加。CT的增加可能会对DNA扩增的下限产生负面影响。注意到在30CT以上发现污染物。此外,发现与较高的盐浓度相比,较低的盐浓度对于DNA扩增是最佳的,尽管在所有测试的盐浓度下都产生了扩增子。数据还表明,从裂解缓冲液中移除热塑性聚合物基质后,用水洗涤该热塑性聚合物基质降低了盐对qPCR扩增的任何抑制作用。
[0155] 讨论
[0156] 不受理论或特定应用模式的束缚,这些研究的数据表明有助于使用热塑性聚合物基质从细胞裂解物质中分离核酸(NA)的可能的作用机制,如图4所概述。在合适的盐条件下,NA和核酸扩增抑制剂快速结合到热塑性聚合物基质的表面(见图3A),包括在热塑性聚合物基质层之间可能形成的任何凹槽(见图3J-图3K)。由于裂解缓冲液中存在表面活性剂,通过快速吸收可以提高与热塑性聚合物基质结合的NA的量(参见图3L)。如表面积和扩增产率之间的反比关系所证明的,NA和核酸扩增抑制剂都似乎与热塑性聚合物基质结合(见图3E和图3F)。NA在热塑性聚合物基质上的结合似乎几乎立即发生,这被在各种暴露时间下获得相似的扩增产率所证实(见图3A)。在低盐洗涤期间,过量的NA和核酸扩增抑制剂被充分去除以允许NA扩增(参见图1B和3K)。此外,由于NA似乎优先位于DipStix热塑性聚合物基质的各层之间的凹槽中(参见图3J和图3K),因此某些NA可能会“被捕获”在热塑性聚合物基质的孔中(参见图3G和图3H),如被延长洗涤时间后一致的DNA回收所证明(参见图3C)。最后,将与NA结合的热塑性聚合物基质放入NA扩增缓冲液(其有助于NA溶剂化(洗脱))中时,剩余的NA快速进入溶液中(参见图3B、图3C和图3K),在其中可用于NA扩增。
[0157] 这些数据突出了通过使用热塑性聚合物基质(例如3D打印的聚合物基质)来简单、快速地分离NA的新方法。由于本文公开的方法的速度和简便性,热塑性聚合物基质为常规的NA分离方案提供了有利替代方案。此外,随着消费级别的热塑性聚合物基质变得更容易获得、易于定制的平台,例如本文公开的DipStix示例,人们将在需要NA分离的实验室和基于POC的应用中找到更广泛的应用。
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