发明领域

此项发明是关于实现活性、多步分子和生物学样品的制备和诊断分 析中使用的设备及方法。主要包括与电细胞分离，细胞裂解，和(或) 酶促反应相关的设备方法，特别是用双向电泳进行细胞颗粒的无流道 (CHANNEL-LESS)分离，对分离出细胞进行的高压直流脉冲电裂解， 酶促反应的设备和方法，这些都是用单个生物电学芯片来实现的(例如， 在一个完整的分析系统中)。此项技术在很多方面都有其应用价值，如： 食物和水的质量检测，传染病诊断，癌症诊断，骨髓检查(特别是干细 胞的分离和分析)以及用于法学目的的基于基因的个体鉴定。另外，这 套装置方法还可以用于对基因表达的研究，特别是用于从大量其他细胞 中分离少数特别类型的细胞以用来对特定的亚群中的RNA进行研究。

发明技术背景

分子生物学，免疫学分析，诊断分析实验及其他一些生物学的基础 工作的主要步骤包括：获得细胞样品(如血浆、组织等)；分离所需细 胞材料，裂解或裂解细胞以释放出粗制DNA、RNA(下文提到有关DNA 的内容同样适用于RNA)和全部蛋白质；提纯粗制裂解物(即除去细胞 残余物)；然后进行酶促反应进行所需要的分析。

双向电泳(DIELECTROPHORESIS)是分离微粒的常用技术方法， 无论它们在溶液中是否电离都一样有效。本发明所报道过的已有技术大 多采用一种以玻璃载片为基础的设备，载片表面上暴露有集成电极板， 载片上还包括一个有几百微升容积的流动仓(flow chamber)。用这种设 备进行细胞分离的依据是，不同细胞在一个有适当频率和振幅的交流 (AC)信号的作用下，按照它们的电学性质，通过适宜的电导性来选择 分离缓冲液。这种设备存在很多不足，主要包括以下几点：第一，分离 与未被分离的细胞一起非特异性的粘着在暴露出来的破璃表面及电极 上。第二，流动仓(flow chamber)的容量过大(几百微升)，以至于热 对流干扰先前被电极捕获的细胞，并使之脱离。第三，清除其他不需要 细胞在没有干扰需要保留在电极上的细胞的情况不易实现——这是因为 电极与所需细胞阻碍了液体流(fluidic flow)，因此，也阻挡了包含其他 不需要的细胞的清洗液体流。

裂解或溶解细胞可以释放出粗制DNA，RNA和其它的细胞组分。此 前报道过的电细胞裂解技术，通常采用一种包括一组高压直流(DC)脉 冲的大型设备，而不是采用微芯片技术。这些传统方法存在很多不足， 主要包括：第一，市售大型设备指定的电裂解条件不能使细胞释放出大 分子量(分子量大于20Kb)DNA分子，这是因为大分子量的DNA不能 顺利通过由以前的裂解方法在细胞膜上产生的孔道。第二，一些开始释 放到裂解室(lysis)的核酸因为非特异性地附着在裂解室(lysis)的表面 而损失掉了。第三，用于电裂解的传统的大型设备只能作为一个独立的 单元工作，这样使双向电泳分离与电裂解不能在同一设备组件中完成。  

接下来进行的是粗制裂解产物的纯化(相当于分离清除其它无用的 细胞残体)。纯化后的裂解产物将进行酶促反应，以准备杂交，鉴定、 分析。这些酶促反应包括变性，裂解或扩增裂解产物。在这些样品准备 与DNA加工过程后，才可以进行杂交反应。最后，检测结果和数据还原 (DATA REDUCTION)将从杂交结果中得到分析结论。这些传统的方 法和加工过程存在许多问题，主要包括：首先，这些样品的制备加工步 骤，与杂交、鉴定和分析等其它的主要步骤相分离。另外，传统方法在 大量样品上进行的多种操作是分离的(如：移液，离心，电泳等)，经 常是复杂且高消耗的，需要很高的技术水平。许多技术因为灵敏度，特 异性、及再生产能力的不足而使应用受到了限制。例如：核酸杂交分析 在诊断中的运用已经被这些问题所限制了。

现在已经有人开始应用双向电泳进行细胞分离、鉴定：如U.S.Patent No.4,326,934 to Herbert中介绍了一套依靠连续电泳进行细胞分 类的装置和方法。细胞利用细胞微粒在双向电泳中的阴阳两性运动而得 到分离。分离出的细胞根据在两极间运动的特征性偏转距离来进行分类 和标记。

U.S.Patent No.5,344,535 to Walter et al.也介绍了一种依靠双向电 泳分离鉴定微生物和其他微粒的设备方法。细胞依靠它们特征性的电泳 速度而被分离。

U.S.Patent No.5,569,367 to Walen et al.介绍了一套用一对完整电 极分离混合物的设备和方法。该设备运用2个通电电极阻扰细胞流的顺利 通过，然后用一个不均一的选择区域使不同种类细胞得以分离。电极结 构是由一些排列起来，干扰细胞流动的“插入网状结构”组成的。

此外，进行简并加工步骤，或分步的努力尝试也开始出现了。例如， 不同的microrobotic系统已经被设计用来准备分析在一定支持材料上的 DNA探针，Beattie et al.，in The 1992 San Diego Conference：Genetic Recognifion，November，1992，运用一种microrobofic系统来将包含有 DNA特异序列的小液滴储存到在玻璃底质上的分离的的样品板上。也有 许多尝试是关于一种基于单个芯片或底质的统一系统，这种系统包括主 要的样品准备与诊断分析的复合步骤。A.Manz etal.，在“Miniaturized Total Chemical Analysis System：A Novel Concept For Chemical Sening”，Sensors And Actuators，B1(1990)，PP.244-248，中介绍了一种“完全化学分析系统” (TAS)，它包括一个小型化TAS构造的组件，样品输送，任何必须的化 学反应。染色体分离鉴定将可以自动进行。另一种设计中的整合系统是 Stapleton，U.S.Patent No.5,451,500中提到的，该专利介绍了一种自动鉴定 目的核酸序列的系统，在该系统中，多种生物样品将分别以二维形式植 入包含载体的母体中。不同种类的载体将被运用于不同种类的诊断分析 和实验控制版中(TEST PANEL)。

用于实现样品制备与分析的多方面功能的复合电极系统也已经披露 了，这种系统用于多种生物样品的制备和分析。Pace，U.S.Patent A，908，112， 题为“Silicon Semiconductor Wafer for Analyzing Micronic Biological Samples”介绍了一种分析分离装置，该装置主要部分是在半导体设备中 的一个通道组成的毛细管，电极被安置在通道中以用来作用于毛细管中 的液体的流动。Pace指出，对毛细管而言，直线运送距离应小于100微米， 并且，所有分析仪器的功能可以通过整合到一个硅晶片来实现，如样品 注射，反应前导，纯化，鉴定，信号条件交替回路(signal condifioning cricuifny)等，还有逻辑on-board智能。

Soane et al.在题为U.S.Patent 5,126,022“Method and Device for Moving Molecules by the Applicafion of a plurality of Electrical Fialds”，中介绍了一 种系统，该系统利用电极电势使材料在管道中运动，在那里所需成分将 被引导进充满反应活性的抗原—抗体系统的管道内，电离的微粒将在管 中运动或与互补成分相结合，进行染色，荧光标记，放射性同位素标记 (radiolabel)，特异酶标记等化学反应以用于各种不同的目的--如实现自 然界中的物理、化学变性等。这就是说明细菌或哺乳动物的细胞或病毒 将在电极电势的作用下，在复杂的管道系统中进行分离，它们在管道网 络中的运动将取决于运动材料的大小，电性、形状等因素。Clark，U.S.Patent 5,194,133题为“Sensor Devices”，介绍了一种进行样品流(sample fluid) 分析的传感设备，该设备中的底质表面上形成了包含某种材料的加长微 电机管道(micromachined channel)，材料可以是淀粉，琼脂糖，藻朊 酸盐(alginate)，角叉(菜)胶(carrageenan)，聚丙烯酰胺聚合凝胶等， 它们将在液体经通道时引起样品的分离，被分离的材料可以是某种粘蛋 白、抗体、血凝素、某种酶、一系列酶或油脂。

从不同表面上提取DNA的仪器也有介绍。Shukla U.S.Patent 5,340,449. 题为“Apparatus for Electroelution”的专利中介绍了一种系统方法，用于 从固态母体材料表面，如：聚丙烯酰胺、琼脂糖、或类似PVDF等种类 的膜上，用电学的方法提取DNA，RNA，蛋白质等大分子物质。材料被 从solid phase中提取到按“molecular weight cut-off membranes”划分的容 器里。Okano，U.S.Patent5,434,049题为“Separation of Polynucleotides Using Supporst Having a Plwality of Electrode-Containing cell”介绍了一种在样品 中鉴定一系列目标多(聚)核苷酸的方法，该方法是对每一个小室施加电 压，使其像电极一样对捕获的多(聚)核苷酸进行提取，被提取的材料将可 以进行收集。

一般的说，以前这些精细加工是要消耗很多时间和劳动的，各个步 骤和步骤之间都需要人的参与。如此复杂的复合步骤是不理想的，因为 有污染和操作失误的可能性。而某些步骤中使用的复杂机械和自动化系 统一般来说又是异常昂贵，这还不用说花销奢侈，占地面积巨大的大型 实验室。

从上述讨论中不难看出，已经出现了很多开发高效样品分离与预备 反应的技术的尝试，但是鉴于上述原因，这些技术还是有限的，不足的， 还不能够简便的形成一个能够进行完整的DNA诊断分析的系统。长时间 以来，对这样一个系统的需求，一直没有得到满意的解决。

现在依然存在着对能提高双向电泳分离生物细胞能力，并能提高分 离出细胞的稳定性的装置和方法的需求。也还存在着对能提高细胞的准 备与分析水平，并能将细胞分离、预备、分析整合到一个系统的方法的 需求。

发明概述

本发明广泛地涉及到在分子生物学样品的电学分离，电裂解，及诊 断分析中使用的仪器和方法。特别是用于通过双向电泳实现细颗粒的无 流道分离、对被分离出的细胞进行直流高压脉冲电裂解、样品纯化(即： 从细胞裂解物，这样的粗制混合物中分离出所需的成分)、以及酶促反 应等的设备和方法。所有这些都可以在单一的生物芯片上完成，这是靠 样品中不同成分的不同的迁移率和亲和性来实现的。

本发明的一个方面是一种具有多个包被电极的微型硅芯片组成的装 置，电极由一层旨在防止电极与样品直接接触的保护层包被。一个被包 被的流动单元(FLOW CELL)与芯片结合在一起，形成一个有入口与出 口的密封的空间，该密封空间将被连接到塑料管道以使得材料可以通过 入口，出口分别进行输入，输出。

这个装置的典型使用方法包括：制备将要导入的、随后进行双向电 泳的细胞样品(例如，在细胞分离缓冲液中的悬浮物)；将样品导入流 动仓(FLOW CHAMBER)中(通过泵的作用)；将样品放置在电场中， 实现所需细胞从样品中进行双向电泳分离；通过泵作用使溶液流经流动 单元(FLOW CELL)以洗去不需要的细胞；对所需细胞施加一系列的电 脉冲来使其裂解；最后按照所需进行细胞裂解物的酶促反应。

本发明的主要目的是提供一套实现细胞分离，裂解和酶促反应的装 置和方法。

此外这项发明的另一目标还有：提供一套装置方法，使得细胞分离， 分解，酶促反应可以由单一芯片来完成，以避免移液，离心等机械操作。

本发明的另一个目的是提供一套装置和方法，将电极装置，缓冲液， 渗透层的使用结合起来，以完成所需细胞的均一分离。

本发明的再一个目的是提供一套装置方法，以通过渗透层的使用， 来完成对所需细胞的均一分离，并使得细胞在流动仓(FLOW CHAMBER)上及电极上的非特异性吸附的可能性变的最小。

本发明的还一个目的是提供一套装置方法，使得在流动仓(FLOW CHAMBER)中没有管道(CHANNEL)的情况下，能够轻松的洗去不需 要的细胞。

本发明的又一个目的是提供一种裂解被电极捕获的所需细胞的方 法，该方法是在电极上以一种高度局域化，受控制的模式使用一系列高 电压直流脉冲，从而使DNA、RNA或蛋白质可以完整的从细胞中释放出 来。

本发明的再一个目的是在同一个流动仓中实现细胞裂解物的酶促反 应，使核酸从杂质蛋白中分离出来，且不引起DNA、RNA的任何损失。

本发明的又一个目的是在一个单一芯片上的独立的流动仓中，完成 一步或多步上述操作，如细胞分离、裂解，去除DNA和RNA中的蛋白质 的酶促反应，DNA和RNA的核酸酶(NUCLEASE)消化，DNA或RNA的 杂交、免疫实验，以及配体结合反应(ligand binding reaction)等。

附图的简要说明

图1：显示本发明的装置的顶视图，它携带一个微芯片及其一个流动 仓，该流动仓包括流体管道和一个监测窗。

图2：包被渗透层的芯片的示意图，显示出了一些圆形电极及反电极。

图3A：棋盘布局形式电装置的示意图，该装置由一组5×5放置的圆形 电极组成，每个电极具有与其最邻近的电极相反的偏压(5×5的安排只是 示意性质的，该阵列可多于或少于25个电极)。

图3B：交流电场分布的计算机模型示意图，它相应于图3A所示的棋盘 形式布局，得到了一种规则分布的电场，电极处是最强场，电极之间的 区域是最弱场。

图3C：正方框形式的布局的示意图，框架中放置了5×5的电极，在同 一个正方框上的电极具有相同的偏压，它与最邻近的正方框上的电极的 偏压相反。

图3D：一幅交流电场分布的计算机模型示意图，它相应于图3C所示 的正方框形式的布局。

图4A：芯片的详细视图。

图4B：显示保留在示于图4A的芯片的几个电极上的大肠杆菌细胞样 品，并使用示于图3A和3B的棋盘式形式布局从人血细胞(包括红细胞和白 细胞)中分离。

图5：显示洗掉人血细胞后的图4B中所示的大肠杆菌细胞。

图6：显示从图4B和图5中所示的大肠杆菌细胞中释放出的核酸样 品，并通过施加直流电波浓缩。

图7：显示图6中的核酸的琼脂糖凝胶电泳分析后拍摄的照片，显示 电流裂解后从细胞中释放出全部的核酸，包括基因组DNA，超螺旋质粒 DNA和RNA。

图8A：显示杂交对照，显示通过电增强杂交对从大肠杆菌释放的质 粒DNA的特异性捕获。

图8B：显示图8A中的杂交对照，以及在三明治测试后的结果，其中， 来自大肠杆菌的质粒DNA样品被电杂交到额外的探针上。

图9A：显示杂交对照，显示通过电增强杂交对从大肠杆菌释放的核 糖体RNA的特异性捕获。

图9B：显示图8A中的杂交对照，以及在三明治测试后的结果，其中， 来自大肠杆菌的核糖体RNA样品被电杂交到额外的探针上。

图10A：显示芯片在清洗后的表面。

图10B：显示保留在示于图10A的芯片的电极上的HeLa细胞的样品， 并使用示于图3A和3B的棋盘式形式布局从人血细胞(包括红细胞和白细胞) 中分离。

图10C：显示了在洗掉人血细胞后的图10B中的Hela细胞样品。

图10D：显示了染色后的图10B和C中所示的Hela细胞。

图11A和B：显示全套的流动仓的截面的示意图，它被设计用来进行 细胞分离，细胞裂解，对DNA/RNA的酶促脱蛋白，和/或DNA或RNA杂 交。

图12A至D：分别是四种不同微芯片设计的示意图。

最佳实施例的详细描述

本发明包含下述的设备和方法。它们主要是通过双向电泳、直流高 压电脉冲裂解，从粗提混合物(如细胞裂解物)中分离所需成分，以及 进行细胞裂解物的酶促反应等方法，来完成细胞颗粒的无流道分离，所有 这些工作都是在一块生物芯片上完成的。

这项发明的具体装置结构是：

本发明的最佳实施例包括在图1中所示的支架10，包括在印刷电路板 14上的微硅芯片12，芯片12中安置的流动单元16，形成一个包括流动管 18a、18b的流动仓，及探测窗20。流动仓的最佳体积为10μl。支架10还 包括一个输出插头(output pin)22，用以将支架10和电控制器——例如， 设备或计算机(没有示出)——之间的电连接。

微芯片12如图2所示(精细结构图如图4A所示)。它包括多个圆形微电 极24和相反电极34。为了防止电极和被引入到上面放置的流动单元16的 样品直接接触，微电极24最好包被有保护层。(详细说明见下文)。

在一个最佳实施方案中，芯片12包括四个反向电极34和5×5排列的铂 金微电极，这是使用已知的标准的半导体制造技术制造的。这里需要说 明的是，电极的数量可多可少，这里的5×5只是示例而已。实际上，一 个集成有更多电极的芯片，可以回收大量的靶细胞，因此，可以得到更 多的核酸。相邻的微电极24间的中心距优选为200μm，每个电极24的最 佳直径大约为80μm。

在这个实施方案中，芯片12的制备过程是：首先在热氧化的硅薄膜 上喷涂厚100nm的钛钨层，然后在钛钨层上喷涂厚300nm的铂金层。使用 光刻技术限定的在王水中的湿刻使喷涂的金属形成图形。低强度(LOW STRESS)的硅氮化物(1.3μm)和硅氧化物(100nm)的薄层以等离子状态下 的化学蒸汽的形式(PLASMA-ENHANCED CHEMICAL VAPOR DEPOSITION)沉积在模制后的金属表层。再使用通过光刻术形成图形 的干燥等离子蚀刻，穿过介质层蚀刻到电极阵列。芯片12被导线固定在 印刷电路板14上(最好与个人计算机内存卡国际组织的个人计算机卡的标 准相一致)。

在将芯片12固定在印刷电路板14之后，先用异丙醇清洗，再用去离子 水清洗，最后用氮气流吹干。固定有干燥芯片12的电路印刷电路板14被 垂直的放置在等离子体清洁仓中，在250m Torr，250W的条件下用氩清洗 五分钟。等离子清洁之后，渗透层被加到每个芯片12上。

首先，通过如下步骤制备2.5％浓度的底渗透层(BPL)乙醛酰琼脂糖溶 液：将乙醛酰琼脂糖(250mg)(来自Sigma，St.Louis，MO)加到10ml去离子蒸 馏水中，混合，煮沸八分钟。完全溶解的琼脂糖溶液使用1.2μm的注射 过滤器(syringe filter)，热过滤到预热了的Eppendorf试管(65℃)中。再 将被过滤的琼脂糖溶液在65℃平衡五分钟。接下来是顶渗透层(TPL)的 制备。先将抗生蛋白链菌素(streptavidin，Boehringer Mannheim，Indianapolis， IN)加入到含有氯化钠(250mM)和磷酸钠(10Mm，PH7.2)的溶液中， 以制备抗生蛋白链菌素(streptavidin)溶液(5mg/ml)。将抗生蛋白链菌素 (streptavidin)溶液与等温的(temperature equilibrate)BPL溶液合并， 形成2％的琼脂糖和1mg/ml的抗生蛋白链菌素(streptavidin)。将热的BPL 溶液(50μl)加到每块芯片上，并使用旋转涂布器(EC101D，Headway Research，Garland，TX)，在室温，2500rpm的条件下旋转20秒。在BPL凝固 以后，再在上面加入热的TPL溶液(50μl)，在室温，在旋转涂布器中在 10000rpm的条件下旋转20秒。最后，将包被好的芯片放在37℃烘烤30分 钟。

在乙醛酰琼脂糖和抗生蛋白链菌素的伯胺基之间的西佛碱(schiff base)式连接可以被新配制的氰硼氢化钠(sodium cyanoborohydride)(0.2M)/ 硼酸钠(0.3M)溶液还原。反应条件是在室温，pH9.0的环境中作用1小 时。剩下的醛基基团可以在硼酸钠(0.3M)存在的条件下被甘氨酸缓冲 溶液加帽(CAPPED)，反应条件是在室温，PH9.0的环境中作用30分钟。 最后，芯片用去离子水清洗5分钟，在空气中风干4小时，然后在4℃的条 件下保存。

本发明中的支架10的制备过程如下：选一块做好的芯片12/印刷电路 板14，用胶将聚碳酸酯铸造(polycarbonate molded)  的流动单元16固 定在芯片上，在200W UV光下使用UV胶(NORLAND 68，Thorlabs，New Brunswick，NJ)固定四十五秒钟(4焦耳/CM2)。最好用相似的方法，把玻 璃盖片粘在流动单元顶部，以形成一个密封的流动仓。输入输出塑料管(18a， 18b)通过引导附件(lure fittings)26分别粘接在输入输出口上。

这样支架10已经做好，可以用来进行实验了。一个实验是进行大肠杆 菌(E.coli)细胞的分离，裂解，和酶促反应的；另一个实验是关于宫颈癌细胞 的分离的。

大肠杆菌实验

首先是按照常规的技术培养细胞。一段296bP大的基因片段从沙门 肠炎杆菌的SpaO编码区取出并放大，然后用INVITROGEN T/A克隆试剂 盒(INVITROGEN，San Diego，CA)克隆到pCR2.1质粒(3890bp)上。 按照试剂盒的说明来进行连接，连接产物被用来转化具有INVαF’能力的 大肠杆菌。将转化株在LB平板培养基中生长，培养基中包括100μg/ml的 氨苄青霉素，80μl的x-gal(20mg/ml)，4μl异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 (40mM)，进行蓝/白颜色筛选。为了筛选克隆，挑选出10个白色菌落，裂解 并释放DNA用于分析。这些DNA用SpaO特定引物通过PCR进行扩增，同 时用凝胶电泳检验扩增产物。将一个在PCR筛选中为阳性的克隆在37℃， 每分钟震动225次的条件下，在LB氨苄青霉素液体培养基(100μg/ml) 中过夜培养。

然后，按照常规的方法准备细胞培养物。制备细胞分离缓冲液，它 包括0.05×TBE(4.5μM Tris，4.5μM硼酸，0.1μM EDTA， PH8.2)，250mM蔗糖，PH8.2。此缓冲溶液的导电率用Accumet PH Mrter 50 (Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)测量是114μS/cm。对细胞分离时的导 电率进行精心选择，以确保大肠杆菌细胞在双向电泳中处于阳性，而所 有的普通人血细胞在双向电泳中都是处于阴性。培养的大肠杆菌细胞悬 浮液(1ml)在325×g条件下离心4分钟，除去上清液。将细胞团粒在细胞 分离缓冲液中洗涤(1ml)，并在上述同样的条件下进行立新。细胞然后 再次在细胞分离缓冲夜中悬浮。再将新鲜的EDTA-抗凝血人血(20μl) 加入大肠杆菌细胞悬浮液中(1ml)，至此完成细胞培养。

细胞培养被引入本发明的支架10中，用双向电泳分离大肠杆菌细胞。 支架10被放置在NIKON相差显微镜的平台上。光源的提供是环形光源 (ring light)(Precision MicroOptics，Irvine，CA)。图象信号的收集通 过10倍物镜由CCD/RGB彩色摄象机(Sony DXC-151，Mikron Instruments， San Diego，CA)完成。同时用Sony VCR记录，并由Sony电视监视器监 控。液体通过蠕动泵(Model RP-1，Rainin Instrument，Woburm，MA) 使液体流经管道18和流动单元16。电极24的信号由一个功能/随意波形发 生器产生(Model hp33120A，Hewlett-Packard，Santa Clara，CA)，并 由示波器所显示(Model HP54600，Hewlett-Packard)。

细胞培养物在双向电泳之前，必须进行计算机模型和双向电泳设计 研究。为了使人血细胞被更容易洗脱，最好大肠杆菌细胞进行阳性双向 电泳，人血细胞进行阴性双向电泳。在阳性双向电泳力的作用下，大肠 杆菌细胞向阳性场最大的电极区域移动。在阴性双向电泳的力的作用下， 人血细胞向阴性场最大的区域移动。此种情况发生的几率，一般来说是 以计算机模型和双向电泳设计为基础的。

双向电泳的基本原理是诱导极性粒子在非均一电场中移动，该原理 已经被广泛的研究了。例如：R.Pethig，“Dielectrophoresis：Using Inhomogeneous AC Electrical Fields To Separate and Manipulate Cell”，Crit. Rev.Biotech.，16：331-48(1996)；X.Wang，et al.，“A Unified Theory of Dielectrophoresis and Travelling Wave Dielectrophoresis”，J.Phys.D： Appl.Phys.，：27：1571-75(1994)；G.Fuhr，“Cell manipulation and Cultivation Under AC Electric Field Influence in Highly Conductive Culture Media″，Biochim.Biophys.Acta 1158：40-46(1993)；and M. Washizu，″Molecular Dielectrophoresis of Biopolymers″，IEEE Trans.Industry Applicat.30：835-43(1994)。双向电泳现象一般可以由势能描述

                ψ＝- m· E

其中 m是在非传导性媒介中悬浮颗粒的瞬间感生偶极子； E是应用的 电场。因此，双向电泳力作用于粒子可以写为势能梯度。

当离子有净电荷为0时，并且周围的介质为各向同性时，平均势能可 以被简化为：

                ψ＝-(1/2)pvE2

其中，p是在v体积内的悬浮颗粒的有效极化率。极化率的数值和符 号是由粒子和介质的介电常数，及其外加电场的频率来决定。R.Pethig， ″Dielectrophoresis：Using Inhomogeneous AC Electrical Field To Separate And Manipulate Cells″，Crit.Rev.Biotech 16：331-48(1996)。在稳态，具有 阳性极化率粒子(p＞0)就会倾向于处在高场区域；具有阴性极化率粒子 (p＜0)就会倾向于处在低场区域。

为了模拟在本发明的电极24周围的电场的分布，要做以下两个假设： 首先，无论芯片还是流动仓的低频区域的线性长度要比外加直流场的波 长小的多。其次，样品溶液是中性的。在这样两个假设下电场可以由解 Laplace等式来解决本实验框架中的特别定位结构。

             2＝0； E＝-

(是电势)电极固定限制条件的电势。在芯片其余部分正常电流 是0，在阳极电极＝v0；在阴极电极＝0，在芯片其他部分及流动仓 中δ/δn＝0。

因此，样品溶液中的电场及极性粒子的势能的数值可以由有限积分 的方法算出。K.Binns，″The Analytical and Numerical Solution of Electric and Magnetic Fields″(John Wiley & Sons，N.Y.1992)

大肠杆菌细胞受双向电泳阳性力驱动的频率，血细胞受双向电泳阴 性力驱动时的频率是根据细胞混合物在不同的条件下通过经验决定的。 研究是通过逐步的增加正弦信号的频率(峰峰值是10伏特)来进行的， 起始时频率为5KHz。当频率达到10KHz时，大肠杆菌和其他的人血细胞 的分离就可以被清楚的观察到了。这些电参量被用于后面的大肠杆菌的 分离中。

为了在细胞培养物中实现大肠杆菌细胞从血细胞中的分离，采用了 一个没有使用过的支架10装置。首先用分离缓冲液洗涤支架10上的芯片 12，分离缓冲液是由样品/缓冲液储集器28通过管18和流动单元16泵出的。 接下来，细胞培养物被泵入流动单元16，随后泵关闭。整个电极24的阵 列(也就是所有25个电极是5横5纵的阵列)被按照棋盘偏压形式布局排 列，以达到强场在每个电极，弱场处于电极之间的区域的要求。如图3A- 3B所示，采用峰峰值为10伏特的10KHz的正弦信号。如图4B所示(对照 图4A)，大肠杆菌细胞30(在电极24的强场区域所收集的)从人血细胞 (在电极24之间的弱场区域所收集的)中的分离过程，大致需要4分钟。 随后，泵重新启动，进行清洗过程。

使用了图3A中所示的棋盘偏压形式布局(checkerboard biasing format) 而不是图3C所示的正方框行布局(square wall format)。由图3B可以看出， 相应于棋盘形式布局的场分布形成了强场位于每个电极处，弱场处于电 极之间的区域的均一的分布，但是，如图3D所示，正方框型布局就无法 使强场散布在电极之间。之所以这种弱场散布于电极之间的布局(如图3B 所示)成为首选，是因为这样的布局可以洗脱那些不需要的细胞(就是那 些聚集于弱场之中的细胞)，而毫不干扰到所需的细胞(就是保留在电 极处的细胞)。这是因为需要的细胞和电极并不位于液体流动的通路上， 因此并不阻碍含有不需要的细胞的洗脱液的流动。特别要明了的是这种 棋盘形式布局最基本的结构是由成组的电极所构成的，每一组电极都和 其最近的相邻电极加上相反的偏压。

当细胞培养混合样品即将从样品/缓冲储集器28中抽干时，由流动单 元16中加入分离缓冲液，洗涤剩余的样品，此过程中交流信号保持接通。 如图5所示，(对照图4B)整个过程洗净除去了人血细胞，而保留了大肠 杆菌细胞30。洗涤后，含有蛋白酶K(490μg，Boehringer Mannheim， Indianapolis，IN)的分离缓冲液(300μl)由流动单元16泵入流动仓， 以降解蛋白，使其分子量变小。

接下来用电裂解来完成所得到的大肠杆菌细胞的裂解。为了裂解细 胞，需要在4个反电极34(图2)和25个较小的细胞收集电极中施加连续 脉冲(500V，50μs脉冲幅宽)。脉冲按以下方法进行：每20次脉冲的极 性在两组电极24和34之间交替改变。每个裂解过程总共采取400次脉冲。 交替改变脉冲，是用来拉动、推动细胞内物质，使其冲出细胞。图6表示 核酸36的样品是由大肠杆菌细胞中释放出来，并在交流波作用下浓缩的。

这些裂解产物的混合物于50℃下保温20分钟，以消化污染DNA的杂 蛋白。这些裂解产物被泵出流动单元16，并收集。双向电泳分离和电裂 解结合在一起，重复6次，并将所有裂解产物都集中起来，以准备用于分 析。

聚集的裂解产物在16000×g下离心5分钟，回收上清夜。然后向溶液 中加入两倍体积的冰乙醇(-20℃)，混合，在16000×g下离心10分钟，除去 上清夜；沉淀在空气下干燥。再用0.05×TBE缓冲液(300μl)溶解沉 淀。取出30μl的再溶解溶液与含有RNase的溶液(3μl，10mg/ml， Boehringer Mannheim)混合。混合溶液在37℃下保温30分钟。

接下来采用凝胶电泳方法分析收集产物。将600mg融化琼脂糖溶于 50ml 1×TBE缓冲液以配制1.2％琼脂糖凝胶，在琼脂糖溶液凝固之前 加入2.5μg溴化乙锭(Ethidium bromide)。被蛋白酶K处理的裂解产物样 品，无论是否经过RNase的处理，与标记DNA(marker DNA)一起被加 样到凝胶之上。图7是图6中的核酸经琼脂糖凝胶电泳后的照片，显示了 在电裂解后的从细胞中释放出来的全部核酸(包括基因组DNA，超螺旋 DNA和RNA)。

下面进行的是DNA杂交实验。将能与质粒DNA的SpaO区域特异性结 合的寡核苷酸捕获探针的3′端与生物素相结合。用50mM的L-组氨酸缓冲 液稀释探针，配制浓度为500nM的探针溶液。捕获探针被固定在检验微 位点上，该检验微位点包括抗生蛋白链菌素，同时电极24加以阳性偏压。 电偏压是通过在每个电极24上保持200nA的电流1分钟来实现的。随后， 剩余的探针溶液被移走，芯片12用50mM的L-组氨酸缓冲液清洗。用于对 照的探针(ATA5和GAS探针)的固定用上述同样的方法来实现。

将部分蛋白酶K作用后的裂解产物在L-组氨酸缓冲液中相应稀释3和 5倍以易于DNA的杂交。稀释后的裂解产物样品在100℃水浴10分钟，使 DNA成片段形式(最终DNA的大小在300bp-1Kbp)，并成为单链DNA。 为了验证对照的存在，可以将450nA的电流保持三分钟，使得能与捕获探 针ATA5特异结合的RCA5合成寡聚核苷酸靶片断(见：F.Becker，et al.，″Separation of Human Breast Cancer Cells From Blood By Differential Dielectric Affinity，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：860-64(1995))平行地与 被固定的ATA5探针及其附近的非特异性的GAS探针进行电杂交。当捕获 过程结束后，加入新配的L-组氨酸缓冲液以替代原有的缓冲液，进行电 严谨清洗。冲洗是通过在一次给每列加150个直流脉冲的条件下，每间隔 0.2秒开，0.1秒关通以1μA/pad的电流来实现的。

进行三明治杂交实验的过程中，报道探针是按以下方法进行杂交反 应的。先在室温条件下，用含有超声波降解变性的的小牛胸腺DNA(100 μg/ml，Sigma，St.Louis，MO)的1×STE缓冲液浸泡芯片12五分钟。然 后排除缓冲液，将15微升混合液(即含有500mM报道探针和上述的小牛 胸腺DNA的1×STE缓冲液)加到芯片12上，室温保持五分钟。接下来， 用15微升用0.2×STE配制的1％SDS缓冲液清洗五遍，再用五毫升相同缓 冲液室温浸泡十分钟。最后用0.2×STE清洗五遍。

图8A所示为用于电增强靶捕获从大肠杆菌释放的质粒DNA杂交对照 37。图8B所示为三明治实验后的结果，在三明治实验中，从大肠杆菌释 放出的质粒DNA38与其他的探针进行了电杂交。如图8A所示，寡聚核苷 酸探针的化学固定作用完全按期望进行(即固定的探针能与寡聚核苷酸 结合)。如图8B所示，从电裂解中得到的大肠杆菌质粒DNA38经热处理 后，可以直接用来进行以杂交为基础的实验，它有很强的可重复性，而 不需要一个酶促扩增的过程。

接下来进行的是RNA杂交反应。能与16S RNA进行杂交的寡聚核苷 酸捕获探针的序列为：5′-XGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGA CGCACTTTA-3′，它的3′末端与生物素结合。用50mM的L-组氨酸缓冲液 稀释探针，配制浓度为500nM的探针溶液。将捕获探针固定在含有抗生 蛋白链菌素的微位点上，并且下面的电极被加上正偏压。加正偏压是通过 将每一个电极的电流保持在200nA并保持一分钟来实现的。此后，剩余的 探针溶液将被转移出，再用50mM的L-组氨酸缓冲液来清洗芯片。用于对 照的探针(ATA5和GAS探针)的固定也可用同样的方法来实现。

为测试对照，通过将每个电极的电流保持在450nA并保持三分钟， 将特异于捕获探针ATA5的合成RCA5寡聚核苷酸靶与固定的ATA5探针及 其附近的非特异性的GAS探针平行进行电杂交。合成寡聚核苷酸靶5′- AATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACC TCATAAAGTGCGTCGT AGTCCGGATTGGAGTATGCAACTCG-3′的捕 获是用相同的方法实现的。为了便于16S RNA的杂交，将部分的用蛋白 激酶K处理过的细胞裂解物在L-组氨酸溶液中分别稀释三倍和五倍。这里 也使用了用于上述的质粒DNA杂交的稀释的细胞裂解物样品。当捕获过 程完成以后，加入新配的Tris-磷酸缓冲液(20mM的Tris碱，20mM的磷酸 氢二钠(dibasic sodium phosphate)，pH9.0)以替代L-组氨酸缓冲液来完成电 严谨清洗。仅使用L-组氨酸缓冲液来完成简单的电严谨清洗不足以有效 地清除非特异性结合的RNA。而用Tris-磷酸缓冲液可以在和温和的电场 条件下获得比使用L-组氨酸缓冲液好很多的效果。冲洗是通过在一次给 每列加70个直流脉冲的条件下，每间隔0.2秒通以0.1秒750nA/pad的电流 来实现的。

进行三明治杂交实验的过程中，报道探针是按以下方法进行杂交反 应的。先在室温条件下，用含有超声波降解变性的的小牛胸腺DNA(100 μg/ml，Sigma，St.Louis，MO)的1×STE缓冲液浸泡芯片12五分钟。然 后排除缓冲液，将15微升混合液(即含有500mM报道探针和上述的小牛 胸腺DNA的1×STE缓冲液)加到芯片12上，室温保持五分钟。接下来， 用15微升用0.2×STE配制的1％SDS缓冲液清洗五遍，再用五毫升相同缓 冲液室温浸泡十分钟。最后用0.2×STE清洗五遍。

图9A所示为用于电增强靶捕获从大肠杆菌释放的核糖体RNA的杂交 对照39a。图9B所示为三明治实验后的结果，在三明治实验中，从大肠杆 菌释放出的核糖体16S RNA 39b与其他的探针进行了电杂交。如图9A所 示，寡聚核苷酸探针的化学固定作用完全按期望进行(即固定的探针能 与寡聚核苷酸结合)。如图8B所示，从电裂解中得到的大肠杆菌核糖体 RNA 39b经热处理后，可以直接用来进行以杂交为基础的实验，它有很 强的可重复性，而不需要一个酶促扩增的过程。

宫颈癌实验

如上所述，支架10也用来从外周血细胞混合物中分离培养的宫颈癌 细胞(HeLa cell)。

首先，按照常规方法制备细胞培养物。这种由人子宫颈肿瘤而来的 表皮癌细胞系，是由San Diego的California University的核心细胞培养机 构完成的。其生长培养基(250ml)的制备是通过将L-谷氨酰胺(2.5ml， BRL life Technologies)及胎牛血清(25ml，Gemini Bio-Products)加入到 RPMI 1640(222.5ml，BRL Life Techinologies)中制备的。为了检验介质 的无菌性，取出一部分介质(3ml)转移到锥型试管(15ml)中，试管松 口置于5％的CO2的培养箱中(National)。37℃下，培养一周。在此一周中， 每天都要检查试管的污浊状况。接下来，一小瓶冰冻的细胞迅速在37℃ 下水浴，并加以搅拌，使之很快的解冻。立刻将同等体积的预热后的培 养基加入细胞液中，然后将混合物转移至锥型试管(15ml)中。再加一 部分培养基到细胞中(6ml)使最终体积为8ml。细胞在1100rpm下离心2 分钟，成团状。除去上清夜，使细胞沉淀再次在新培养基(10ml)中悬 浮。细胞悬浮液置于37℃，5％CO2下培养。采用胰蛋白酶化细胞来收集 细胞，然后将其在新鲜培养基中重新悬浮，准备立即使用。细胞量是1× 106/ml。

接下来是按照常规方法准备细胞混合物。细胞分离缓冲液成分包括 0.0025×TBE(225nM Tris，225nM硼酸，5nM EDTA，pH8.2)及250mM 的蔗糖。缓冲液的导电率用Accumet pH Meter 50(Fisher Scientific， Pittsburgh，PA)测量是10μS/cm。对细胞分离缓冲液的导电率进行谨慎 的选择，以确保HaLe细胞进行阳性双向电泳，正常的人血细胞进行阴性 双向电泳。HeLa细胞培养悬浮液(1ml)在325×g下离心4分钟，除去上清液。 用细胞分离缓冲液(1ml)清洗细胞沉淀，并在上述同样条件下进行离心。 HeLa在细胞分离缓冲液(1ml)中再次悬浮。新制的EDTA-抗凝血人血(1ml) 在400g下旋转5分钟，除去上清液，取出压紧的细胞(5μl)，加入到Hela 细胞悬浮液(1ml)。

此试验中的双向电泳系统除了包括一个用来帮助探测的激光以外， 一切如上所述。支架10被放置于分析探针装置中(Model 6000 Micromanipulator，Carson City，NV)。通过光纤，通过2个He-Ne 594-nm激 光头以一个斜角发射出去(6mW输出功率；Research ElectroOptics，Boulder，CO)进行激光刺激。图象信号被一个冷却彩色电偶 合仪器(CCD)摄象机(DEI-750T，Optronics Intemational，Chelmsford，MA) 收集，此摄象机是通过一个8倍物镜(numerical aperture 0.15)和一个630 ±25nm的频率通过过滤器(band-pass filter)来完成收集的。图象获得是 用一个图象获取器(frame grabber)(Scion，Fredericak，MD)和与Macintosh兼 容的StarMax 3000/200上的IPLab 3.1.1软件共同实现的。流体泵出是通过 蠕动泵(Model RP-1，Rainin Instruments，Woburn，MA)来完成的。电信号有 一个功能/随意波形发生器(Model HP33 120A，Hewlett-Packard，Santa Clara，CA)产生，并且被示波器(Model HP54600，Hewlett-Paclard)所显示。

HeLA细胞用双向电泳从血细胞中分离。首先将芯片12用流动仓中泵 出的分离缓冲液清洗，并同时湿润芯片的浸透层，以及去除仓中的气泡。 图10A所示的是经过清洗后的芯片12的表面。然后细胞混合物被泵入流动 仓，泵关闭。电极24的整个阵列是按如上所述的棋盘形式排布的，并采 用峰峰值为6伏30KHz的正弦信号。如图10B所示的，HeLa细胞31(聚集 在电极24的峰值区域内)从外围人血细胞32(聚集在电极25的峰谷区域 内)的分离过程大约需要3分钟。当细胞样品即将从样品/缓冲液储存器中 排干时，分离缓冲液通过流动单元流过以清洗样品剩余部分，此过程中依然 显示交流信号，因此使得任何其他的被带入流动仓中的HeLa细胞被吸附 在电极24上，存留，而在电极之间收集到的外周人体血液细胞则被冲走。 图10C显示了清洗后的芯片表面。

为了证明在电极上的细胞是HeLa细胞，而不是外围淋巴细胞，我们 需从同样的血液中制备浅黄色外壳细胞(buffy coat cell)，用同样的分离 缓冲液稀释，并在相同条件下进行电泳。在这个实验里，我们可以看到 淋巴细胞在电极之间的电场峰谷处，并且远离电极，这证明了HeLa细胞确 实在电极上。

分离的HeLa细胞按照如下步骤进行荧光染色。在分离缓冲液(100 μl)中加入核酸结合的荧光染料和碘化丙锭(propidum iodide)(2μl， 1mg/ml；Molecular Probes，Eugene，OR)。当细胞分离结束后，染色缓 冲液被泵入流动单元中。在荧光图像(见图10D)被捕捉到前的染色过程 需要大概60秒。通过比较结果图像中的细胞与电极直径(已知为80μm) 的大小，我们可以得到单个细胞直径估计。电极上的分离细胞的大小在 17-34μm之间，这与在反射式显微镜下观察到的HeLa细胞的大小相吻 合。另外，通过与淋巴细胞的形状的比较我们更确信了这些细胞是HeLa 细胞。如果需要的话，分离的HeLa细胞可以被裂解，并进行上述酶促反 应。

在上述双向电泳分离过程中，没有观察到细胞的对流。如上所述， 这实现了在干扰最小的条件下，清除掉最初存留在电极上的细胞的目的。

附加设计

图11A和11B表示了一种用于进行细胞分离，细胞裂解，DNA/RNA 的酶促脱蛋白过程，和/或DNA或RNA杂交的全套支架10的截面示意图。 支架10包括一个在微芯片12上的U形流动单元仓16。微芯片12在U形仓的 一个臂40a中有一组25个电极24a和四个反电极34a组成阵列，而在U型仓 的另一个臂40b中有一组由9个电极24b组成的阵列。应该注意，电极组阵 列中的电极数量可以不必与图示中相同，图中的电极数量只是举例说明 而已，而不是一种限定。软管18a，18b，18c通过接口42a，42b，42c接到 流动仓16上，这给流动仓中液体的流入流出提供了通道。

采用如图11A和11B那样的U形流动仓的一个优点在于，它可以使不 同的过程在不同的空间中完成而无须移动或重新导入样品。比如，如图11A 所示，软管18c关闭，样品通过软管18a引入。如上所述就可以那样在电 极24a处分离、裂解所需细胞。然后，如图11B所示，关闭软道18a并打开 软管18c，通过控制流经流动单元的液体流，在单元16中的不同电极上施加 偏压，使得细胞裂解物中的所需部分从U形管臂的40a移动到管臂40b。然 后，如在电极24b中，细胞裂解物被用来进行杂交或其它酶促反应。这种划 分空间的方法的另一个优点是避免了细胞裂解物中未洗净的杂质成分的 干扰。

图12A-D是可用于本发明的四种不同芯片设计的示意图。图12A所示 芯片设计是用来研究双向电泳和电裂解中电极的最佳直径的。我们相信， 通过采用由微电极覆盖更大面积的新设计的芯片，可以在更短的时间内 得到更高产量的所需细胞。

图12B表示了一种融合了如前所述的双向电泳和移动波加速特点的 芯片设计。图12B中的芯片设计是靠在双向电泳分离细胞(使用中央微电 极阵列)过程中引入移动波(使用full face power supply)来实现细胞悬 浊液的环形移动的。

图12C和D所示是用来测定移动波分离和传输细胞的芯片设计。

本发明的一些实施例对本发明的实现和应用方法进行了详细的描述， 它很明显的会被同领域技术人员所轻松掌握了，但是对本发明的某些改 变或修饰，并不分离开所附权利要求所要求保护的精神及范围。

相关申请说明

这是1996年9月6日提交的仍在审查中的专利申请序列号为08/709, 353的部分继续申请，其说明书全部内容引入本文作为参考。

联邦财政支援声明

此项发明系由美国政府支持并付诸实施的，具体的说是由，美国商 业部的领导下的高科技计划(Advanced Technology Program)中与Nanogen 公司签定的合同号为：95-08-009而决定。