[0001] 本发明属于固体废弃物处理领域，具体涉及一种强化好氧堆肥中抗性基因去除及促进腐殖化的方法。

[0002] 抗生素的使用甚至滥用加速了耐药细菌的产生，微生物耐药性已成为全球最严峻的公共卫生挑战之一，联合国环境规划署中将抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)列为六大新兴环境问题之首。畜禽养殖是抗生素耐药性重要的“源”，畜禽粪便是ARGs的重要贮存库，其作为肥料施入农田土壤后，会造成土壤中ARGs种类和数量显著增加。研究发现，粪肥施用的土壤中有63种ARGs亚型的丰度比对照土壤高192～28000倍(ZhuYG,Johnson TA,Su JQ et al.,Diverse and abundant antibiotic resistance genes in Chinese swine farms.Proceedings ofthe NationalAcademy ofSciences ofthe United States of America,2013,110(9):3435‑3440.)。土壤中的ARGs可进一步通过“土壤‑植物”系统进入作物，最终随食物链对人类健康构成潜在威胁。因此，有效阻控畜禽粪便中ARGs在环境中的传播已成为社会公共安全需求。

[0003] 好氧堆肥是畜禽粪便无害化、减量化和资源化最重要的途径之一。但传统好氧堆肥工艺存在生物转化慢、无害化不彻底、腐殖化程度低(产品肥效低)等问题。现有研究表明，虽然堆肥过程中抗生素可被降解，但抗生素引发的抗性基因经传统好氧堆肥后并不能被有效削减(Su JQ,Wei B,Qu Y et al.,Antibiotic resistome and its association with bacterial communities during sewage sludge composting.Environmental Science&Technology,2015,49(12):7356‑7363.)。添加剂的应用是强化堆肥的主要技术策略。目前，堆肥添加剂主要有微生物菌剂和生物炭等材料添加剂。中国专利CN116948883A公开了一种复合芽孢杆菌生物菌剂削减猪粪好氧堆肥中磺胺类抗性基因sul1、sul2及整合子基因intI1。中国专利CN116730755A公开了一种通过接种木质纤维素高效水解菌促进木质纤维素类有机废弃物堆肥中木质纤维素的降解，提升堆肥产品质量。但微生物菌剂通常对堆肥条件要求较高，且外源微生物往往竞争不过土著微生物，实际生产中往往效果不明显。中国专利CN107129374A公开了一种利用竹材生物炭降低有机肥中四环素类抗性基因丰度的方法，其将竹材在600℃下高温裂解成生物炭，再将其以堆肥物料干重的2.5％添加到堆肥中，添加生物炭处理的三种四环素类抗性基因丰度显著低于对照组。中国专利CN 
115196616A公开了一种镁盐改性生物炭材料降低粪肥中ARGs的方法，其将稻壳生物炭与镁盐溶液混合制备镁盐改性生物炭材料，并以粪便重量的2％添加到堆肥材料中，整体上镁盐改性生物炭添加组磺胺类抗性基因(sul2、dfrA1、dfrA7)、大环内酯类抗性基因(ermF、ermB)及MGEs整合子基因(intI1)的绝对丰度低于对照组，普通生物炭处理组的sul1、sul2、dfrA7、ermF基因绝对丰度明显高于对照组。文献“添加不同比例玉米生物炭的堆肥腐殖质光谱学表征”(候智斌,谢益平,曹长春,徐锦涛.科学技术与工程,2023,23(26):11459‑
11475.)公开了在堆肥中添加10％和15％的玉米生物炭可使产品腐殖质含量增加。可见，这些报道方案中生物炭材料通常用量较大(物料干重的2％‑20％)，大幅增加生产成本，不利于田间推广应用。

[0004] MnFe2O4是一类尖晶石铁氧体催化剂，晶格中多变的氧缺陷空位、容易被激发的能带等微观结构会引起多变的微观界面特性，目前，MnFe2O4应用于好氧堆肥中抗性基因的削减及强化腐殖化的研究尚未见报道。

[0005] 为解决现有的好氧堆肥方法无害化不彻底、腐殖化程度低等技术问题，本发明提供一种利用MnFe2O4强化好氧堆肥中抗性基因去除及促进腐殖化的方法。

[0006] 具体而言，本发明是通过以下技术方案实现的：

[0007] 1)原料准备：

[0008] 将畜禽粪便、堆肥辅料混合，调节含水率为55％‑65％(含水率优选60％)，碳氮比20‑30(C/N优选25)，随水加入MnFe2O4添加剂，得到堆肥原料；

[0009] 所述畜禽粪便包括猪粪、鸡粪、羊粪或牛粪中的一种或多种；

[0010] 所述堆肥辅料为小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆或木屑中的一种或多种，粉碎至长度<3cm；

[0011] 所述的畜禽粪便、堆肥辅料的鲜重质量比为3:1‑6:1；

[0012] 所述MnFe2O4添加剂的添加量为初始堆肥物料干重的0.01％‑0.5％。

[0013] 2)好氧堆肥：

[0014] 利用上述准备的堆肥原料进行常规好氧堆肥，升温期和高温期每2‑3天翻堆一次，降温期和腐熟期每7天翻堆一次，堆肥温度高温期(50℃以上)不低于5天，好氧堆肥的时间为20‑30天，即实现强化去除堆肥产物中的抗性基因及促进腐殖化；堆肥产物符合有机肥料腐熟标准(NY525‑2021)。

[0015] 本步骤的好氧堆肥方法为本领域常规堆肥方法，如文献(Sun HJ,Chen S,Zhu N et al.,Hydrothermal carbonization aqueous phase promotes nutrient retention and humic substance formation during aerobic composting of chicken manure.Bioresource Technology,2023,385:129418.)中公开的方法。

[0016] 优选的，上述技术方案中所使用的添加剂MnFe2O4是通过如下水热法制备的：配置‑1 ‑1 ‑10.1mol L 氯化铁和0.05mol L 氯化锰的混合溶液，逐滴加入3mol L NaOH溶液至pH为12。
然后将上述悬浊液注入到高压反应釜中，将高压反应釜置于马弗炉中，以10℃/min的速率升温至250℃，反应12h。反应结束后，待高压反应釜冷却至室温后，将样品取出，用去离子水和乙醇交替洗涤数次，至洗出液pH不再变化，最后在真空干燥箱中60℃干燥12‑24h，取出研磨后过300目筛，获得黑褐色粉末即为MnFe2O4添加剂。

[0017] 本申请中，术语“抗生素抗性基因”、“抗性基因”均是指磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类抗性基因。术语“强化或促进腐殖化”是指提高腐殖酸含量，提高堆肥产品肥效。

[0018] 与现有好氧堆肥方法相比，本发明的强化好氧堆肥中抗性基因去除及促进腐殖化的方法具有以下有益效果：

[0019] 1)本发明强化去除抗性基因效果及腐殖化效果显著，实施例堆肥结束时，本发明方法获得的堆肥产物中磺胺类抗性基因相对丰度相比对照降低60％‑73％(其中，sul1基因相对丰度相比对照降低60％‑73％，sul2基因相对丰度相比对照降低24％‑69％)；四环素类抗性基因相对丰度相比对照降低50％‑57％(其中，tetC基因相对丰度相比对照降低60％‑84％，tetG基因相对丰度相比对照降低25％‑41％，tetM基因相对丰度相比对照降低42％‑
53％，tetO基因相对丰度相比对照降低12％‑88％，tetW基因相对丰度相比对照降低42％‑
64％，tetX基因相对丰度相比对照降低70％‑73％)；大环内酯类抗性基因相对丰度比对照降低20％‑80％(其中ermB基因相对丰度相比对照降低26％‑57％，ermC基因相对丰度相比对照降低1.4％‑65％，ermF基因相对丰度相比对照降低11％‑99％)；氨基糖苷类抗性基因相对丰度比对照降低45％‑66％(其中，aadA基因相对丰度相比对照降低46％‑77％，aadD相对丰度相比对照降低14％‑43％)，腐殖质HS相比对照提升2％‑14％，腐殖酸HA相比对照提升6％‑15％。

[0020] 2)本发明操作简单，材料成本低廉，无二次污染。MnFe2O4结构高度可控，可通过调变金属摩尔比、煅烧温度及时间等调控其界面性质，针对性适配多酚‑美拉德反应催化机制，同时实现有机固体废弃物高效无害化与资源化，适于大面积推广。附图说明

[0021] 图1本发明实施例1堆肥过程中，0.01％MnFe2O4添加组和对照组磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类抗性基因相对丰度变化对比图；

[0022] 图2本发明实施例1堆肥过程中，0.01％MnFe2O4添加组和对照组腐殖质HS和腐殖酸HA含量变化对比图；

[0023] 图3本发明实施例2堆肥过程中，0.1％MnFe2O4添加组和对照组磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类抗性基因相对丰度变化对比图；

[0024] 图4本发明实施例2堆肥过程中，0.1％MnFe2O4添加组和对照组腐殖质HS和腐殖酸HA含量变化对比图；

[0025] 图5本发明实施例3堆肥过程中，0.5％MnFe2O4添加组和对照组磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类抗性基因相对丰度变化对比图；

[0026] 图6本发明实施例3堆肥过程中，0.5％MnFe2O4添加组和对照组腐殖质HS和腐殖酸HA含量变化对比图。

[0027] 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明：

[0028] 实施例中MnFe2O4制备方法：

[0029] 配置0.1mol L‑1氯化铁和0.05mol L‑1氯化锰的混合溶液，逐滴加入3mol L‑1NaOH溶液至pH为12。然后将上述悬浊液注入到高压反应釜中，将高压反应釜置于马弗炉中反应(以10℃/min的速率升温至250℃，反应时间为12h)。反应结束，待高压反应釜冷却至室温后，将样品取出，用去离子水和乙醇交替洗涤数次，至洗出液pH不再变化，最后在真空干燥箱中干燥(温度为60℃，时间为12h)，获得黑褐色粉末，取出研磨后，过300目筛待用；

[0030] 实施例1

[0031] (1)物料制备及混合：本实施例中鸡粪原料取自南京市某鸡场的新鲜鸡粪(含水率70％)，小麦秸秆取自江苏省农业科学院六合试验田(含水率8％)，将小麦秸秆粉碎至<3cm。
将新鲜鸡粪、小麦秸秆按5:1混合，加入适量水调节含水率为60％，C/N为25。随水加入初始堆肥物料干重的0.01％的MnFe2O4，添加MnFe2O4的设为试验组，无添加剂的为对照组。

[0032] (2)好氧堆肥：将步骤(1)中所得堆肥物料进行常规好氧堆肥，本实施例使用常规方法进行堆肥，参考文献“Sun HJ,Chen S,Zhu N et al.,Hydrothermal carbonization aqueous phase promotes nutrient retention and humic substance formation during aerobic composting of chicken manure.Bioresource Technology,2023,385:129418.”中公开的方法。使用长63cm，宽48cm，高36cm的立方体保温箱进行堆肥。升温期和高温期每2‑3天翻堆一次，降温期和腐熟期每7天翻堆一次，好氧堆肥的时间为30天(试验组和对照组均在堆肥第1天升温至50℃以上，50℃以上天数维持11天，之后经历降温腐熟期)，经检测，试验组和对照组堆肥产物均符合有机肥料腐熟标准(NY525‑2021)。

[0033] 对两组堆肥过程中抗性基因和腐殖化参数进行检测，结果如图1和图2所示。图1中，(a)‑(d)分别为磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类相对丰度的检测结果。

[0034] 抗性基因测定方法：高通量qPCR法，目的基因的相对丰度以16S rRNA基因拷贝数归一化，参照文献“Zhu N,Long YJ,Kan ZX et al.,Reduction ofmobile genetic elements determines the removal of antibiotic resistance genes during pig manure composting after thermal pretreatment.Bioresource Technology,2023,387:129672.”的方法。

[0035] 由图1可知，随着好氧堆肥过程的进行，抗性基因相对丰度均不断下降，但对照组经过30天好氧堆肥，仍有较高抗性基因残留。0.01％MnFe2O4添加可显著促进抗性基因的降解，堆肥结束时，磺胺类抗性基因相对丰度相比对照降低60％，四环素类抗性基因相对丰度相比对照降低50％，大环内酯类抗性基因相对丰度相比对照降低80％，氨基糖苷类抗性基因相对丰度相比对照降低66％。

[0036] 图2中，(a)、(b)分别为腐殖质HS、腐殖酸HA的检测结果。HS和HA的测定方法：2g研磨好的堆肥样品加入20mL提取液(0.1mol/LNaOH和0.1mol/LNa4P2O7，体积比为1:1)，室温下振荡2h，4000rpm离心10min，提取上清液，去掉滤渣，滤渣按上述操作重复3次。滤液为总腐殖质HS。取2/3HS用6mol/L盐酸酸化至pH1.0‑2.0，充分搅拌，室温下静置过夜，4000rpm离心10min，沉淀物即腐殖酸HA，用0.1mol/LKOH溶解，定容。采用TOC仪测定样品中的HS和HA。

[0037] 由图2可以看出，随着好氧堆肥过程的进行，堆体腐殖化程度逐渐升高，对照组堆肥结束腐殖质HS相比初始提升33％，腐殖酸HA相比初始提升89％。0.01％MnFe2O4添加显著促进了堆肥过程的腐殖化程度，堆肥结束时，腐殖质HS相比对照提升14％，腐殖酸HA相比对照提升15％。

[0038] 实施例2

[0039] (1)物料制备及混合：本实施例中鸡粪原料取自镇江市某鸡场的新鲜鸡粪(含水率75％)，小麦秸秆取自连云港秸秆场(含水率7％)，将小麦秸秆粉碎至1‑3cm。将新鲜鸡粪、小麦秸秆按3:1混合，加入适量水调节含水率为55％，C/N为30。随水加入初始堆肥物料干重的
0.1％的MnFe2O4，添加MnFe2O4的设为试验组，无添加剂的为对照组。

[0040] (2)好氧堆肥：将步骤(1)中所得堆肥物料进行常规好氧堆肥(步骤同实施例1)。使用长63cm，宽48cm，高36cm的立方体保温箱进行堆肥。升温期和高温期每2‑3天翻堆一次，降温期和腐熟期每7天翻堆一次，好氧堆肥的时间为30天(试验组和对照组均在堆肥第1天升温至50℃以上，50℃以上天数维持10天，之后经历降温腐熟期)，经检测，试验组和对照组堆肥产物均符合有机肥料腐熟标准(NY525‑2021)。

[0041] 对两组堆肥过程中抗性基因和腐殖化参数进行检测，结果如图3和图4所示。检测方法同实施例1。

[0042] 图3中，(a)‑(d)分别为磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类相对丰度的检测结果。由图3可知，随着好氧堆肥过程的进行，抗性基因相对丰度均不断下降，但对照组经过30天好氧堆肥，仍有较高抗性基因残留。0.1％MnFe2O4添加可显著促进抗性基因的降解，堆肥结束时，磺胺类抗性基因相对丰度相比对照降低71％，四环素类抗性基因相对丰度相比对照降低56％，大环内酯类抗性基因相对丰度相比对照降低20％，氨基糖苷类抗性基因相对丰度相比对照降低45％。

[0043] 图4中，(a)、(b)分别为腐殖质HS和腐殖酸HA的检测结果。由图4可以看出，随着好氧堆肥过程的进行，堆体腐殖化程度逐渐升高，对照组堆肥结束腐殖质HS相比初始提升33％，腐殖酸HA相比初始提升91％。0.1％MnFe2O4添加显著促进了堆肥过程的腐殖化程度，堆肥结束时，腐殖质HS相比对照提升12％，腐殖酸HA相比对照提升9％。

[0044] 实施例3

[0045] (1)物料制备及混合：本实施例中鸡粪原料取自盐城市某鸡场的新鲜鸡粪(含水率60％)，小麦秸秆取自盐城市秸秆场(含水率9％)，将小麦秸秆粉碎至1‑3cm。将新鲜鸡粪、小麦秸秆按6:1混合，加入适量水调节含水率为65％，C/N为20。随水加入初始堆肥物料干重的
0.5％的MnFe2O4，添加MnFe2O4的设为试验组，无添加剂的为对照组。

[0046] (2)好氧堆肥：将步骤(1)中所得堆肥物料进行正常好氧堆肥(步骤同实施例1)。使用长63cm，宽48cm，高36cm的立方体保温箱进行堆肥。升温期和高温期每2‑3天翻堆一次，降温期和腐熟期每7天翻堆一次，好氧堆肥的时间为30天(试验组和对照组均在堆肥第1天升温至50℃以上，50℃以上天数维持8天，之后经历降温腐熟期)，经检测，试验组和对照组堆肥产物均符合有机肥料腐熟标准(NY525‑2021)。

[0047] 对两组堆肥过程中抗性基因和腐殖化参数进行检测，结果如图5和图6所示。检测方法同实施例1。

[0048] 图5中，(a)‑(d)分别为磺胺类、四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类相对丰度的检测结果。

[0049] 由图5可知，随着好氧堆肥过程的进行，抗性基因相对丰度均不断下降，但对照组经过30天好氧堆肥，仍有较高抗性基因残留。0.5％MnFe2O4添加可显著促进抗性基因的降解，堆肥结束时，磺胺类抗性基因相对丰度相比对照降低73％，四环素类抗性基因相对丰度相比对照降低57％，大环内酯类抗性基因相对丰度相比对照降低29％，氨基糖苷类抗性基因相对丰度相比对照降低63％。

[0050] 图6中，(a)、(b)分别为腐殖质HS和腐殖酸HA的检测结果。由图6可以看出，随着好氧堆肥过程的进行，堆体腐殖化程度逐渐升高，对照组堆肥结束腐殖质HS相比初始提升34％，腐殖酸HA相比初始提升88％。0.5％MnFe2O4添加显著促进了堆肥过程的腐殖化程度，堆肥结束时，腐殖质HS相比对照提升2％，腐殖酸HA相比对照提升6％。

[0051] 对比例1

[0052] (1)物料制备及混合：对比例中鸡粪原料取自南京市某鸡场的新鲜鸡粪(含水率70％，来源同实施例1)，小麦秸秆取自江苏省农业科学院六合试验田(含水率8％，来源同实施例1)，将小麦秸秆粉碎至<3cm。

[0053] 将新鲜鸡粪、小麦秸秆按5:1混合，加入适量水调节含水率为60％，C/N为25，随水加入初始堆肥物料干重的0.01％的MnO2，添加MnO2(麦克林，中国)的设为试验组，无添加剂的为对照组。

[0054] (2)好氧堆肥：将步骤(1)中所得堆肥物料进行常规好氧堆肥(步骤同实施例1)。使用长63cm，宽48cm，高36cm的立方体保温箱进行堆肥。升温期和高温期每2‑3天翻堆一次，降温期和腐熟期每7天翻堆一次，好氧堆肥的时间为30天(试验组和对照组均在堆肥第1天升温至50℃以上，50℃以上天数维持11天，之后经历降温腐熟期)，经检测，试验组和对照组堆肥产物均符合有机肥料腐熟标准(NY525‑2021)。

[0055] 对两组堆肥过程中抗性基因和腐殖化参数进行检测，检测方法同实施例1。并与实施例1中的MnFe2O4添加组进行比较，结果如表1所示。

[0056] 表1各处理组堆肥腐熟产物中抗性基因相对丰度

[0057]

[0058] 由表1可知，与对照组相比，MnO2添加反而增加了堆肥产物中各类抗性基因的相对丰度，同时降低了腐殖质HS的含量(降低13％)，腐殖酸HA增加有限(增加4.7％)，而MnFe2O4添加可显著促进抗性基因的降解，堆肥产物中磺胺类抗性基因相对丰度相比对照降低60％，四环素类抗性基因相对丰度相比对照降低50％，大环内酯类抗性基因相对丰度相比对照降低80％，氨基糖苷类抗性基因相对丰度相比对照降低66％。同时，MnFe2O4添加显著促进了堆肥过程的腐殖化程度，堆肥产物中腐殖质HS相比对照提升14％，腐殖酸HA相比对照提升15％。

[0059] 对比例2

[0060] (1)物料制备及混合：本实施例中鸡粪原料取自南京市某鸡场的新鲜鸡粪(含水率70％，来源同实施例1)，小麦秸秆取自江苏省农业科学院六合试验田(含水率8％，来源同实施例1)，将小麦秸秆粉碎至1‑3cm。

[0061] 将新鲜鸡粪、小麦秸秆按5:1混合，调节碳氮比为25，加入适量水调节含水率为60％，随水加入初始堆肥物料干重的0.01％的MnSO4，添加MnSO4(麦克林，中国)的设为试验组，无添加剂的为对照组。

[0062] (2)好氧堆肥：将步骤(1)中所得堆肥物料进行常规好氧堆肥(步骤同实施例1)。使用长63cm，宽48cm，高36cm的立方体保温箱进行堆肥。升温期和高温期每2‑3天翻堆一次，降温期和腐熟期每7天翻堆一次，好氧堆肥的时间为30天(试验组和对照组均在堆肥第1天升温至50℃以上，50℃以上天数维持11天，之后经历降温腐熟期)，经检测，试验组和对照组堆肥产物均符合有机肥料腐熟标准(NY525‑2021)。

[0063] 对两组堆肥过程中抗性基因和腐殖化参数进行检测，检测方法同实施例1。并与实施例1中的MnFe2O4添加组进行比较，结果如表2所示。

[0064] 由表2可知，与对照组相比，MnSO4添加反而增加了堆肥产物中各类抗性基因的相对丰度，同时腐殖质HS含量不变，腐殖酸HA含量微量增加(增加7％)，而MnFe2O4添加可显著促进抗性基因的降解，堆肥产物中磺胺类抗性基因相对丰度相比对照降低60％，四环素类抗性基因相对丰度相比对照降低50％，大环内酯类抗性基因相对丰度相比对照降低80％，氨基糖苷类抗性基因相对丰度相比对照降低66％。同时，MnFe2O4添加显著促进了堆肥过程的腐殖化程度，堆肥产物中腐殖质HS相比对照提升14％，腐殖酸HA相比对照提升15％。

[0065] 表2各处理组堆肥腐熟产物中抗性基因相对丰度

[0066]

[0067] 虽然上述实施例已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。