【発明の詳細な説明】 本発明は誘電泳動の現象を利用した、微生物、その他の粒子の特性化または確認の方法と装置に関する。

不均一電場での媒質中に懸濁した誘電分極性粒子が、
正味電荷を有さないとしても、電場の強さの増減方向にそれらを移動させる傾向がある（それらの分極性が媒質の分極性よりも大きいか小さいかに依存して）「誘電泳動」力の支配下にあることは周知であり、体積Ｖと有効分極性Ｐとを有する粒子が支配されるこの力は関係式： Ｆ＝PV（Ｅ・▽）Ｅ によって与えられ、式中Ｅは粒子の位置における電場の強さであり、▽はデルベクトル オペレーター（del ve
ctor operator）である。 如何なる点における電界強さも振動するが、電界パターンは一定である交流電界では、粒子に対する誘電泳動力は一方向性であるが、その大きさは振動的に変動し、生ずる粒子運動は一方向性であり、例えば粒子の分極性が周囲媒質の分極性よりも大きい場合には、粒子を電界強度の増大する方向に、通常は、間に電界が生ずる電極系のいずれか一方の方向に粒子を移動させる。 交流電界の使用は粒子上の正味電荷のために粒子に正味の力が作用しないという利点を有する、このような力はそれ自体が交番であり、サイクルにわたるその平均が零であるからである。

生物学的細胞を含む水性又はその他の流体サスペンジョンからこのような細胞を回収するために、サスペンジョンを電極系を備えた容器に、電極がサスペンジョン中に浸せきするように入れ、次に電極間に電圧（通常は交流）を与えて、サスペンジョン内の細胞（それら自体に隣接する位置の電界強さの増加する方向に必らず移動する）を電極のいずれか一方の方向に移動させて、電極上又は電極に隣接する周囲に回収することによって、誘電泳動効果を利用することが提案されている。 ジェイ・エイ・アール・プライス（JARPrice）、ジェイ・ビー・エッチ・バート（JPHBurt）およびアール・ペッシング（R.Pething）によるバイオチミカ エト バイオフィジカ アクタ（Biochimica et Biophysica Acta）9
64（1988）,221〜230頁における論文に述べられているように、電極間の間隙に通して光線を照射し、透過後の光線ビームの強度を測定することによって、細胞の回収速度を観察し、測定した：すなわち、細胞回収が進行するにつれての光線の吸収または散乱の増加による透過光線の強度低下が回収される細胞総数と細胞回収速度との両方の測定値を時間の関数として与える。 通常、回収速度は最初が増大であり、その後サスペンジョン中に残留する細胞濃度の低下と既に回収された細胞の電極における存在によるスクリーニングもしくは飽和効果（saturt
ioneffect）との両方により減少する。

上記論文に報告されているように、細胞回収速度が供給電界の周波数の関数、すなわち電極に供給される電圧の関数であることが判明している。 １種類の細胞（またはその他の粒子）に関して回収速度スペクトルすなわち細胞回収速度を供給電界の周波数に関連づける曲線を例えば100Hz〜10MHzの電極周波数範囲にわたって得ることができ、異なる種類の細胞は有意に異なる回収速度スペクトルを有することが判明する。

異なる種類の細胞は有意に異なる回収速度スペクトルを有するというこの事実のために、全体としてのサスペンジョンの複合もしくは総合回収速度スペクトルを確立し、このスペクトルを個々の可能な成分の既知スペクトルと、このような個々のスペクトルを加算して実験的に得られた複合スペクトルに一致する複合スペクトルが得られる割合とに関して分析することによって微生物の流体サスペンジョンの未知懸濁成分の同定が可能になると期待される。

しかし、このような複合スペクトルが得られるような既知装置では、このように実施するために要する時間と労力が不都合に大きい、この理由は１周波数における回収速度の各測定後に研究すべきサスペンジョンのサンプルを含む容器をフラッシュして、新たなサンプルを充てんしなければならない、または少なくとも存在するサンプルを、これが本質的によどんでいるので例えば容易には想像されないようなやり方で、激しく撹拌することによって、その本来の研究前の状態に回復させなければならないからである。 さらに、電極間の間隙に通してのみ照射する光線ビームによる回収速度モニターリングは、
電極の「後方に」隠された回収粒子については直接の情報を与えないので、不充分な手段である。

本発明の目的は、サスペンジョン中の誘電分極性粒子の誘電泳動回収速度と回収速度スペクトルを確認するための改良装置と、このような回収速度と回収速度スペクトルをこのような装置を用いて確認し、それによってサスペンジョン中のこのような粒子を既知種類の粒子の既知回収速度スペクトルを参照して特性化または同定する改良方法とを提供することである。 本発明が適用される粒子は例えば微生物のような、種々の種類の動物性粒子と、例えば血液細胞のような細胞、例えばウィルスとプラスミドのような細胞より小さい粒子、および動物性物質によって被覆されるもしくは被覆されない、例えばラテックスビーズのような非動物性物質粒子であり；下記開示の中で、簡潔さのために単に粒子という表現はこのような広範囲に理解される意図のものである。

本発明の１態様（aspect）によると、サスペンジョン流体室；室内のこのような流体に影響を及ぼすために配置された電極系；電極構造の電極間に交流電圧を与え、
それによってこのような流体中に空間的に不均一な交流電界を確立して、流体中に懸濁した誘電分極性粒子のこのような電極に隣接した誘電泳動回収を誘電する手段；
および室内の一定位置における（at a location）粒子濃度の測定手段を含み、室は入口から出口まで室を通って流れる流体が電極構造と前記位置とを通って流れるように配置された入口と出口、および室を通るこのような流体の流れを生ずるように配置された手段を備える、流体サスペンジョン中の粒子の誘電泳動回収速度の確認装置を提供する。

室を通る流体の流れを生ずるように配置された手段は、室の出口から入口まで流体を再循環させるように配置された流体循環手段である。

微生物、その他の粒子の濃度を測定する手段は室を通して（但し、電極構造においてではなく、電極構造よりも下流の位置で）光線ビームを放出するように配置された光源と、室を通過後の光線ビームの強度と光線ビームが横切る流体中に懸濁した微生物、その他の粒子の濃度の増減を示唆する、光線ビームの吸収または散乱の増減とに敏感な光線デテクター（light detector）手段とを含む、既述した種類のものであることが好ましい。

本発明の他の態様によると、流体サスペンジョン中の誘電分極性粒子の誘電泳動回収速度を確認する方法であって、サスペンジョン流体に電極構造を硫過させる工程；電極構造に所定期間、所定周波数の交流電圧を供給することによって、空間的に不均一な交流電界を流動する流体中に確立して、流体中に懸濁した誘電分極性粒子を電極構造に隣接した誘電泳動回収を誘導する工程、その後に電極構造のエネルギー供給を停止し、それによって電極に隣接して回収された粒子を放出する工程および放出粒子が電極構造より下流の位置を通って流動流体によって運ばれる時に生ずる、このような位置における粒子濃度増加パルスを測定する工程を含む方法を提供する。

本発明によるこの方法は本発明による上記装置を用いて実施されることが好ましい。

電極構造からの回収粒子の放出後に測定位置を通って運ばれる粒子濃度の増加パルスはその後その流動中にサスペンジョン流体中に迅速に分散する。 被検サスペンジョンの回収速度スペクトルの全範囲またはクリティカル範囲を確認するために必要なデータを得るためには、少量であるので再循環させなければならないサンプルに対しても、連続電極構造電圧供給期間中に異なる周波数の供給交流電圧を用いて、この方法を反復実施しなければならない。 このようにして得られたデータを次に、特定微生物または他の粒子の回収速度スペクトルに関する対応既知濃度によって補正して、得られる回収速度データを生ずるために被検サスペンジョン中に必要な、このような粒子の相対的及び／又は絶対的濃度を確立することができる。

添付図面を参照した下記の詳細な説明から、本発明はさらに完全に理解されるであろう。

図１は本発明によって用いるための電極系を備えた室アサンブリ（chamber assembly）の概略透視図であり； 図２は図１に示した室アセンブリを含む、本発明による装置の概略図であり； 図３は図２の装置で生ずる光線ビームの吸収が装置使用中の微生物その他の粒子の回収期間中及び後の時間によって変動する様子を示すグラフであり； 図４は以前の研究者によって確立され、公開された先行技術で入手可能な、４種類の微生物の回収速度スペクトルのグラフである。

図１に示した、一般に参照数字10によって表示される室アセンブリは両方ともガラス製であり、透明なバックプレート11とフロントプレート12とを含み、これらの間にはさまれたスペーサーシート13を有する。 スペーサー
13の中央部分はプレート11と12との間に薄い室14（スペーサー13の厚さ、約0.05mmであるが、対処する懸濁粒子のサイズに依存して広範囲の値になりうる）を形成するために、除去される、プレート12は入口15と室14方向に開いた出口16とを有する。 室14は高さ約10mm、長さ40mm
である。 バックプレート11はその上に、約１ミクロン厚さに付着し、エッチングされて、それぞれ接続末端タブ
19と20と一体化した、相互嵌合した電極17と18の対を形成する金属層例えばアルミニウム層としての電極構造を有する。 各電極は８本の平行なフィンガーによって形成され、各フィンガーは幅0.06mmであり、他方の電極の各隣接フィンガーから0.06mmだけ分離する、各フィンガーの長さの中央部分は室14の内部に曝露されて、室内に入れられた流体に極めて接近するが、流体と電極との実際の接触を阻止するために絶縁材料製保護フィルムが設けられる。 電極の形状は電極間に電圧を供給する時に電極の直接近くに空間的に非常に不均一な電界を形成するような形状である。 電極17と18は出口16よりも入口15に近く、電極と出口16との間に室14の領域21を残し、この領域を通して矢印22によって表示される光線ビーム（例えば450又は660nm波長、または特定物質により適した他の波長）が電極17または18によって妨害されずに照射するように配置される。

図１に示す室アセンブリ10を図２に示す本発明による装置に組み入れる。 これは、粒子すなわち同定すべき微生物を含む液体サスペンジョン24のタンク（reservoi
r）23を含む。 室アセンブリ10の入口15に接続された管2
5は、タンク23の液体サスペンジョン24に浸せきし、室アセンブリの出口16を管26によってポンプ27へ接続し、
このポンプはペリスターポンプ（peristaltic pump）であり、室14を通してサスペンジョン液体を取り出し、戻り管（return tube）28を介して例えば0.1〜1.0ml/分の速度でタンク23にもどす。 エアライン29からの空気はタンク中のサスペンジョン24を通してバルブし、撹拌と換気の維持に役立つ。 サスペンジョン24のpHをモニターするためのpHプローブ（probe）30はタンク23にも達し、p
Hを望ましい一定レベルに位置することが可能である。
この理由は、電極17と18における誘電泳動による微生物の回収速度がサスペンジョンのpHに依存することが判明したからである。 温度変動も回収速度に影響する傾向があるので全装置は望ましい一定温度に維持することが好ましい。

この装置は、特定周波数と振幅の交流電圧を生じるシグナル発生機も含み、この電圧はスイッチ32によって、
交流電圧をモニターするのに役立つオシロスコープ33及び室アセンブリ10の電極17と18に供給される。 電極に供給される電圧は５〜30ボルトの選択された振幅及び10Hz
〜10MHz以上の周波数を有することが便利である。 光源、好ましくは室14を通して光線22を放出するために配置された図１に示すような電源41によって電圧を与えられたLED光源40と、光線が室14を通過した後に光線22の強度を測定し、チャートレコーダー43に入力する図１の
42に示すような光度計とも備える。

この装置を使用するにあたっては、ポンプ27に連続的に室14からのサスペンジョン24の流れを取り出せてタンク23に再循環させながら、スイッチ32を例えば５秒間閉じ、所定振幅及び特定周波数のシングル発生機31からの電圧を電極17及び18へ供給し、電極に隣接したサスペンジョン中に空間的に不均一な交流電極を生じさせ、その結果、サスペンジョン中の微生物が誘電泳動的に移動し、電極上にまたは隣接して回収される。 スイッチ32を開くと回収された微生物が放出され、サスペンジョン液体の連続流によって下流に運ばれ、サスペンジョン中の増加濃度の局在化パルスとして光線22を通過する。

チャートレコーダー43によって記録され、時間ｔの関数として光線22の測定強度Ｉを表わす光度計から生じた出力シグナル形状を図３に示す。 電極17及び18に供給電圧が不存在の場合には、定常測定ビーム強度I ₁は、室アセンブリ10を通過する前にビーム強度を表わす値I ₀未満である。 差I ₀ −I ₁は、室アセンブリ10通過中の強度低下を表わし、これは主として室14へ流れる液体中に懸濁された微生物による光の吸収および／または散乱によるものである。 交流電圧が時間t ₁に電極17と18に供給されると、電極上にまたは隣接して微生物が回収されるにつれて測定光線強度が値I ₂まで急激に上昇し、下流流体中の微生物濃度は、光線22を通過するにつれて急激に減少する。 供給電圧がスイッチオフされる時間t ₂までの間、電極における回収速度が低下し始め、電極の下流の微生物濃度が対応して上昇し始めるにつれて光線の測定強度が低下し始める。 時間t ₂において供給電圧を除去すると、
流動サスペンジョン中の微生物濃度増加の高度に局在化したパルスとして下流に運ばれる回収微生物の電極からの突然の放出が生じ、パルスがビームを通過する時にビーム強度の低い値I ₃までの急激な減少を生じる。 わずかに後の時間t ₃では、パルスが通過し、測定ビーム強度は定常値I ₁に戻る。 強度差I ₁ −I ₃によって表わされる吸収増加は、回収速度の直接の結果であるI ₁ −I ₂の強度の比較的小さい上昇に比べて、t ₁ −t ₂の間に回収される微生物の量及び初期の回収速度の非常に高感度の測定（おそらく係数100）である。

濃度増加サスペンジョンのパルスは光線ビーム22中を通過したならば、タンク23中に戻し入れられた時に迅速に分散し、そこでエアーライン24からの空気によってさらに撹拌される。 図２に示すように、好ましくは自動的に、コンピューター44の制御下での種々な周波数における電極17と18への交流電圧の連続供給は間断なく、順次行われ、コンピューターによって記憶される、被検流体の回収速度スペクトルを画定するデータを確立する。 従って、10Hzから1MHzまでの周波数範囲にわたって回収スペクトルを得るために要する時間は今までに公知の方法による１日を越える時間から５分間以下に低下する。 被検サンプルの粒子含量を分析するための、このようにして得られたスペクトルの画定データと特定の個々の微生物または他の可能な関連粒子の既知スペクトルからの対応データとの比較も適当なコンピュータープログラムを用いて迅速に行うことができるので、サンプルの分析も本発明の装置または方法を用いて迅速に実施することができる。

以前の研究から公知の４種の微生物の回収速度スペクトルを図４に示す、図４では曲線34,35,36および37はそれぞれ、黄色ブドウ球菌（Staphylococws aureus）、シュードモナス フルオレッセンス（Preudomonas fluore
suns）、大腸菌（E.coli）およびビー・セレウス（B.ce
reus）の回収速度スペクトルを表す。 このような以前の結果を無批判に基準スペクトルとして採用するのではなく、本発明による特定の装置によって用いて、これらを装置の次の使用中にセットした時に確立される操作条件によってこの装置を用いて得られるような基準スペクトルのライブラリーを形成することが好ましい。 しかし、
一般に装置はごく低レベルのルーチン較正を必要とするにすぎず、それにも拘らず、感度の著しい増加、微生物その他の粒子種に対する大きい選択性、今までに利用可能である装置に比べて非常に改良された、操作の速度と簡潔さが生ずる。

上述したように、電極17と18はアルミニウム製であることができ、ガラスプレート11上に金属層を付着させ、
エッチングして、必要な電極パターンを形成することによって製造される。 アルミニウムの代りに、白金または金メッキクロム電極も用いることができ、このような電極はエッチング方法または、例えばフォトレジストのような適当な材料を用いて金属層を付着させる前に基体（substratc）上にパターンマスクを形成し、次にパターンマスクを除去することによって付着金属の不必要部分を除去して、基体上に直接付着した場所にのみ金属を残す「リフト−オフ（lift−off）方法」によって製造される。

フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−304149（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−100340（ＪＰ，Ａ) 特公 昭62−25989（ＪＰ，Ｂ２) (58)調査した分野(Int.Cl. ⁶ ，ＤＢ名) G01N 27/447