作为纤维素材料产生细菌，已知的有醋杆菌属(Acetobacter)菌株例 如以BPR2001菌株为代表的木醋杆菌蔗糖发酵亚种(Acetobacter xylinum subsp.sucrofermentans)、木醋杆菌ATCC23768、木醋杆菌ATCC23769、 巴斯德醋杆菌(Acetobacter pasteruianus)ATCC10245、木醋杆菌 ATCC14851、木醋杆菌ATCC11142以及木醋杆菌ATCC10821、土壤杆 菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、八叠球菌属(Sarcina)、 假单胞菌属(Pseudomonas)、无色杆菌属(Achromobacter)、产碱杆菌属 (Alcaligenes)、产气杆菌属(Aerobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、Zeuglare、 利用NTG(亚硝基胍)等通过已知的方法改变这些细菌所产生的各类变体。
用于改善醋杆菌的纤维素生产效率的方法已在大量专利申请中提出， 包括Bioplymer Research Co.，Ltd.递交的那些专利申请。获得突变体的方 法以及利用昂贵的特定活性剂的方法在例如，JP-A-62-265990、 JP-A-63-202394、JP-A-63-74490、JP-A-2-238888、JP-B-6-43443、 JP-B-5-1718、JP-A-7-184677和JP-A-7-184675中有描述。控制搅拌下的 培养条件的方法公开在例如，JP-A-9-94094、JP-A-9-514136等中。
在上文所描述的已知的培养方法中，同时产生非常小量的水溶性多糖， 但几乎所有的作为主产物的纤维素材料被认为具有β-1，4-糖苷键，并且纤维 素结晶学中所用的Iα-结晶与Iβ-结晶的比率((Iα/Iβ)×100，以下称之 为Iα分数)被认为是64到72％(SCIENCE，Vol.223，283(1984))。Iα结晶 本质上具有低的表面活力如润湿性，因为当特定的晶面，尤其是(11-0) 晶面取向时，该晶面中的羟基密度低于Iβ结晶中的密度。因而，由传统微 生物例如醋杆菌产生的纤维素材料(其中Iα分数高达64到72％并且(11-0) 晶面取向)本质上具有低的表面活力。
在有些专利文献公开的实例中，在醋杆菌培养方法下生产纤维素为基 础的物质时，相对于作为碳源的糖的纤维素转化效率为30％或更高。不过， 可以认为实际水平的纤维素转化效率是大约20％几。这些已知的培养方法 就其操作而言很复杂，因为考虑到所用的是需氧的醋杆菌菌株的事实，旋 动培养需要特殊的特性。
一般地，利用旋动培养作为工业生产方法，而且产生的纤维素材料的 基本形态公开在美国专利5,144,021(1992)中。根据该美国专利，所述纤维 素具有球形或椭圆形、大小约为0.1到10mm的宏观结构，其内部结构为 交织的网络，因此认为所述纤维素材料具有在高湿时抗压性高的特征。然 而，高抗压性也意味着难以排水，因而干燥困难。此外，由于上述球形或 椭圆形宏观结构的四周不存在放射状延伸的原纤(fibril)，可以想到使该 宏观结构彼此均一地分散开需要相当的能量。此外，根据美国专利 5,144,021，结晶度不是太高，即70％或更低，因而可以想到该纤维素本身 的强度以及当与其它聚合材料组合时的性能会较差。
具有0.12到0.20的沉降压缩度(Sedimentaion compression degree) 的细菌纤维素松散物质公开在JP-B-2,877,676中。以0.1％细菌纤维素水悬 液具有动态粘度1000cp或更高(30℃，10rad/s)为特征的细菌纤维素公开 在JP-B-2,971,024中。这些公开，如JP-B-6-43443，表明细菌纤维素容易 截留住水，并且这种传统的纤维素材料具有高的增稠和分散效果，但缺点 是将所述材料加工成固体产品时需消耗相当能量。在另一方面，由醋杆菌 菌株产生的细菌纤维素在商业上仅用作声音振荡板。
已研究了作为食品添加剂的细菌纤维素的开发，但未导致真正的商业 化。这被认为部分地归因于虽然醋杆菌菌株产生的纤维具有直径细至几个 nm的突出特点，但它的宏观形态却仅是椭圆形，因而与其它纤维材料相 比远不利于加工的事实。此外，作为另一个原因，还认为可归因于细菌纤 维素未以真正有功能的形式在培养物中生产的事实。
本发明人通过16s-rRNA的基因分析发现与肠杆菌属(Entero bacter) 高度同源的微生物(CJF002菌株)产生纤维素样物质，并递交了将该微生 物用于石油三次回采的方法发明的专利申请(JP-A-2001-321164)。在该 专利申请中，将静止培养描述为优选的培养方法，并公开了利用该微生物 的产物封闭石油基岩中的水掠通道(water weeping channel)的方法，但 未公开与产生的纤维素样物质有关的各种碳源及所述纤维素样物质的详细 结构、功能等。

本发明人发现利用肠杆菌属纤维素产生细菌的培养物可产生新的纤维 素材料。这种新的纤维素材料几乎是球形的，最大直径为几个毫米，其中 大原纤(macrofibril)自中心向四周放射状形成，不同于传统微生物生产的纤 维素的椭圆形态。这种形状很容易从培养液中分离，通过过滤器洗涤纯化， 并分散形成次级产品。它可提供低能耗的生物方法，并具有表现出由区别 于传统材料的特殊形状引起的新功能的可能性。此外，本发明的新纤维素 材料具有非常高的结晶度，因而纤维素本身的强度以及与其它聚合材料组 合时的性能都很出色。
(1)本发明涉及球形纤维素材料，其中纤维素材料为通过β-1，4-型糖链 键构成的水不溶性多糖，结晶度为70％或更高，并且从中央向四周放射状 地形成大原纤。
(2)此外，本发明涉及纤维素材料，其中纤维素材料为通过β-1，4-型糖 链键构成的水不溶性多糖，葡萄糖单位在该水不溶性多糖中的组成比为85 ％到100％，而且纤维素结晶多形的Iα分数不小于45％且不大于63％。
(3)此外，本发明涉及根据上文第(1)或(2)项的纤维素材料，其中通过 粘度测量方法确定的纤维素cadoxene溶液的粘度平均聚合度为3500或更 高。
(4)此外，本发明涉及根据上文第(1)至(3)中任何一项的纤维素材料， 它通过培养肠杆菌属微生物、其突变体或其微生物传代培养物获得。
(5)此外，本发明涉及根据上文第(4)项的纤维素材料，其中上文描述 的肠杆菌属微生物是CJF002菌株。
(6)此外，本发明涉及生产根据上文第(1)至(3)中任何一项的纤维素材 料的方法，包括用选自由肠杆菌属微生物、其突变体和其微生物传代培养 物组成的组中的至少一种微生物以103到107/ml的量接种培养基，然后在 搅拌在不低于20℃且不高于45℃的温度下利用糖作为碳源培养所述微生 物。
(7)此外，本发明涉及根据上文第(1)至(3)项的纤维素材料和其它聚合 物材料和/或金属和/或金属氧化物的复合材料。
(8)此外，本发明涉及一类以葡萄糖、半乳糖和岩藻糖而非羧化糖作 为主成分的水溶性多糖，它通过用选自由肠杆菌属微生物、其突变体和其 微生物传代培养物组成的组中的至少一种微生物以103到107/ml的量接种 培养基，然后在不低于4℃且不高于30℃的温度下利用糖作为碳源培养所 述微生物获得。
附图的简短说明
图1是通过搅拌(转子搅拌)培养获得的本发明的纤维素材料的光学 显微照片(比例尺代表1mm)。
图2是通过搅拌(鼓泡通气)培养获得的本发明的纤维素材料的光学 显微照片(比例尺代表1mm)。
图3是本发明的纤维素材料的扫描电镜照片(比例尺代表3μm)。
图4是添加氧化铝时通过搅拌培养获得的本发明的纤维素材料/无机材 料复合材料的光学显微镜照片(比例尺代表5mm)。
图5是添加氧化铝时通过搅拌培养获得的本发明的纤维素材料/无机材 料复合材料的扫描电镜照片(比例尺代表3μm)。
图6显示本发明的纤维素材料的固态13C-NMR光谱；而
图7显示本发明的纤维素材料的广角X-射线衍射光谱。
实施本发明的最佳方式
作为优选的方面，本发明的新材料是纤维素材料，其特征在于该纤维 素材料是通过β-1，4-型糖链键构成的水不溶性多糖，由肠杆菌属微生物如 CJF002菌株、其突变体或微生物传代培养物产生，葡萄糖单位的组成比为 85到100％，结晶度为70％或更高，与由醋杆菌菌株产生的传统细菌纤维 素相比，纤维素结晶学中所用的Iα分数保持在低水平，并且形态为球形， 其中大原纤自中央向四周放射状地形成。
本发明的纤维素材料除了β-1，4-型糖链键，还可具有1，2-键、1，3-键和 1，6-键。这些化学键可以包括在一个分子链中，或者存在于通过氢键等与不 是纤维素(由β-1，4-吡喃葡萄糖重复链组成的聚合物)的水不溶性多糖的混 合态中。非葡萄糖的结构糖无特殊限制，并且包括各种类型的己糖、戊糖 和羧化糖，但常为半乳糖和甘露糖。
对于本发明优选的水不溶性纤维素材料，从结构上进行详细描述，其 Iα分数在45到63％的范围内，通常50％左右，这比醋杆菌菌株产生的纤 维素的Iα分数(即64到72％)小，并且结晶度为70％或更高，尤其是在 某些情况下，大于90％。
此外，本发明的纤维素材料由具有数10nm的非常小直径的原纤构成， 因而由该纤维素材料制备的片状材料具有非常大量的缠结点，因此它的机 械强度非常高。由醋杆菌菌株产生的纤维素的结构描述在美国专利 5,144,021中，但根据其权利要求，它的结晶度为70％或更小，因此可以想 到它的机械强度比本发明的纤维素材料低。本文所述的结晶度是由固态 13C-NMR测定的数值，并且其定义和测量的细节将在下文描述。结晶度通 常通过X-射线衍射测定，但对于传统上以及本发明的微生物产生的纤维 素，通过X-射线衍射测量结晶度不合适，因为这些情况下选择性地采取了 特定的晶面取向。
如果培养物中的碳源为糖蜜，葡萄糖单位的组成比下降，但不低于85 ％。此外，如果碳源为单独的蔗糖或葡萄糖，有极少数情况下葡萄糖单位 的组成比为100％，并且在大多数情况下，为大约98％。
因为Iα分数低并且在分子链中引入了半乳糖和甘露糖残基，本发明的 纤维素材料具有诸如提高的可加工性、与其它聚合物的合金形成、与金属 和金属氧化物的合金形成及与其它材料的粘着和识别或不识别蛋白的能力 等特征，这在以诸如透明性和机械强度为应用特征的传统细菌纤维素中是 根本不可能预期的。当然，这并不意味着本发明的纤维素材料不可以应用 于传统领域。
此外，本发明的纤维素材料具有纤维素II的晶体成分。纤维素II的晶 体表面具有其上选择性地出现羟基的晶面(11-0)以及其上选择性地出现氢 原子的晶面(110)，从而形成在本质上适于合金形成的晶体类型。
本发明的纤维素材料的葡萄糖单位的组成比可由作为碳源利用的糖组 分的比率以及培养条件来控制。原则上，如果用作为碳源的糖类型的数目 增加，在所得的纤维素材料中结构糖组分多样化。为增加葡萄糖组分的量， 可以利用葡萄糖作为碳源。
此外，本发明的纤维素材料可以通过应用同步培养制备成几乎具有相 同的聚合度。取出产品时的聚合度无特殊限制，但优选约300或更高。
如果需要本发明的纤维素材料具有机械强度，优选调整聚合度至3500 或更高。不过，本发明描述的聚合度是通过对纤维素应用cadoxene法获得 的数值，并且尤其当葡萄糖组成比低时，它是一个近似值。
本发明的纤维素材料的特征在于可以独立存在或连结在一起的、最大 直径为几毫米的基本上球体，它自中心向四周放射状地形成大原纤。每个 球体的大小和每个大原纤的形式可通过搅拌培养的条件控制。
对于搅拌培养，可以应用旋动培养(其中搅拌浆旋转)、摇床培养(其 中容器往复运动或旋转)以及通过鼓泡通气的搅拌培养。
本发明的纤维素材料的球体的一个实例是由球芯和自球芯放射状延伸 的锥形组分构成的，如图1所示。锥形组分和球芯在锥形组分的顶端结合， 并且在锥形组分的底端观察到纤维状物质。锥形组分的高度几乎与球芯的 半径相等。这种形式通过低速搅拌培养获得。低速搅拌培养条件取决于装 置，尤其是搅拌桨的大小和形状，因而无法绝对限定。如果搅拌速度太低， 则引起问题，以至于所得的纤维素材料形成整个的凝胶状物质，并与搅拌 桨纠缠在一起。如果搅拌速度太高，则得到细片样的纤维素材料，但其形 状可以是浆状、鳞片状等不确定形式，且大小不均一。作为一个实例，当 利用直径为60mm的搅拌桨时，在50rpm到200rpm的旋转速度下获得 图1所示的形态。另一个实例示于图2中。大原纤自具有略小于1mm的 直径的球芯放射状线性延伸约1mm长度。这种形态通过鼓泡通气获得， 并且吹气量为每1m3培养液1m3/分的空气。
球体的球芯大小为0.1mm到数毫米，但如果生产条件相同的话可以 变得非常一致，如图1所示。球体通过粗的网孔很容易被分离和纯化。例 如，球体可以由简单压缩被相当可观地脱水，以致它可以就此被加工成产 品(包含或多或或少的水)，或者烧蚀(ablate)时容易被干燥。根据最终的 用途，蛋白去除操作可能是非必需的，这导致相当可观的费用减少。如果 需要蛋白去除操作，可以通过蛋白酶、表面活性剂处理或通过氧化漂白除 去蛋白。在某些情况下，可以利用低浓度的碱性水溶液。此外，由醋杆菌 菌株产生的传统纤维素是鳞片状的细片样凝胶物质，因而会容易地导致网 筛阻塞，这样难以实施上文所述的步骤。
微观上，球体由各具有20到100nm大小的微纤维组成。因为球体由 这些微纤维组成，球体的表面积很大。由氮吸收法(BET法)测量的表面 积大至约50到150m2/g，这约为普通浆表面积大小的100倍。由于非常大 的表面积，本发明的纤维素材料的球体由于它的毛团样形式适于用作载体、 吸附剂等，并且可直接填充到柱子等中。本发明的水不溶性纤维素材料在 形态上显著不同于由醋杆菌菌株产生的传统纤维素，后者实质上为凝胶， 需要相当的能量烧蚀和干燥，因此，本发明材料从工业观点看是有价值的。
具有毛团样形式作为基础形态的球体的直径可以根据接种细菌的初始 浓度、培养溶液的大小和搅拌速度凭经验确定。
可以选择接种细菌合适的初始浓度，合适的浓度为大约103到107/ml。 培养基的pH无特殊限制，范围为2.2到9.5，优选5.0到8.0。合适的温度 范围为20到45℃。在培养产生本发明的纤维素材料的过程中，下文所述 的本发明的水溶性多糖同时得以生产，并且优选将培养维持在高温如20℃ 或更高，以提高纤维素材料的产率。
微观水平(如通过电子显微镜观察)上球体形态为特征性的形态，其 中大量的扁平微纤维高度交织在一起，并且相分离结构中的圆孔相互连接 (图3)。这里，相分离中的圆孔是指在聚合物颗粒能够形成之前，即当 聚合物浓度为临界浓度或更低时，在不良溶剂中形成的扁平孔结构。当不 良溶剂中聚合物浓度大于临界浓度时，产生聚合物的初级颗粒，形成颗粒 连接在一起的结构。美国专利5,144,021(1992)中描述的细菌纤维素具有与 上述结构相似的结构，初级颗粒连接在一起。
由于此种特征性的形态，纯化的本发明的纤维素材料特点在于当它重 新分散在水中时，该物质具有非常低的浆液粘度，并且在二次加工中能够 被容易地处理，与传统上来源于醋杆菌菌株的所谓细菌纤维素不同。例如， 对于来源于醋杆菌菌株的细菌纤维素的水分散体(0.1wt％)，沉降压缩度 为0.12到0.20，而本发明的纤维素材料的沉降压缩度低至仅为小于0.12。 这意味着湿压缩性高。因此，例如，本发明的纤维素材料在产生非常薄的 片层方面很有利，并且仅需要低能干燥。这里的沉降压缩度是浆液在1700 G离心30分钟后的纤维素沉降体积(Bml)与浆液原始体积(Aml)的 比率(B/A)。此外，对于来源于醋杆菌菌株的细菌纤维素，其烧蚀后物 质的0.1％水悬液的动态粘度为1000cp或更高(30℃，10rad/S)，而本发 明的纤维素材料低至仅为200cp。由于此类特点，本发明的纤维素材料能 够非常容易地加工成各类片和分离器。这些特点被认为主要由它的特征性 形态引起，但它们也可能与OH基团在微纤维表面的取向以及50到60％ 的小Iα分数有关。
本发明的新纤维素材料适于作为与非纤维素聚合材料或无机物例如金 属或金属氧化物形成复合材料的材料。
可用于形成复合材料的聚合物包括，但不限于，例如，一般的疏水聚 合物例如聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)和聚苯乙烯(PS)，亲水聚合物例如聚环 氧烷烃(PAO)，以及超级工程塑料例如聚砜(PSu)、聚酰胺(PA)、聚 酯(PET)、聚酰亚胺(PI)。可以制备与这些聚合物的合金。尤其是，可 以调整本发明的纤维素材料使之具有比来源于醋杆菌菌株的纤维素更低的 Iα分数，从而改善纤维素材料的OH基团的取向平衡，并且原则上它可以 容易地与各类聚合物组合。半乳糖被认为可以选择性地识别蛋白等，因而 半乳糖作为结构糖的存在使得与蛋白等的组合更容易。因而，所述纤维素 材料在存在小量亲水溶剂和/或疏水溶剂时相对容易与各类聚合物组合，并 且可以开发作为有用的功能性材料或工业材料。当然，来源于本发明所用 的细菌的蛋白可用作为组合材料，由此有助于材料以及组合方法的费用降 低并同时达到培养系统的有效利用。此外，本发明的纤维素材料具有大小 约50nm的微纤维作为结构单位，因而可能在纳米水平形成复合材料。
用于与本发明的纤维素材料、水溶性多糖或这些混合物形成复合材料 的无机物例如金属和金属氧化物的实例包括金、银、铜、铂、钯、铝、铁、 铋和镁或其合金及其氧化物，它们可以是磁性材料、电介质材料、反应催 化剂等。形成复合材料的方法可以包括，但不具体限于，利用高加速度球 磨机的方法、利用班伯里混合器的方法、实施多次反复的高压挤压的反复 滚动法、以及在聚合物溶液中形成复合材料的湿分散法。
作为形成复合材料的合适的方法，最初将无机物分散于培养液中，或 在开始培养后的某个时间点向培养液中添加无机物，由此产生新的由微生 物产生的基本上保留本发明的形态的纤维素/无机物复合材料。适于使用的 无机物的实例包括能够在pH7或更高的的电荷零点时形成胶体的无机氧 化物或氢氧化物，例如α-氧化铝、γ-氧化铝、勃姆石、三羟铝石、氧化铍、 一氧化镉、氢氧化镉、氢氧化钴、氧化铜、氢氧化铁、α-氧化铁、γ-氧化 铁、纤铁矿、氢氧化铅、氧化镁、氢氧化镁、氢氧化锰、氧化铊、氧化钒、 氧化锌和氧化镧。此外，作为其它实例，能够在pH7或更低的电荷零点时 形成胶体的无机氧化物和氢氧化物也是适用的，例如铝化合物象水铝石和 三水铝石、氢氧化铁例如getite、氧化硅、氧化锡、氧化钛、氧化锆、非碱 金属钛酸盐、非碱金属锆酸盐等。由于它们几乎不增加培养基的粘度，当 向培养基中加入时它们的量和颗粒大小不受限制，并可以由本领域熟练技 术人员依据培养技术适当地确定。不过，如果量或颗粒大小很大，并且期 望与所产生的纤维素材料均一分散地混合时，应当增强透气性和搅拌。这 些复合材料可使无机物特异性的功能有效展示。如果这些无机材料与纤维 素材料以复合材料的形式混合，不仅具有促进细微分散的效果，并可将无 机材料的加强作用赋予纤维素材料。例如，与氧化铝的复合材料可用作为 研磨材料、催化剂载体、气体净化过滤器、液体净化过滤器、分离膜、用 于有机溶剂(尤其是基于有机氯的溶剂)的吸附及分离材料、油墨吸附材 料、湿度控制材料等的原料。与氧化钛的复合材料可用作为UV吸收剂和 光催化剂材料。与碳酸钡的复合材料可用作为X-射线遮蔽体和铁电物质的 原料。与氧化锆的复合材料可用作为低热导材料和高折射材料的原料。与 氧化钴的复合材料可用作为顺磁/低电导材料的原料。与钛酸钡的复合材料 可用作为铁电物质的原料。与γ铁酸盐的复合材料可用作为铁电物质的原 料。此外，与氧化锌的复合材料可用作为催化剂的原料、感光材料的基材 以及橡胶硫化加强材料的原料。
在根据本发明的培养方法中获得的纤维素材料/无机物复合材料可以 以复合材料的形式从培养基中分离，并且能够以原复合材料的状态用作为 最终的原料，即使是在最后阶段。因此，每单位质量产品的废液处理费用 被相当可观地降低了。
这些复合材料能够更有效地表现出添加的无机氧化物的功能。例如， 与α-氧化铝、γ-氧化铝、氢氧化钴、氧化钒等的复合材料能够用作为水介 质中使用的各类催化剂载体和纳米分散研磨基材；与氧化锌的复合材料可 用作为场致发光分散基材；与氧化钛的复合材料可用作为光催化剂基材； 而与钛酸钡的复合材料可用作为高电介质基材。
本发明的纤维素材料具有多种特点，例如精细的大小为50到100nm 的微纤维结构，极高的比表面积，出色的蛋白吸收性、小的线性膨胀系数 和高的弹性因子，因此除了此处所述的合金形成以外，还可用于多种用途。 例如，作为应用，它可开发成无纺织品、吸收剂、缘于与蛋白的尤其强的 相互作用的蛋白吸收剂、分离膜、人造皮肤、载体、水保持剂、增稠剂、 分散/悬浮稳定剂、食品材料等。它也可以用于微孔膜、泡沫、橡胶、乳胶、 粘合剂等中作为复合材料的结构组分。对于这些应用，由醋杆菌产生的传 统纤维素可在一定程度上使用。不过，由于本发明纤维素材料具有低的Iα 分数，由此在表面具有高密度的OH基团并具有高的表面活性，而且含有 半乳糖残基和甘露糖残基，显然，根据本发明的纤维素材料可以与其它材 料强烈地相互作用，因而在上文所述的应用中比传统纤维素更为有效。
下文将描述生产本发明的纤维素材料的方法。
属于肠杆菌属的纤维素产生细菌可用作为本发明的纤维素材料产生细 菌。例如，可以利用CJF002菌株、其微生物传代培养物、通过公知的方 法利用NTG(亚硝基胍)等突变这些微生物产生的各类突变体等。这里， CJF002菌株是指以“肠杆菌种CJF-002”最初于2000年3月29日保藏在 国立高级工业科技研究院，国际专利微生物保藏所(IPOD)(位于Central 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，日本)的肠杆菌属微生物菌株，该菌株 于2002年11月1日从最初保藏转为根据布达佩斯条约的保藏，保藏号 “FERM BP-8227”。
有利的是，能够产生本发明的纤维素材料的细菌为兼性需氧菌，因而 不论存在或不存在氧气(空气)都能够培养。对于培养基，可以利用各类 合成及天然培养基。优选含糖的培养基。碳源包括葡萄糖、果糖、半乳糖、 麦芽糖、蔗糖、果聚糖、甘露醇、山梨糖醇、赤藓糖醇、甘油、乙二醇、 淀粉、糖浆、玉米浆、麦芽汁和淀粉水解物。在尤其是CJF002菌株的情 况下，可以将传统醋杆菌菌株不能利用的、廉价的、作为所谓糖蜜的柑橘 糖蜜、甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、甜菜汁、糖蔗汁、柑橘类植物等的各种果汁 有机酸，单独使用或者使用其两种或多种的混合物。对于氮源，以下物质 可以单独使用或者使用其中两种或多种的混合物：无机氮源例如铵盐和硝 酸盐，有机氮源例如发酵培养基、蛋白胨、大豆粉、肉膏、酪蛋白、尿素 和豆浆。
对于培养基，适当时可以单独使用以下物质或者使用其中两种或多种 的混合物：氨基酸、维生素及脂肪酸作为有机痕量营养，或者磷酸盐、铁 盐、锰盐及其它金属盐作为无机盐。
由于用于本发明的肠杆菌属微生物如CJF002菌株微生物、其突变体 或传代培养物为兼性需氧菌，由此不论有氧或厌氧条件，培养都得以发生， 产生本发明的纤维素材料。培养形式不受限制，并且原则上，培养微生物 的公知方法可用于实施所述培养。例如，可以任意选择、组合并使用各种 手段和装置，例如搅拌罐，它包括如发酵缸和罐、带挡板的摇瓶、Sakaguchi 摇瓶和气升式搅拌罐、泵驱动的发酵液循环及摇瓶培养(其中容器本身被 往复运动和旋转)。此外，根据需要可以进行搅拌培养同时吹气。对于吹 气，可以使用例如含氧气体如空气，或者使用例如无氧气体如氩气或氮气。 此类气体可由本领域熟练技术人员根据培养系统的条件适当选择。
此外，在培养方法中，可以使用公知的方法，例如，分批发酵法、反 复分批发酵法、连续发酵法等。在本发明中，特别优选的培养方法是搅拌 下的有氧培养。在静止培养中，本发明的纤维素材料通常以凝胶形式产生， 因而其纯化和烧蚀困难。不过，应当特别强调的优点是在用CJF002菌株 微生物、其突变体或传代培养微生物生产纤维素材料时，不同于醋杆菌菌 株，细菌埋于所产生的凝胶中的可能性很低，因此与醋杆菌菌株的生产相 比，纯化相对容易。
当搅拌培养低速进行时，这种特殊特点提供了优势。可以产生图1的 照片中所示的非常特殊的独立释放的材料(毛团样形式)。这高度有利， 因为只通过漂洗就可以除去细菌，根据最终用途这导致费用的显著降低。
在实际培养中，适当时细菌的初始浓度可以选择，但合适的浓度为约 103到106/ml，优选约103到106/ml。培养基的pH不受限制，但优选为2.2 到9.5，更优选7左右。合适的温度范围为20到45℃。在本发明中，尤其 是，如果利用CJF002菌株，在培养生产所述纤维素材料的过程中同时形 成一类水溶性多糖，并且优选将培养维持在高温如30℃或更高，以提高纤 维素材料的产率。
根据本发明的另一种新材料为一类以葡萄糖、半乳糖和岩藻糖(它们 各自的含量为30％左右)而非羧化糖作为主成分的水溶性多糖。产生此类 水溶性多糖是本发明所用微生物的培养中的特征之一。例如，通过单纯降 低培养温度到约30℃或更低，可产生作为主要产物的水溶性多糖类。为何 使用术语“水溶性多糖类”的原因在于如果进行更精确的溶解性分离，它 可以再分为数种水溶性多糖。不过，实践中，由于精细分离可能是非必需 的，并且在许多场合下以混合态利用这些多糖就费用减少而言更为有利， 所以有意识地将所述材料描述为水溶性多糖类。术语“水溶性”包括表现 出高膨胀性质的材料。
象本发明的水溶性多糖(类)一样，在链中掺入C6位由甲基取代的脱氧 衍生物例如岩藻糖的情况是独一无二的。如果该水溶性多糖用普通的交联 剂交联，它们可以高度吸收水等而成凝胶，并且通过被施加到另一种材料 的表面或者被掺入到另一种材料中然后被铸型，它们可容易地用于生物相 容性材料、药物递送系统(DDS)的介质以及能够/不能够识别细胞的药剂 中。此外，本发明的水溶性多糖类具有分散不同材料的出色能力，并在盐 存在时具有强的分散保持力，而这是基于纤维素的分散剂经常遇到的问题。 因而，这类水溶性多糖可用于包括美容在内的广泛的工业应用。当然，基 本地，它可以与其它材料如聚合材料形成合金，如所描述的水不溶性纤维 素材料那样。
本发明的水溶性多糖类可以在与先前描述的用于培养产生纤维素材料 的培养基实质上相同的培养基中产生，但是如果培养在低的培养温度如低 于20℃的温度下进行，它作为主要产物产生。对于碳源，蔗糖比葡萄糖更 优选。在这种情况下，纤维素材料或多或少地产生。水溶性多糖类与纤维 素材料的生产比率在低温下升高，但在低于4℃的温度下，任何一种产物 几乎都不产生。由于分离/产生此类溶解在培养基中的多糖需要巨大的能量 和费用，该类多糖有必要高浓度地存在于培养基中。
对于从培养液中纯化通过本发明的方法获得的纤维素材料、复合材料 以及水溶性多糖类的方法，可以应用各种方法，并非限制性的，有例如通 过过滤净化以及通过离心沉降倾析。纯化程度可根据应用适当选择，并且 根据应用可以存在来源于微生物的蛋白、培养基成分等。在某些情况下， 来源于微生物的蛋白的存在可为提高与其它成分的粘着或为其它目的带来 更为有效的结果。纤维素材料和水溶性多糖类可以混合。
现在将通过实施例进一步具体描述本发明。此外，下文将描述鉴定和 评价由本发明的培养方法产生的纤维素材料等的方法。
(1)分析纤维素材料和水溶性多糖类的冻干品的糖组分
用商业上可获得的纤维素酶水解纤维素材料的冻干品(水解度约75 ％)。同时，用无机酸降解水溶性多糖类的冻干品，并用纤维素酶进一步 水解残余物。所得的降解物根据下文所描述的条件分析中性糖和糖醛酸。
(i)中性糖
利用Shimadzu公司生产的HPLC装置(LC-9A)和Tosoh公司生产 的柱子(TSK-gel Sugar AXG：φ4.6mm×150mm)，注射样品，然后利用 0.5mM的硼酸钾缓冲溶液作为洗脱剂以0.4ml/分洗脱。利用1％精氨酸和 3％硼酸作为柱后标记。流速为0.5ml/分并且反应温度为150℃。
(ii)糖醛酸
分析以与分析中性糖相同的方式进行，除了使用Shimadzu公司生产 的柱子(Shinpal ISA-07：φ4.6mm×250mm)，并且洗脱和柱后标记的流 速均变为0.8ml/分。
(2)纤维素材料的结构糖的键合形式
根据常规方法使纤维素材料的冻干品充分甲基化，用三氟乙酸水解成 单糖单位，然后通过乙酸酐-吡啶法还原乙酰化，以转化成部分甲基化的糖 醇的乙酰衍生物(部分甲基化的乙酸糖醇酯)。利用气相色谱 (Hewlett-Packard生产的HP 5890A，Supelco日本有限公司生产的SPB-5 柱子，载气：He，检测模式：FID)和气相色谱-质谱分析(JEOL有限公司 生产的JMS DX-303，电离，EI法)由甲基化分析估计纤维素材料的键合形 式。
(3)纤维素材料的Iα分数
固态13C-NMR光谱测量利用Bruker有限公司生产的DSX 400分光计 和CP/MAS法进行。接触时间为1ms，脉冲间隔5s，90°脉冲4.8μs，累 积数目3000并且旋转速度4000Hz。由所得的固态13C-NMR光谱(图6) 和下列公式(参见Macromolecules，17，1465(1984))计算Iα分数。图 6显示了利用葡萄糖作为碳源获得的实施例1中纤维素材料的固态 13C-NMR光谱。该光谱显示作为纤维素材料的结构糖单位的葡萄糖单位在 C4-碳处的碳。Iα组分出现在峰2(Iα/2+Iβ/2)和峰3(Iα/2)，并且Iα组 分的分布比如括号中所示各为0.5。Iβ组分出现在峰1(Iβ/2)和峰2 (Iα/2+Iβ/2)，并且Iβ组分的分布比如括号中所示各为0.5。因此，Iα分 数可由下列公式确定：
           Iα分数＝(I3×2/(I1+I2+I3))×100
I1：峰1的积分强度，I2：峰2的积分强度，I3：峰3的积分强度。
(4)纤维素材料的晶面取向
晶面取向由广角X-射线衍射(图7)和下列公式(Polymer Journal， 7，157(1975))计算：
             晶面取向＝(I11-0/I200)×100
I11-0：(11-0)晶面的衍射强度，I200：(200)晶面的衍射强度。
(5)纤维素材料的聚合度
分子量M由通过cadoxene溶液的粘度测量方法获得的特性粘数(η) 和下列公式(参见European Polymer Journal，1，1，(1965))计算，然 后除以165以确定聚合度。图7显示了利用葡萄糖作为碳源获得的实施例 1中纤维素材料的广角X-射线衍射模式。
                [η]＝3.85×10-2M0.76
(6)结晶度
固态13C-NMR光谱利用Bruker有限公司生产的DSX 400分光计通过 CP/MAS法测量。接触时间为1ms，脉冲间隔5s，90°脉冲4.8μs，累积 数目3000并且旋转速度4000Hz。在所得的固态13C-NMR光谱的C4-碳 峰中，高场侧的峰被定义为非晶形组分(峰面积A)，而低场侧的峰被定 义为结晶组分(峰面积B)。结晶度χc由下列公式(参见Polymer Journal， 17，707(1985)(K.Kamide，K.Okajima，K.Kowsaka，T.Matsui)确定：
                  χc＝(B/(A+b))×100
实施例1
使含有4.0％蔗糖、葡萄糖或中国制造的甜菜糖蜜的多糖生产培养基 (下文称之为PPM培养基。Polysaccharide-production-medium，Akihiko Shimada，Viva Origino，23，1，52-53，1995)经受高压蒸气灭菌处理。然后， 将1000ml培养基投入内体积为2000ml的发酵缸中，以104 CFU/ml的量 接种CJF 002菌株，并在低速(70rpm)搅拌下于30℃在温和吹泡通气下 培养2天。在所有类型的培养中，获得了如图1所示的具有自中心向四周 放射状地形成的大原纤的球形纤维素材料。具体的，它由球芯和自球芯放 射状延伸的锥形组分构成。锥形组分和核在锥形组分的顶端接合，并在锥 形组分的底端观察到纤维状物质。锥形组分的高度几乎与球芯的半径相等。 将它们用网筛(50目)过滤、漂洗、压缩、然后浸入1％的NaOH溶液中、 灭菌、再中和、漂洗和压缩，由此可容易地得到含水的白色絮凝体。由葡 萄糖培养获得的纤维素材料具有图1所示的形状，并且直径一般是均一的， 并且液体渗透性出色。上述的过滤、漂洗、压缩等步骤非常令人满意。如 下文所述，由醋杆菌菌株产生的传统纤维素是具鳞的细片形凝胶物质，因 而导致网筛容易堵塞，从而难以实施上述步骤。发现只通过漂洗即可除去 几乎所有的细菌，而无需浸泡在1％的NaOH溶液中。
结构糖组分、结晶度、Iα分数以及晶面取向分析的结果显示在表1中。 显然，β-1，4-键占主导地位，结构糖中葡萄糖含量为87.8到99.6％，结晶 度为80％或更高，而Iα分数至多为62％，且平均57％。Iα分数低于比较 实施例2中由醋杆菌菌株产生的纤维素的事实可归因于共同存在结构与仅 由葡萄糖构成的真正纤维素相近的水不溶性多糖。非葡萄糖的糖组分主要 是半乳糖和甘露糖。基于糖的水不溶性纤维素材料的产率为10到15％。
实施例2
将经过高压蒸气灭菌操作的含2.0％葡萄糖的一立方米(1m3)多糖生 产培养基(Polysaccharide-production-medium，Akihiko Shimada，Viva Origino，23卷1期，52-53页，1995)投进3m3的培养罐中，以2×104CFU/ml 的量接种CJF 002菌株，以1m3/分的通气速率由培养罐底部吹气，并于 30℃培养24小时。每隔1小时用稀释的NaOH溶液调节，从而培养物中 的pH为7。培养完成后，通过向培养基中吹入高压蒸气灭菌，粗网过滤， 进行离心脱水处理，然后用1％苛性钠在90℃溶菌处理数小时，中和，漂 洗并脱水以获得含大约10wt％的纤维素的湿饼。饼直接用水稀释，并用光 学显微镜观察它的宏观结构。结果显示在表2中。图2显示了与图1中基 本上相同的球形，其中大原纤自中心向四周放射状地形成，但由于培养条 件不同，它们在原纤的形状和大小上有差别。具体地，这种从球芯以约1mm 的长度放射状地线性延伸的大原纤的直径略微小于1mm。与通过搅拌培 养醋杆菌菌株获得的鳞状细片形或不确定形式(K.Watanabe，Cellulose 5， 187(1998))相比，本发明微生物产生的纤维素具有独立的或者某种程度 上连接的独特结构，其中大原纤从中心放射状延伸，因而它绝对是一种新 的由微生物产生的纤维素材料。
此外，用电子显微镜观察了通过冻干上述湿饼获得的样品的微观结构。 结果显示于图3。通过搅拌培养醋杆菌菌株获得的细菌纤维素是网状的， 但它的微纤维本身是圆形的，结构与其中产生的聚合物的瞬时粒子通过相 分离连接的结构(参见美国专利5,144,021，图2)接近。在另一方面，如 图3所示，本发明的产品一般是扁平的，并具有特征性形态，其中圆孔如 在相分离结构中那样互相连接，而且在微纤维之间具有高得多的相互连接 程度。此外，分析了本发明的纤维素材料的结构糖的键合形式，结果发现 β-1，4-糖苷键占总键的96％或更多，并且纤维素在结构糖中占主导地位。 此外，结晶度为90％或更高，并且从X-射线衍射中发现II-型结晶形式或 多或少地存在。
实施例3
将具有3％葡萄糖浓度的1000毫升PMM投进总体积为5000ml的小 发酵缸中，然后无菌接种CJF002菌株(2×104CFU/ml)，并向其中加入 α-氧化铝(平均粒径0.5μm，300mg)，并在100rpm的搅拌转速和600ml/ 分的通气速率下搅拌培养48小时。培养基灭菌、脱水、用碱洗涤、中和、 洗涤并脱水，获得纤维素材料/无机物复合材料。其光学显微照片显示于图 4中。对于具有添加的氧化铝的复合材料，清楚地观察到相似的形态，即 在巨大球芯周围具有放射状大原纤的新形态。该球体的大小为不存在氧化 铝时球体的两倍或更大。在本实施例中，如果氧化铝完全掺入到产生的纤 维素材料中，氧化铝的含量以体积分数计约为1/25。纤维素/无机物复合材 料冻干品的电镜照片显示在图5中。发现不确定形状的氧化铝固定在高度 蜘网般的结构区域上。对这种冻干品进行数次再分散处理，并用电子显微 镜再次观察。结果发现固定的氧化铝几乎未从纤维素微纤维中分离或脱离。
实施例4、5和6
分别独立混合5克α-氧化铝(实施例4)(平均粒径0.5μm)、5g锐 钛矿型氧化钛(实施例5)(粒径0.5μm)和5g金红石型氧化钛(实施 例6)(粒径0.5μm)并各自分散于500ml具有2％葡萄糖浓度的PMM 中，然后无菌装进总体积为2000ml的各自的烧瓶中，接种CJF002菌株 (2×104CFU/ml)。振荡培养以200rpm的摇速进行18小时。不进行通 气和pH调整。灭菌后马上测量葡萄糖消耗量，发现葡萄糖消耗量有很大 差别，α-氧化铝为94％、锐钛矿型氧化钛为36％而金红石型氧化钛为21 ％。这可能归因于后两种材料的表面是碱性的，而前一种材料的表面是酸 性的。用光学显微镜观察所得的纤维素材料/无机物复合材料，结果在每个 实施例中均观察到具有自中心向四周放射状形成的大原纤的球形。在较少 消耗葡萄糖的氧化钛的情况下，纤维素的量几乎与氧化铝的情况相等。因 此，葡萄糖向纤维素的转化效率似乎提高了。
实施例7和比较实施例1
实施例2中获得的微生物产生的新纤维素材料湿饼用水稀释，使纤维 素含量为0.1wt％，并用TK匀浆机以简单方式分散以获得分散体(实施例 7)。商业上可获得的由Fujicco有限公司生产的Nata de coco(由醋杆菌 菌株通过静止培养获得的细菌纤维素pericle)同样地用TK匀浆机以简单 方式分散以获得0.1wt％的纤维素分散体(比较实施例1)。这些分散体的 沉降压缩度通过本说明书描述的方法测量。结果发现比较实施例1中的沉 降压缩度为0.20或更高，而本发明实施例7中的产品为0.08。这意味着后 者更容易压缩。类似地，利用B-型粘度计在10/SEC的旋转速度下测量动 态粘度。本发明的产品具有200cp的动态粘度，而比较实施例1的产品具 有600cp的动态粘度。也就是说，可以认为本发明的新微生物产生的纤维 素材料在干燥能力和次次加工性能方面比已知的所谓细菌纤维素更为有 利。
实施例8
根据实施例1中描述的培养方法，利用逐步添加葡萄糖溶液使培养基 中的葡萄糖浓度为1％的方法，于15℃进行4天培养。在15℃的温度下， 几乎没有纤维素材料产生。在培养液高压灭菌后，用网筛(50目)分离并 取出些许产生的纤维素材料，并通过离心分离沉淀除去细菌。浓缩培养滤 出液至原始体积的一半，然后投入三倍于浓缩滤出液体积的丙酮溶液中， 同时搅拌。所得的沉淀用网筛过滤。滤出的物质以10％的浓度再次溶于水 中。添加甲醇和乙醇后该溶液不容易产生沉淀。从重溶的溶液中除去残渣。 然后用三倍于该溶液体积的丙酮再次析出沉淀。滤出的物质用水/甲醇混合 物(30％甲醇)洗涤获得期望的材料。期望材料的结构糖组成显示于表2。 发现期望的材料含有半乳糖、岩藻糖和葡萄糖作为主成分，并含有糖醛酸 成分。
实施例9
利用中国制造的甜菜糖蜜作为碳源按照与实施例1中相同的方式进行 培养。培养温度为30℃。培养完成后，培养基于120℃高压灭菌20分钟。 原样干燥灭菌的培养液以获得纤维素材料和水溶性多糖类的混合物。混合 物中纤维素材料与水溶性多糖类的比率(纤维素材料/水溶性多糖类)为 6/5。
实施例10和比较实施例2
除了利用葡萄糖作为碳源并且培养温度为40℃之外，以与实施例1中 相同的方式获得具有与图1所示的相似形态的纤维素材料(实施例10)。 以与实施例1中相同的方式，将所获得的纤维素材料用网筛过滤，漂洗， 压缩，然后浸入1％的NaOH溶液中，灭菌，然后再中和，漂洗和压缩， 获得含水的絮凝体。该纤维素材料在网筛中的液体渗透性出色，因此这些 过滤、漂洗、压缩等步骤可以相当容易地进行。之后，用双轴捏和机 (Kurimoto有限公司生产的KRC Kneader(商标))在200rpm于140 ℃同时干燥并压碎絮凝体。将所得的干粉分散在四氢呋喃(THF)中，然 后将聚砜(分子量5,000)溶解在其中。聚砜占THF、纤维素材料和聚砜 总量的百分比为8wt％，而纤维素材料的百分比为0.8wt％。将所得的聚 砜溶液/纤维素材料分散体液体以500μm的厚度浇铸到玻璃板上，并干燥 以获得纤维素/聚砜膜。所得的膜的线性膨胀系数为19ppm，它约为聚砜 线性膨胀系数(即55ppm)的1/3。纤维素材料本身的线性膨胀系数为5 ppm，而且随复合材料在令人满意的水平形成，合金材料的线性膨胀系数 下降并变得接近5ppm。
作为比较实施例2，培养醋杆菌菌株以获得纤维素。利用标准条件和 Hestrin-Schramm培养基(参见S.Hestrin和M.Schramm，Biochem，J.，58， 345(1954))，培养在pH为6，温度为28℃且通气搅拌下进行。比较实 施例2中所获得的纤维素材料为不确定的鳞状细片形并且部分地凝胶化， 因此它堵塞网筛，因而难以通过过滤、冲洗、压缩等步骤。比较实施例2 中所获得的纤维素材料的结构和组成显示于表1。对于糖组成，葡萄糖含 量为100％，且链键全是β-1，4-键。该纤维素材料具有高的Iα分数(即69 ％)和高的晶面取向。利用比较实施例2中获得的纤维素材料，以与实施 例10中相同的方式得到了纤维素/聚砜膜。该膜的线性膨胀系数为35ppm， 这明显大于本发明的膜。这归因于比较实施例的纤维素材料的表面活性 (OH基团的密度)太低以至于不足以形成复合材料的事实。
[表1]   碳源   结晶度   (％)    Iα分数    (％)     晶面     取向     (％)             结构糖组分   1-4键形   式的分数   (％)   基于糖   的产率   (％)  Glc  Gal  Man  Ara   实施例1   蔗糖   85    59     91  97.8  1.7  0.5  0   98   12   葡萄糖   91    62     92  99.6  0.3  0.1  0   99   15   甜菜糖蜜   82    50     85  89.7  8.7  1.2  0.4   95   10   比较   实施例2   葡萄糖    69     90  100  0  0  0   100   5
Glc：葡萄糖，Gal：半乳糖，Man：甘露糖，Ara：阿拉伯糖
[表2]   碳源                                 结构糖组分(％)     Rha   Rib   Man   Ara   Fuc   Gal   Xyl   Glc   葡萄糖     0.5   0   2.9   0   33.6   33.0   0   30.1
Rha：鼠李糖，Rib：核酮糖，Man：甘露糖，Ara：阿拉伯糖，Fuc：岩藻糖，Gal：半乳糖， Xyl：木糖，Glc：葡萄糖
工业实用性
本发明的纤维素材料具有高的纤维状原纤表面活性，并且由于它的形 态学特点，是出色的复合材料的原料，可用作为组合成分的稳定性赋予剂、 微量过滤的分离介质和具有稳定形态结构的片/粒状材料。此外，本发明的 纤维素材料/无机物复合材料在基本形态上与非复合纤维素材料等同，并且 不仅可表现出所含无机物的特异性功能，而且提供由于它的形态所产生的 新功能，从工业角度看极其有意义。
在如同本发明的水溶性多糖类的链中掺入葡萄糖的C6-甲基基团脱氧 衍生物例如岩藻糖的情况是独一无二的。如果该水溶性多糖用普通的交联 剂交联，它们将高度吸收水或其它溶剂变成凝胶，并且如果它们被施加到 另一种材料的表面或者被掺入到另一种材料中然后被铸型后，可容易地用 于生物相容性材料、DDS介质以及能够/不能够识别细胞的试剂中。此外， 本发明的水溶性多糖类具有分散不同材料的出色能力，并在盐存在时具有 强的分散保持力，而这是基于纤维素的分散剂经常遇到的问题。因而，此 水溶性多糖类可用于包括美容在内的广泛的工业应用。
纤维素材料和水溶性多糖类可以与其它材料如聚合材料、金属和金属 氧化物组合用于制备合金。