【発明の詳細な説明】

【０００１】 関連出願（群）の陳述 本願は、その明細書を本明細書中に十分に記載した場合には出典明示して本明細書の一部とみなす、1996年9月6日に出願された同時係属出願番号08／709，353
号の一部継続出願である。

【０００２】 フェデラルファンドの陳述 本発明は、Advanced Technology Program下、合衆国商務省によってNanogen，
Inc.社に与えられたコントラクト番号95−08−009下の政府支援でなされた。

【０００３】 発明の分野 本発明は、有効な多工程の分子および生物試料の調製および診断分析を行うためのデバイスおよび方法に関する。 一般的に、それは電子的な細胞分離、細胞溶解および／または酵素反応用のデバイスおよび方法に関し；より詳細には、その全てを単一のバイオエレクトロニック・チップ上（例えば、集積アッセイ系中）
で行い得る、誘電泳動（dielectrophoresis）、分離した細胞のＤＣ高電圧パル ス電気溶解および／または酵素反応、による細胞粒子のチャネルレス分離を達成するためのデバイスおよび方法に関する。 これらの操作は、例えば、食料および／または水の質のモニター、感染症診断、癌の診断、骨髄の処理（例えば、幹細胞の分離および分析）ならびに法医学目的の個人の遺伝学に基づく同定を包含する種々の適用に有用である。 さらに、これらのプロセスおよびデバイスは、遺伝子発現研究、特に、特異的な副次集団のＲＮＡを実験する目的のために多数の他の細胞から特異的なタイプの少数の細胞を分離する、遺伝子発現研究において用い得る。

【０００４】 発明の背景 数ある中で、多くの分子生物学的および免疫学的なアッセイ、診断アッセイおよび試験の基礎には、細胞試料（例えば、血液、組織、、ほか）を得、望ましい細胞材料を分離し、望ましい細胞を粉砕または溶解させて粗製ＤＮＡおよびＲＮ
Ａ（単純性のため、以下の明細書中でＤＮＡに言及する場合には、適当な場合にはＲＮＡについても言及している）、全タンパク質を放出させ、粗製ライゼートを精製し（すなわち、細胞残渣を除去し）、ついで幾つかの酵素反応を行わせて望ましいライゼートを分析する工程が含まれる。

【０００５】 誘電泳動は、溶液中で荷電されているかまたは荷電されていないかのいずれかである微細粒子を分離するための一般的な技術となってきた。 本発明以前に報告された技術は、スライド表面に平板された露出した（すなわち裸の）交番嵌合電極を有し、数百μｌの容量を有するフローチャンバーを有するスライドガラスに基づくデバイスでほぼ常に行う。 細胞は、適当な導電率を有する分離緩衝液（群）および好適な増幅および周波数を有するＡＣ信号を選択することによって、それらの誘電特性に基づいてかかるデバイスで分離される。 これらの従前のデバイスは、以下のものを包含する幾つかの問題点を有する。 第１の問題点は、分離した細胞および分離していない細胞の双方が、スライドの暴露されたガラス表面および暴露された電極表面に非特異的に結合することである。 第２の問題点は、フローチャンバーの容積が大きすぎて（数百μｌ）、熱的対流が電極によって最初に保持された細胞を乱し、落とすことである。 第３の問題点は、いずれの望ましくない細胞を洗うことが、電極上に望ましく保持する細胞を乱すことなく簡単に行えないことであり、これは、望ましい細胞および電極が流体流動の途上（in t
he way of）に位置し、したがっていずれの望ましくない細胞を含有する洗浄流 動を遮断するからである。

【０００６】 細胞を破砕または溶解すると、他の細胞構成物と共に粗製ＤＮＡおよびＲＮＡ
を放出する。 本発明以前に報告された電気細胞溶解技術は、慣用的に、マイクロチップ−ベースのデバイスとは反対に、マクロデバイスに一連の高電圧ＤＣパルスを加えることによって行われる。 これらの従来の電気溶解技術は幾つかの問題点を含み、それには以下のものが含まれる。 第１の問題点は、市販のマクロ−デバイスによって特定される電気溶解条件は、従前の溶解法によっては細胞膜中に創製されたポアを介して高分子量ＤＮＡ分子が適合しないため、（２０Ｋｂよりも大きな）高分子量のＤＮＡ分子が放出されないことである。 第２の問題点は、
溶解チャンバーで元々放出された幾分かの核酸が、その溶解チャンバーの表面に対するその非特異的な結合により、損失することである。 第３の問題点は、従来の電気溶解マクロデバイスは、誘電泳動的な細胞分離および電気溶解の双方を同じモジュールで行い得ないような孤立ユニット（stand alone unit）として作動することである。

【０００７】 ついで、粗製ライゼートを精製し（すなわち、望ましくない細胞残渣を洗い流すか、または分離する）、ついで精製したライゼートを酵素反応（群）に付してハイブリダイゼーション、検出および分析用のライゼートを調製する。 かかる反応には、例えば、該ライゼートを変性させること、切断すること、または増幅させることが含まれ得る。 これらの試料調製およびＤＮＡプロセシング工程の後でのみ、実際のハイブリダイゼーション反応を行い、最後に検出およびデータ整理によりハイブリダイゼーション事象を分析結果に変換する。 これらの従来の調製およびプロセシング技術は幾つかの問題点を有し、それには以下のものが含まれる。 第１の問題点は、試料調製およびプロセシングの工程を、典型的には、ハイブリダイゼーション、検出および分析の他の主たる工程とは別に、かつ離して行うことである。 さらに、これらの技術の大部分は、多数の試料に対して膨大な操作（例えば、ピペット操作、遠心分離、電気泳動）を行うことが含まれる。 それらはしばしば複雑かつ時間がかかり、一般的には高度の技能を要する。 数々の技術は、感度、特異性または再現性の不足によってその適用が制限される。 例えば、これらの問題点は、核酸ハイブリダイゼーション分析の多くの診断適用を制限している。

【０００８】 誘電泳動を用いて細胞を分離および同定する試行がなされている。 例えば、He
rbertに対する米国特許第4,326,934号は、連続誘電泳動による細胞分類用の方法および機器を開示している。 細胞は、細胞粒子の正および負の双方の誘電泳動運動を使用することによって分離された。 分離された細胞は、２の電極を通って運動する細胞の特徴的な偏向距離（deflection distance）を調べることによって 特徴付けおよび／または分類された。 また、Walterらに対する米国特許第5,344,535号は、誘電泳動による微生物お よび他の粒子を特徴付けするための方法および機器を開示している。 細胞は、その特徴的な誘電泳動収集速度を合致することによって特徴付けられた。 そして、Walterらに対する米国特許第5,569,367号は、一対の交番嵌合電極を 用いて混合物を分離するための方法および機器を開示している。 該機器は、不均一な交番フィールド（alternating field）を加えることによって細胞の直線的 な流動を妨害し、さらに異なるタイプの細胞をフラクションに分離する２の電圧印加交番嵌合電極を用いた。 該電極構造は、当該構造を通して流動するのを妨害するように並んだ挟み込まれたグリッド様構造よりなる。

【０００９】 さらに、ある種のプロセシング工程またはサブ工程を一緒に合する試行がなされている。 例えば、支持材料上にＤＮＡプローブのアレイを調製するために種々の微小自動装置系が提唱されている。 例えば、Beattieらは、1992年11月のThe 1
992 San Diego Conference: Genetic Recognitionにおいて、微小自動装置系を 用いて、特異的なＤＮＡ配列を含有する微小液滴をガラス基板上の個々の微細加工試料ウェルに沈殿させた。 多工程の全体試料調製および診断系も含まれるであろう、単一のチップまたは基板上に形成した集積系を記載する種々の試行がなされている。 例えば、A． Manzら、“Miniaturized Total Chemical Analysis Syst
em: A Novel Concept For Chemical Sensing”中のSensors And Actuators，B1 （1990），pp.244−248は、小型化ＴＡＳのモジュラー構造を含む'全化学分析 系（total chemical analysis system）'（ＴＡＳ）を記載している。サンプリング、試料輸送、いずれかの必要な化学反応、クロマトグラフィー分離ならびに検出は自動的に行われた。なおもう１つの提唱された集積系はStapleton、米国 特許第5,451,500号であり、それは、複数の生物試料を二次元形式でキャリアを 含むマトリクスに個別に取入れる標的核酸配列の自動化検出用の系を記載している。異なる種類の診断試験または試験パネルに対して、異なるタイプのキャリアが記載されている。

【００１０】 種々の複数電極系が開示されており、それは、複数の態様の生物試料の調製および分析を行う趣旨を有している。 Pace、“Silicon Semiconductor Wafer for
Analyzing Micronic Biological Samples”なる標題の米国特許第4,908,112号は、半導体デバイス中のチャネルによって毛細管サイズの導管が形成された分析分離デバイスを記載しており、それにおいては、導管を通した液体の運動を活性化させるようにチャネル中に電極が位置する。Paceは、導管に対する横方向の寸法は１００μｍ未満であると陳述している。Paceは、分析機器の全ての機能：試料注入、試薬導入、精製、検出、信号調節回路、ロジックおよびオン−ボード知能を単一のシリコンウェハ内に集積し得るとも陳述している。Soaneら、“Method
and Device for Moving Molecules by the Application of a Plurality of Ele
ctrical Fields”なる標題の米国特許第5,126,022号は、それによって、電極に 電位を加えることによって材料がトレンチを通って運動する系を記載しており、
それにおいては、媒質中を運動するか、または運動して相補的なコンポーネント、色素、蛍光タグ、放射性同位元素標識、酵素特異的タグまたは現存している物理学的または化学的のいずれかである種々の変換のごとき多数の目的用の他のタイプの化学材料と接触する所与の荷電粒子と反応性である抗原−抗体で満たされた種々のトレンチに選択されたコンポーネントが案内され得る。 細菌もしくは哺乳動物細胞またはウイルスを、電極に電位を加えることによって複雑化されたトレンチ・ネットワークによってソートし得、電場を加えることによる細胞またはウイルスのトレンチ・ネットワークを通しての運動は運動する特定の材料のサイズ、電荷または形状に基づくこともいわれている。 Clark、“Sensor Devices” なる標題の米国特許第5,194,133号は、チャネルに沿って流体が通過するに従っ て試料流体の分離を引き起こすための、その表面が、デンプン、アガロース、アルギナート、カラギーナンまたはポリアクリルアミド・ポリマーゲルのごとき材料を含有する縦長の微細加工チャネルを形成する基板を含む試料流体の分析用のセンサーデバイスを開示している。 該生物材料には、例えば結合タンパク質、抗体、レクチン、酵素、一連の酵素または脂質が含まれ得る。

【００１１】 種々の表面からＤＮＡを溶出するための種々のデバイスが知られている。 Shuk
la、“Apparatus for Electroelution”なる標題の米国特許第5,340,449号は、 電場中でポリアクリルアミド、アガロースおよびＰＶＤＦのごとき膜のごとき固相マトリクス材料からタンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡのごとき巨大分子を溶出させるための系および方法を記載している。 材料は固相から、分子量カットオフ膜によって一部画定された容量に溶出される。 Okano、“Separation of Polynuc
leotides Using Supports Having a Plurality of Electrode-Containing Cells
”なる標題の米国特許第5,434,049号は、試料中の複数の標的ポリヌクレオチド を検出するための方法を開示しており、該方法は、捕捉したポリヌクレオチドを溶出するように電極に作用するように個々のチャンバーに電位を加える工程を含み、溶出された材料はついで収集用に利用可能である。

【００１２】 一般的に、従前のプロセスは極めて労働および時間集約的であった。 プロセスの間またはプロセス間のいずれかにヒトの介在を要する複数工程は、汚染およびオペレーター誤操作の可能性が存在する点で最適に及ばない。 さらに、個々のプロセスを行うための複数の機械または複雑な自動装置系の使用は、費用および物理学的な空間要件の見地より、しばしば最大級の研究所以外では禁止される。

【００１３】 前記の議論から明らかなように、試料調製および調製反応を行うための有効な技術を提供しようとする膨大な試行がなされている。 しかしながら、前述の理由により、これらの技術は制限され、不足している。 これらの種々のアプローチは、簡単に合して完全ＤＮＡ診断アッセイを行い得る系を形成されていない。 かかる系に対する長い間認識されていた要望にもかかわらず、満足のゆく解決策は以前に全く提唱されていない。 生物細胞の改善された誘電泳動分離ならびに分離した細胞の改善された生物安定性に導く方法およびデバイスに対する持続した要望が存在する。 また、細胞調製および分析を改善し、単一系に細胞の分離、調製および分析を集積し得る方法およびデバイスに対する持続した要望も存在する。

【００１４】 発明の概要 本発明は、電子的な分子生物学的な試料分離、溶解および診断分析を行うためのデバイスおよび方法に広く関する。 より詳細には、誘電泳動による細胞粒子のチャネルレス分離、分離した細胞のＤＣ高電圧−パルス電気溶解、試料精製（すなわち、細胞ライゼートのごとき粗製混合物からの望ましいコンポーネントの分離）、および／または酵素反応（群）を達成し、その全てを試料中の種々の材料についての異なる移動度および／または異なる親和性を利用する単一のバイオエレクトロニック・チップ上で行い得るデバイスおよび方法に関する。

【００１５】 本発明の１つの態様において、デバイスは、複数の被覆電極を有する微細加工シリコンチップを含む。 該電極は好ましくはいずれかの電極と試料との間の直接的な接触を防ぐ保護層で被覆されている。 被覆フローセルはチップに結合して、
流入口と排出口を有する密閉チャンバーを形成し、それはさらに各々該流入口および排出口を通した材料の流入および排出を可能とするプラスチック管系に結合し得る。 かかるデバイスを用いる１つの例示的な方法には、導入用の細胞試料（例えば、細胞調製緩衝液中の懸濁液）の調製およびつづく誘電泳動；試料のフローセルへの導入（例えば、ポンプ輸送を介して）；試料を電場に付して試料から望ましい細胞を誘電泳動的に分離すること；フローセルを通して溶液をポンプ輸送することによって望ましくない細胞を洗い流すこと；ついで、残存する（望ましい）
細胞を少なくとも１のシリーズの電気パルスに付して該細胞を溶解すること；ならびに／または、所望により、ライゼートを酵素反応（群）に付すことが含まれる。

【００１６】 したがって、本発明の主たる目的は、細胞の分離、溶解および／または酵素反応を行うためのデバイスおよび方法を提供することにある。 本発明のさらなる目的は、ピペット操作および遠心分離のごとき機械的操作を省略し得るように、単一チップ上で細胞の分離、溶解および／または酵素反応（
群）を行うためのデバイスおよび方法を提供することにある。 本発明のさらなる目的は、電極アドレス指定、緩衝液および浸透層の使用の組合せを提供して望ましい細胞の均一な分離を達成するためのデバイスおよび方法を提供することにある。 なおさらなる本発明の目的は、浸透層の使用を介してフローチャンバーおよび／または電極に対する細胞の最小限の非特異的な付着で、目的細胞の均一な分離を提供するためのデバイスおよび方法を提供することにある。 いまださらなる本発明の目的は、望ましくない細胞の洗い流しをフローチャンバー中のチャネルなしに洗浄を通して簡単に達成するデバイスおよび方法を提供することにある。

【００１７】 もう１つの本発明の目的は、ＤＮＡおよびＲＮＡの双方またはタンパク質がそれらの完全性が無傷のまま細胞から放出されるように、非常に局所化されかつ制御された様式で電極に少なくとも１のシリーズの高電圧ＤＣパルスを加えることによって電極上に保持された目的細胞を溶解させることにある。 なおもう１つの本発明の目的は、同一のフローチャンバー中でライゼートに対して酵素反応を行って、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれの損失をも引き起こさずに、汚染しているタンパク質から核酸を解放させることにある。 いまだもう１つの本発明の目的は、１またはそれを超える上記操作、すなわち細胞分離、細胞溶解、ＤＮＡ／ＲＮＡの酵素除タンパク質、またはＤＮＡ／ＲＮ
Ａのヌクレアーゼ消化、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡハイブリダイゼーション、
イムノアッセイまたはリガンド結合反応を、単一チップ上の自己含有（self-con
tained）フローチャンバー中で行うことにある。

【００１８】 好ましい具体例の詳細な説明 本発明は、誘電泳動による細胞粒子のチャネルレス分離、分離した細胞のＤＣ
高電圧−パルス電気溶解、細胞ライゼートのごとき粗製混合物からの目的コンポーネントの分離、および／またはかかるライゼートの酵素反応を行い、その全てを単一のバイオエレクトロニック・チップ上で行い得るデバイスおよび方法を含む。

【００１９】 本発明の好ましい具体例は、プリント回路基板１４上の微細加工シリコンチップ１２、該チップ１２にマウントされて流体管系１８ａおよび１８ｂを含むフローチャンバーを形成するフローセル１６、ならびに検出ウインドー２０を含む、
図１に示すカートリッジ１０を含む。 該フローチャンバーは、好ましくは約１０
μｌの容積を有する。 該カートリッジ１０は、当該カートリッジ１０を電子的コントローラ（例えば、機器またはコンピュータ）（示さず）に電気的に接続するための出力ピン２２も含む。 微細加工チップ１２を図２に示す（詳細は図４Ａに示す）が、示すごとくそれは、複数の円形微小電極２４およびカウンター電極３４を含む。 該電極２４は、
好ましくはいずれかの電極とオーバーライイング（overlying）フローセル１６ （より詳細に後に説明する）に導入した試料との間の直接的接触を防ぐ保護層で被覆されている。

【００２０】 好ましい具体例において、該チップ１２は４つのカウンター電極３４および各々が５つの白金微小電極２４を有する５の列を含み、よく知られている標準的な半導体加工技術を用いて作製される。 電極の数は本明細書中に示すものよりも多くても少なくてもよく、本明細書は説明目的のためのみで５×５の配置を用い、
これに限定されるものではないことは注記しておく。 実際、より多くの電極を有するチップは、より多数の標的化細胞の回収を促進し、したがって、より高い核酸の収量を促進し得る。 隣接する電極２４の間の中心から中心までの距離は、好ましくはだいたい約２００μｍであって、各電極２４の直径は好ましくはだいたい約８０μｍである。

【００２１】 この具体例においては、まずチタン−タングステン（Ｔｉ−Ｗ）層を熱酸化したシリコンウェハ上にスパッタリングして約１００ｎｍの厚みとし、ついで該Ｔ
ｉ−Ｗ層上に白金層をスパッタリングして約３００ｎｍの厚みとすることによってチップ１２を調製した。 王水中のフォトリソグラフィー画定したウエットエッチを用いて金属被覆をパターンニングした。 低応力窒化ケイ素（１.３μｍ）お よび二酸化ケイ素（１００ｎｍ）の薄膜を、プラズマ−化学気相成長によってパターンニングした金属の表面に蒸着させた。 フォトリソグラフィー的にパターンニングしたドライプラズマエッチを用いて、誘電体から電極アレイを通してエッチングした。 チップ１２は、各々、プリント回路基板１４（好ましくは、Person
al Computer Memory Card International Associationのパーソナルコンピュー タカード規格に適合する）にワイヤボンディングした。

【００２２】 チップ１２を回路基板１４にボンディングした後に、チップ１２をイソプロパノールで洗浄し、つづいて脱イオン水で濯いだ。 ついで、チップ１２を窒素蒸気によって吹きつけ乾燥させた。 ついで、乾燥したチップ１２を載せたボード１４
をプラズマ・クリーナーボート（plasma cleaner boat）中に垂直に置き、アル ゴン中（２５０ｍＴｏｒｒ、２５０Ｗ）で５分間掃除した。 プラズマ掃除の後に、浸透層を各チップ１２に加えた。

【００２３】 まず、グリオキシルアガロースの２.５％底部浸透層（ＢＰＬ）溶液を以下の ごとく調製した。 グリオキシルアガロース（２５０ｍｇ）（Sigma社製，St. Lou
is， MO）を１０ｍｌの脱イオン蒸留水に添加し、混合し、ついで８分間煮沸し た。 完全に溶解したアガロース溶液を、１.２μｍのシリンジ・フィルターを用 いて予め温めた（６５℃）エッペンドルフチューブに高温濾過した。 濾過したアガロース溶液を６５℃に５分間平衡させた。 つぎに、上部浸透層（ＴＰＬ）を以下のごとく調製した。 ストレプトアビジン溶液（５ｍｇ／ｍｌ）は、ストレプトアビジン（Boehringer Mannheim社製，Indianapolis，IN）を塩化ナトリウム（ ２５０ｍＭ）およびリン酸ナトリウムを含有する溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７.２） 中に懸濁することにより調製した。 そのストレプトアビジン溶液を温度平衡させたＢＰＬ溶液と合して、２％のアガロースおよび１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジンを得た。 温ＢＰＬ溶液（５０μｌ）を各チップ上に置き、スピンコーティング装置（EC101D，Headway Research社製，Garland，TX）中、2500ｒｐｍ、室温 にて２０秒間スピンした。 ＢＰＬを固化させた後に、温ＴＰＬ溶液（５０μｌ）
をＢＰＬの上部に置き、スピンコーティング装置中、10,000ｒｐｍ、室温にて２
０秒間スピンした。 ついで、被覆したチップを３７℃にて３０分間焼いた。

【００２４】 グリオキシルアガロースとストレプトアビジンの第１級アミンとの間のシッフ塩基結合を、新たに調製したホウ水素化シアノナトリウム（０.２Ｍ）／ホウ酸 ナトリウム（０.３Ｍ）、ｐＨ９.０を用いて室温にて１時間還元した。 残存しているアルデヒド基は、ホウ酸ナトリウム（０.３Ｍ）中のグリシン緩衝液（０.２
Ｍ）、ｐＨ９.０で室温にて３０分間キャッピングした。 チップは、最後に脱イ オン水で５分間濯ぎ、４時間風乾し、ついで４℃にて保存した。 本発明のカートリッジ１０は、調製したチップ１２／プリント回路基板１４を選択し、ポリカーボネート成形フローセル１６を、好ましくは２００ＷのＵＶ光下にて４５秒間（４ジュール／ｃｍ ² ）、ＵＶ接着剤（Norland 68， Thorlabs，
New Brunswick，NJ）を用いて、チップ１２上に接着することによって完成した。 好ましくは、カバーガラス・スリップをフローセル１６の上部に接着して、同一の手法を用いて密閉フローチャンバーを形成する。 流入および排出プラスチック管系１８ａおよび１８ｂは、各々、ルアー（lure ）取付け部２６を介してフ ローセル１６の流入口および排出口に加え、ついで適所に接着した。 これで、カートリッジ１０は試験する準備ができた。 試験を行って、イー・コリ（E.coli)細胞を分離し、溶解し、酵素反応させ、また、試験を行って子宮頸 癌腫細胞を分離した。

【００２５】 イー・コリ（E.coli)試験 まず、細胞培養物をよく知られている技術を用いて調製した。 サルモネラ・エンテリティディス（Salmonella enteritidis）のＳｐａＯ領域から２９６ｂｐのフラグメントを増幅させ、ついでInvitrogen T／A Cloning Kit（Invitrogen社 製，San Diego，CA）を用いてプラスミドｐＣＲ２.１（３８９０ｂｐ）にクローン化した。 連結はキットの指示書に従って行い、連結産物を用いてＩＮＶαＦ' コンピテントなイー・コリを形質転換した。 形質転換体を、青色／白色スクリーニング用のアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、８０μｌのｘ−ｇａｌ（２０ｍ
ｇ／ｍｌ）および４μｌのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（４０ｍＭ
）を補充したＬＢプレート上で増殖させた。 クローンにつきスクリーニングするために白色のコロニーを取り上げ、溶解させて分析用のＤＮＡを放出させた。 そのＤＮＡをＳｐａＯ特異的プライマーを用いるＰＣＲによって増幅させて、アンプリコンをゲル電気泳動によって調べた。 ＰＣＲスクリーニングからの１の陽性クローンを、２２５ｒｐｍで振とうさせつつ、ＬＢおよびアンピシリン液体培養物（１００μｇ／ｍｌ）中、３７℃にて一晩増殖させた。

【００２６】 ついで、細胞培養物をよく知られた技術を用いて調製した。 ０.０５×ＴＢＥ （４.５μＭのトリス、４.５μＭのホウ酸、０.１μＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８.２）
、２５０ｍＭのスクロースを含む細胞分離緩衝液、ｐＨ８.２を調製した。 該緩 衝液の導電率は、Accumet ｐH Meter 50（Fisher Scientific社製，Pittsburgh ，PA）によって測定して１１４μＳ／ｃｍであった。 その条件下で細胞分離を行う導電率は、イー・コリ細胞が確実に正の誘電泳動に付され、かつ全ての正常なヒト血液細胞が確実に負の誘電泳動に付されるように注意深く選択した。 培養したイー・コリ細胞懸濁液（１ｍｌ）を３２５×ｇにて４分間遠心し、上清を除去した。 その細胞ペレットを細胞分離緩衝液（１ｍｌ）中で洗浄し、前記と同一の条件を用いてペレット化した。 ついで、該細胞を細胞分離緩衝液（１ｍｌ）に再懸濁した。 新鮮なＥＤＴＡ−抗凝固処理ヒト血液（２０μｌ）をイー・コリ細胞懸濁液（１ｍｌ）に添加し、細胞培養物を完成した。

【００２７】 細胞培養物を本発明のカートリッジ１０に導入し、誘電泳動を行ってイー・コリ細胞を分離した。 カートリッジ１０をNikon社製の位相差顕微鏡のステージに 置いた。 照明はリング光（Precision MicroOptics社製，Irvine, CA）によって 供した。 イメージ信号は、１０×対物レンズを介してＣＣＤ／ＲＧＢカラービデオカメラ（Sony DXC−151，Mikron Instruments社製，San Diego，CA）によって収集し、Sony VCRを用いて記録し、Sonyテレビモニターによってモニターした 。 流体は、ペリスタポンプ（Model RP−1，Rainin Instruments社製，Woburn，M
A）を介して管系１８およびフローセル１６を通してポンプ輸送した。 電極２４ 上の信号は関数／アービトラリー波形発生器（functional/arbitrary waveform
generator）（Model HP33120A，Hewlett Packard社製，Santa Clara，CA）から 発生させて、オシロスコープ（Model HP54600，Hewlett Packard社製）によってモニターした。

【００２８】 細胞培養物を誘電泳動に実際に付す前に、コンピュータ・モデリングおよび誘電特徴付け実験を行った。 ヒト血液細胞の洗い流しを促進するためには、イー・
コリ細胞が正の誘電泳動に付され、かつ全ての正常なヒト血液細胞が負の誘電泳動に付されることが好ましい。 正の誘電泳動力下では、イー・コリは正のフィールド最大（field maxima）が発生している電極に向けて移動する。 負の誘電泳動力下では、ヒト血液細胞は負のフィールド最大が発生している電極間の空間に向けて移動する。 これが発生する周波数は、コンピュータ・モデリングおよび誘電体特徴付け実験に基づいて経験的に決定した。

【００２９】 誘電泳動の基本理論、不均一な電場下の誘導分極を有する粒子の運動は広範に研究されている。 例えば、R. Pethig、“Dielectrophoresis: Using Inhomogene
ous AC Electrical Fields To Separate and Manipulate Cells”, Crit. Rev.
Biotech, 16:331-48 (1996); X, Wangら、“A Unified Theory of Dielectropho
resis and Travelling Wave Dielectrophoresis”, J. Phys. D: Appl. Phys.,
27:1571-74 (1994); G. Fuhr, “Cell Manipulation and Cultivation Under AC
Electric Field Influence in Highly Conductive Culture Media”, Biochim.
Biophys. Acta, 1158:40-46 (1993);およびM. Washizu、“Molecular Dielectr
ophoresis of Biopolymers”，IEEE Trans. Industry Applicat., 30:835-43 (1
994)を参照されたし。 誘電泳動現象は、一般的にエネルギーポテンシャル

【００３０】

【数１】

【００３１】

【数２】

ｐは体積

ｖを有する懸濁粒子の有効分極率（effective polarizability ）である]と単純化し得る。 分極率（

ｐ ）の値および符合は粒子および培地の誘 電率、ならびに加えた電場の周波数に依存する。 R． Pethig，“Dielectrophores

is：Using Inhomogeneous AC Electrical Fields To Separate And Manipulate

Cells”，Crit. Rev. Biotech., 16:331-48 (1996). 安定状態においては、正 の分極率（

ｐ ＞０）を有する粒子は高フィールド領域に留まり、負の分極率（

ｐ ＜０）を有する粒子は低フィールド領域に留まろうとするであろう。

【００３２】 本発明の電極２４の周りの電場の分布をモデル化するために、以下の２の仮定を設定した：第１に、低周波数領域内ではチップおよびフローチャンバーの双方の寸法は加えたＡＣフィールドの波長よりもはるかに小さい。 第２に、試料溶液は電気的中性を有する。 これらの２つの仮定下では、ラプラス方程式

【００３３】

【数３】

ion of Electric and Magnetic Fields”（John Wiley & Sons社, NY, 1992）

を参照されたし。

【００３４】 イー・コリ細胞を正の誘電泳動力に付し、かつ血液細胞を負の誘電泳動力に付す周波数は、細胞混合物を異なる条件に付すことによって経験的に決定した。 実験は、５ＫＨｚから出発してシヌソイド信号（１０ボルトのピークからピーク）
の周波数を徐々に増大させることによって行った。 周波数が１０ＫＨｚに達した場合に、イー・コリ細胞およびヒト血液細胞の残りとの明白な分離が認められた。 これらの電気的パラメーターは、イー・コリ細胞の単離に後に用いた。 細胞培養物中の血液細胞からイー・コリ細胞の誘電泳動分離を行うために、未使用のカートリッジ１０を用いた。 カートリッジ１０のチップ１２を、まず、管系１８およびフローセル１６を通して試料／緩衝液貯蔵部２８から分離緩衝液をポンプ輸送することによって洗浄した。 つぎに、細胞培養物をフローセル１６にポンプ輸送し、ポンプのスイッチを切った。 電極２４の全体アレイ（すなわち、
５列×５行のアレイ中の全体で２５の電極）を、１０ＫＨｚで１０ボルトのピークからピークのシヌソイド信号を加えることによって、図３Ａ−３Ｂに示すごとく、各電極にフィールド最大を供し、電極間の領域にフィールド最小を供するチェッカー盤バイアス形式でアドレス指定した。 図４Ｂ（および図４Ａと比較して）示すごとく、ヒト血液細胞３２（フィールド最小の電極２４の間の領域に収集された）からイー・コリ細胞３０（フィールド最大の電極２４に収集された）の分離はほぼ４分で終了した。 その後、ポンプのスイッチを入れて、洗浄プロセスを開始した。

【００３５】 図３Ｃに示す四角形壁形式よりも、図３Ａに示すチェッカー盤バイアス形式を用いた。 図３Ｂに示すごとく、チェッカー盤スタイルのアドレス指定に対応するフィールド分布は、各電極にフィールド最大を有し、電極間の領域にフィールド最小を有する電場の均一な分布を提供し、一方、図３Ｄに示すごとく、四角形壁スタイルのアドレス指定は電極間に散在するフィールド最小を供する。 （図３Ｂ
に示すごとく）フィールド最小が電極間に散在する配置を有することが好ましい。 かかる配置では望ましくない細胞（すなわち、フィールド最小の領域に収集された細胞）の洗い流しを、望ましい細胞（すなわち、電極に保持された細胞）を乱すことなく簡単に行えるからである。 これは、望ましい細胞および電極が流体流動を妨げるように位置しておらず、したがって、いずれの望ましくない細胞を含有する流動の洗い流しも遮断しないからである。 チェッカー盤スタイルのアドレス指定は、電極をグループ化し、各グループの電極をその最も近い隣接するグループの電極とは反対にバイアスすることによって実質的に行い得ることは理解される。

【００３６】 試料細胞培養物混合物を試料／緩衝液貯蔵部２８からほぼ排出したら、ＡＣ信号をいまだ入れたまま、分離緩衝液を添加してフローセル１６を通して試料の残部を洗浄する。 図５に示すごとく（図４Ｂと比較して）、洗浄プロセスはヒト血液細胞を洗い流し、イー・コリ細胞３０は保持された。 洗浄後に、プロテイナーゼＫ（４９０μｇ、Boehringer Mannheim社製，Inidianapolis，IN）を含有する分離緩衝液（３００μｌ）をフローチャンバー１６にポンプ輸送してタンパク質のサイズを減少させた。

【００３７】 ついで、電気溶解を行って保持されたイー・コリ細胞を溶解した。 細胞を溶解するために、４のカウンター電極３４（図２に示す）および２５のより小さい細胞収集電極２４との間に１のシリーズのパルス（５００Ｖ、５０μｓパルス幅）
を加えた。 該パルスは、２０パルス毎の極性が電極２４および３４の２グループの間で入れ替わるように加えた。 全体で４００のパルスを各溶解プロセスにつき加えた。 交番パルスは細胞を押し、細胞から材料を引き出した。 図６はイー・コリ細胞から放出され、ＤＣ波を加えることによって濃縮させた核酸３６の試料を示す。

【００３８】 ライゼート混合物は５０℃にて２０分間インキュベートして、ＤＮＡ−汚染タンパク質を消化させた。 該ライゼートは、フローセル１６からそれを汲み出すことによって収集した。 誘電泳動分離および電気溶解の組合せを６回繰返し、全てのライゼートを分析用に一緒に保存した。 保存したライゼートを１６０００×ｇにて５分間遠心した。 つぎに、上清を回収し、２倍容量の冷蔵エタノール（−２０℃）を該溶液に加え、混合し、ついで１６０００×ｇにて１０分間遠心した。 上清を除去し、ペレットを風乾させた。
ついで、該ペレットを０.０５×ＴＢＥ緩衝液（３００μｌ）に再溶解させた。 再溶解溶液のフラクション（３０μｌ）を、ＲＮエース（３μｌ、１０ｍｇ／ｍ
ｌ、Boehringer Mannheim社製）を含有する溶液と合した。 合した溶液を３７℃ にて３０分間インキュベートした。

【００３９】 ついで、ゲル電気泳動を行って収集した材料を分析した。 １.２％アガロース ゲルは、６００ｍｇのアガロースを５０ｍｌの１×ＴＢＥ緩衝液中で融解させることによって調製した。 アガロース溶液が固化する前に、エチジウムブロマイド（２.５μｇ）をそれに添加した。 ＲＮエース処理を行ったかまたは行っていな いプロテイナーゼＫ処理したライゼート試料を、マーカーＤＮＡと共にゲルに負荷した。 図７は、図６の核酸のアガロースゲル電気泳動後に撮った写真像を示し、ゲノムＤＮＡから、超コイル形成プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡにわたる全スペクトルの核酸が電気溶解後に細胞から放出されたことを示している。

【００４０】 ついで、ＤＮＡハイブリダイゼーション・アッセイを行った。 プラスミドＤＮ
ＡのＳｐａＯ領域に特異的なオリゴヌクレオチド捕捉プローブ（３９−ｍｅｒ）
をその３'末端でビオチンと合体させた。 該捕捉プローブを５０ｍＭのＬ−ヒス チジン緩衝液中に希釈して、最終濃度５００ｎＭとした。 該捕捉プローブを、正にバイアスした基部（underlying）電極２４とストレプトアビジンを含む試験マイクロロケーションに固定化した。 電気的バイアスは、各電極２４の電流を１分間、２００ｎＡに維持することによって行った。 その後に、残存するプローブ溶液を除去し、チップ１２を５０ｍＭのＬ−ヒスチジン緩衝液で洗浄した。 コントロール用のプローブ（ＡＴＡ５およびＧＡＳプローブ）の固定化は、前記と同一のプロトコールを用いて行った。

【００４１】 ＤＮＡのハイブリダイゼーションを促進するために、プロテインキナーゼＫ処理したライゼートのフラクションを、Ｌ−ヒスチジン緩衝液中で各々３倍および５倍希釈した。 この希釈したライゼート試料を１００℃のウオーターバス中にて１０分間煮沸して、ＤＮＡを断片化し（ＤＮＡの最終サイズは３００ｂｐないし１Ｋｂの間の範囲にわたる）、また、ＤＮＡを一本鎖化させた。 コントロールの存在を確認するために、各電極の電流を３分間、４５０ｎＡに維持することによって、捕捉プローブＡＴＡ５に特異的な合成ＲＣＡ５オリゴヌクレオチド標的（
F． Beckerら、“Separation of Human Breast Cancer Cells From Blood By Dif
ferential Dielectric Affiity”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:860-64 (1
995)を参照されたし）を固定化ＡＴＡ５プローブおよび隣接する非特異的ＧＡＳ
プローブの双方に平行して電子的にハイブリダイズさせた。 捕捉プロセスを終了した後に、新鮮なＬ−ヒスチジン緩衝液を負荷して古いものを入れ替え、電子的ストリンジェンシー洗浄を行った。 洗浄は１５０のＤＣパルス（０.１秒間入れ 、０.２秒間切るパッド当たり１μＡ）を１の列に同時に加えることによって行 った。

【００４２】 サンドイッチ・アッセイを行うために、レポータープローブのハイブリダイゼーションを以下のごとく行った。 チップ１２を、超音波処理し、変性させた子ウシ胸腺ＤＮＡ（１００μｇ／ｍｌ、Sigma社製，St.Louis，MO）を含有する１× ＳＴＥ緩衝液中に、室温にて５分間浸漬した。 その後に、緩衝液を排出し、１５
μｌの混合溶液（前記子ウシ胸腺ＤＮＡを含有する１×ＳＴＥ緩衝液中の５００
ｍＭのレポータープローブ）をチップ１２上に置き、室温にて５分間維持した。
ついで、該チップ１２を０.２×ＳＴＥで作製した１％のＳＤＳ緩衝液１５μｌ で５回洗浄し、５ｍｌの同緩衝液中に室温にて１０分間浸漬した。 最後に、該チップを０.２×ＳＴＥで５回洗浄した。

【００４３】 図８Ａはイー・コリから放出させたプラスミドＤＮＡの電子的に強化した標的捕捉についてのハイブリダイゼーション・コントロール３７を示し、図８Ｂはイー・コリからのプラスミドＤＮＡの試料３８をさらなるプローブに電子的にハイブリダイズさせるサンドイッチ・アッセイ後の結果を示す。 図８Ａが示すごとく、オリゴヌクレオチド・プローブの固定化法は予想どおりに作動し（すなわち、
固定化プローブはオリゴヌクレオチドを捕捉した）、しかも、図８Ｂに示すごとく、電気溶解から得た熱処理プラスミドＤＮＡ３８は、高い再現性で、かつ酵素増幅プロセスを含む必要なしに、ハイブリダイゼーション・ベースのアッセイに直接用い得る。

【００４４】 ついで、ＲＮＡハイブリダイゼーションを行った。 １６Ｓ ＲＮＡに特異的なオリゴヌクレオチド捕捉プローブ5'−XGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACG CACTTT
A-3'をその３'末端でビオチンと合体させた。 該プローブを５０ｍＭのＬ−ヒス チジン緩衝液に希釈して、最終濃度５００ｎＭとした。 捕捉プローブは、正にバイアスした基部電極とストレプトアビジンを含む試験マイクロロケーションに固定化した。 バイアスは、各電極の電流を１分間、２００ｎＡに維持することによって行った。 その後に、残存するプローブ溶液を除去し、チップを５０ｍＭのＬ
−ヒスチジン緩衝液で洗浄した。 コントロール用のプローブ（ＡＴＡ５およびＧ
ＡＳプローブ）の固定化は、前記したのと同一のプロトコールを用いて行った。

【００４５】 コントロールを試験するために、捕捉プローブＡＴＡ５に特異的な合成ＲＣＡ
５オリゴヌクレオチド標的を、各電極の電流を３分間、４５０ｎＡに維持することによって、固定化ＡＴＡ５プローブおよび隣接する非特異的ＧＡＳプローブの双方に同時に電子的にハイブリダイズさせた。 合成オリゴヌクレオチド標的5'-A
ATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGG
AGTATGCAACTCG-3'の捕捉は、前記したごとく行った。 １６Ｓ ＲＮＡのハイブリダイゼーションを促進するために、プロテインキナーゼＫ処理したライゼートのフラクションをＬ−ヒスチジン緩衝液に各々３倍および５倍希釈した。 プラスミドＤＮＡハイブリダイゼーションにつき前記で使用した希釈ライゼート試料をここでも用いた。 捕捉プロセスが終了したら、新鮮なトリス−リン酸緩衝液（２０
ｍＭのトリス−塩基、２０ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ９.０）を負 荷してＬ−ヒスチジン緩衝液を置き換えて、電子的ストリンジェンシー洗浄を行った。 Ｌ−ヒスチジン緩衝液で電子的ストリンジェンシー洗浄を単純に行うことは非−特異的に捕捉されたＲＮＡを減少させるのには不十分であったが、トリス−リン酸緩衝液を用いた場合は、Ｌ−ヒスチジン緩衝液と共に用いた電場条件よりもより温和な条件でさえも非常に有効であった。 洗浄は、７０のＤＣパルス（
パッド当たり７５０ｎＡを０.１秒間入れ、０.２秒間切る）を列に同時に加えることによって行った。

【００４６】 サンドイッチ・アッセイを行うために、レポーター・プローブのハイブリダイゼーションは以下のごとく行った。 チップを、超音波処理した変性子ウシ胸腺Ｄ
ＮＡ（１００μｇ／ｍｌ、Sigma社製，St.Louis，MO）を含有する１×ＳＴＥ緩 衝液に室温にて５分間浸漬した。 その後に、緩衝液を排出し、１５μｌの混合溶液（前記した子ウシ胸腺ＤＮＡを含有する１×ＳＴＥ緩衝液中の５００ｍＭのレポーター・プローブ）をチップ上に置き、室温にて５分間維持した。 ついで、該チップを０.２×ＳＴＥを用いて作製した１％のＳＤＳ緩衝液１５μｌで５回洗 浄し、５ｍｌの同緩衝液に室温にて１０分間浸漬した。 最後に、チップを０.２ ×ＳＴＥで５回洗浄した。 図９Ａは、イー・コリから放出されたリボソームＲＮＡの電子的に強化した標的捕捉についてのハイブリダイゼーション・コントロール３９ａを示し、図９Ｂ
はイー・コリからのリボソーム１６Ｓ ＲＮＡ３９ｂをさらなるプローブに電子的にハイブリダイズさせたサンドイッチ・アッセイ後の結果を示す。 図９Ａが示すごとく、オリゴヌクレオチド・プローブの固定化法は予想どおりに作動し（すなわち、固定化プローブがオリゴヌクレオチドを捕捉した）、しかも、図９Ｂに示すごとく、電気溶解から得た熱処理リボソームＲＮＡ３９ｂは、高い再現性で、かつ酵素的増幅プロセスを含む必要なしに、ハイブリダイゼーション・ベースのアッセイに直接使用し得る。

【００４７】 子宮頸癌腫試験 前記したごとく、カートリッジ１０を用いて、混合物中の末梢血液細胞から培養子宮頸癌腫細胞（ＨｅＬａ細胞）を分離し、単離した。 まず、よく知られた技術を用いて細胞培養物を調製した。 ヒト子宮頸癌由来の上皮性癌腫セルライン（ＨｅＬａ）は、University of Califoria at San Diego
のコア細胞培養施設によって調製した。 増殖培地（２５０ｍｌ）は、ＲＰＭＩ１
６４０（２２２.５ｍｌ、BRL Life Technologies社製）にＬ-グルタミン（２． ５ｍｌ、BRL Life Technologies社製）およびウシ胎仔血清（２５ｍｌ、Gemini
Bio-Products）を添加することによって調製した。 増殖不能につき該培地を試験するために、その一部（３ｍｌ）をコニカルチューブ（１５ｍｌ）に取り、キャップを緩めてそのチューブを５％ ＣＯ ₂インキュベーター（National社製）中、
３７℃にて１週間置いた。 該チューブは汚染につき１週間毎日チェックした。 つぎに、細胞の凍結バイアル（１.０ｍｌ）を３７℃のウォーターバス中で振とう させることによって迅速に解凍した。 ついで、等容量の予め温めた培地を直ちに細胞に添加し、その混合物をコニカルチューブ（１５ｍｌ）に移した。 さらなる部の培地（６ｍｌ）を細胞に添加して、最終容量８ｍｌとした。 １１００ｒｐｍ
にて２分間の遠心分離によって細胞をペレット化した。 その上清を除去し、細胞ペレットを新鮮な培地（１０ｍｌ）に再懸濁させた。 その細胞懸濁液を５％ Ｃ Ｏ ₂存在下、３７℃にてインキュベートした。 細胞をトリプシン処理し、ついで 直ちに使用するための新鮮な培地にそれを再懸濁することによって細胞を収集した。 細胞の計数は１×１０ ⁶ ／ｍｌであった。

【００４８】 ついで、細胞混合物をよく知られた技術を用いて調製した。 細胞分離緩衝液は、０.００２５×ＴＢＥ（２２５ｎＭのトリス、２２５ｎＭのホウ酸、５ｎＭの ＥＤＴＡ、ｐＨ８.２）、２５０ｍＭのスクロースを含んでいた。 該緩衝液の導 電率は、Accumet pH Meter 50（Fisher Scientific社製，Pittsburgh，PA）によって測定して１０μＳ／ｃｍであった。 細胞分離用の緩衝液誘電率を注意深く選択して、ＨｅＬａ細胞が正の誘電泳動に確実に付され、全ての正常血液細胞が負の誘電泳動に確実に付されるようにした。 培養したＨｅＬａ細胞懸濁液（１ｍｌ
）を３２５×ｇにて４分間遠心分離し、上清を除去した。 細胞ペレットを細胞分離緩衝液（１ｍｌ）中で洗浄し、前記と同一の条件を用いてペレット化した。 ついで、ＨｅＬａ細胞を細胞分離緩衝液（１ｍｌ）に再懸濁した。 新鮮なＥＤＴＡ
−抗凝固処理したヒト血液（１ｍｌ）を４００×ｇにて５分間遠心し、上清を除去した。 パックされた細胞（packed cell）（５μｌ）を取り出し、ＨｅＬａ細 胞懸濁液（１ｍｌ）に添加した。

【００４９】 この試験で用いた誘電泳動系は、それが検出において支援するためのレーザーをも含んでいた以外は、前記のものと同様である。 カートリッジ１０は、分析プローブ・ステーション（Model 6000 Micromanipulator，Carson City，NV）上に置いた。 レーザー励起は、斜角から光ファイバーを介した２のＨｅ-Ｎｅ ５９ ４−ｎｍレーザー（６ｍＷ出力；Research ElectroOptics社製，Boulder，CO） によって伝搬した。 イメージ信号は、８×対物レンズ（開口数０.１５）および ６３０±２５ｎｍバンドパス・フィルターを通して冷カラー（cooled color）電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（DEI-750T，Optronics International社製，Chelm
sford，MA）によって収集した。 イメージの獲得は、Macintosh compatible Star
Max 3000／200上、フレームグラバー（Scion社製，Frederick，MD）およびIPLab
3.1.1． ソフトウェアによって達成した。 流体ポンプ輸送は、ペリスタポンプ （Model RP-1，Rainin Instruments社製，Woburn，MA）を用いて行った。 電極信号は、関数／アービトラリー波形発生器（Model HP33120A，Hewlett Packard社 製，Santa Clara，CA）から発生させて、オシロスコープ（Model HP54600，Hewl
ett-Packard社製）によってモニターした。

【００５０】 ＨｅＬａ細胞を血液細胞から誘電泳動的に分離した。 まず、チップ１２を、フローチャンバーを通して分離緩衝液をポンプ輸送することによって洗浄した（これにより、チップ浸透層を濡らし、チャンバー中のいずれのエアをも除去することが助けられる）。 図１０Ａは洗浄後のチップ１２の表面を示す。 つぎに、細胞混合物をフローチャンバーにポンプ輸送し、ポンプのスイッチを切った。 電極２
４の全体アレイを、３０ＫＨｚの６ボルトのピークからピークのシヌソイド信号を加えることによって、前記したチェッカー盤形式でアドレス指定した。 図１０
Ｂに示すごとく、末梢ヒト血液細胞３２（フィールド最小２５の電極間に収集した）からＨｅＬａ細胞３１（フィールド最大の電極２４に収集した）の分離は、
ほぼ３分で完了した。 細胞試料を試料／緩衝液貯蔵部からほぼ排出したら、ＡＣ
信号をいまだ入れたまま、分離緩衝液を添加してフローセルを通してポンプ輸送し試料の残部を洗浄し、これによっていずれのさならるＨｅＬａ細胞をも電極２
４に付着させ保持されるべきフローチャンバーに運搬され、洗い流すべき電極間に収集された末梢ヒト血液細胞を洗浄した。 図１０Ｃはこの洗浄工程後のチップ表面を示す。

【００５１】 電極上の細胞がＨｅＬａ細胞であって末梢リンパ球ではないことを確認するために、同一の血液から軟膜細胞を調製し、同分離緩衝液で洗浄し、同誘電泳動条件に付した。 この実験においては、リンパ球は電極間のフィールド最小に運動し、電極から離れることが示され、ＨｅＬａ細胞が電極上に存在することが示された。 ついで、単離したＨｅＬａ細胞は以下のごとく蛍光染色を通して染色した。 核酸結合蛍光色素であるヨウ化プロピジウム（２μｌ、１ｍｇ／ｍｌ；Molecular
Probes社製，Eugene，OR）を分離緩衝液（１００μｌ）に添加した。 細胞単離プロセスを終えたら、染色緩衝液をフローセルにポンプ輸送した。 染色プロセスは図１０Ｄに示す蛍光イメージを獲得する前に約６０秒かかった。 得られたイメージにより、８０μｍであることが知られている電極の直径に対する細胞のサイズを比較することによって、個々の細胞の直径を測定し得た。 電極に対する単離細胞の見積りサイズは、１７ないし３４μｍで変動し、このことは、倒立顕微鏡下でＨｅＬａ細胞を見ることから得た概算値と一致する。 加えて、これらの細胞の形状は、それがＨｅＬａ細胞であることを確認するリンパ球と比較してよく決定した。 単離したＨｅＬａ細胞は溶解し得、所望により、前記したごとき酵素反応（群）に付し得る。 細胞の対流運動は、前記の誘電泳動分離プロセスの間に全く観察されなかった。 前記したごとく、これにより、電極によって最初に保持された細胞の乱れを最小限にとどめ、かつ洗い流すことが助けられる。

【００５２】 さらなるデザイン 図１１Ａおよび１１Ｂは、細胞分離、細胞溶解、ＤＮＡ／ＲＮＡの酵素除タンパク質プロセス、ならびに／またはＤＮＡもしくはＲＮＡハイブリダイゼーションを行うための自己含有カートリッジ１０のデザインの断面図を示す。 カートリッジ１０には、マイクロチップ１２上のＵ−形状のフローセル・チャンバー１６
が含まれる。 マイクロチップ１２には、Ｕ−形状チャンバーの１のアーム４０ａ
中の２５の電極２４ａおよび４のカウンター電極３４ａのアレイならびにＵ−形状チャンバーのもう１のアーム４０ｂ中の９の電極２４ｂのアレイが含まれる。
該電極アレイ中に用いる電極の数が本明細書に示すものとは異なり得、本明細書は例示的な電極の数を示し、それに限定されるものではないことは注記しておく。 管系１８ａ、１８ｂおよび１８ｃは、フローチャンバー１６へのおよびフローチャンバーからの流体連通を供する通路４２ａ、４２ｂおよび４２ｃでフローチャンバー１６に結合する。

【００５３】 図１１Ａおよび１１Ｂに示すごときＵ−形状のフローチャンバーの１の利点は、試料を物理的に取り出しおよび／または再導入することなく、実質的に異なるチャンバーで異なるプロセスを行い得ることである。 例えば、図１１Ａに示すごとく、管系１８ｃを閉じ、試料を管系１８ａを通してに導入する。 目的細胞の単離および溶解は、前記したごとく電極２４で起こる。 ついで、図１１Ｂに示すごとく、管系１８ａを閉じ、管系１８ｃを開く。 望ましい部のライゼートは、フローセルを通る流動およびセル１６中の種々の電極の電気的荷電を操作することによって、Ｕ−形状チャンバーのアーム４０ａからアーム４０ｂに運動する。 ついで、例えば、電極２４ｂにおいて、ライゼートをハイブリダイゼーションまたは幾つかの他の酵素反応に付す。 この区画化アプローチは、完全に洗い流されなかったライゼート中の望ましくないフラグメントからの妨害を回避するさらなる利点を有する。

【００５４】 図１２Ａ−Ｄは、本発明に取り込み得る４の異なるマイクロチップのデザインの概略図である。 図１２Ａは誘電泳動および電気溶解の双方につき最適な電極寸法を調べるためのチップのデザインを示す。 微小電極によってカバーされるより広範な領域を有する新たにデザインされたチップを用いることにより、目的細胞のより高い収量をより短時間で達成し得ると考えられる。 図１２Ｂは、前記した誘電泳動および進行波ポンプ輸送特徴を合するチップのデザインを示す。 図１２Ｂ中に示すチップのデザインは、（中央の微小電極アレイを用いて）細胞の誘電泳動分離の間に（正面向きの電源を用いて）進行波を加えることによって、導入した細胞懸濁液の円形運動を供する。 図１２Ｃおよび１２Ｄは、細胞を分離し、輸送するための進行波の使用を評価するためのチップのデザインを示す。

【００５５】 本発明のある種の具体例を詳細に示し、説明したが、当業者であればこれらの教示に鑑みて、添付した請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱することなく、これらにある種の変化および修飾を作成し得ることは容易に明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、マイクロチップならびに流体管系および検出ウインドーを含むフローチャンバーを載せた本発明のデバイスの上面図を示す。

【図２】 図２は、幾つかの円形電極およびカウンター電極を示す浸透層で被覆されたチップの概略図である。

【図３Ａ】 図３Ａは、各電極がその最も近い隣接する電極とは反対のバイアスを有する円形電極の５×５配置のチェッカー盤スタイルの電子的アドレス指定の概略図である（５×５配置の使用は説明目的のためのみであって、アレイは２５よりも多いまたは少ない電極を有し得る）。

【図３Ｂ】 図３Ｂは、図３Ａに示したチェッカー盤スタイルのアドレス指定に対応するＡ
Ｃフィールド分布のコンピュータモデルの概略図であり、ここでは電場の規則的分布が各電極におけるフィールド最大および電極間の領域におけるフィールド最小で得られる。

【図３Ｃ】 図３Ｃは、円形電極の５×５配置の四角形壁スタイルの電子的アドレス指定の概略図であり、ここでは同一の四角形フレーム上の電極が最も近い隣接する四角形フレーム（群）上の電極とは反対である同一のバイアスを有する。

【図３Ｄ】 図３Ｄは、図３Ｃに示した四角形壁スタイルのアドレス指定に対応するＡＣフィールド分布のコンピュータモデルの概略図である。

【図４Ａ】 図４Ａはチップの詳細な図を示す。

【図４Ｂ】 図４Ｂは、図３Ａおよび３Ｂに示したチェッカー盤スタイルの電子的アドレス指定を用いて図４Ａに示したチップの幾つかの電極上に保持され、ヒトの血液細胞（赤血球および白血球の双方）から分離されたイー・コリ（E.coli)細胞の試 料を示す。

【図５】 図５はヒト血液細胞を洗い流した後の図４Ｂの保持されたイー・コリを示す。

【図６】 図６は、図４Ｂおよび５に示したイー・コリ細胞から放出され、ＤＣ波を加えることによって濃縮した核酸の試料を示す。

【図７】 図７は、図６の核酸のアガロースゲル電気泳動によって分析した後に撮った写真像を示し、ゲノムＤＮＡから、超コイル形成プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡにわたる全スペクトルの核酸が電気溶解後に細胞から放出されたことを示している。

【図８Ａ】 図８Ａはイー・コリから放出されたプラスミドＤＮＡの電子的に強化したハイブリダイゼーションによる特異的な捕捉を示すためのハイブリダイゼーション制御を示す。

【図８Ｂ】 図８Ｂは、図８Ａのハイブリダイゼーション制御、およびイー・コリからのプラスミドＤＮＡの試料をさらなるプローブに電子的にハイブリダイズさせるサンドイッチ・アッセイ後の結果を示す。

【図９Ａ】 図９Ａはイー・コリから放出されたリボソームＲＮＡの電子的に強化したハイブリダイゼーションによる特異的な捕捉を示すためのハイブリダイゼーション制御を示す。

【図９Ｂ】 図９Ｂは図９Ａのハイブリダイゼーション制御、およびイー・コリからのリボソーム１６Ｓ ＲＮＡをさらなるプローブに電子的にハイブリダイズさせるサンドイッチ・アッセイ後の結果を示す。

【図１０Ａ】 図１０Ａは洗浄後の本発明のチップの表面の図である。

【図１０Ｂ】 図１０Ｂは、図３Ａおよび３Ｂに示したチェッカー盤スタイルの電子的アドレス指定を用いて図１０Ａに示したチップの電極上に保持され、ヒト血液細胞（赤血球および白血球の双方）から分離されたＨｅＬａ細胞の試料を示す。

【図１０Ｃ】 図１０Ｃはヒト血液細胞を洗い流した後の図１０ＢのＨｅＬａ細胞の試料を示す。

【図１０Ｄ】 図１０Ｄは染色後の図１０Ｂおよび１０ＣのＨｅＬａ細胞の試料を示す。

【図１１Ａおよび１１Ｂ】 図１１Ａおよび１１Ｂは、細胞分離、細胞溶解、ＤＮＡ／ＲＮＡの酵素除タンパク質プロセス、ならびに／またはＤＮＡもしくはＲＮＡハイブリダイゼーションを行うためにデザインされた自己含有（self−contained）フローチャンバー の断面概略図である。

【図１２Ａ−Ｄ】 図１２Ａ−Ｄは、各々、４の異なるマイクロチップのデザインの模式図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. ⁷識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｂ０３Ｃ 5/00 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｑ 1/68 37/00 １０１ Ｇ０１Ｎ 33/53 27/26 ３３１Ａ 37/00 １０１ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 エドワード・エル・シェルドン・ザ・サー ド アメリカ合衆国92131カリフォルニア州サ ンディエゴ、バーチ・ブラッフ・プレイス 12515番 (72)発明者 レイ・ウー アメリカ合衆国92128カリフォルニア州サ ンディエゴ、ケイプウッド・レイン14021 番 (72)発明者 ジェイムズ・ピー・オコーネル アメリカ合衆国92014カリフォルニア州デ ル・マー、ホスカ・ドライブ682番 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA41 CA01 GA27 HA12 HA15 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ01 QQ16 QQ18 QQ42 QQ52 QQ96 QR55 QR82 QS02 QS15 QS16 QS20 QS28 QX04 4D054 FA10 FB01 FB09 FB20 4G057 AB00 AB38 4G075 AA13 BB03 CA12 CA20 DA01 EB01 EC21 【要約の続き】 した。