在人和其他哺乳动物的免疫系统中，IgE介导Ⅰ型超敏反应。它是 对某些食物、药物和环境过敏原产生的过敏应答，其表现为以下症状， 过敏性鼻粘膜炎、哮喘、过敏性皮炎、和过敏反应。目前治疗过敏症 的方法仅存在有限的应用，即试图用已鉴定的过敏原使遗传性过敏症 个体脱敏或者试图用治疗性化合物改善正发作的过敏反应。基于过敏 原的脱敏免疫治疗的缺陷包括难以鉴定相关过敏原和应用已鉴定过敏 原常导致不利反应(世界卫生组织和国际免疫学联合会工作组，柳叶 刀，1989；i:259-261)。缓解过敏症的其他治疗为应用治疗化合物阻 断导致过敏反应的急性炎性级联反应。这些化合物包括抗-组胺剂、解 充血剂、β2拮抗剂和皮质类固醇。抗-组胺剂、解充血剂、和β2拮抗 剂在过敏性级联反应中作用于IgE活动的下游，使它们成为针对过敏症 状的缓解性治疗，而不是必须作用于更靠近IgE介导的过敏反应的初始 活动的预防性治疗。这些缓解治疗提供短期和部分缓解，且常伴随不 利副作用。一些患严重过敏症的患者用皮质类固醇治疗有效。类固醇 治疗减轻炎症，但存在广泛的免疫抑制。
为了避免已知治疗药物的缺点，更值得通过选择靶向IgE的干扰 因素防止过敏应答。与其他免疫球蛋白一样，IgE具有两个重链和两个 轻链。ε重链具有五个结构域，一个可变VH区和恒定区CH1到CH4。 IgE分子的两条ε链的恒定区联合起来包括IgE的恒定区或Fc区。IgE 循环并通过IgE Fc区上的位点吸附于效应细胞例如嗜碱细胞和巨细 胞，结合在细胞表面的高亲合性FcεRI受体。在一种过敏应答中，过 敏原(例如，花粉、灰尘螨虫蛋白质、跳蚤抗原)结合于巨细胞或嗜 碱细胞-结合IgE可变区上的抗原结合位点。该作用使IgE分子和Fcε RI受体交联。IgE-抗原复合物由此发出信号使巨细胞和嗜碱细胞脱粒， 同时释放组胺和其它炎性介质。这些介质产生过敏症状，上调IgE的产 生，同时加深对过敏原的敏感性(Davis等，Springer Semin Immunopathol, 1993；15:51-73)。
曾有报道可以通过给予抑制IgE与巨细胞和嗜碱细胞结合的干 扰，可以治疗过敏性疾病。例如，已经研究将相应于IgE Fc上各种位 点的合成肽作为IgE与FcεRI受体结合的竞争性抑制物。研究者已经 假定该肽作为影响IgE与FcεRI受体结合的IgE上位点的拮抗剂，并 作为结合位点的图谱部分。
竞争性抑制IgE肽和下面包括非-人IgE肽类似物的所有IgE肽的 氨基酸残基按照Dorrington和Bennich给出的对人IgE的编号索引(免 疫学综述(Immunol Rev),1978；41:3-25，还可以从国际互联网站 点http:/www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids得到)。人序列在本文SEQ ID NO:1中列出，编号入表1所示。狗、大鼠和小数序列的IgE同源物 也在表1中列出，分别列为SEQ ID NOS:2、3、和4。动物序列与人 IgE对照显示。人IgE中以及来自其它物种的同源物的各氨基酸位置在 本文中按照表1所示的氨基酸序列的编号系统确定，除非领有说明。
Helm等(自然，1988:331:180-183)显示一种跨越人IgE的C- 末端CH2和N-末端CH3区、IgE的氨基酸301-376、长度为76个氨基 酸的重组多肽通过竞争性抑制降低IgE与人巨细胞的结合。其它研究报 道，仅CH3区参与结合FcεRI。例如，相应于人序列氨基酸401-415 的大鼠序列肽(表1)抑制大鼠IgE与大鼠巨细胞的结合(Burt和 Stanworth，欧洲免疫学杂志，1987；17:437-440)。来自人IgE残基 419-463的肽防止大鼠巨细胞敏感(Nio等，FEBS Lett,1992,314: 229-231)。Jardieu和Presta(WO93/04173)报道CH3和CH4区的肽 同源物，其可以包括氨基酸373-390,420-428,446-453,及邻近区， 其差别性结合FcεRI受体。然而，这些肽需要高浓度，以获得对IgE 结合的有效抑制。这些高浓度会因有造成剂量过高而导致明显的生理 反应，不具治疗实用性。
抗-IgE抗体也已应用于对IgE上参与结合FcεRI受体的位点作图 的方法。用针对各种IgE Fc结构域的小鼠单克隆抗体的研究揭示特异 于CH3结构域的抗-IgE单克隆抗体抑制IgE与其高度亲合受体的结合 (Baniyash等，分子免疫学，1988；25:705-711；和Stadler等，Immunol Cell Biol,1996；74:195-200)。这些单克隆抗体研究与早先应用多 克隆抗肽抗体对可能参与受体结合的位点作图的研究一致。例如，特 异于IgE氨基酸401-415的兔抗体(Burt等，分子免疫学，1987；24: 379-389)，和氨基酸355-368(Robertson和Liu，分子免疫学，1988； 25:103-113)显示对未结合的IgE具有特异性，但与受体-结合IgE的 反应性很差。
含有来自狗IgE氨基酸356-479的至少五个连续氨基酸的犬类IgE 肽片段对于制备用于诊断狗体内过敏症的抗体是有用的(JP 9179795,1997)。这些结果提示了狗ε链CH3结构域中表面暴露的效 应位点，但没有该效应位点的指教，也没有公开抗-IgE抗体的治疗应 用。
这些表位作图研究证明十分一致地证明ε重链的CH3结构域可以 作为抑制IgE与嗜碱细胞和巨细胞结合的作用的目标。然而，各种研究 对于CH3上最有用位点的精确定位非常不一致。用位点特异性抗体对 IgE的交叉抑制研究(例如，Burt等，1987)结果通常被牵强地解释为 ε链上FcεRI结合位点的精确位置。这些交叉抑制研究的解释是有限 制的，因为它不能假定抗体识别位点等于配体结合位点。抗体可能通 过直接与所需目标位点结合而抑制，但他们也可以战局非连续效应位 点，通过空间障碍或引入构象改变来抑制配体结合。
因此，表位作图研究提供了经验观察，但没有解决CH3结构域中 高亲合受体的结合位点。在缺乏明确定义的结合位点的情况下，没有 方法可用于可靠的预期具有对效应位点(其直接或不直接参与结合至 FcεRI)具免疫交叉反应的潜在治疗性合成免疫原。
而且，在缺乏IgE的X-衍射晶体图谱数据的情况下，IgE的可利 用的结构模型不足以用来可靠地预测适合抗-IgE的干扰作用的IgE上 的位点。基于IgG的经暴露的三维结构的分歧结构已作为IgE、以及与 IgE和其高亲合受体之间相互作用有关的IgE的CH2/CH3区的模型。 这些模型推测了涉及与IgE分子的线性非-邻接残基接触位点的各种构 象依赖性结构。位点的某些模型提示了同一ε链上非连续位点之间由 分子间二硫键结合环(Helm等，欧洲免疫学杂志，1991，21:1 543-1548) 或通过静电作用力维持的分子间环(Presta等，生物化学杂志(J Biol Chem)1994,269:26368-26373)介导的相互作用。其它模型推测IgE 分子的二聚体ε链的片段之间分子内相互作用。事实上，实验观察表 明潜在接触点包括ε链CH3结构域上的几个散在和不连续位点，其明 白地指出FcεRI结合位点的三级结构不能用模型来容易地解决(Helm 等，1988；Baniyash等，1988；和Presta等，1994)。因此，关于有 用的合成肽拮抗剂和模拟IgE上效应位点的免疫原还没有理论模型公 开。在缺乏X-射线结晶图谱确定的IgE的结构的情况下，该有用的肽 位点仅能通过经验实验得到。
用特异性抑制IgE与嗜碱细胞和巨细胞上的高亲和受体结合的抗- IgE抗体治疗过敏症的概念已有报道(Stadler等，1996；Davis等1993)。 该抗-IgE抗体为致过敏性的(交叉联结)或是非致过敏性的(非交叉 联结)。大部分这类抗IgE抗体为致过敏性的。它们将IgE结合和交联 到嗜碱细胞和巨细胞表面，引发过敏症的药物介质的释放。该交联可 能导致过敏反应和死亡。
因此，以抗IgE抗体治疗过敏性疾病是具决定性的。某些非致敏 性抗体保留对ε链CH3区域的特异性，不会交联细胞-结合IgE，因而 显示对IgE-介导组胺释放的抑制活性(Davis等，1993；Stadler等， 1996)。Rup和Kahn(U.S.4940782)报道该非致敏性单克隆抗体可与 游离的大鼠IgE反应，但不与结合至大鼠巨细胞FcεRI受体的IgE反 应。更显著的是，其抑制大鼠巨细胞的致敏作用。这些对人IgE具同源 特异性的非致敏性抗体也抑制相同作用模式的致敏作用。这些抗-人IgE 抗体结合游离的血清IgE，结合B细胞结合IgE，但不能结合与嗜碱细 胞和巨细胞高亲合受体结合的IgE，并且防止人细胞的致敏作用。推测 这些抗体通过对结合受体的IgE上的位点的特异性发生作用(Rup和 Kahn,US4940782；Davis等，1993；Chang,US5420251；Presta等，免疫 学杂志，1993；151:2623-2632)。另外，还发现一种具有不同特异性 的非致敏性抗-人IgE单克隆抗体也中和游离IgE(Rudolf等，免疫学 杂志，1996；157:5646-5652)。该抗-IgE不直接与受体结合位点结合， 因为它也识别FcεRI-结合IgE。看起来它的作用在于通过改变受体对 游离IgE结合的热力学平衡降低嗜碱细胞的致敏作用。
因此，直接结合FcεRI结合位点的抗-IgE抗体和在其它效应位点 干扰与FcεRI结合的抗-IgE抗体均可阻断游离IgE导致的巨细胞和嗜 碱细胞的致敏作用。这些潜在的免疫治疗抗体将CH3看作是与高亲合 IgE Fc受体相互作用的IgE结构域，这与以前作图研究结果抑制。然 而，结合位点的更精确鉴定，以及可选择的有用效应位点例如Rudolf 等描述的效应位点仍然不很清楚。Rudolf等也应用了一种噬菌体表现 文库鉴定了结合它们的抗-IgE单克隆抗体的mimotope肽；然而，肽 mimotope与人IgE的一级氨基酸序列不具有同源性(Rudolf等，免疫 学杂志，1998；160:3315-3321)。
对FcεRI受体位点具有表观特异性的人源化单克隆抗-IgE抗体正 处于通过被动免疫治疗人过敏症的临床研究中(MacGlashan等，免疫 学杂志，1997；158:1438-1445)。已经发现，注入抗体，rhuMAb-E25， 降低患者IgE血清浓度，下调效应细胞上IgE受体的表达，降低过敏原 激发的过敏性致敏作用，并改善哮喘合过敏性鼻粘膜炎的症状。该抗 体表现良好的安全曲线。临床实验结果证实了抗-IgE研究用于治疗过 敏症的可靠性。但该治疗模式还存在下述问题：通过抗-IgE进行的免 疫治疗通过被动免疫实现，即通过注入抗体实现。该抗体必须以足够 高的剂量和足够高的频率经不方便的静脉内或皮下途径施用，以获得 抗体的连续药理有效浓度。该有效剂量由患者体重、循环中游离IgE 的基础水平、和给药途径确定。在最近的临床实验中，治疗效果所需 的稳态浓度通过两周剂量获得，通过随后的双周剂量维持。对于一个 典型过敏症患者，治疗全过程总共耗费2000-3000mg的人源化抗体， 需要七到十次不方便的静脉内给药(MacGlashan等，1997；155: 1835-1840)。在医院环境中该抗体量的耗费和花销以及多次注入的不 方便，说明该治疗对于大多数患者是太昂贵了。
单克隆抗体rhuMAb-E25临床有效性证实了通过被动施用抗-IgE 的免疫治疗的可靠性。还提供了一种替换的经主动免疫进行的抗-IgE 研究的基本原理，不管该免疫原是否和何时可以被设计出来。
用IgE免疫原主动免疫进行的抗-IgE治疗，即通过抗内源性IgE的 “接种”，将在花费和方便程度是优选的。抗IgE的“接种”提供了超 越被动免疫的优点：少量低价免疫原，不频繁施用，以及通过肌肉注 射方便施用，并且不必定制与受体物种相容的鼠抗体，即当应用于人 时去“人源化”抗体，因为该程序应用患者自身的免疫系统产生抗体。 然而，虽然上述脱敏单克隆抗体可能暗示了IgE免疫原的期望，但他们 没有公开安全有效免疫原的特性。该免疫原必须模拟相关IgE效应位 点，具有足以诱导交叉抑制抗体的相似性，同时保留足以避免诱导非 致敏性抗体的位点特异性。而且，有效的IgE免疫原必须具备高度免疫 刺激性。有必要研制一种相关、安全的位点特异性、和足够免疫效力 的上述免疫原。
用于过敏症免疫治疗的IgE免疫原必须是免疫刺激物，以便诱导 足以降低IgE-介导的致敏作用水平的抗-IgE。该免疫原必须设计成能够 克服对自身分子表现的强烈耐受。Haba和Nisnonoff(美国国家科学院 科学进展1990；87:3363-3367)仅通过在从出生到第10天的很短新 生时段内用IgE免疫小鼠产生有效的抗-IgE应答。超过该时间段的接 种不能产生所需的自主免疫应答，除非用于免疫小鼠的IgE已经共价偶 联于外源载体蛋白质，匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)。同时，包含融合 日本血吸虫(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽-S-转移酶蛋白质的 CH2-CH3ε链区的重组蛋白质诱导大鼠脱敏抗-IgE应答(Hellman，欧 洲免疫学杂志，1994；24:415-420)。
其它研究者关心通过寻找良好位点特异性的肽IgE免疫原，使诱 发非致敏性抗-IgE抗体的风险降至最低，而该IgE抗体交叉连接至已 和巨细胞和嗜碱细胞表面联结的IgE。例如，将对应于IgECH4区中的 位点的肽(SEQ ID NO:1的残基497-506)与KLH联结，用于诱导多 克隆抗体，其有效地抑制大鼠巨细胞中IgE-介导的信号传导。然而， 该肽-KLH结合物表现较差的免疫刺激能力，其必须以含高峰期免疫的 兔抗血清的被动免疫大鼠疫苗来说明功效(Stanworth等，柳页刀， 1990；336:1279-1281)。Stanworth等人的CH4免疫原是本发明人在 那之后的工作得到的，该免疫原为一系列经合成的合成免疫原，其共 价联结至混杂人T辅助细胞抗原表位。这类肽的免疫原性为经改良的， 因而优越于原来的KLH-肽偶合物，但是没有提供证据显示所得的抗 IgE抗体的功效(Wang,WO95/26365)。而且，如本文实施例1所示 (表2，第34项)，对以前揭示的CH4效应位点具有特异性的抗肽抗 体(Stanworth等，1990)对人IgE不具交叉反应性。Burt和Stanworth (1987)针对IgE-CH3 401-415肽的早期抗肽研究也提供了引发脱敏交 叉反应的证据，但这也需要筛选高峰期的兔血清，并使用定义不完全 的肽-载体蛋白质结合物，以通过在大鼠模型中被动免疫观察效果。还 未曾证明合成肽在诱导免疫宿主产生能够抑制组胺释放的多克隆抗血 清方面有效。
在得到效果和安全性足够的免疫原性和特异性合成肽免疫原之 前，对上述现有技术免疫原的改进是必要的。本发明通过组合若干鉴 定和设计合成肽免疫原的其它方法，实现了上述改进。这些方法包括： (1)鉴定有效目标表位的有效方法；(2)通过将B细胞目标表位于 含有广泛反应性的混杂T辅助细胞(Th)表位的肽结合，增强B细胞 目标表位的免疫原性的方法；(3)应用组合肽化学增强T细胞表位功 能的方法，以及由此进一步适应远亲后代种群的可变免疫应答；和(4) 通过引入环状限制，稳定构象特征，从而使对自身分子的交叉反应最 大化。
合成肽已经被用于“表位作图”，以鉴定蛋白质表面的免疫区决定 簇或表位，用于研制新疫苗和诊断试剂。表位作图应用一系列目标蛋 白质上对应区域的重叠肽，以鉴定参与抗体-免疫原决定簇相互作用的 位点。通常，表位作图应用长度相对较短的肽，以精确检测线性决定 簇。已知最快的表位作图法是PEPSCAN，它是基于同时合成数百个偶 联到固体支持物上的长度为8-14个氨基酸的重叠肽。检测偶联肽的结 合抗体的能力。PEPSCAN研究在定位线性连续决定簇方面有效，但对 于鉴定模拟不连续效应子位点所需的表位无效，例如HIV受体/共同- 受体结合位点(Meloen等，Ann Biol.Clin.,1991,49:231-242)。一种 替代方法依赖于一系列长度范围从15-60个残基不等的嵌套重叠肽合 成物。这些较长的肽是可靠的，但需要通过一系列独立的固相肽合成 法繁琐地合成，而不是通过快速和同步PEPSCAN合成。得到的一系列 嵌套重叠肽然后可以用于在例如实验免疫和中和感染系统中分析抗体 结合，以便鉴定包括简单不连续表位的最佳呈递的免疫结构域决定 簇。该方法通过Wang等关于来自HTLVⅠ/Ⅱ(US5476765)和HCV(US 5106726)的免疫结构域位点作图研究示例说明。它被用于选择gp120 序列上HIV中和表位最佳出现的精确位置(Wang等，科学，1991,254: 285-288)。
肽免疫原通常比蛋白质更柔韧，不易保持任何优选结构。因此通过 引入环形限制来稳定肽免疫原是有用的。一种准确环化的肽免疫原可 以模拟和保守目标表位的构象，由此诱导真正分子上与该位点具有交 叉反应性的抗体(Moore，合成肽第二章：用户指南，ed.Grant,WH Freeman and Company:New York,1992,pp/63-67)。
影响来源于受体/共同受体复合物的肽免疫原的免疫原性的另一个 重要因素是通过与宿主T-辅助细胞受体和第Ⅱ类MHC分子反应的T 辅助细胞表位将该肽呈递给免疫系统(Babbitt等，自然，1985,317: 359-361)。T-辅助表位(Th)通常由载体蛋白质提供，由于难于生产 准确限定的肽-载体结合物、大多数抗体对载体应答的错误指向、以及 载体诱导的表位抑制使所述载体蛋白质同时存在缺点(Cease,Intern Rev Immunol,1990,7:85-107；Schutze等，免疫学杂志，1985,135: 2319-2322)。或者，T细胞辅助可以通过含有Th位点的合成肽提供。 因此，被称为混杂Th的Th表位诱导有效的T细胞辅助，并能够与自 身具备很低免疫原性的合成B细胞表位混合，以产生强效肽免疫原(US 5759551)。设计良好的混杂Th/B细胞表位嵌合肽能够在表现多样性 MHC单倍体的遗传多样性种群的大多数成员中诱导Th应答以及随之 而来的抗体应答。混杂Th可以通过来源于强效外源性抗原的特异性序 列提供，例如麻疹病毒F蛋白、乙型肝炎病毒表面抗原、和沙眼衣原 体主要外膜蛋白(MOMP)。一些已知的混杂Th已经显示在强化相当 于十肽激素的低免疫原性肽方面是有效的(US5759551)。
来源于外源病原体的混杂Th表位包括例如，但不限于，乙肝表面 抗原和核心抗原辅助T细胞表位(HBsTh和HBcTh)，百日咳毒素辅 助T细胞表位(PT Th)，破伤风毒素辅助T细胞表位(TT Th)、麻 疹病毒F蛋白辅助T细胞表位(MVF Th)、沙眼衣原体主要外膜蛋白 辅助T细胞表位(CT Th)、白喉毒素辅助T细胞表位(DT Th)、镰 状疟原虫环孢子体辅助T细胞表位(PF Th)、曼森氏血吸虫三糖磷酸 盐异构酶辅助T细胞表位(SM Th)，及大肠杆菌TraT辅助T细胞表 位(TraT Th)。病原体衍生的Th在US 5759551中的SEQ ID NOS: 2-9和42-52列出；衣原体辅助位点P11在Stagg等，免疫学，1993, 79:1-9中列出；HBc肽50-69在Ferrari等，临床研究杂志，1991,88: 214-222中列出。
混杂Th表位长度范围为约15约50个氨基酸残基(US5759551)， 通常具有共同的结构特征，可以含有特异性标志序列。例如，共同特 征是两性分子螺旋，它是疏水氨基酸残基占据螺旋一面，带电荷和极 性残基占据周围面的α-螺旋结构(Cease等，美国国家科学院科学进 展，1987,84:4249-4253)。表位通常含有其它的一级氨基酸模式， 例如一个Gly或带电荷残基后跟随两到三个疏水残基，其后依次跟随 一个带电荷或极性残基。该模式描述了一种被称为Rothbard序列的模 式。另外，表位通常遵循1、4、5、8原则，其中一个带阳性电荷的残 基后第四位、第五位和第八位跟随疏水残基，与1、4、5、8位定位在 同一侧上的两性螺旋一致。因为所有这些结构由共同的疏水、带电荷 和极性氨基酸构成，所以各结构能够在同一个Th表位中同时存在 (Partidos等，遗传病毒学杂志(J Gen Virol),1991,72:1293-99； Alexander等，免疫学，1994,1:751-761)。即使不是全部，但大多 数混杂T细胞表位含有至少一个上述周期性。这些特征可以被插入“理 想化人工Th位点”的设计。
有用的Th位点还可以包括组合的Th，其将选择的简并位点插入 理想化的Th位点的设计中。在Wang等(WO95/11998)中，一类特 别组合表位被称之为“构建的合成抗原文库”或SSAL。构建如SSAL 表位的Th由组织围绕一种不变残基的结构框架的位置取代物组成。 SSAL的序列通过排列混杂Th的一级氨基酸序列确定，在构成Th肽独 特结构的位置上保留相对不变的残基，并在与识别多变性MHC限制元 件有关的位置上提供简并性。MHC-结合基因座的不变和可变位置以及 优选氨基酸列表已有公开(Meister等，疫苗，1995,13:581-591； Alexander等，免疫学，1994,1:751-761)。
SSAL的所有成员在一个单一固相肽合成中与目标B细胞表位和 其它序列同时产生。Th文库序列保留了混杂Th的结构基因座并提供 对广泛单倍体的反应性。例如，从麻疹病毒F蛋白质中得到一种混杂 表位之后，模拟被描述为SSAL1TH1的简并Th表位(Partidos等， 1991)。SSAL1TH1与LHRH目标肽一同应用。象麻疹表位一样， SSAL1TH1遵循Rothbard序列和1、4、5、8规则： 1               5                   10                  15 Asp-Leu-Ser-Asp-Leu-Lys-Gly-Leu-Leu-Leu-His-Lys-Leu-Asp-Gly- Leu Glu Ile      Glu Ile Arg      Ile Ile Ile      Arg Ile Glu     Ile
Val          Val
Phe Phe Phe Phe Phe Phe Phe
将带电荷残基Glu或Asp加在位置1，以增加Th疏水侧周围的电 荷。然后在两性螺旋疏水侧的2、5、8、9、10、13和16位保留疏水 残基，2、5、8、9、10、13和16位的可变性提供了一种具有结合广泛 MHC限制元件能力的表面。SSAL特征的静作用在于增大了人工Th的 免疫抑制的范围(WO95/11998)。
用上述肽技术和肽设计元件，即精确的表位图谱、环状限制、插 入混杂Th表位或理想化的混杂Th、以及理想化的SSAL Th表位设计 的肽免疫原是本发明的有效合成肽IgE免疫原的基础。由于通过优化定 位和环化作用提供IgE效应位点的有效呈递，使得这种肽的适当靶向作 用和安全性是优选的，并且由于广泛反应性Th应答，使得它们的免疫 效力是优选的。
发明概述
本发明提供了新的合成肽结合组合物，用于通过主动免疫治疗IgE- 介导的过敏症。该免疫在接种宿主中诱导产生高效价特异于IgE效应位 点的非-致敏性多克隆抗体。随后防止巨细胞/嗜碱细胞的激发和活化， 下调IgE合成。
用肽组合物接种宿主进行治疗，其中包含的每种肽含有一个从人 IgEε重链CH3区片段(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸413-435或SEQ ID NO:5)或其它物种的同源序列(例如SEQ ID NOS:6-8HE 84) 修饰得到的目标抗原肽序列(本发明称为“IgE-CH3区抗原”或“IgE-CH3 区抗原肽”)。
通常，IgE-CH3区抗原是一种长度约为25至约29个氨基酸之间的 肽序列，其基本上与上述哺乳动物IgE抗体ε重链CH3区的片段同源， 含有由约23个氨基酸残基分隔开来的两个半胱氨酸残基。在本发明 重，基本上同源意味着除了两个半胱氨酸残基，还可以插入或取代高 达约四个其它氨基酸取代(优选保守取代)。
优选，目标位点从下面的天然IgE序列修饰得到：
(1)将一个半胱氨酸残基插入413位或同源位置的N-端侧，除非 天然序列的413位或414位已经存在半胱氨酸；
(2)将天然目标序列415位到434位的所有肽天然半胱氨酸进行 保守取代(优选取代为丝氨酸)；
(3)在435位或同源位置的C-端一侧插入半胱氨酸，除非天然序 列的435位或436位已经存在半胱氨酸；和
(4)在保留的半胱氨酸之间形成二硫键，从而产生环状结构。该 结构还可以含有来自IgE413-435片段任意末端的1-5个附加氨基酸， 只要保留单一二硫键环形结构。
本发明提供了一种人IgE的优化的IgE-CH3区抗原肽，其具有如 下序列： Cys-Gly-Glu-Thr-Tyr-Gln-Ser-Arg-Val-Thr-His-Pro-His-Leu-Pro-Arg- Ala-Leu-Met-Arg-Ser-Thr-Thr-Lys-Cys(SEQ ID NO:5)。人IgE目标 位点通过一个非天然末端半胱氨酸和由天然序列的丝氨酸残基取代成 的一个半胱氨酸残基环化而成。由含有该IgE-CH3区抗原的肽免疫原 诱导的抗体与人IgE交叉反应，并通过人IgE抑制人嗜碱细胞的致敏作 用。
或者，可以从相关物种的同源ε链片段衍生其它物种IgE的相应目 标位点。例如，该目标序列可以来自于狗、大鼠和小鼠的ε序列，如 表1所示(SEQ ID NOS:2、3和4)，或者Navarro等(分子免疫学， 1995,32:1-8)提供的马的IgE-CH3序列。可以从这些序列得到其它 IgE-CH3区抗原肽(SEQ ID NOS:6、7、8、和84)。
优选地，本发明的IgE-CH3区抗原共价联结一种化学偶联的载体 蛋白质，或者经共价联结一种直接合成的合成免疫刺激元件，例如混 杂Th表位而变得更具免疫原性。已经公开了载体蛋白质和免疫刺激元 件的具体实例，例如，匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)载体，人工Th(SEQ ID NO:9)、人工SSAL Th(SEQ ID NOS:10和11)、病原体来源 的Th(SEQ ID NO:12)、以及来自耶尔森氏鼠疫杆菌的免疫刺激侵 染素肽(Inv)(SEQ ID NO:13)。
本发明的完全合成肽偶合物可以由下式表示：
(A)n-(IgE-CH3区抗原)-(B)o-(Th)m-X
或
(A)n-(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-X
或
(A)n-(B)o-(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-X
或
(IgE-CH3区抗原)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
或
(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-(A)n-X 其中：
各A独立地为一种氨基酸，或一种一般性免疫刺激肽；
各B选自氨基酸，
-NHCH(X)CH2SCH2CO-、-NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、
-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺基(ε-N)Lys-、和
-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺基)-；
各Th独立地为一个构成辅助T细胞表位的氨基酸序列，或其免疫 增强类似物或其片段；
IgE-CH3区抗原是一种长度约为25到约29个氨基酸之间的肽，其 基本上与由SEQ ID NOS:5-8和84表示的哺乳动物IgE抗体ε重链 CH3区的片段之一同源，并含有由约23个氨基酸残基分隔开来的两个 半胱氨酸残基；
X为一个氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n为从0到约10；
m为从1到约4；和
o为从0到约10的数。
更具体地说，IgE-CH3区抗原选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、来自哺乳动物IgE-CH3抗体ε重链的 同源序列、及其交联反应性和免疫功能类似物。
本发明的肽组合物包括长度约为25-约100个氨基酸残基，优选约 25约80个氨基酸残基，更优选约45到约65个氨基酸残基的肽免疫原。
还提供了佐剂和/或传送载体和常规加入疫苗制剂的其它成分，以 及给要说明，以便产生针对目标IgE效应位点的免疫治疗抗体。其随后 抑制循环IgE对嗜碱细胞和巨细胞的致敏作用，由此防止IgE-过敏原 复合物对巨细胞/嗜碱细胞的激发和活化。该由抗体介导、由本发明的 肽组合物诱导的抑制机制将特异性地减少或消除IgE-介导的病理作 用，同时使免疫系统的防御成分，例如IgG，不被影响。
发明详述
本发明涉及一种新的肽和肽结合组合物，用于产生特异于IgE Fc 部分第三区，即ε链的CH3区上目标效应位点的高效价多克隆抗体。
为了方便起见，本文使用的术语“肽偶合物”指含有Th表位共价 连接于IgE-CH3区抗原肽的分子，其通过常规肽键从而形成一个较大 肽，或通过共价连接其它形式的分子。
本发明组合物的高度位点特异性使能够交联结合于嗜碱细胞/巨细 胞表面FcεR1的二价IgE的抗-IgE抗体的产生最小化，由此诱导非致 敏性抗-IgE抗体的产生。因此，本发明进一步涉及一种治疗哺乳动物 包括人IgE-介导的过敏症的安全方法。
通过全程筛选人IgE CH2和CH3区上有用的免疫反应性侯选位点 确定目标抗原序列。Helm等(1988)和Presta等(1994)公开：从IgE CH2区羧基端区域开始，通过CH3区的一段长区域含有潜在的效应位 点，在其基础上选择CH2和CH3位点用于合成肽免疫原。按照 Brookhaven国家实验室在国际互联网上的地址 http://www.pdb.bnl.gov/pdv.bin/pdbids和Helm等的报道(欧洲免疫学杂 志，1991:21:1543-1548)提供的人IgE的三维结构理论模型推测在 IgE构象中存在潜在的环结构。将二硫键合环整合到选择的肽免疫原的 设计中，从而模拟预测环的状况，以使设计出的目标抗原肽和自身IgE 分子之间的交叉反应性的可能性变为最大。合成潜在的目标抗原位 点，通过固相肽合成化学偶联于KLH赋予其免疫原性，或者通过连续 合成共价连接于混杂Th表位和其它免疫刺激序列(表2)。将几个位 点合成为整合有特定二硫键的环状肽，从而将可变肽稳定成为组装了 预测的IgE环结构的构象。然后制备超免疫血清，检测抗血清与人IgE 的交叉反应性，鉴定潜在有用的效应目标位点。从血清中纯化对人IgE 具有高度交叉反应性的抗体，并在体外分析组胺释放，评价所述抗体 抑制IgE介导的人嗜碱细胞的致敏作用的能力。由包含SEQ ID NO:5 的肽诱导的抗-肽抗体表现对IgE的强烈交叉反应性(表2)，与在组 胺释放分析中表现的高度抑制活性大部分一致(表3)。SEQ ID NOS: 14和15的肽共有的目标表位对应于表1所示的IgE CH3区的片段。表 1排列显示了人IgEε重链的CH2、CH3、和CH4区与来自狗、大鼠、 和小鼠同源序列的氨基酸序列。确定对于本发明的IgE-CH3区抗原有 用的人ε链序列上的目标位点在表1中以下划线表示，包括人ε链残 基413-435。在表1中狗、大鼠、和小鼠蛋白质的同源目标序列也以下 划线表示。马的同源序列为Navarro等(分子免疫学，1995,32:1-8) 氨基酸序列的残基296-318。
本发明的下划线的目标IgE CH3效应位点、和衍生的IgE-CH3区 抗原肽是短肽序列，当合成它们本身时，通常免疫原性较差活没有免 疫原性，远不能作为自身抗原。可以将这些短肽化学偶联于一种载体 蛋白质，例如匙孔帽贝血蓝蛋白(KLH)以使其免疫增强。该基于 “IgE-CHE区抗原-载体蛋白质”的免疫原的不利之处在于，与大载体 蛋白质相比抗原的免疫原性较差，这是一个与肽-载体蛋白质结合物有 关的固有问题。该结合物产生的大部分抗体是针对载体蛋白质的无功 能抗体。本发明的优选免疫原是完全合成肽，其使无关抗体的产生最 小化，由此诱导更集中针对目标IgE-CH3区抗原，例如SEQ ID NOS: 5-8和84的免疫应答。
然而，因为本发明的短IgE-CH3区抗原肽(例如，SEQ ID NOS: 5-8和84)是非-免疫原性T细胞-依赖性表位，它们依赖于非固有Th 表位的免疫原性。本发明提供的优选肽共价连接于混杂Th表位。本发 明的免疫原诱导位点特异性免疫反应，从而精确地靶向效应位点，由 此产生非-交联性抗-IgE抗体。得到的位点特异性抗体抑制致敏作用和 过敏性应答，但不诱导同时进行的脱粒作用。
本发明提供了作为本发明免疫原性肽偶合物的实施方式的具体实 施例。这些实施例提供了合成的免疫刺激元件与IgE-CH3区抗原肽(例 如SEQ ID NOS:5-8和84)的连接，从而在遗传多样性宿主种群中产 生针对IgE CH3区目标位点的广泛的强效交叉反应性抗体。这些抗-IgE 抗体是非致敏性的，特异性地针对IgE(实施例2和3)。这些抗体， 随后导致组胺释放的抑制，减小IgE-介导的应答，从而产生对IgE-介 导的过敏症的有效治疗和/活预防。
对于主动免疫，本发明所说的术语“免疫原”涉及肽结合组合物， 其能够诱导抗IgEε重链第三区上存在的效应位点(例如，SEQ ID NOS:5-8和84)的抗体，导致IgE-介导的嗜碱细胞和巨细胞脱粒的抑 制。本发明的肽组合物包括IgE-CH3区抗原肽，优选经化学偶联连接 于载体蛋白质，更优选IgE-CH3区抗原肽经化学偶联连接混杂辅助T 细胞表位(Th表位)，最优选含有IGE-CH3区抗原序列和混杂辅助T 细胞表位(Th表位)序列的完全合成肽。
优选通过一种间隔区(例如，Lys-Lys-Lys)经化学偶联将载体蛋 白质共价连接于IgE-CH3区抗原肽。优选用一种间隔区(例如，Gly- Gly)将Th肽(例如，SEQ ID NOS:9-12)通过化学偶联或优选通过 直接合成共价连接于IgE-CH3区抗原肽(例如，SEEQ ID NOS:5-8和 84)，从而使其连接于IgE-CH3区抗原序列的N-或C-末端，以便诱 导有效的抗体应答。免疫原任选地还可以包括一种一般性免疫刺激氨 基酸序列，例如，一种对应于来自耶尔森氏鼠疫杆菌属(Brett等，欧 洲免疫学杂志，1993,23:1608-1614)(SEQ ID NO:2)侵染素蛋白 质区域的序列。该一般性免疫刺激序列可以含有一种任选的间隔区， 通过它与Th肽结合。
本发明的完全合成肽可以由下式表示:
(A)n-(IgE-CH3区抗原)-(B)o-(Th)m-X
或
(A)n-(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-X
或
(A)n-(B)o-(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-X
或
(IgE-CH3区抗原)-(B)o-(Th)m-(A)n-X
或
(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-(A)n-X 其中：
各A独立地为一种氨基酸，或一种一般性免疫刺激肽；
各B选自氨基酸，-NHCH(X)CH2SCH2CO-、 -NHCH(X)CH2SCH2CO(ε-N)Lys-、-NHCH(X)CH2S-琥珀酰亚胺基(ε- N)Lys-、和-NHCH(X)CH2S-(琥珀酰亚胺基)-；
各Th独立地为一个构成辅助T细胞表位的氨基酸序列，或其免疫 增强类似物或其片段；
IgE-CH3区抗原代表本发明定义的IgE-CH3抗原肽序列(或其交叉 反应性和免疫功能类似物)；
X为一个氨基酸的α-COOH或α-CONH2；
n为从0到约10；
m为从1到约4；和
o为从0到约10的数。
本发明的肽免疫原含有约25至约100个氨基酸残基，优选约25约 至80个氨基酸残基，更优选约25至约65个氨基酸残基。
如果A为一种氨基酸，它可以是任何非天然或任何天然氨基酸。 非天然氨基酸包括但不限于D-α-氨基酸、β-丙氨酸、鸟氨酸、正亮氨 酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、甲状腺氨酸、γ-氨基丁酸、高丝氨酸、瓜 氨酸等。天然氨基酸包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱 氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、 和缬氨酸。而且，如果n大于1，二个或三个A基团为氨基酸，那么每 个氨基酸可以独立地相同或不同。
如果A为一种侵染素区，则它可以是来自耶尔森氏鼠疫杆菌种侵 染素蛋白的免疫刺激表位。这种免疫刺激特性来源于这种侵染素结构域 与T细胞上存在的β1整联蛋白分子相互作用的能力。发现与β1整联 蛋白相互作用的侵染素结构域的特定序列已经由Brett等描述(欧洲免 疫学杂志，1993；23:1608)。在US5759551中已经描述过用于连接 混杂Th表位的侵染素结构域(Inv)的一种优选实施方式，其经参考插 入本文。Inv结构域具有如下序列: Thr-Ala-Lys-Ser-Lys-Lys-Phe-Pro-Ser-Tyr-Thr-Ala-Thr-Tyr-Gln-Phe(SED ID NO:13)或为来源于另一种耶尔森氏鼠疫杆菌种侵染素蛋白相应区域的其 免疫刺激类似物。这种类似物还可以含有取代、删除或株系变异，只要类 似物保留免疫刺激特性。免疫刺激类似物还可以含有一种任选的间隔区， 通过它结合于Th表位。
在一个优选实施方式中，n为3，(A)3依次为一种侵染素结构域 (Inv)、甘氨酸和甘氨酸。
(B)o任选为一种间隔区，包括上述天然或非天然氨基酸。每个B 独立地相同或不同。载体蛋白质通过间隔区(例如，Lys-Lys-Lys)经 化学偶联与肽共价结合。B氨基酸还可以为一种位于混杂Th表位(例 如，SEQ ID NO:9)与IgE-CH3肽(例如，SEQ ID NO:5)和其交叉 反应性和功能性免疫类似物之间的间隔区，例如Gly-Gly或(ε-N)Lys。 除了使Th表位与B细胞表位即物理分隔，该间隔区还还可以破坏Th 表位与IgE-CH3肽(例如SEQ ID NO:5)和其免疫类似物结合产生的 所有人工二级结构，因此减弱了Th和/或B细胞应答之间的干扰。B的 氨基酸还可以构成一种作为增强Th和IgE结构域分隔作用的柔韧性绞 链的间隔区。在免疫球蛋白重链绞链区中发现了编码柔韧性绞链的序列 的实例。柔韧性绞链序列通常富含脯氨酸。一种特别有用的柔韧性绞链 为序列Pro-Pro-Xaa-Pro-Xaa-Pro(SEQ ID NO:9)，其中Xaa为任意氨基 酸，优选为天冬氨酸。由B氨基酸提供的构象间隔使本发明的肽免疫 原和合适Th细胞和B细胞之间的相互作用更为有效，由此增强了对Th 表位和抗体-诱导性表位以及它们的交叉反应性和免疫功能类似物的免 疫应答。
Th是一种含有Th表位的氨基酸序列(天然或非天然氨基酸)。 Th表位可以由连续或不连续表位构成，因此不是Th的每一个氨基酸一 定是表位的一部分。因此，Th表位，包括Th表位的类似物和片段，能 够增强或刺激对IgE-CH3抗原肽(例如，SEQ ID NOS:5-8和84，及 其免疫功能类似物)的免疫应答。表现为免疫结构域和混杂的Th表位 在表现广泛分歧型MHC的动物和人群中具有高度和广泛的反应性 (Partidos等，1991；US5759551)。本发明肽的Th结构域约具有10 到50个氨基酸，优选约具有10到30个氨基酸。当出现多重Th表位 (即m≥2)，则每个Th表位独立地相同或不同。Th片段是Th表位的 连续部分，其足以增强或刺激对IgE-CH3抗原肽(例如，SEQ ID NOS: 5)及其免疫功能类似物的免疫应答。
本发明的表位包括，例如但不限于病原体来源的乙肝病毒表面和核 心抗原辅助T细胞表位(HBs TH和HBc Th)、百日咳毒素辅助T细 胞表位(PT Th)、破伤风毒素辅助T细胞表位(TT Th)、麻疹病毒F 蛋白辅助T细胞表位(MVF Th)、沙眼衣原体主要外膜蛋白辅助T细胞 表位(CT Th)、白喉毒素辅助T细胞表位(DT Th)、镰状疟原虫环孢子 体辅助T细胞表位(PF Th)、曼森氏血吸虫三糖磷酸盐异构酶辅助T细 胞表位(SM Th)，及大肠杆菌TraT辅助T细胞表位(TraT Th)。病原 体来源的Th在US5759551的SEQ ID NOS:2-9和42-52中列出；衣原体 辅助位点P11在Stagg等，免疫学，1993,79:1-9中列出；HBc肽50-69 在Ferrari等，临床研究杂志，1991,88:214-222中列出，它们经参考插 入本文。
本发明举例的Th位点还包括称之为“Syn Th(1、2、4)”的人工Th 位点(SEQ ID NO:9)，人工SSAL Th位点“(1、4、9 PALINDROMIC) Th”、“IS(1、4、9 PALINDROMIC)LF Th”和“IS(1、4、9 PALINDROMIC) LF简化Th”(SEQ ID NOS:10、11和60)、及其免疫功能类似物。功 能性Th类似物包括免疫增强类似物、交叉反应性类似物和任何这些Th表 位的片段。功能性Th类似物进一步包括在Th表位中的保守取代、附加、 删除、和插入一到10个氨基酸残基，而基本上不改变Th表位的Th刺激 功能。
本发明的合成肽通常含约50到约90个氨基酸，包括：
(a)一种免疫刺激侵染素区，
(b)一种辅助T细胞(Th)表位，和
(c)一种IgE-CH3区抗原肽。
更具体地说，本发明的合成肽免疫原由下式描述：
(A)n-(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-X，
(A)n-(B)o-(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-X，
(A)n-(IgE-CH3区抗原)-(B)o-(Th)m-X，
(IgE-CH3区抗原)-(B)o-(Th)m-(A)n-X，和
(Th)m-(B)o-(IgE-CH3区抗原)-(A)n-X。
Th表位任选地通过间隔区B连接于IgE-CH3肽和其交叉反应性 和功能性免疫类似物的N端或C端。本发明的优选肽免疫原是含有IgE- CH3抗原肽(例如，SEQ ID NO:5)(或其免疫类似物)和Th表位，以 及任选地Inv(SEQ ID NO:13)的肽。在一个更优选的实施方式中，Th 表位是HBs Th、HBc Th、MVF Th、PT Th、TT Th、CT Th(例如，SEQ ID NO:12)、或人工Th(SEQ ID NOs:9-11和60)、或其功能性免疫 类似物，任选地，A是通过(B)o间隔区，例如Gly-Gly或(ε-N)Lys结 合的Inv(SEQ ID NO:13)。
IgE-CH3区抗原的结构包括一种来自人IgE CH3区域的肽序列(SEQ ID NO:1的氨基酸413-435)或其它物种的同源序列(例如，SEQ ID NOS: 6-8和84)，然后进行下列修饰：
在天然IgE序列的基础上修饰得到目标位点，即将一个半胱氨酸残基 插入413位或同源位置的N端侧，除非天然序列的413或414位已经存在 半胱氨酸，
将位置418或同源非人序列的相应位置的天然半胱氨酸或天然目标序 列的任意其它半胱氨酸取代为丝氨酸(除非位置413或414和435或436 已经存在所述天然半胱氨酸)，
在位置435或同源位置的C端侧插入半胱氨酸，除非天然序列的位置 435湖436已经存在半胱氨酸，和
在保留的半胱氨酸之间形成一个二硫键，从而产生一个环状结构。
所述环状结构还含有来自IgE413-435片段任意末端的1至5个附加氨 基酸，只要保持单二硫键环状结构。本发明提供了一种序列如下的优化的 人IgE目标抗原Cys-Gly-Glu-Thr-Tyr-Gln-Ser-Arg-Val-Thr-His-Pro-His- Leu-Pro-Arg-Ala-Leu-Met-Arg-Ser-Thr-Thr-Lys-Cys(SEQ ID NO:5)。人 IgE目标抗原通过非天然末端半胱氨酸环化，第一个丝氨酸残基取代天然 序列的半胱氨酸残基。由含有该IgE-CH3区抗原的肽免疫原诱导的抗体与 人IgE交叉反应，通过人IgE抑制人嗜碱细胞的致敏作用。
同样，其它物种IgE的相应IgE-CH3区抗原序列可以从相关物种的同 源ε链片段得到。例如，该目标序列可以来自狗、大鼠、和小鼠ε链序列， 如表1中SEQ ID NOS:2、3和4所示，可以得到Navarro等公开的马序 列和IgE-CH3区抗原序列。
按照本发明，IgE-CH3区抗原肽(例如，SEQ ID NOS:5-8和84)的 交叉反应性和免疫功能类似物可以进一步含有保守取代、附加、缺失、或 插入一到约四个氨基酸残基，只要得到的肽类似物能够诱导与IgE-CH3肽 (的免疫应答交叉反应。保守取代、附加、和插入可以用本发明定义的天 然或非天然氨基酸实现。
含有两种或多种Th表位的本发明肽免疫原混合物的肽组合物可以增 强更广泛种群的免疫效力，并因此提供对IgE-CH3区抗原(例如，SEQ ID NOS:5-8和84)的改进的免疫应答。
本发明的肽免疫原可以通过本领域普通技术人员公知的化学合成 法制备。参见，例如，Fields等，《合成肽：用户指南》第三章，Grant, W.H.编，Freeman和Co.,New York,NY,1992,p.77。如果一种肽 免疫原包括一种SSAL Th，则通过提供专属于该位置的氨基酸混合物， 将选择氨基酸偶联到一个特定可变位置上。因此，可以应用固相合成 法——自动Merrifield技术，用t-Boc或Fmoc化学保护α-NH2，并应 用侧链保护的氨基酸，在例如，430A或431型应用生物系统肽合成仪 (the Applied Biosystems肽Synthesizer Models 430A或431)上合成 肽。
完成所需肽免疫原的组装后，按照标准程序处理树脂，以从树脂上 切除肽，并使氨基酸侧链上的功能基团脱封闭。通过例如HPLC纯化 游离肽，通过例如氨基酸分析、质谱、和/或测序鉴定生化特征。肽的 纯化和特征鉴定方法对于本领域技术人员是公知的。
其它产生本发明的含有IgE和Th位点的合成肽构建物的化学方法 包括通过形成一种“硫醚”键连接卤族乙酰化和半胱氨酰化肽。例如， 可以将一个半胱氨酸加到含Th肽的C末端，半胱氨酸的巯基可以用于 与结合到IgE-CH3肽(例如SEQ ID NO:5)或其交叉反应性和功能性 免疫类似物N-末端的亲电基团(例如，赖氨酸残基的N-氯乙酰-修饰的 或马来酰亚胺衍生的α-或ε-NH2基)形成一个共价键。在该模式中， 可以得到Th-(IgE-CH3区抗原)或其逆向物的构建体。
本发明的免疫原还可以是聚合的。可以应用常规方法，通过，例如免 疫原与交联剂的反应，例如通过戊二醛和赖氨酸残基的-NH2之间的反应实 现。通过另一种方法，即通过将一个附加的半胱氨酸加到合成免疫原的N- 末端，使“A-Thm-间隔区-(IgE-CH3区抗原)聚合或与另一种免疫原共 聚合。半胱氨酸N-端的巯基可以用于与赖氨酸残基的氯乙酰-修饰氨基酸 或马来酰亚胺衍生的α-NH2基或ε-NH2基形成一种“硫醚”键，所述赖 氨酸残基结合于分支多聚-赖胺酰核心分子(例如K2K、K4K2K或 K8K4K2K)的N-末端。还可以在一种分支的多聚赖氨酰核心树脂上直接合 成所需肽构建物，制备本发明免疫原的分支聚合物(Wang等，科学，1991； 254:285-288)。
或者，较长的合成肽免疫原可以通过公知的重组DNA技术合成。 一些有关分子可龙技术的标准手册提供了详细的通过表达重组DNA和 RNA制备本发明肽的方法。为了构建编码本发明肽(例如，含有SEQ ID NOS:5-8和84的免疫原性肽，和其它的物种-特异性同源物)的基因， 将氨基酸序列逆向翻译成一种核酸序列，优选利用应用于基因将在其 中表达的有机体的优化密码子。接着，制备编码肽的基因，通常通过 合成编码肽和一些必要的调控元件的重叠寡核苷酸。将合成基因组装 起来插入所需的表达载体。本发明涵盖的合成核酸序列包括编码本发 明肽、免疫功能类似物的核酸序列，以及特征在于非编码序列发生改 变，但没有改变由其编码的肽的免疫原性的核酸构建体。还提供了含 有编码本发明肽的序列的核酸。将合成基因插入适当的克隆载体，得 到重组体，并进行鉴定。然后在选择的表达系统和宿主适合的条件下 表达肽。利用标准方法纯化和鉴定肽。
本发明的核酸自身可以用作称之为“DNA疫苗”的成分。在本发 明的所述实施方式中，通过将编码所述肽的核酸导入患者自身细胞， 诱导本发明的免疫原性肽在那些细胞中表达。制备和应用DNA疫苗的 方法公开于US专利5580859,5589466,和5703055；同时参见WO 97/02840和W.McKonnell和F.Askari，新英格兰医学杂志，1996,334: 2-45，它们均经被参考插入本文。认为制备和应用本发明的肽和肽偶合 物的方法在本发明的范围内。
本发明所有肽组合物的效果可以通过体外分析证实，其中用本发明 的肽组合物接种宿主动物，得到的抗体显示通过IgE抑制嗜碱细胞和巨 细胞的致敏作用，如实施例2和6所示。效果还可以在体内证实，即 用物种-适当的肽组合物(例如用含有SEQ ID NOS:24和/或25的免 疫原制剂免疫小鼠)注射宿主，然后监测对IgE-CH3肽和其交叉反应 性和功能性免疫类似物的激素免疫应答，如实施例5的详细描述。
本发明的另一方面提供了一种在一种药物可接受的传送系统中含 有一种免疫有效量的一种或多种本发明的肽免疫原的药物组合物。因 此，可以应用佐剂、药物可接受载体或其它疫苗组合物中提供的其它 常规成分将本发明的肽配制成一种药物组合物。可以用于本发明的佐 剂或乳化剂包括明矾、不完全弗氏佐剂、liposyn、皂甙、角鲨烯、L121、 emulsigen、单磷脂酰脂类A(MPL)、QS21、ISA51、ISA35、ISA206 和ISA720，以及其它的有效佐剂和乳化剂。所述制剂包括速释和/或缓 释制剂，以及诱导系统免疫和/或诱导局部粘膜免疫的制剂，其可以通 过，例如，用微粒包封免疫原或将免疫原与微粒共同给药实现。本领 域普通技术人员能够容易地确定所述制剂。制备、保存、和灭菌该制 剂的方法是本领域技术人员已知的。
本发明的免疫原可以通过任何常规途径给药，包括皮下、口服、肌 内、或其它非肠道或肠道途径给药。同样，免疫原可以作为单剂量或 多剂量给药。本领域普通技术人员能够容易地确定免疫方案。
本发明的肽组合物含有一种有效量的一种或多种本发明的肽免疫 原和一种药物可接受的载体。在一种适当剂量单位剂型中的组合物通 常含有每公斤体重约0.5μg到约1mg的免疫原。如果以多剂量给药， 可以方便地分成每剂量单位制剂适当量。例如，初始剂量，例如0.2-2.5 mg；优选1mg由本发明的肽组合物表示的免疫原通过注射，优选肌肉 内注射给药，然后施用重复剂量(增强量)。剂量将根据患者的年龄、 体重和一般健康状况而定，正如疫苗和治疗领域公知的那样。
对合成的IgE-CH3肽免疫原的免疫应答可以通过捕获在O’Hagan 等(疫苗，1991；9:768)描述的生物可降解微粒中或其上传送来改 进。可以将免疫原与或不与佐剂包封入生物可降解微粒，以强化免疫 应答，包括可能特别应用于粘膜过敏反应的局部粘膜免疫，并提供用 于口服给药和用于局部给药的延时或周期应答的时间控制释放 (O’Hagan等，1991；和Eldridge等，1991；28:287-294)。
本发明的药物组合物以与预防遗传性过敏反应包括过敏性鼻粘膜 炎、食物过敏症、哮喘、过敏反应、跳蚤过敏性皮炎、和其它IgE-介 导的超敏反应的疫苗类似的方式使用。
本发明前面引证的所有专利和参考文献被参考插入本文。
下面实施例中提供了具体的肽和肽偶合物免疫原，用来举例说明本 发明。这些实施例仅为了说明，而不以任何方式构成对本发明范围的 限制。
实施例1
人IgE分子上潜在效应位点的鉴定 肽的设计
按照Helm等(1988)和Presta等(1994)公开，即覆盖人IgEε 重链CH2和CH3区的较长片段参与IgE与FcεRI受体的结合，选择 人IgEε重链CH2和CH3区中的位点用于肽模拟。合成这些位点的序 列作为目标位点肽，通过(1)通过化学偶联将它们与较大载体蛋白质 例如KLH连接，或(2)将含有混杂Th和Inv(SEQ ID NO:13)的 构建肽连接于目标位点的氨基末端，使它们成为抗原。选择这些区中 的特定位点作为用于环化的肽，所述环化基于Brookhaven关于人IgE 表面暴露环的三维模型(http:www.pdb.bnl.gov/pdb.bin/pdbids)的预 测。将特定环状限制引入这些肽的设计中，从而使抗原与自身IgE分子 之间的交叉反应最大化。因此，引入天然序列中没有发现的半胱氨酸 合成了几种合成构建体，以便在模拟Brookhaven模型预测的环结构中 形成特定位置的二硫键合环。在某些情况下，天然半胱氨酸被丝氨酸 取代，以防止形成不利于该模型的构象。
构建体在表2中列出。表2描述栏中，标“*”的肽被半胱氨酸二 硫键环化。为了环化插入天然序列的半胱氨酸残基在表2的氨基酸序 列中用括号表示，其它的插入残基，取代天然残基的残基，或参与形 成二硫键的天然半胱氨酸在表2的氨基酸序列中用下划线表示。其它 肽是线形的。在第三栏中标“a”的肽代表IgE-CH2/3或-CH3抗原肽， 通过常规戊二醛或MBS(m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟琥珀酰亚胺酯， Pierce Chemical Co.，分类号No.22510)的偶联反应化学连接于KLH载 体蛋白质。第三栏中标“b”的肽合成为所示的IgE抗原肽与Th位点 串联。使用的Th位点包括来自乙肝B病毒的HBs19-32Th、来自麻疹 病毒的MVF Th、和来自百日咳毒素的PT149-146Th(如US5759551 中的参考)、称之为P11的CT Th(Stagg等，1993)和称之为“1、4、 9 PALINDROMIC Th”(SEQ ID NO:10)、“IS(1、4、9 PALINDROMIC) LF Th”(SEQ ID NO:11)、“IS(1、4、9 PALINDROMIC)LF简 化Th”(SEQ ID NO:60)、和“Syn Th(1、2、4)”(SEQ ID NO: 9)的新的人工Th位点。标“c”的肽是与Inv区免疫刺激肽(SEQ ID NO:13)串联合成的“b”构建体的变异体。
“b”和“c”构建体还合成为具有Gly-Gly间隔区，用来分隔 IgE-CH2/3或-CH3目标抗原位点与Th位点，以及分隔Th与Inv免疫 刺激位点。表2中的“b”和“c”构建体具有连接到IgE目标位点氨基 末端的Th和/或Inv区。通过超免疫动物，随后检查与人IgE交叉反应 的超免疫血清，从表2的肽免疫原中筛选用于治疗过敏症的侯选目标 抗原肽。 筛选侯选目标抗原肽的具体方法： 1．IgE-CH3区抗原肽和结合物的合成
表2中列出肽通过Merrifield固相合成技术在应用型生物系统自动 肽合成仪上应用Fmoc化学合成。如果一种肽免疫原包括一种SSAL Th，则通过提供等摩尔比的氨基酸混合物在一个特定可变位置偶联一 种选择氨基酸。完成所需肽的组装后，按照标准程序应用三氟乙酸处 理树脂，以从树脂上切除肽，并使氨基酸侧链上的保护基团脱封闭。 对于环状肽，将切除下来的肽溶解于15％DMSO水溶液中静置48小 时，以促进链内半胱氨酸之间二硫键的形成。 2．实验性免疫
用实验肽免疫原肌肉内接种大鼠或豚鼠。剂量为100μg肽悬浮于 0.5ml体积。第一剂量与完全弗氏佐剂一同给药。以后的剂量在不完全 弗氏佐剂中给药。动物在第0、3、6、和10周或0、2、4、和8周接 受注射。以两周间隔取血，通过IgE肽ELISA确定反应性，通过人IgE ELISA确定交叉反应性。 3．ELISA分析
在用100μL 0.5μg/ml无载体的适当“a”目标抗原位点肽的10 mM NaHCO3缓冲液(pH9.5)于37℃保温1小时涂布的96孔微滴度 平板进行确定抗-IgE肽反应性的肽ELISA。为了确定抗-人IgE交叉反 应性，在用5μg/ml人IgE骨髓瘤蛋白质以类似方式涂布的人IgE-涂布 的96-孔微滴平板上进行人IgE ELISA(American Biosystems,Inx.cat. no.A113)。肽或人IgE-涂布孔用250μL 3％明胶/PBS液于37℃保温1 小时，以封闭非特异性蛋白质结合位点。用含体积百分比0.05％TWEEN 20的PBS冲洗三次，然后干燥。将100μL稀释样品加入各孔，使其 于37℃反应1小时。然后用含体积百分比0.05％TWEEN20的PBS冲 洗各孔六次，除去未结合的标记抗体。向各孔中加入100μL以预先确 定的优化稀释度在1％体积正常山羊血清、0.05％体积TWEEN20的PBS 液中稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊-抗-大鼠IgG山羊抗体或抗-豚 鼠IgG山羊抗体，于37℃保温30分钟。用含体积百分比0.05％TWEEN 20的PBS冲洗各孔六次，除去未结合的标记抗体结合物，然后与100 μL含有0.04％重量间苯二胺(OPD)和0.12％体积过氧化氢的柠檬酸 钠缓冲液(pH5.0)的底物混合物反应15分钟。加入100μL 1M H2SO4中止反应，测定A492的吸收度。基于吸收度的线性回归分析，将截止 A492置于0.5，计算以吸收度倒数的Log10显示的ELISA效价。该截止 值是精确的，因为进行每次分析稀释正常豚鼠对照样品的值均少于 0.15。 结果
侯选目标抗原位点在表2中描述。它们表示为结合KLH载体的 “a”肽或结合合成Th位点的“b”肽，或者结合合成Th和Inv的“c” 肽。大鼠或豚鼠如上述具体方法免疫，在第8周收集的超免疫抗血清 通过抗-肽ELISA和抗-人IgE ELISA如具体方法所述分析。
一些CH2/3和CH3肽免疫原是免疫原性的，因为它们诱导效价在 log102-5范围内的抗-肽抗体。含有人ε链301-376(表1的编号机制) 的长片段的CH2/3抗原目标位点均强烈地与人IgE交叉反应，如所示 在抗-人IgE ELISA上的log10效价大于3。从342位开始和超过该位置 (例如，第21和22个)的一些CH3肽丧失交叉反应性。然而，对于 包括一个含354-372相对较短区域的CH3肽，交叉反应性很大程度地 恢复(例如，第27、28、和29个)，除了第31个(354-368)。在第 20个(跨越374-385位的环状肽)中看到另一个交叉反应的短区域。
如第14、17、23、24、25、和26个缺乏交叉反应性所证明，从 365延伸到413的延长序列没有交叉反应性，尽管与交叉反应性354-372 区和20号(374-385)代表的交叉反应区有重叠。有趣的是，以27、 28、29(354-372)和20(374-385)号作为例子的短交叉反应片段丢 失了长环状肽17号(365-398)的构象，尽管它们在那些交叉反应区有 重叠。重叠非交叉反应位点的交叉反应位点再次发现超过了从399位 开始延伸到445位的区域，如15和30号的交叉反应性，以及19 (432-445)和23(404-435)号的弱交叉反应所示。显然两个包括位 置418的相似环状肽，15(413-435)和18(404-434)，仅15号(SEQ ID NO:5)418位的半胱氨酸由丝氨酸取代的，与人IgE交叉反应。 Stanworth(Stanworth等，柳叶刀，1990；336:1279-1281)描述的相应 于IgE效应位点的CH4位点不表现交叉反应性(34号)。
这些结果证明，IgE肽的交叉反应性是一种由构象特征影响的综合 现象，不能从重叠的线形肽的直接分析推测。从表2与人IgE表现交叉 反应性的结合物中选择IgE-CH3区抗原，用于进一步分析。
实施例2
人IgE分子上效应位点的鉴定
从表2表现对人IgE具高亲合交叉反应性的肽偶合物(如它们各自 抗血清的抗-IgE效价高于log10=3所证明)中筛选IgE-CH3区抗原肽。 如上述制备豚鼠超免疫血清。通过蛋白质A亲合色谱从超免疫血清纯 化豚鼠IgG抗体，通过功能分析确定抗-IgE通过过敏原-特异性IgE抑 制人嗜碱细胞殖民作用的能力。分析端点表示为IgE-街道的组胺释放 的百分抑制率。
通过蛋白质A亲合色谱(ImmunoPureImmobilized Recomb Protein A,Pierce)从血清纯化豚鼠IgG抗体，将洗脱的抗体制备成25 mM PIPES缓冲液，0.15M NaCl,pH7.2中8mg/ml标准浓度。从用一 种无关肽免疫原接种豚鼠收集到的血清，制备对照抗体制剂。将这些 抗体用于测定IgE-介导的人嗜碱细胞致敏作用降低的分析。利用Percoll 密度梯度离心从志愿者的静脉血制备人嗜碱细胞(MacGlashan，过敏 症临床免疫学杂志(J Allergy Clin Immunol)，1993；91:605-615)。收集 分带的白细胞，冲洗，悬浮于所述的0.1ml PAGCM缓冲液 (MacGlashan,1993)，除了用于悬浮细胞的PAGCM缓冲液用含有 44％D2O的水配制。用于分析的IgE是过敏原特异性的，为人BPO-特 异性IgE或特异于HIV糖蛋白gp120的嵌合人IgE。用于以0.25μg/ml 浓度致敏的过敏原-特异性IgE与8mg/ml等体积纯化豚鼠抗体(总体 积为0.1ml)在37℃预保温15分钟，然后加入嗜碱细胞。将抗体混合 物加入细胞，保温20分钟，使细胞被未结合IgE致敏。然后加入过敏 原，如所述为BPO21-HAS或gp120多肽(MacGlashan,1993)刺激致 敏细胞。
适当保温后，使细胞与上清液分离，用自动荧光测定技术分析上清 液种的组胺含量(Siraganian,Anal Biochem,1974:57:383-394)。所有 反应进行两次。从样品和总组胺中扣除自发释放后，从二者的比值计 算组胺释放百分率。结果表示为组胺释放百分抑制率，其通过实验抗 体的组胺释放与无关特异性对照抗体的组胺释放比值所确定。对人嗜 碱细胞的组胺释放分析由Johns Hopkins大学医学院，Johns Hopkins哮 喘和过敏中心，Baltimore的Donald W.MacGlashan博士友情操作。 结果
表3显示了对人IgE的交叉反应性表现为log10＞3的豚鼠抗-肽抗体 抑制组胺释放的结果。用第8周采集血液纯化的抗体进行测定，除了 同样被鉴定的抗肽15b和15c的抗体从第12周收集的血清进行测定。 从分别于第8周和12周采血纯化的抗-15b和抗-15c抗体得到的抑制结 果显示为61％和71％。各动物用15b和15c接种，但收集来自两组动 物的第8和12周抗体的结果，显示于表3。(这些组的豚鼠在第10周 接受附加一次的肽偶合物注射，以便保证在第12周采血时的高抗体水 平)。与由表3所示的其余肽诱导的IgE交叉反应性抗体的反应性相比， 抗-15抗体的显著抑制反应性是出乎意料的。其它那些IgE-CH3区抗原 肽不能产生抑制作用，或者出现抑制组胺释放的水平，其是可忽略或 不可重复的。
比较了与肽15b(SEQ ID NO:14)和15c(SEQ ID NO:15)的 抗原位点(SEQ ID NO:5)重叠的IgE-CH3区抗原肽诱导的抗体的组 胺释放抑制结果和IgE交叉反应性。由肽19、23、24、和33代表的IgE 抗原含有与15肽抗原序列(SEQ ID NO:5)重叠的短序列。它们对IgE 的交叉反应性与15相比较差，并且缺乏抑制活性。18肽的IgE抗原序 列(SEQ ID NO:44)含有15号肽的完全抗原序列，除了(1)羧基末 端赖氨酸缺失，(2)418位天然半胱氨酸保留，和(3)存在九各附加 N-末端氨基酸。它不具有对IGE的交叉反应性，不能抑制组胺释放。 相比较而言，具有抗原SEQ ID NO:5的15号免疫原提供出乎意料的 反应性。15号的IgE-CH3区抗原序列具有通过引入末端半胱氨酸形成 的环状结构，不存在418位半胱氨酸的作用(其已被取代)，它表现 为一种与IgE交叉反应和诱导抑制IgE致敏作用抗体的抗原。
在13周分别取血制备15b(SEQ ID NO:14)和15c(SEQ ID NO: 15)诱导的抗体，并进行测试。到第13周，IgE ELISA所确定的IgE 的交叉反应性和组胺释放抑制百分率比第12周的值减小。而且，发现 两组制备品的抗体在降低组胺释放方面个别地有效：分别为抗-15b抑 制28％，抗-15c抑制20％。
这两种抗体抑制组胺释放的程度是剂量依赖性的，如抗体稀释作用 所证明的那样。当分析全浓度(8mg/ml)的第13周抗-15b制品，然 后分析1:3和1:9稀释度的制品时，组胺释放的百分抑制率分别为 28％、21％和14％。
豚鼠抗-15b制品在无过敏原的情况下直接激发IgE-敏感性嗜碱细胞 测试，作为其交联受体-结合IgE能力和诱导脱离能力的评价。抗-15b 导致的组胺释放等于供体细胞自发组胺释放的水平。这表明SEQ ID NO:5的IgE抗原的特异性抗体是非致敏性的。因此，用含有IgE-CH3 区抗原SEQ ID NO:5的肽结合免疫原(SEQ ID NOS:14和15)进行 的主动免疫诱导抑制IgE-介导的致敏作用而其自身不引起组胺释放的 非致敏性抗-IgE抗体。这些主动诱导的多克隆抗体对以前研究，包括 意图通过主动免疫治疗过敏症的治疗性和非致敏性抗-IgE单克隆抗体 的已有研究(US4940782,US5420251，和Presta等，1993)未曾描述 的IgE效应位点表现特异性。
实施例3
同种型的免疫抑制特异性和潜力
检查了SEQ ID NOS:14和15的主动免疫应答诱导的多克隆抗体对 IgE和对IgG的特异性比较。将实施例2描述的从12周血样制备的抗 -15b豚鼠抗体，通过实施例1描述的IgE ELISA和类似的IgG ELISA 进行对IgE和IgG交叉反应性的平行比较。对于IgE ELISA，用5μg/ml 人IgE骨髓瘤涂布平板。对于IgG ELISA，用5μg/ml纯化的人IgG (Sigma试剂级人IgG)涂布平板。在上述两个ELISA中测试浓度为 0.5和0.1μg/ml的纯化豚鼠抗-15b的反应性。结果与从对照豚鼠血清 纯化的抗体和“无抗体”对照比较。当抗-15b抗体浓度为0.5μg/ml时， 在IgE中的A490值为1.126，在浓度为0.1μg/ml时为0.344。抗-15b抗 体在IgG中的A490值等于对照抗体和背景值。豚鼠抗-15b抗体对人IgG 没有交叉反应性。本发明的肽组合物不诱导识别IgG抗体的抗体，因 此是特异于IgE的同种型。它们将抑制IgE-介导的过敏反应，不产生 对IgG保护性抗体应答的不期望的免疫抑制。
实施例4
本发明的代表性肽偶合物
表4A所示的完全合成的本发明的免疫原性肽偶合物，通过实施例 列出的固相法合成。表中的各肽均可以由下式表示：(A)n-(Th)m-(B)o- (IgE-CH3区抗原)-X，但前面公开的其它通式表示的肽可以理解在本 发明的范围内。IgE-CH3区抗原序列是表4A肽中的SEQ ID NO:5、6、 或8，但应当理解来自其它哺乳动物物种的同源IgE-CH3区抗原序列在 本发明肽的范围内。该免疫原性肽含有来自外源病原体(例如，SEQ ID NO:20、87)的Th位点，还含有人工Th(例如，SEQ ID NOS:14、 18、21和90)。除了表4A所示的例子，可以从表5举例说明的混杂 Th位点中选择其它病原体-相关Th，可以从表6举例说明的Th位点中 选择人工Th。该实施例的各肽在免疫原性元件之间有Gly-Gly或(ε- N)Lys间隔区，但本发明的肽还可以含有其它间隔区(例如，SEQ ID NO:16)或没有间隔区。
这些实施例的肽还包括一种任选的Inv免疫刺激位点(例如，SEQ ID NOS:15-19和22)。然而应当理解，本发明不限于Inv作附加的免疫 刺激元件。如KLH结合物所示，本发明的肽偶合物还包括一种偶联于 一种载体蛋白质的IgE-CH3区抗原。 材料和方法
如实施例1所述合成、切除、环化和纯化表4A所列出的本发明的 代表性肽构建体(SEQ ID NOS:18、85、87、88、90和91)。配制所 述肽构建体，免疫小动物例如豚鼠或大动物例如猪或狒狒，用于评价 它们的免疫原性。将肽悬浮于0.5ml包含代表性乳化剂或佐剂例如 ISA51、ISA720、DDA或单磷脂酰脂类A(MPL)中液体。对于豚鼠 肽剂量为100μg，对于猪或狒狒为300μg，肌肉内接种动物。
如表4A的说明，动物在0、3和6周或0、2、和4周接受注射。 如实施例1所述通过人IgE或狗IgE ELISA评价初始免疫后8后取血的 实验血样对IgE的交叉反应性，除了对于狗IgE ELISA，使用1μg/ml 狗IgE骨髓瘤蛋白质(Bethyl Laboratories Inc.,Montgomery TX)涂布 平板，使用以预先确定的优化稀释度稀释的辣根过氧化酶标记的蛋白 质A/G试剂(Pierce Chemical Co.,Rockford IL)作为检测狗IgE的示 踪物。还评价了肽诱导的交叉反应物抑制IgE-介导的组胺释放的能力。 如实施例2中的详细描述，利用蛋白A亲合色谱从代表性免疫血清纯 化豚鼠、猪、或狒狒的IgG，进行功能分析确定通过过敏原-特异性IgE 对人嗜碱细胞致敏作用的抑制能力。分析端点表示为，与用特异于无 关抗原的抗原诱导的同一物种的对照抗体相比，IgE-介导的组胺释放的 抑制百分率，如表4B所示。 结果
代表性肽构建体均具有相关的免疫原性，所有被测试的肽均诱导 对相应的人IgE或狗IgE的强烈位点-指向交叉反应性，如抗-人IgE或 抗-狗IgE ELISA中Log10效价超过3所示(表4A)。通过抗-IgE肽抗 体通过嗜碱细胞抑制组胺释放的能力评价所示，豚鼠、猪、和狒狒抗 体均观察到抑制IgE-介导的致敏作用。狒狒抗体的该功能性交叉反应 性非常显著，因为狒狒IgG对人IgE的中和作用非常类似于人系统。 因此，本发明肽构建体作为通过主动免疫治疗过敏症的试剂的效果在 肽物种和目标物种高度同源的模型中说明。
实施例5
对小鼠的免疫和体内效果评价
用5组16只小鼠，通过下面列出的免疫和致敏方案评价SEQ ID NOS:24和25(37b和38b)肽的效果。
16只小鼠组(Balb/c)，雌性，8-10周龄，用本发明指示的肽组 合物皮下接种。在第0、3、6、和11周给小鼠20μg/0.2ml剂量。第一 个剂量用完全弗氏佐剂制备，随后的剂量用不完全弗氏佐剂制备。用 一种半抗原结合物——二苯基化KLH(DNP-KLH)在第7和10周使 小鼠致敏。通过腹膜内施用DNP-KLH的0.4％明矾液，5μg/0.2ml/剂 量，完成致敏。通过施用佐剂和磷酸盐缓冲的生理盐水在对照组中进 行模拟免疫和致敏。 各组如下： 1．免疫/模拟致敏，用肽37b和0.4％明矾 2．免疫/致敏，用肽37b和DNP-KLH 3．模拟免疫/致敏，用弗氏佐剂和DNP-KLH 4．免疫/模拟致敏，用肽38b和0.4％明矾 5．免疫/致敏，用肽38b和DNP-KLH
在第0、5、7、9、10、11、13、16、和20周收集血清。在第10 和11周从各组取两只小鼠制备脾细胞。
应用一种抗-小鼠IgG辣根过氧化酶结合物，用未结合肽37(小鼠 IgE-CH3取抗原肽，SEQ ID NO:8)涂布孔的微滴平板进行肽ELISA， 用DNP-BSA结合物涂布的微滴平板进行DNP ELISA，通过常规ELISA 分析监测对肽抗原和对DNP的IgG应答。通过常规IgG ELISA在用小 鼠单克隆IgE SPE 7(Sigma)涂布的平板上监测抗-37b抗体与小鼠IgE 的交叉反应性。在20周的全程中，比较各组对肽免疫原产生的IgG应 答对小鼠IgE的交叉反应性，通过本发明肽组合物的抗体应答的可逆性 和安全性证据确定10-20周中1)一级和二级应答，2)是否存在不期 望的IgG应答的免疫抑制，和3)是否发生所需的抗-IgE反应性的降低。
在第7、9、10、11、13、和16周，通过完全IgE ELISA和DNP- 特异性ELISA监测IgE应答。在第10和11周，通过DNA-特异性 ELISPOT分析记录分泌对DNP具特异性的IgE的脾细胞B细胞数。同 时，因为血清IgE水平不能完全推定过敏反应，即，IgE测定可能错过 对体内致敏性的显著影响，通过在大鼠中(异源PCA)小鼠血清的被 动经皮过敏反应分析测定小鼠的致敏作用。异源PCA优选为小鼠中固 有PCA分析，因为小鼠IgE与小鼠IgG相反，其选择性地使大鼠皮肤 巨细胞交叉致敏。因此，异源小鼠/大鼠PCA反应是是IgE-特异性的， 不会被可能在自体固有的小鼠PCA分析中发生的IgG-介导的过敏反应 混淆(Maekawa和Ovary,免疫学方法杂志，1984,71:229-239)。
比较各组IGE应答的免疫抑制和免疫抑制的同种型特异性的 ELISA、ELISPOT、和PCA结果。实验方法描述如下。 完全IgE ELISA
对于测定小鼠血清中总IgE的ELISA，用1μg/ml单克隆大鼠抗- 小鼠IgE,R35-72(Pharmingen)涂布微滴平板，如所述冲洗和封闭。 将连续稀释的小鼠血清加入平板并保温。通过与生物素酰化单克隆大 鼠抗-小鼠IgE,R35-118(Pharmingen)反应，然后连续加入抗生蛋白 链菌素-辣根过氧化酶(Pierce)和OPD，检测捕获的IgE。测定A492 的值。 DNP-特异性IgE ELISA
对于测定用DNP-KLH致敏的小鼠血清中DNP半抗原-特异性小鼠 IgE的ELISA，用5μg/ml DNP-BSA结合物(Molecular Probes,Inc) 涂布微滴平板的孔。如上述检测对DNP半抗原具特异的捕获的IgE。 DNP-特异性ELISPOT
对于测定分泌DNP半抗原-特异性小鼠IgE的B细胞的ELISPOT 分析，用5μg/ml DNP-BSA结合物涂布用0.45μm硝基纤维素滤纸串 接起来的无菌微滴平板的孔，例如MULTISCREEN HA平板(Millipore Inc.,cat.no.MAHAS4510)。将从致敏和对照小鼠中制备的连续稀释的 脾细胞加入孔中，在5％CO2下于37℃保温过夜。将细胞从平板中冲洗 出来，记录作为滤纸上固定点的DNP半抗原具特异性的IgE-分泌细 胞，然后用碱式磷酸酶结合的-大鼠单克隆抗体R35-118染色，利用5- 溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(Sigma)作为显色底物。 异源PCA
将来自免疫/致敏和对照小鼠的连续稀释血清皮内注射到背部剃光 毛的雄性Sprague-Dawley大鼠中。将稀释血清分10-12次注射给三组 平行麻醉动物的背部皮肤(50μl/部位)。各注射模式重复两只动物。 24小时潜伏期后，为了有效致敏皮肤巨细胞，静脉内注射1mg DNP- BSA的1％Evans蓝染料的PBS液激发大鼠。30分钟到1小时后，使大 鼠窒息并剥皮，以便可以在背部皮肤侧观察到呈蓝色的反应。从产生 容易确定斑点的最高血清稀释度确定PCA效价。
实施例6
小鼠的免疫和被动皮肤过敏反应的抑制
为了研究本发明免疫原性肽接种对IgE-介导的炎症反应的影响， 通过用本发明的肽接种小鼠诱导对小鼠IgE-CH3目标抗原位点，SEQ ID NO:8的抗体应答。然后用得到的小鼠抗血清抑制由结合大鼠巨细 胞的小鼠IgE的交叉反应引发的被动皮肤过敏反应(PCA)。 材料和方法
用本发明的肽组合物，SEQ ID NO:25如实施例5所述接种Balb/c 小鼠，除了仅在0、3、和6周给小鼠皮下注射，同时不对小鼠致敏。 在第8周，收集小鼠血清，通过小鼠IgE ELISA评价对IgE的交叉反应 性。小鼠IgE ELISA与实施例1中人IgE ELISA所述相同，除了微滴 平板的孔用1μg/ml小鼠抗-DNP IgE单克隆抗体SPE7(Sigma Chemical Co.,St.Louis MO)涂布，并使用辣根过氧化酶(HRP)-标记的山羊抗 -小鼠IgG(Kirkegaard和Perry Laboratories,Gaithersburg MD)检测捕 获的小鼠IgG。20只接种小鼠中的13只具有对小鼠IgE的交叉反应性 抗体。从抗小鼠IgE的ELISA效价≥2.3的7个小鼠中收集血清，用作 位点特异性-抗-IgE。
用10只Balb/c小鼠的另一组制备鼠IgE。该组接受单次腹膜内施 用1.0μg/0.2ml卵清蛋白(Oa)的0.4％明矾液。通过实施例5描述的 完全IgE ELISA，除了用Binding Site Inc.(San Diego,CA)提供的HRP- 标记的绵羊抗-小鼠IgE检测捕获的IgE，在第20天测定小鼠血清中的 IgE含量。在10只小鼠中，7只具有明显的IgE应答，效价≥log10 1.6。 收集这些血清用作抗-Oa IgE工作储备液。
IgE血清浓缩液用PBS连续稀释为1∶62,1∶124，和1∶248， 然后用等体积的位点特异性抗-IgE血清进一步稀释。因此，小鼠IgE 的最终稀释度为1∶124,1∶248，和1∶496，而小鼠抗-IgE的稀释度 为1∶2。制备的IgE的对照稀释液仅用PBS作为稀释液。
具有或不具有抗-IgE血清的IgE稀释液在37℃保温1小时，各取 50μl用于评价异源PCA反应。 结果
将稀释的小鼠IgE的50μl样品以每组两排四次注射的方式皮下注 射到大鼠脱毛背部。一排是仅在PBS中稀释到1∶124；1∶248；和1∶ 496的IgE的三个对照，平行的一排是与位点特异性抗-IgE保温的连续 稀释IgE。每排的第四次注射为单独PBS，作为观察组织损伤的对照。 该方式在两只大鼠上重复。
24小时后，静脉内注射1mg DNP-Oa结合物的1％Evans蓝染料诱 导PCA反应。1小时后，使大鼠窒息并剥皮。DNP-Oa过敏原交联大鼠 巨细胞上的受体结合的小鼠抗-Oa IgE。由交联引发的脱粒增强Evans 蓝染料的渗透力，然后在与脱粒范围成比例的大鼠皮下侧出现兰色 区。然而，当游离IgE被位点-特异性鼠抗-IgE减少后，就几乎不能使 大鼠巨细胞致敏，从而PCA反应被抑制。测量正确角度的两个方向上 大鼠皮下侧蓝色区的直径，然后取平均值，评价PCA反应。两只大鼠 上测定的两次PCA抑制结果在表7中显示。
按照对小鼠IgE固有敏感性的不同，区分大鼠，以便抑制PCA反 应的对照和抗-IgE能够在同一只大鼠中比较出来。对小鼠IgE上的目 标抗原位点具特异性的鼠抗血清在两只大鼠中均抑制小鼠IgE-介导的 PCA反应。因此，通过特异于非-人IgE的目标抗原位点的肽组合物免 疫获得的抗体应答导致相似非-人IgE介导的炎症反应的抑制。
表1  Sequence  224        230               240                     250     253b            260  Humanε (Seq ID No:1)  Dogε (Seq ID No:2)  Ratε (Seq ID No:3) Mouseε (Seq ID No:4) V C S R D F T P P T V K I L Q S S - C D G G G H F - P P T I Q L L C L V S G Y T P G T I N I A C A L N F I P P T V K L F H S S - C N - P V G D T H T T I Q L L C L I S G Y V P G D M E V A R P V N I T K P T V D L L H S S - C D - P N A F - H S T I Q L Y C F V Y G H I Q N D V S I V R P V T H S L S P P W S Y S I H R C D - P N A F - H S T I Q L Y C F I Y G H I L N D V S V     270                     280                 290                 300                  310  Humanε  (Seq ID No:1)  Dogε  (Seq ID No:2)  Ratε  (Seq ID No:3)  Mouseε  (Seq ID No:4) T W L E D G Q - V M D V D L S T A - S T T Q E G E L A S T Q S E L T L S Q K H W L S D R T Y I W L V D G Q K A T N I F P Y T A P G T K - E G N V T S T H S E L N I T Q G E W V S Q K T Y H W L M D D R K I Y D T H A Q N V - L I K E E G K L A S T Y S R L N I T Q Q Q W M S E S T F S W L M D D R E I T D T L A Q T V - L I K E E G K L A S T C S K L N I T E Q Q W M S E S T F                    320                 330                 340                 350  Humanε  (Seq ID:No:1)  Dogε  (Seq ID:No:2)  Ratε  (Seq ID:No:3)  Mouseε  (Seq ID:No:4) T C Q V - T Y Q G H T F E D S T K K C A D S N P R G V S A Y L S R P S P F D L F I R K S P T T C Q G F T F K D E A R K - - - - - C S E S D P R G V T S Y L S P P S P L D L Y V H K A P K T C K V - T S Q G E N Y W A H T R R C S D D E P R G V I T Y L I P P S P L D L Y E N G T P K T C R V - T S Q G C D Y L A H T R R C P D H E P R G A I T Y L I P P S P L D L Y Q N G A P K
表1(续)         360                 370                  380                390  Humanε (Seq ID:No:1) Dogε (Seq ID:No:2) Ratε (Seq ID:No:3) MouSeε (Seq ID:No:4) I T C L V V D L A P S K G T V N L T W S R A S G K P - V N H S T R K E E K Q R - N G T L T I T C L V V D L A T M E G M - N L T W Y R E S K E P - V N P G P L N K - K D H F N G T I T L T C L V L D L E S E E - N I T V T W V R E R K K S I G S A S Q R S T - K H H - N A T T S L T C L V V D L E S E - K N V N V T W N Q E - K K T S V S A S Q W Y T - K H H N N A T T S  400                410                 420                 430                    440  Human ε (Seq ID:No:1) Dog ε  (Seq ID:No:2) Ratε (Seq ID:No:3) MouSe ε (Seq ID:No:4) V T S T L P V G T R D W I E G E T Y Q C R V T H P H L P R A L M R S T T K T - S G P R A A P V T S T L P V N T N D W I E G E T Y Y C R V T H P H L P K D I V R S I A K A - P G K R A P P I T S I L P V D A K D W I E G E G Y Q C R V D H P H F P K P I V R S I T K A - L G L R S A P I T S I L P V V A K D W I E G Y G Y Q C I V D R P D F P K P I V R S I T K T Q P G Q R S A P             450                 460                  470                  480  Human ε (Seq ID:No:1) Dog ε (Seq ID:No:2) Rat ε (Seq ID:No : 3) Mouseε (Seq ID:No:4) E V Y A F A T P E W P G S R D K - R - T L A C L I Q N F M P E D I S V Q W L H N E V Q L P D D V Y L F L P P E - E E Q G T K D R V T L T C L I Q N F F P A D I S V Q W L R N D S P I Q T E V Y V F L P P E - E E E K N K - R - T L T C L I Q N F F P E D I S V Q W L Q D S K L I P K E V Y V F P P P E - E E S E D K - R - T L T C L I Q N F F P E D I S V Q W L G D G K L I S N
表1(续) 490                     500                  510                520  Humanε (Seq ID:No:1) Dogε (Seq ID:No:2) Ratε  (Seq ID:No:3) Mouseε (Seq ID:No:4) A R H S T T Q - P R K T K G S - - G F F V F S R L E V T R A E W-Q E K D E F I C R A V H E D Q Y - T T T G P H K V S G S R P A F F I F S R L E V S R V D W E Q-K N K F T C Q V V H E S Q H S T T T - P L K T N G S N Q R F F I F S R L E V T K A L W T Q T K Q-F T C R V I H E S Q H S T T T - P L K S N G - N Q G F F I F S R L E V A K T L W T Q R K Q-F T C Q V I H E  530              540  Human ε  (Seq ID:No:1) Dog ε  (Seq ID:No:2) Rat ε (Seq ID:No:3) Mouse ε (Seq ID:No:4) A A S P S Q T V Q R A V S V N P G K A L S G S R A L R E P R A L Q K P R “Human”表示“人类”；“Dog”表示“狗”；“Rat”表示“大鼠”；“Mouse”表 示“小鼠”。
表2 筛选IgE CH2/3肽，用于选择候选IgE抗原     IgE来源的目标抗原位点 连接于目标抗原位点 的免疫刺激序列 与人IgE的 交叉反应性     编号；描述↑     氨基酸序列 Log20 ELISA 效价   对     HuIgE  1  CH2/3 (328-376) (C358→S) CADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVDLAPSKGTVNLTWSR     (SEQ ID NO:28) a     KLH     3.66  2  CH2/3 (317-376) (C358→S) QGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVDLAPSKGTV NLTWSR     (SEQ ID NO:29) a     KLH     5.08  b     1,4,9  Palindromic Th lib-GG     3.77  3 CH2/3(313-376) (C358→S) QVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVDLAPS KGTVNLTWSR     (SEQ ID NO:30) a     KLH     3.12  4  CH2/3(301-376) (C356→S) QKHWLSDRTYTSQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSP TITSLVVDLAPSKGTVNLTWSR     (SEQ ID NO:31)  a     KLH     4.04  5  CH2/3(328-362) (C358→S) CADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVD     (SEQ ID NO:32) a     KLH     4.40  6  CH2/3(317-362) (C358→S) QGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVD     (SEQ ID NO:33) a     KLH     4.30
表2(续)     IgE来源的目标抗原位点 连接于目标抗原位点 的免疫刺激序列     与人IgE的     交叉反应性     编号；描述↑     氨基酸序列 Log10 ELISA效价 对     HuIgE  7  CH2/3 (313-362) (C358→S) QVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTITSLVVD     (SEQ ID NO:34) a     KLH     3.92  8  CH2/3 (301-362) (C358→S) QKHWLSDRTYTSQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPT ITSLVVD     (SEQ ID NO:35) a     KLH     3.37  9  CH2/3 (328-356) CADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTI     (SEQ ID NO:36) a     KLH     3.49  10  CH2/3 (317-356) QGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTI     (SEQ ID NO:37) a     KLH     4.71 b     HBS19-32Th-GG     3.76 c  Inv-GG-HBs 19-32Th-GG     2.94  11  CH2/3 (313-356) QVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPTI     (SEQ ID NO:38) a     KLH     4.31  12  CH2/3 (301-356) (C322→S) QKHWLSDRTYTSQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPT I     (SEQ ID NO:39) a     KLH     2.79  13  CH2/3(301-376) QKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRKSPT  ITCLVVDLAPSKGTVNLTWSR     (SEQ ID NO:40) a     KLH     3.77  14 (C)CH3 (391-398)  (C)* (C)KQRNGTLT(C)     (SEQ ID NO:41) b HBs19-32Th-GG     1.47 c  Inv-GG- HBS19-32Th-GG     0.77
表2(续)     IgE来源的目标抗原位点 连接于目标抗原位点 的免疫刺激序列 与人IgE的 交叉反应性     编号；描述↑     氨基酸序列 Log10 ELISA效价 对HuIgE  c  Inv-GG- HBs19-32Th-GG     0.77  15 (C) CH3(413- 435)(C)*(C418→S) (C)GETYQSRVTHPHLPRALMRSTTK(C)     (SEQ ID NO:5)  b  Syn Th(1,2,4)-     GG     4.24  c  Inv-GG-Syn Th (1,2,4)-GG     4.17  16  CH2/3 (301-345) QKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVSAYLSRPSP     (SEQ ID NO:42)  b     HBs19-12Th-GG     2.31  17  (C)CH3(365-396)  (C)* (C)PSKGTVNLTWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGT(C)     (SEQ ID NO:43)  b     HBs19-32Th-GG     ＜1.0  18  (C)CH3(404-434)  (C)* (C)PVGTRDWIEGETYQCWTHPHLPRALMRSTT (C)     (SEQ ID NO:44)  b     HBs19-32Th-GG     ＜1  19  CH3(432-445)  STTKTSGPRAAPEV     (SEQ ID NO:45)  b     HBs19-32Th-GG     2.725  20  (C)CH3(374-382-  (C)-383-385)* (C)WSRASGKPV(C)NHS     (SEQ ID NO:46)  b     HBs19-32Th-GG     3.976  21  CH3(345-357)* (C)PSPFDLFIRKSPT(C)     (SEQ ID NO:83)  b HBs19-32Th-GG     ＜1Δ  c     InV-GG-HBs19-32     32Th-GG  22 (C)CH3(343-360)* (C)SRPSPEDLFIRKSPTITC     (SEQ ID NO:47)  b     HBs19-32Th-GG     ＜1Δ  c  Inv-GG-HBs19-     32Th-GG  23 (C)CH3 (404-413) (P)(C)* (C)VGTDWIEGE(P)(C)     (SEQ ID NO:48)  b HBs19-32Th-GG     ＜1Δ
表2(续)     IgE来源的目标抗原位点 连接于目标抗原位点 的免疫刺激序列 与人IgE的 交叉反应性     编号；描述↑     氨基酸序列 Log10 ELISA效价 对HuIgE c  Inv-GG-HBs19-     32 Th-GG  24  (C)(P)CH3 (403- 413)(P)(C)* (C)(P)PVGTRDWIEGE(P)(C)     (SEQ ID NO:49) b  HBs19-32Th-GG     ＜1Δ c  Inv-GG-HBs19-     32 Th-GG  25 (C)CM3 (387-400) (C)* (C)KEEKQRNGTLTVTS(C)     (SEQ ID NO:50) b  HBs19-32Th-GG     ＜1Δ c  Inv-GG-HBs19-     32 Th-GG  26  CH3 (387-394) KEEKQRNG     (SEQ ID NO:51) b  HBs19-32Th-GG     ＜1 c  Inv-GG-HBs19-     32 Th-GG  27  (C)CH3 (373- 381)(C)* (C)WSRASGKPV(C)     (SEQ ID NO:52) b  HBs19-32Th-GG     2.40Δ c  Inv-GG-HBs19-     32 Th-GG  28  CH3(354-373)(C)* PTITCLVLDLAPSKGTVNLT(C)     (SEQ ID NO:53) b  HBs19-32Th-GG     2.59  29  CH3(354-369) PTITQLVLDLAPSKGT    (SEQ ID NO:54) b  HBs19-32Th-GG     2.39  30  CH3(399-424) TSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPH(SEQ ID NO:55) b  HBs19-32Th-GG     4.01
表2(续)     IgE来源的目标抗原位点 连接于目标抗原位点 的免疫刺激序列 与人IgE的 交叉反应性     编号；描述↑     氨基酸序列 Log10 ELISA效价 对HuIgE  31  CH3(354-368)(C)* (C358→S)(D362→C) PTITSLVLCLAPSKG(C)     (SEQ ID NO:56) b  HBs19-32Th-GG     ＜1  32 (C)CH3(370- 390)(C)* (C)VNLTWSRASGKPVNHSTRKEE(C)     (SEQ ID NO:57) b  HBs19-32Th-GG     3.45  33 (C)CH3(373-424)* (C)TWSRASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLTVTSTLPVGTRDWIEGETYQCRVTHPH     (SEQ ID NO:58) b  HBs19-32Th-GG     2.33  34  CH4(497-506) KTKGSGFFVF     (SEQ ID NO:59) b  HBs19-32Th-GG+ MVF288-302Th-GG+ PT149-176Th-GG     ＜1 *=环化肽 ↑=表1,SEQ ID NO.1的氨基酸残基编号 △="b"和"c"肽的混合物的交叉反应结果 (C)=导入天然序列用于环化的半胱氨酸 C→S=取代半胱氨酸的丝氨酸，D→C=取代天冬氨酸的半胱氨酸
表3 抑制组胺释放的抗-IgE抗体的评价 IgE抗原 编号     IgE抗原描述     (SEQ ID NO)     连接于IgE抗原的     免疫源性元件 组胺释放 抑制百分率  1  CH2/3(328-376)(C353→S)     (SEQ ID NO:28) a     KLH     0  2 CH2/3(317-376)(C358→S)     (SEQ ID NO:29) a     KLH     14％ b  1,4,9 PALINDROMIC Th-GG- 17％and 0  5  CH2/3(328-362)(C358→S)     (SEQ ID NO:32) a     KLH     0  6  CH2/3(317-362)(C358→S)     (SEQ ID NO:33) a     KLH     0  7  CH2/3(313-362)(C358→S)     (SEQ ID NO:34) a     KLH     6％  8  CH2/3(301-362)(C358→S)     (SEQ ID NO:35) a     KLH     6％ 11  CH2/3(313-356)     (SEQ ID NO:38) a     KLH     6％ 15 (C)CH3(413-435)(C)* (C418→S)     (SEQ ID NO:5) b     Syn Th(1,2,4)-GG  58％and     71％- C  Inv-GG-Syn Th (1,2,4)-GG- 20 (C)CH3 (374-382-(C)-383- 385)*     (SEQ ID NO:46) b     HBs19-32Th-GG     0 30  CH3 (399-424)     (SEQ ID NO:55) b     HBs19-32Th-GG-  9％and 0 32 (C)CH3 (370-390)(C)*     (SEQ ID NO:57) b     HBs19-32Th-GG-     0 *环化肽 (C)引入天然序列用于环化的半胱氨酸 (C→S)取代半胱氨酸残基的丝氨酸     ≠合并的抗-15b和抗-15c IgG显示的结果 ↑从8周收集的血清纯化的抗肽抗体对组胺释放的抑制，除了注的例外 12周收集的抗肽抗体对组胺释放的抑制
表4A 本发明的代表性肽     IgE-CH3     抗原 SEQ ID NO     描述， 免疫刺激序列的 SEQ ID NO(S)     肽的氨基酸序列和SEQ ID NO SEQ ID NO:5 Syn Th(1,2,4)-GG- SEQ ID NO:9 KKKIITITRIITIITTIDGGCGETYQSRVTHPHLPRALMRSTTKC     (SEQ ID NO:14) SEQ ID NO:5  InV-GG-Syn  Th(1,2,4)-GG- SEQ ID NOS:13,9 TAKSKKFPSYTATYQFGGKKKIITITRIITIITTIDGGCGETYQSRVTHPHLPRALMRSTTKC     (SEQ ID NO:15) SEQ ID NO:5  CT Pll Th-GG-Syn  Th(1,2,4)1-GG- SEQ ID NOS:12,9 TINKPKGWGKEGGKKKIITITRIITIITTIDGGCGETYQSRVIHPHLPRALMRSTTKC     (SEQ ID NO:17) SEQ ID NO:5 IS(1,4,9 PAL↑)LF 简化的Th-GG- SEQ ID NO:60 ISISEIKGVIVHKIEGILFGGCGETYQSRVIHPHLPRALMRSTTKC    T  RT  TR   T     (SEQ ID NO:18) SEQ ID NO:5  Inv-IS(1,4,9 PAL↑)LF 简化的Th-GG- SEQ ID NOS:13,60 TAKSKKFPSYTATQFGGISISEIKGVIVHKIEGILFGGCGETYQSRVIHPHLPRALMRSTIKC     T  RT  TR  T     (SEQ ID NO:19) SEQ ID NO:5 (CT Pll Th)-GG- IS(1,4,9 PAL↑)LF 简化的Th-GG- SEQ ID NOS:12,60 TINKPKGYVGKEGGISISEIKGVIVHKIEGILFGGCGETYQSRVTHPHLPRAMRSTTKC  T  RT   TR  T     (SEQ ID NO:20)
表4A(续) SEQ ID NO:5 (1,4,9 PAL↑)Th-GG- SEQ ID NO:10            ISEIKGVIVHKIEGIGGCGETYQSRVIHPHLPPAILMRSTTKC  MT   RT  TRM  TM  L L V    (SEQ ID NO:21) SEQ ID NO:5  Inv-(1,4,9 PAL↑)Th- GG-SEQ ID NOS:13,10  TAKSKKFPSYTATYQFGGISEIKGVIVHKIEGIGGCGETYQSRVTHPHLPRALMRSTTKC  MT   RT  TRM  TM  L L V    (SEQ ID NO:22) SEQ ID NO:5 (CT Pll Th)-(1,4,9  PAL↑)Th-GG-SEQ ID  NOS:12,10  TINKPKGYVGKEGGISEIKGVIVHKIEGIGGCGETYQSRVTHPHLPRALMRSTTKC        MT  RT   TRM  TM     L L V    (SEQ ID NO:23) SEQ ID NO:5  CTRllTh-GG-IS(1,4,9, PAL↑)LF简化的 Th-GG- SEQ ID NOS:12,60  TINKPKGYVGKEGGISISEIKGVIVHKIEGILFGGCGETYQSRVTHPHLPRALMRSTTKC   T  RT   TR  T     (SEQ ID NO:85) SEQ ID NO:5  klh*-KKK- [klh*]-KKKCGETYQSRVTHPHLPRALMRSTTKC SEQ ID NO:8  klh*-KKK- [klh*]-KKKCGYGYQSIVDRPDFPKPIVRSITKC SEQ ID NO:8  IS(1,4,9 PAL↑)LF 简化的Th-GG- SEQ ID NO:60  ISISEIKGVIVHKIEGILFGGCGYGYQSIVDRPDFPKPIVRSITKC     T  RT   TR   T     (SEQ ID NO:24) SEQ ID NO:8  Syn Th(1,2,4)-GG- SEQ ID NO:9  KKKIITITRIITIITTIDGGCGYGYQSIVDHPDFPKPIVRSITKC     (SEQ ID NO:25) SEQ ID NO:6  klh*-KKK- [klh*]-KKKCGETYYSRVTHPHLPKDIVRSIAKC SEQ ID NO:6  Syn Th(1,2,4)-GG- SEQ ID NO:9  KKKIITITRIITIITTIDGGCGETYYSRVTHPHLPKDIVRSIAKC     (SEQ ID NO:26)
表4A(续) SEQ ID NO:6  IS(1,4,9 PAL↑)LF Th- GG-SEQ ID NO:11  ISISEIKGVIVHKIEGILFGGCGETYYSRVTHPHLPKDIVRSIAKC  MT     RI    TRM  TM  L    L   V(SEQ ID NO:27) SEQ ID NO:6  SMTPITh-K-Syn Th (1,2,3)-K-SEQ ID  NOS:86,60  KWFKTNAPNGVDEKIRIεKKKKIITITRIITIITTIDεKCGETYYSRVTHPHLPKDIVRSIAKC     (SEQ ID NO:87) SEQ ID NO:6  CTP11Th-εK-Syn  Th(1,2,4)-εK-SEQ ID  NOS:12,9  TINKPKGYVGKEεKKKKIITITRIITIITTIDεKCGETYYSRVTHPHLPKDIVRSIAKC     (SEQ ID NO:88) SEQ ID NO:6  ArTMVFTh-εK- SEQ ID NO:89  ISLTEIRTVIVTRLETVLFεKCGETYYSRVTHPHLPKDIVRSIAKC     (SEQ ID NO:90) SEQ ID NO:6  SMTPITh-εK- ArtMVFTh-εK- SEQ ID NOS:86,89  KWFKTNAPNGVDEKIRIεKISLTEIRTIVIVTRLETVLFεKCGETYYSRVTHPHLPKDIVRSIA  KC     (SEQ ID NO:91) *klh=匙孔冒贝血蓝蛋白，化学连接(参见实施例1) ↑=复发的(palindromic)
表4(B) 本发明的肽构建体的免疫原性 肽构建体的 SEQ ID NO 免疫的物种 对IgE的位点-指向 交叉反应性 (Log10滴度) ％HRc     ％HRd     抑制 人IgEgE 目标物  SEQ ID NO:18     GPa     4.4e     1     96  SEQ ID NO:85     GPa     4.2e     3     87  SEQ ID NO:18     Piga     4.1e     3     84  SEQ ID NO:18  Baboona     4.8e     8     53 狗IgE 目标物  SEQ ID NO:87     GPb     3.4f     NT     NT  SEQ ID NO:88     GPc     3.2f     NT     NT  SEQ ID NO:90     GPd     3.2f     NT     NT  SEQ ID NO:91     GPb     3.2f     NT     NT a豚鼠，猪和狒狒用人IgE肽构建体在0,3和6周接种，第8周收集的血清进行人IgE ELISA检测和HR抑制． b豚鼠用狗IgE肽构建体在0,2和4周接种，第6周收集血清，进行狗IgE ELISA． c平均％HR d％HR抑制=对照-％HR/对照×100 GP：豚鼠 NT：未检测
表5 外源病原体来源的Th表位的氨基酸序列 Th描述 SEQ ID NO     氨基酸序列     MVF288-302 Th     61  LSEIKGVIVHRLEGV     MVF258-277 Th     62  GILESRGIKARITHVDTESY      TT830-844 Th     63  KKQYIKANSKFIGITEL      TT947-966 Th     64  KKFNNFTVSFWLRVPKVSASHL      PT149-176 Th     65  KKLRRLLYMIYMSGLAVRVHVSKEEQYYDY      TT73-99 Th     66  YDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIK      PT18-41 Th     67  GAYARCPNGTRALTVAELRGNAEL      HBs 19-32 Th     68  FFLLTRILTI PQSLD      HBc120-140 Th     69  VSFGVWIRTPPAYRPPNAPIL      HBc21-40 Th     70  SDFFPSVRDLLDTASALYRE     HBc50-69 Th     71  PHHTALRQAILCWGELMTLA     TT615-631 Th     72  WVRDIIDDFTNESSQKT  HIV gp41 Th6 (N-)     73  RAGRAILHIPTRIRQGLER  HIV gp41 Th6 (C-)     74  AVAEGTDRVIEVLQRAGRAIL     CT A8106-130 Th     75  ALNIWDRFDVFTLGATSGYLKGNS     CT pll Th     12  TINKPKGYVGKE     DT1 Th     76  DSETADNLEKTVAALSILPGHG     DT4 Th     77  EEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAATNFVESC     PF Th     78  DIEKKIAKMEKASSVFNVVNS     SM Th     79  KWFKTNAPNGVDEKIRI     TraT1 Th     80  GLQGKIADAVKAKG     TraT4 Th     81  GLAAGLVGMAADAMVEDVN     TraT6 Th     82  STETGNQHHYQTRVVSNANK     SMTPI Th     86  KWFKTNAPNGVDEKIRI
表6 代表性人工Th表位和SSAL的氨基酸序列 Th描述 SEQ ID NO： 氨基酸序列 (1,4,9 PALINDROMIC)Th  10  ISEIKGVIVHKIEGI  MT  RT   TRM TM  L  L  V  Syn Th(1,2,4)  9  KKKIITITRIITIITTID  IS(1,4,9 PALINDROMIC)LF 简化的    Th  60  ISISEIKGVIVHKIEGILF     T  RT   TR  T IS(1,4,9 PALINDROMIC)LF Th  11  ISISEIKGVIVHKIEGILF    MT  RT   TRM TM     L L V  ArtMVF Th  89 ISLTEIRTVIVTRLETVLF
表7 PCA反应的抑制 IgE 稀释度 大鼠#5 大鼠#6 没有抗-IgE (mm) 抗-IgE  1∶2(mm) 没有抗-IgE (mm) 抗-IgE  1∶2(mm) 0  0 0  0  0 1∶496  0 0  4.3  0 1∶248  0 0  7.0  6.0 1∶124  11 4* 13.0  12.7 *极浅的蓝
序列表 一般信息： (ⅰ)申请人：UNITED BIOMEDICAL INC.,ET AL (ⅱ)发明名称：作为免疫原治疗过敏症的肽组合物 (ⅲ)序列数目：91 (ⅳ)通讯地址：
(A)地址：Morgan & Finnegan
(B)街道：345 Park Avenue
(C)城市：New York
(D)州：NY
(E)国家：USA
(F)邮政编码：10154-0054 (ⅴ)计算机可读形式：
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：WORD 8.0 (ⅵ)在先申请数据：
(A)申请号：US 09/100,287
(B)申请日：20 JUNE 1998
(C)分类号：514 (ⅶ)当前申请数据：
(A)申请号：待定
(B)申请日：21-JUN-1999
(C)分类号： (ⅷ)律师/代理人资料：
(A)姓名：MARIA C.H.LIN
(B)注册号：29,323
(C)参考/案卷号：1151-4155PC1 (ⅸ)电讯信息：
(A)电话：212-758-4800
(B)传真：212-751-6849 (2)SEQ ID NO:1的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：325氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：人IgE的ε链 (ⅹ)参考文献：Dorrington和Bennich,免疫学综述(Immunol Rev.),1978,41:3-25 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 1: Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys    1             5                  10 Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe
    15                   20 Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly  25                  30                 35 Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu
        40                   45 Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala
50                  55                   60 Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln
            65                   70 Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser
    75                  80 Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly 85                  90                   95 His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp
        100                105 Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg
110                 115                 120 Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro
            125                 130 Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro Ser
    135                 140 Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser 145                150                 155 Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu
        160                 165 Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr
170                 175                 180 Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu
            185                 190 Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro
    195                 200 Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly 205                 210                 215 Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr
        220                 225 Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu
230                 235                240 Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile
            245                 250 Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro
    255                 260 Asp Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr 265                 270                 275 Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu
        280                  285 Val Thr Arg Ala Glu Trp Gln Glu Lys Asp Glu Phe
290                 295                 300 Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser
            305                 310 Gln Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly
    315                 320 Lys 325 (2)SEQ ID NO:2的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：312氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：狗IgE的ε链 (ⅹ)参考文献：Patel等，免疫遗传学(Immunogenetics),1995,41:282-286 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 2: Ala Cys Ala Leu Asn Phe Ile Pro Pro Thr Val Lys  1               5                  10 Leu Phe His Ser Ser Cys Asn Pro Val Gly Asp Thr
    15                  20 His Thr Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Ile Ser Gly 25                   30                  35 Tyr Val Pro Gly Asp Met Glu Val Ile Trp Leu Val
         40                 45 Asp Gly Gln Lys Ala Thr Asn Ile Phe Pro Tyr Thr
 50                 55                   60 Ala Pro Gly Thr Lys Glu Gly Asn Val Thr Ser Thr
             65                  70 His Ser Glu Leu Asn Ile Thr Gln Gly Glu Trp Val
    75                   80 Ser Gln Lys Thr Tyr Thr Cys Gln Gly Phe Thr Phe 85                   90                 95 Lys Asp Glu Ala Arg Lys Cys Ser Glu Ser Asp Pro
       100                  105 Arg Gly Val Thr Ser Tyr Leu Ser Pro Pro Ser Pro
110                 115                 120 Leu Asp Leu Tyr Val His Lys Ala Pro Lys Ile Thr
            125                 130 Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Thr Met Glu Gly Met
    135                 140 Asn Leu Thr Trp Tyr Arg Glu Ser Lys Glu Pro Val 145                 150                 155 Asn Pro Gly Pro Leu Asn Lys Lys Asp His Phe Asn
        160                165 Gly Thr Ile Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Asn
170                175                  180 Thr Asn Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Tyr Cys
            185                 190 Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Lys Asp Ile Val
   195                  200 Arg Ser Ile Ala Lys Ala Pro Gly Lys Arg Ala Pro 205                 210                  215 Pro Asp Val Tyr Leu Phe Leu Pro Pro Glu Glu Glu
        220                 225 Gln Gly Thr Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Leu
230                 235                240 Ile Gln Asn Phe Phe Pro Ala Asp Ile Ser Val Gln
            245                 250 Trp Leu Arg Asn Asp Ser Pro Ile Gln Thr Asp Gln
     255                260 Tyr Thr Thr Thr Gly Pro His Lys Val Ser Gly Ser 265                 270                275 Arg Pro Ala Phe Phe Ile Phe Ser Arg Leu Glu Val
         280                285 Ser Arg Val Asp Trp Glu Gln Lys ASh Lys Phe Thr
290                 295                 300 Cys Gln Val Val His Glu Ala Leu Ser Gly Ser Arg
           305                  310 (2)SEQ ID NO:3的信息：
(ⅰ)序列特征：
    (A)长度313氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓扑构型：线形
(ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：大鼠IgE的ε链 (ⅹ)参考文献：Steen等，分子生物学杂志，1984,177:19-32 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 3: Ala Arg Pro Val Asn Ile Thr Lys Pro Thr Val Asp  1               5                  10 Leu Leu His Ser Ser Cys Asp Pro Asn Ala Phe His
    15                   20 Ser Thr Ile Gln Leu Tyr Cys Phe Val Tyr Gly His 25                   30                 35 Ile Gln Asn Asp Val Ser Ile His Trp Leu Met Asp
        40                   45 Asp Arg Lys Ile Tyr Asp Thr His Ala Gln Asn Val
50                  55                   60 Leu Ile Lys Glu Glu Gly Lys Leu Ala Ser Thr Tyr
            65                  70 Ser Arg Leu Asn Ile Thr Gln Gln Gln Trp Met Ser
    75                  80 Glu Ser Thr Phe Thr Cys Lys Val Thr Ser Gln Gly 85                  90                   95 Glu Asn Tyr Trp Ala His Thr Arg Arg Cys Ser Asp
        100                 105 Asp Glu Pro Arg Gly Val Ile Thr Tyr Leu Ile Pro
110                 115                 120 Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr Glu Asn Gly Thr Pro
            125                  130 Lys Leu Thr Cys Leu Val Leu Asp Leu Glu Ser Glu
    135                 140 Glu Asn Ile Thr Val Thr Trp Val Arg Glu Arg Lys 145                150                  155 Lys Ser Ile Gly Ser Ala Ser Gln Arg Ser Thr Lys
       160                  165 His His Asn Ala Thr Thr Ser Ile Thr Ser Ile Leu
170                 175                 180 Pro Val Asp Ala Lys Asp Trp Ile Glu Gly Glu Gly
            185                  190 Tyr Gln Cys Arg Val Asp His Pro His Phe Pro Lys
    195                  200 Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys Ala Leu Gly Leu 205                 210                 215 Arg Ser Ala Pro Glu Val Tyr Val Phe Leu Pro Pro
        220                 225 Glu Glu Glu Glu Lys Asn Lys Arg Thr Leu Thr Cys
230                 235                 240 Leu Ile Gln Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Ser Val
            245                  250 Gln Trp Leu Gln Asp Ser Lys Leu Ile Pro Lys Ser
    255                260 Gln His Ser Thr Thr Thr Pro Leu Lys Thr Asn Gly 265                 270                 275 Ser Asn Gln Arg Phe Phe Ile Phe Ser Arg Leu Glu
       280                  285 Val Thr Lys Ala Leu Trp Thr Gln Thr Lys Gln Phe
290                 295                 300 Thr Cys Arg Val Ile His Glu Ala Leu Arg Glu Pro
            305                 310 Arg (2)SEQ ID NO:4的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：313氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：蛋白质 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：小鼠IgE的ε链 (ⅹ)参考文献：Ishida等,EMBO,1982,1:1117-1123 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 4: Val Arg Pro Val Thr His Ser Leu Ser Pro Pro Trp  1              5                   10 Ser Tyr Ser Ile His Arg Cys Asp Pro Asn Ala Phe
    15                   20 His Ser Thr Ile Gln Leu Tyr Cys Phe Ile Tyr Gly 25                  30                   35 His Ile Leu Asn Asp Val Ser Val Ser Trp Leu Met
         40                  45 Asp Asp Arg Glu Ile Thr Asp Thr Leu Ala Gln Thr
50                  55                  60 Val Leu Ile Lys Glu Glu Gly Lys Leu Ala Ser Thr
             65                 70 Cys Ser Lys Leu Asn Ile Thr Glu Gln Gln Trp Met
    75                  80 Ser Glu Ser Thr Phe Thr Cys Arg Val Thr Ser Gln 85                  90               95 Gly Cys Asp Tyr Leu Ala His Thr Arg Arg Cys Pro
        100             105 Asp His Glu Pro Arg Gly Ala Ile Thr Tyr Leu Ile
110            115                      120 Pro Pro Ser Pro Leu Asp Leu Tyr Gln Asn Gly Ala
        125                     130 Pro Lys Leu Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Glu Ser
    135                 140 Glu Lys Asn Val Asn Val Thr Trp Asn Gln Glu Lys 145                 150                 155 Lys Thr Ser Val Ser Ala Ser Gln Trp Tyr Thr Lys
        160                 165 His His Asn Asn Ala Thr Thr Ser Ile Thr Ser Ile
170                 175                 180 Leu Pro Val Val Ala Lys Asp Trp Ile Glu Gly Tyr
           185                  190 Gly Tyr Gln Cys Ile Val Asp Arg Pro Asp Phe Pro
    195                200 Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys Thr Pro Gly 205                210                  215 Gln Arg Ser Ala Pro Glu Val Tyr Val Phe Pro Pro
        220                 225 Pro Glu Glu Glu Ser Glu Asp Lys Arg Thr Leu Thr
230                 235                 240 Cys Leu Ile Gln Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Ser
            245                 250 Val Gln Trp Leu Gly Asp Gly Lys Leu Ile Ser Asn
    255                 260 Ser Gln His Ser Thr Thr Thr Pro Leu Lys Ser Asn 265                 270                 275 Gly Asn Gln Gly Phe Phe Ile Phe Ser Arg Leu Glu
        280                 285 Val Ala Lys Thr Leu Trp Thr Gln Arg Lys Gln Phe
290                 295                  300 Thr Cys Gln Val Ile His Glu Ala Leu Gln Lys Pro
            305                 310 Arg (2)SEQ ID NO:5的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 5: Cys Gly Glu Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro  1              5                   10 His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys
    15                  20 Cys  25 (2)SEQ ID NO:6的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 6: Cys Gly Glu Thr Tyr Tyr Ser Arg Val Thr His Pro    1             5                   10 His Leu Pro Lys Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys
    15                   20 Cys  25 (2)SEQ ID NO:7的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25氨基酸
(B)类型氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 7: Cys Gly Glu Gly Tyr Gln Ser Arg Val Asp His Pro  1               5                  10 His Phe Pro Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys
    15                   20 Cys  25 (2)SEQ ID NO:8的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 8: Cys Gly Tyr Gly Tyr Gln Ser Ile Val Asp Arg Pro 1                5                  10 Asp Phe Pro Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Leu
    15                  20 Cys  25 (2)SEQ ID NO:9的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：18氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 9: Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr  1               5                  10 Ile Ile Thr Thr Ile Asp
    15 (2)SEQ ID NO:10的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：15氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅰⅩ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：2
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：5
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：6
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：10
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：11
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：12
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：14
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：15
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Val" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 10: Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa  1               5                  10 Glu Xaa Xaa
     15 (2)SEQ ID NO:11的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度19氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：3
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注="Ser或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：7
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：8
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：12
(D)其它信息：/注="His或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：13
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：14
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：16
(D)其它信息/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：17
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Val" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 11: Ile Ser Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa  1               5                  10 Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Leu Phe
    15 (2)SEQ ID NO:12的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：12氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 12: Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu  1                5                 10 (2)SEQ ID NO:13的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：16氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 13: Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala  1               5                  10 Thr Tyr Gln Phe
     15 (2)SEQ ID NO:14的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：45氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 14: Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr  1               5                  10 Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Cys Gly Glu Thr
     15                 20 Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg 25                   30                 35 Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys
        40                  45 (2)SEQ ID NO:的信息15: (ⅰ)序列特征：
(A)长度：63氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 15: Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala  1               5                   10 Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Lys Lys Lys Ile Ile Thr
     15                 20 Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Thr Ile Asp 25                  30                   35 Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr
        40                  45 His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr
50                  55                   60 Thr Lys Cys (2)SEQ ID NO：的信息16： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：6氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 16: Pro Pro Xaa Pro Xaa Pro    1                 5 (2)SEQ ID NO:17的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：59氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 17: Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu 1                5                  10 Gly Gly Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile
    15                   20 Ile Thr Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Cys Gly 25                  30                   35 Glu Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro His Leu
        40                   45 Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys
 50                  55 (2)SEQ ID NO:18的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：46氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注="Ser或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：7
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：8
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：12
(D)其它信息：/注="His或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：13
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：16
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 18: Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa  1              5                  10 Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Gly Gly Cys Gly Glu
    15                  20 Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro 25                  30                   35 Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys
         40                 45 (2)SEQ ID NO:19的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：63氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：21
(D)其它信息：/注="Ser或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：24
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：25
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：29
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：30
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：33
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 19: Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala  1              5                   10 Thr Gln Phe Gly Gly Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa
   15                   20 Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe 25                  30                  35 Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr
        40                   45 His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr
50                   55                 60 Thr Lys Cys (2)SEQ ID NO:20的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：60氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：18
(D)其它信息：/注="Ser或Thr"
(ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：21
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：22
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：26
(D)其它信息：/注="His或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：27
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：30
(D)其它信息：/注="GLy或Thr" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 20: Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu  1               5                 10 Gly Gly Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile
    15                   20 Val Xaa Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Gly Gly Cys 25                  30                   35 Gly Glu Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro His
        40                   45 Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys
 50                  55                  60 (2)SEQ ID NO:21的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：42氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：1
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：2
(D)其它信息：/注="Ser或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：5
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：6
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：10
(D)其它信息：/注="His或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置11
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：12
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：14
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：15
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Val" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 21: Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa Xaa Xaa 1               5                   10 Glu Xaa Xaa Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr Gln Ser
     15                  20 Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu Met  25                  30                  35 Arg Ser Thr Thr Lys Cys
         40 (2)SEQ ID NO:22的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：60氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：19
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：20
(D)其它信息：/注="Ser或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：23
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：24
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：28
(D)其它信息：/注="His或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：29
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：30
(D)其它信息：/注="Ile、Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：32
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：33
(D)其它信息：/注="Ile、Met或Val" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 22: Thr Ala Lys Ser Lys Lys Phe Pro Ser Tyr Thr Ala  1                   5               10 Thr Tyr Gln Phe Gly Gly Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa
         15              20 Val Ile Val Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Gly Gly Cys 25                   30                  35 Gly Glu Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro His
        40                   45 Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys
50                   55                 60 (2)SEQ ID NO:23的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：56氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：15
(D)其它信息：/注="Ile,Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：16
(D)其它信息：/注="Ser或Thr" (ⅸ)特征:
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：19
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：20
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：24
(D)其它信息：/注="His或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：25
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：26
(D)其它信息：/注="Ile、Met或Leu" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：28
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：29
(D)其它信息：/注="Ile、Met或Val" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 23: Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu 1                5                   10 Gly Gly Xaa Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa
     15                  20 Xaa Xaa Glu Xaa Xaa Gly Gly Cys Gly Glu Thr Tyr 25                  30                  35 Gln Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala
        40                   45 Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys
50                   55 (2)SEQ ID NO:24的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：46氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注="Ser或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：7
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：8
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：12
(D)其它信息：/注="His或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：13
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：16
(D)其它信息/注="Gly或Thr" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 24: Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa 1               5                  10 Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe Gly Gly Cys Gly Tyr
    15                   20 Gly Tyr Gln Ser Ile Val Asp His Pro Asp Phe Pro  25                  30                   35 Lys Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys Cys
        40                  45 (2)SEQ ID NO:25的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：45氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)序列描述：SEQ ID NO 25: Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr  1               5                   10 Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Cys Gly Tyr Gly
    15                   20 Tyr Gln Ser Ile Val Asp His Pro Asp Phe Pro Lys 25                  30                  35 Pro Ile Val Arg Ser Ile Thr Lys Cys
        40                 45 (2)SEQ ID NO:26的信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：45氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 26: Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile Thr  1               5                 10 Ile Ile Thr Thr Ile Asp Gly Gly Cys Gly Glu Thr
     15                 20 Tyr Tyr Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Lys 25                  30                  35 Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Cys
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(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
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(A)名称/要点：修饰位点
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(A)名称/要点：修饰位点
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：13
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：14
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(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：16
(D)其它信息：/注="Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：17
(D)其它信息/注="Met或Val" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 27: Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His 1                 5                 10 Lys Ile Glu Gly Ile Leu Phe Gly Gly Cys Gly Glu
    15                  20 Thr Tyr Tyr Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro  25                 30                  35 Lys Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Cys
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     15                 20 Lys Ser Pro Thr Ile Thr Ser Leu Val Val Asp Leu 25                  30                  35 Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser
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    15                  20 Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys 25                  30                  35 Ser Pro Thr Ile Thr Ser Leu Val Val Asp Leu Ala
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(B)类型：氨基酸
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(B)类型：氨基酸
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        40                  45 (2)SEQ ID NO:43的信息： (ⅰ)序列特征：
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(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(B)类型：氨基酸
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(B)类型：氨基酸
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    15                   20 His  25 (2)SEQ ID NO:56的信息： (ⅰ)序列特征
(A)长度：16氨基酸
(B)类型：氨基酸
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      15 (2)SEQ ID NO:57的信息： (ⅰ)序列特征：
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(B)类型：氨基酸
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     15                 20 (2)SEQ ID NO:58的信息： (ⅰ)序列特征：
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(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 58: Cys Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn  1              5                   10 His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly
     15                 20 Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr 25                  30                   35 Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg
        40                  45 Val Thr His Pro His
 50 (2)SEQ ID NO:59的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：10氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 59: Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe  1               5                   10 (2)SEQ ID NO:60的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：19氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：4
(D)其它信息：/注="Ser或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：7
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：8
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：12
(D)其它信息：/注="His或Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：13
(D)其它信息：/注="Lys或Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：16
(D)其它信息：/注="Gly或Thr" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 60: Ile Ser Ile Xaa Glu Ile Xaa Xaa Val Ile Val Xaa  1               5                  10 Xaa Ile Glu Xaa Ile Leu Phe
    15 (2)SEQ ID NO:61的信息： (ⅰ)序列特征：
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(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 61: Leu Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile Val His Arg Leu  1               5                  10 Glu Gly Val
    15 (2)SEQ ID NO:62的信息： (ⅰ)序列特征：
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(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 62: Gly Ile Leu Glu Ser Arg Gly Ile Lys Ala Arg Ile  1               5                 10 Thr His Val Asp Thr Glu Ser Tyr
    15                  20 (2)SEQ ID NO:63的信息 (ⅰ)序列特征：
(A)长度：17氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO 63: Lys Lys Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile  1              5                   10 Gly Ile Thr Glu Leu
    15 (2)SEQ ID NO:64的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：22氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 64: Lys Lys Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu  1              5                  10 Arg Val Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu
    15                  20 (2)SEQ ID NO:65的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 65: Lys Lys Leu Arg Arg Leu Leu Tyr Met Ile Tyr Met  1               5                  10 Ser Gly Leu Ala Val Arg Val His Val Ser Lys Glu
     15                  20 Glu Gln Tyr Tyr Asp Tyr 25                  30 (2)SEQ ID NO:66的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：27氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 66: Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr Asp Ser Asp Lys  1                5                  10 Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn
    15                   20 Arg Ile Lys 25 (2)SEQ ID NO:67的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：24氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 67: Gly Ala Tyr Ala Arg Cys Pro Asn Gly Thr Arg Ala  1                5                  10 Leu Thr Val Ala Glu Leu Arg Gly Asn Ala Glu Leu
     15                 20 (2)SEQ ID NO:68的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：15氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 68: Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln  1                5                 10 Ser Leu Asp
    15 (2)SEQ ID NO:69的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：21氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 69: Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala  1               5                   10 Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu
    15                  20 (2)SEQ ID NO:70的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：20氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 70: Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp  1              5                    10 Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu
     15                  20 (2)SEQ ID NO:71的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：20氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形
(ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 71: Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys 1               5                   10 Trp Gly Glu Leu Met Thr Leu Ala
    15                   20 (2)SEQ ID NO:72的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：17氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 72: Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr Asn Glu  1               5                  10 Ser Ser Gln Lys Thr
    15 (2)SEQ ID NO:73的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：19氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 73: Arg Ala Gly Arg Ala Ile Leu His Ile Pro Thr Arg  1               5                  10 Ile Arg Gln Gly Leu Glu Arg
    15 (2)SEQ ID NO:74的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：21氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 74: Ala Val Ala Glu Gly Thr Asp Arg Val Ile Glu Val  1               5                  10 Leu Gln Arg Ala Gly Arg Ala Ile Leu
    15                  20 (2)SEQ ID NO:75的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 75: Ala Leu Asn Ile Trp Asp Arg Phe Asp Val Phe Ser 1                5                  10 Thr Leu Gly Ala Thr Ser Gly Tyr Leu Lys Gly Asn
    15                   20 Ser  25 (2)SEQ ID NO:76的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：22氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 76: Asp Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Val 1                5                   10 Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly His Gly
     15                 20 (2)SEQ ID NO:77的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：39氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 77: Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser  1               5                  10 Leu Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu
    15                   20 Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Thr Asn Phe Val 25                  30                  35 Glu Ser Cys (2)SEQ ID NO:78的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：21氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 78: Asp Ile Glu Lys Lys Ile Ala Lys Met Glu Lys Ala  1               5                  10 Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser
    15                   20 (2)SEQ ID NO:79的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：17氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 79: Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp  1               5                  10 Glu Lys Ile Arg Ile
     15 (2)SEQ ID NO:80的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 80 Gly Leu Gln Gly Lys Ile Ala Asp Ala Val Lys Ala  1              5                   10 Lys Gly (2)SEQ ID NO:81的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：19氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 81: Gly Leu Ala Ala Gly Leu Val Gly Met Ala Ala Asp 1               5                   10 Ala Met Val Glu Asp Val Asn
    15 (2)SEQ ID NO:82的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：20氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 82: Ser Thr Glu Thr Gly Asn Gln His His Tyr Gln Thr  1              5                   10 Arg Val Val Ser Asn Ala Asn Lys
     15                  20 (2)SEQ ID NO:83的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：15氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 83: Cys Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser 1               5                   10 Pro Thr Cys
    15 (2)SEQ ID NO:84的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：25氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 84: Cys Gly Glu Thr Tyr Lys Ser Thr Val Ser His Pro  1               5                  10 Asp Leu Pro Arg Glu Val Val Arg Ser Ile Ala Lys
    15                  20 Cys  25 (2)SEQ ID NO:85的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：60氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：18
(D)其它信息：/注="Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：21
(D)其它信息：/注=“Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：22
(D)其它信息：/注="Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：26
(D)其它信息：/注="Thr" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：27
(D)其它信息：/注="Arg" (ⅸ)特征：
(A)名称/要点：修饰位点
(B)位置：30
(D)其它信息：/注="Thr" (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 85: Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu 1                5                  10 Gly Gly Ile Ser Ile Ser Glu Ile Lys Gly Val Ile
    15                  20 Val His Lys Ile Glu Gly Ile Leu Phe Gly Gly Cys 25                  30                   35 Gly Gly Thr Tyr Gln Ser Arg Val Thr His Pro His
        40                   45 Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Cys
 50                  55                 60 (2)SEQ ID NO:86的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：17氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 86: Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp  1               5                  10 Glu Lys Ile Arg Ile
     15 (2)SEQ ID NO:87的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：62氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 87: Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp 1               5                   10 Glu Lys Ile Arg Ile Lys Lys Lys Lys Ile Ile Thr
    15                   20 Ile Thr Arg Ile Ile Thr Ile Ile Thr Yhr Ile Asp 25                   30                 35 Lys Cys Gly Glu Thr Tyr Tyr Ser Arg Val Thr His
         40                  45 Pro His Leu Pro Lys Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala
50                   55                 60 Lys Cys (2)SEQ ID NO:88的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：57氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 88: Thr Ile Asn Lys Pro Lys Gly Tyr Val Gly Lys Glu   1              5                   10 Lys Lys Lys Lys Ile Ile Thr Ile Thr Arg Ile Ile
   15                   20 Thr Ile Ile Thr Tyr Ile Asp Lys Cys Gly Glu Thr 25                  30                  35 Tyr Tyr Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Lys
        40                 45 Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Cys
50                   55 (2)SEQ ID NO:89的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：19氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 89: Ile Ser Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr 1               5                   10 Arg Leu Glu Thr Val Leu Phe
    15 (2)SEQ ID NO:90的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：45氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 90: Ile Ser Leu Thr Glu Ile Arg Thr Val Ile Val Thr 1                5                  10 Arg Leu Glu Thr Val Leu Phe □Lys Cys Gly Glu Thr
    15                  20 Tyr Tyr Ser Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Lys 25                  30                   35 Asp Ile Val Arg Ser Ile Ala Lys Cys
        40                   45 (2)SEQ ID NO:91的信息： (ⅰ)序列特征：
(A)长度：63氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑构型：线形 (ⅱ)分子类型：肽 (ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO 91: Lys Trp Phe Lys Thr Asn Ala Pro Asn Gly Val Asp  1              5                   10 Glu Lys Ile Arg Ile □Lys Ile Ser Leu Thr Glu Ile
     15                  20 Arg Thr Val Ile Val Thr Arg Leu Glu Thr Val Leu 25                   30                 35 Phe □Lys Cys Gly Glu Thr Tyr Tyr Ser Arg Val Thr
           40                 45 His Pro His Leu Pro Lys Asp Ile Val Arg Ser Ile
    50               55                 60 Ala Lys Cys