| 专利类型 | 发明公开 | 法律事件 | 公开; 实质审查; |
| 专利有效性 | 实质审查 | 当前状态 | 实质审查 |
| 申请号 | CN202411858483.9 | 申请日 | 2024-12-17 |
| 公开(公告)号 | CN119678885A | 公开(公告)日 | 2025-03-25 |
| 申请人 | 安徽农业大学; | 申请人类型 | 学校 |
| 发明人 | 王磊; 崔瑞瑞; 张晓庆; | 第一发明人 | 王磊 |
| 权利人 | 安徽农业大学 | 权利人类型 | 学校 |
| 当前权利人 | 安徽农业大学 | 当前权利人类型 | 学校 |
| 省份 | 当前专利权人所在省份：安徽省 | 城市 | 当前专利权人所在城市：安徽省合肥市 |
| 具体地址 | 当前专利权人所在详细地址：安徽省合肥市蜀山区长江西路130号 | 邮编 | 当前专利权人邮编：230036 |
| 主IPC国际分类 | A01K67/30 | 所有IPC国际分类 | A01K67/30 ; A01M99/00 |
| 专利引用数量 | 0 | 专利被引用数量 | 0 |
| 专利权利要求数量 | 7 | 专利文献类型 | A |
| 专利代理机构 | 专利代理人 | ||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种 生物 防治软体动物 害虫 的方法，利用Phasmarhabditis属 线虫 新物种——六安线虫(Phasmarhabditis luanensis)的 生物防治 方法。该方法包括从自然环境中分离、纯化六安线虫，并通过形态学和分子生物学技术进行种属鉴定。本发明还涉及六安线虫的培养技术，包括固体和液体培养基的选择与优化。通过感染实验，证实了六安线虫对软体动物害虫如蛞蝓和蜗 牛 的高效杀灭能 力 。该生物防治方法旨在减少化学 农药 的使用，降低化学残留，保护人类健康，并提升 农作物 的经济价值。本发明为 可持续农业 生态环境提供了一种新的生物防治策略。 | ||
| 权利要求 | 1.一种利用线虫杀有害生物剂，包括培养基、生物杀虫剂载体。 |
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| 说明书全文 | 基于六安线虫(Phasmarhabditis luanensis)的软体动物害虫生物防治方法 技术领域背景技术[0002] 在生态农场与中草药种植园中，软体动物(如蛞蝓与蜗牛)常在夜晚攀附于植物叶片与嫩芽之上取食，导致作物食用价值降低和经济损失。此外，软体动物可能携带病毒与寄生虫，对人类健康构成威胁。 [0004] 目前，生物防治已成为减少化学农药依赖和保护生态环境的有效途径。在这一领域，Phasmarhabditis属线虫因其对软体动物的致死效果而受到关注。自1990年发现以来，基于Phasmarhabditis属线虫的生物防治产品已在欧洲市场上得到推广，为当地农业生产提供了环保的软体动物管理方案。然而，这些产品在全球范围内的推广受到限制，主要因为缺乏适宜各地区的线虫品系，尤其是在美国和中国等地区。 [0005] 在中国，利用线虫进行软体动物生物防治的研究尚处于起步阶段，与国际先进水平存在差距。软体动物对我国生态农场和中草药种植园构成了严重威胁，同时，随着公众对食品安全的日益关注，开发适合我国本土生态环境的生物防治产品变得尤为迫切。因此，本发明旨在通过深入研究，筛选出对特定软体动物具有高效杀灭作用且对本土生态环境友好的线虫种类，并开发出相应的生物防治产品，以解决我国生态农业中的软体动物防控问题，保障作物产量与质量，同时提升我国在全球生物防治技术领域的竞争力，确保人民的饮食安全。 [0006] 本发明的提出，旨在填补我国在软体动物生物防治技术领域的空白，推动我国生态农业的持续健康发展。 发明内容[0007] 本发明涉及一种适应我国生态环境的Phasmarhabditis属线虫产品及其用于防治软体动物(如蛞蝓、蜗牛)的生物防治方法，旨在填补我国软体动物害虫生物防治领域的空白。本发明的核心目标在于提供一种适应我国生态环境的Phasmarhabditis属线虫产品，以解决当前缺乏专项、高效且环保的软体动物生物灭杀手段的技术难题和商业需求。 [0008] 本发明的技术方案如下： [0009] 本发明所涉及的Phasmarhabditis属线虫是从自然环境中软体动物体内分离得到的。该线虫广泛分布于自然界的腐烂树叶堆等有机物栖息地。当软体动物经过时，线虫能够敏锐感知其存在，并通过气孔侵入软体动物体内。成功寄生后，受感染的软体动物会逐渐表现出外套膜肿胀等病理症状，并在短时间内死亡。基于上述现象，本发明采取以下策略收集线虫：捕捉软体动物后，可通过检查其饲养箱中的排泄物，利用线虫随排泄物排出的特性进行初步收集；或者，直接解剖软体动物，从其体内获取Phasmarhabditis属线虫。收集到的线虫经过适当处理和培养后，即可作为生物农药的活性成分，用于软体动物的生物防治。 [0010] 本发明中的线虫培养方式灵活多样，可采用固体或液体培养基。在选择培养基时，既可使用化学成分精确控制的标准培养基，也可采用成分较粗放的粗培养基。关键在于确保培养基能够提供线虫生长发育所需的蛋白质、甾醇、维生素、矿物质及碳水化合物。 [0011] 从成本效益和生产便捷性出发，商业化生产更倾向于使用如蛋黄盐溶液培养基(包括0.3％～1.5％NaCl，0.5％～3％酵母提取物，0.5％～3％胰蛋白胨，1％～3％橄榄油，3％～6％蛋黄盐溶液)等粗培养基，以降低成本并简化操作流程。为提高线虫采集效率，液体培养基成为优选方案，因为其更适合大规模培养与收获。在实验室阶段，科研人员通常利用锥形瓶进行液体培养实验，而在商业化生产阶段，则采用大型发酵罐作为主要设备。结合高效搅拌系统与通气装置，可确保线虫在液体环境中的健康生长。 [0012] 线虫培养完成后，可通过离心或沉降等分离技术高效收集处于dauer期(休眠期)的线虫。处于该阶段的线虫在储存与运输中更具稳定性，同时保留了优异的生物防治活性。 [0013] 本发明中，线虫展现出广泛的食性。实验表明，线虫不仅能以常见的OP50大肠杆菌为食在实验室环境中正常生长，还能利用包括Top10大肠杆菌在内的多种标准化细菌作为营养来源，维持其健康生长。此外，从蛞蝓体内分离出的多种共生菌也被证实能够有效支持线虫的生长发育。 [0014] 在商业化生产阶段，可综合考虑细菌种类与线虫生长速度的关联，以及某些细菌是否能分泌对软体动物具有杀灭效果的毒素等关键因素，从而筛选出最适合的细菌种类作为线虫的营养来源。此举不仅能够优化线虫的生产效率，还能提升其生物防治效果。 [0015] 鉴于目前科学研究中仅Phasmarhabditis属线虫被证实具有杀灭软体动物的能力，对采集线虫进行准确的种属鉴定尤为重要。本发明结合表观鉴定与分子鉴定两种互补方法，确保鉴定结果的精准可靠。 [0016] 在表观鉴定方面，通过详尽比对文献中关于Phasmarhabditis属线虫的描述特征，进行形态学分类，完成初步判断。分子鉴定则通过分析采集线虫的18SrDNA、28S rDNA及ITS序列等保守遗传标记，与已知的Phasmarhabditis属线虫序列进行比对，进一步验证种属身份。利用这两种方法，我们的研究团队成功鉴定并命名了一种新物种：六安线虫(Phasmarhabditis luanensis)。 [0017] 在后续的培养实验中，我们挑选了体内携带卵的雌性线虫进行固体培养。实验结果显示，培养基中不仅出现了雌性线虫，还观察到了雄性线虫，且雌雄比例约为0.85。这一发现为深入理解该线虫的生殖策略和种群动态提供了宝贵线索。 [0018] 为满足市售线虫在室温下的长期存储需求，本发明采用0.5％～5％琼脂糖凝胶、3％～15％聚丙烯酰胺凝胶或硅藻土等多种载体材料对线虫进行包埋处理。优选用于包埋的线虫处于dauer期(休眠期)，因为这一阶段的线虫不仅具备主动侵染软体动物的能力，其生命周期也显著延长，可达4个月之久，远超正常生长周期仅约3周的线虫。 [0019] 通过该方法，有效提升了线虫产品在市场流通中的稳定性与活性，确保其在使用过程中持续发挥高效的生物防治效果。 [0020] 本发明具有如下有益效果： [0021] 本发明提出了一种高效灭杀软体动物的线虫产品，特别适用于生态农场、中草药种植园等追求绿色生态、严格限制化学农药使用的场所。该技术能够显著降低软体动物对农作物和中草药的危害，有效保障农产品品质与生态安全。 [0022] 国外文献记载显示，高剂量下，Phasmarhabditis hermaphrodita、Phasmarhabditis papillosa及Phasmarhabditis californica在14天内可引起86％～97％的软体动物死亡率。通过实验验证发现，P.luanensis线虫对软体动物的灭杀效果优于国外文献中的结果。 [0023] 本发明的核心在于突破了我国软体动物生物防治技术的瓶颈，填补了该领域的技术空白。这不仅体现了对环境保护的高度责任感，也为农业可持续发展和生态平衡维护提供了全新思路与方法。 [0024] 该技术的推广与实施将显著促进生态农业的发展，减少化学农药对土壤、水源及生物多样性的负面影响，同时提升农产品的市场竞争力，以满足消费者对绿色、健康产品日益增长的需求。此外，本发明的成功应用将带动相关生物防治技术的研发与推广，为我国乃至全球农业生物安全和可持续发展贡献重要力量。 具体实施方式[0025] 以下结合实验室具体试验数据和实施例，进一步详细阐述本发明的技术内容。需要特别说明的是，所提供的实施例旨在清晰展示本发明的实际应用，且不用于限制本发明所涵盖的广泛范围。除非特别指出，实施例中所采用的方法均遵循本领域技术人员的常规操作规范；所有试剂及材料，如未特别说明其来源，均视为市售的标准产品。 [0026] 步骤1、分离线虫 [0028] (2)每天喷洒少量水保持饲养箱湿度，并采集饲养箱中的排泄物在显微镜下挑取线虫。 [0029] 步骤2、培养线虫 [0030] (1)按照琼脂3％，NaCl 0.6％，酵母提取物2.5％，胰蛋白胨0.5％的比例配制固体培养基，并在灭菌锅中灭菌； [0031] (2)按照鸡蛋黄与0.9％ NaCl溶液1:1的比例配制蛋黄盐溶液； [0032] (3)将步骤2.1中的固体培养基冷却至约60℃，按培养基总量的5％加入步骤2.2中制备的蛋黄盐溶液及3％的橄榄油，充分摇匀； [0033] (4)倒板冷却凝固后涂抹Top10大肠杆菌，在25℃培养48h； [0034] (5)将步骤1.2中挑取的线虫接种到步骤2.4中的固体培养基上培养4d； [0035] (6)从步骤2.5中挑取单个线虫接种到步骤2.4中的固体培养基上，继续培养7d； [0036] (7)按照NaCl 0.6％，酵母提取物2.5％，胰蛋白胨0.5％的比例配制液体培养基，并在灭菌锅中灭菌； [0037] (8)将步骤2.7中的液体培养基冷却至室温后，按培养基总量的5％加入步骤2.2中制备的蛋黄盐溶液及3％的橄榄油，充分摇匀； [0038] (9)在液体蛋黄液培养基中加入Top10大肠杆菌，在28℃摇床培养32h； [0039] (10)用蒸馏水冲下步骤2.6中的线虫，并将其加入灭菌的液体培养基中，在25℃摇床培养7d； [0041] 步骤3、鉴定线虫 [0042] (1)使用蒸馏水冲下步骤1.2及步骤2.6中的线虫进行物种表观鉴定，如图1； [0043] (2)使用蒸馏水冲洗步骤2.6中培养的线虫，提取线虫DNA后，利用通用引物扩增28S rDNA序列(28S正向引物：5’‑AGCGGAGGAAAAGAAACTAA‑3’，28S反向引物：5’‑TCGGAAGGAACCAGCTACTA‑3’)，进行物种分子鉴定。 [0044] 步骤4、线虫载体 [0045] (1)按照1.1％配制琼脂糖溶液； [0046] (2)温度达到30℃时加入步骤2通过离心收集的dauer期线虫并搅拌。 [0047] 步骤5、双线嗜粘液蛞蝓感染实验 [0049] (2)挑选30只双线嗜粘液蛞蝓，个体重量为1.07g±0.22g(变异范围20％)。将蛞蝓分为6组，每组5只，其中实验组(感染组)和对照组各3组(如图2)； [0050] (3)实验组每个饲养盒中加入120,000条P.luanensis线虫，相当于每平方厘米底部布料上添加1200条线虫；对照组每盒加入1mL用于饲养线虫的Top10大肠杆菌，并补充蒸馏水，确保液体总量与实验组一致； [0051] (4)以生菜叶和狗粮作为软体动物的饲料，控制温度为25℃，保持基底湿润以利于线虫存活及活动，但不形成积水。持续观察5天，统计软体动物的存活率(如图3)。 [0052] 步骤6、同型巴蜗牛感染实验 [0053] (1)准备6个饲养盒，每个盒子底部铺设面积为100cm2的纯棉无纺布作为基底。 [0054] (2)挑选36只同型巴蜗牛，个体直径为8mm±1mm，分为6组，每组6只。其中，实验组(感染组)和对照组各3组。 [0055] (3)实验组每个饲养盒中加入90,000条P.luanensis线虫，相当于每平方厘米底部布料上添加900条线虫；对照组每盒加入1mL用于饲养线虫的Top10大肠杆菌，并补充蒸馏水，使液体总量与实验组一致 [0056] (4)以生菜叶作为软体动物的饲料，控制温度为25℃，保持基底湿润以利于线虫存活及活动，但不形成积水，连续观察10天，统计软体动物的存活率(如图4)[0057] 最后，需要特别说明的是，以上所列仅为本发明的具体实施例。本发明并不局限于这些实施例，还可以进行多种变形或调整。凡是本领域普通技术人员根据本发明公开内容直接推导或联想到的所有变形与改进，均应视为属于本发明的保护范围。附图说明 [0058] 下面结合附图对具体实施方式作进一步详细说明。 [0059] 图1，P.luanensis线虫雌雄个体体态特征 [0060] 注：图中展示了线虫的两种性别个体。左上方为雄性个体，其尾部呈伞骨状形态，典型地与雄性生殖器结构相关；下方为雌性个体，其尾部呈针状，符合雌性个体的形态特征。 [0061] 图2，P.luanensis线虫与其他Phasmarhabditis属线虫28S rDNA构建进化树[0062] 注：进化树的构建采用了邻接法(NJ法)，并进行了1000次Bootstrap检验，仅展示置信度≥50％的支持值。分析结果表明P.luanensis线虫属于Phasmarhabditis属。 [0063] 图3，P.luanensis线虫与其他Phasmarhabditis属线虫28S rDNA多重序列比对[0064] 注：多重序列比对结果涵盖了国内外发现的部分Phasmarhabditis属线虫，分析表明P.luanensis与其他Phasmarhabditis属线虫属于不同种。 [0065] 图4，P.luanensis线虫感染双线嗜粘液蛞蝓实验 [0066] 注：实验设置实验组和对照组各3组。每个饲养盒内铺设面积为100cm2的纯棉无纺布作为基底，并分别放入5条双线嗜粘液蛞蝓，个体重量为1.07g±0.22g(变异范围20％)。实验组每平方厘米添加1200条P.luanensis线虫；对照组则加入1mL用于饲养线虫的Top10大肠杆菌，并补充蒸馏水，使液体总量与实验组相同(图4a、4b)。实验结果显示，对照组蛞蝓无死亡情况，而实验组的蛞蝓在第5天全部死亡，图4c中展示了部分实验组死亡个体。 [0067] 图5，P.luanensis感染下双线嗜粘液蛞蝓存活率 [0068] 注：图中展示了双线嗜粘液蛞蝓在暴露于每平方厘米1200条P.luanensis线虫条件下的存活率变化，以及对照组(无线虫侵染)双线嗜粘液蛞蝓的存活率变化。实验结果显示，在线虫处理组中，蛞蝓存活率随时间逐渐下降，并在第5天降至0％；而对照组蛞蝓在5天内存活率保持为100％。 [0069] 图6，P.luanensis感染下同型巴蜗牛存活率 [0070] 注：图中展示了同型巴蜗牛在暴露于每平方厘米900条P.luanensis线虫条件下的存活率变化，以及对照组(无线虫侵染)同型巴蜗牛的存活率变化。实验结果显示，在线虫处理组中，蜗牛存活率随时间逐渐下降，并在第10天降至0％；而对照组蜗牛在10天内存活率保持为100％。 |
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