哺乳动物细胞表达系统
阅读：207发布：2020-05-11
专利汇可以提供哺乳动物细胞表达系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种高效稳定的 哺乳动物 细胞表达系统，该表达系统应用新型的高效表达载体，将目标基因在合适的哺乳动物宿主细胞株中进行高效表达。利用本发明的表达系统可以显著提高目标基因在宿主细胞中的表达 水 平，同时大大减少筛选高表达细胞株的时间和成本，实现目标蛋白在哺乳动物细胞中的高产量稳定表达。，下面是哺乳动物细胞表达系统专利的具体信息内容。
1.一种新型的哺乳动物细胞表达载体，其特征在于，所述的哺乳动物表达载体仅含有单个表达框，由一个强启动子带动目标基因、筛选标记基因和扩增标记基因的表达。这些基因之间通过IRES序列连接。
2.根据权利要求1所述的哺乳动物细胞表达载体，其中所述的单个表达框包括下列原件，且优选以如下顺序排列：(a)强启动子；(b)目标基因的克隆位点；(c)合成的IRES元件；(d)扩增标记基因；(e)FDMV IRES元件；(f)合成的大肠杆菌EM7元件；(g)筛选标记基因；(h)转录终止子；和(i)启动在大肠杆菌中起始复制的PUC序列。
3.根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其中所述的强启动子包括CMV、SV40、EF1-α、RSV、MLU、MPSV启动子，优选CMV启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其中所述的合成的IRES元件包括FMDV IRES序列和合成的GTX IRES序列。所述的FMDV IRES核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述的合成的GTX IRES核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其中所述的扩增标记基因包括DHFR基因和GS基因，优选DHFR。
6.根据权利要求2所述的哺乳动物细胞表达载体，其中所述的筛选标记基因包括GFP、ZEO、HYP、NEO、RFP。
7.一种高效稳定的哺乳动物细胞表达系统，其特征在于，利用权利要求1-6任意一项权利要求所述的哺乳动物细胞表达载体，将目标基因转染到合适的哺乳动物宿主细胞，产生外源蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达，所述的哺乳动物细胞表达系统包括：A.权利要求1-6任意一项权利要求所述的哺乳动物细胞表达载体；B.哺乳动物宿主细胞；C.将含有目标基因的表达载体转染到哺乳动物宿主细胞；D.筛选获得高表达目标基因的稳定细胞株。
8.根据权利要求7所述的哺乳动物细胞表达系统，其中所述的哺乳动物宿主细胞选自中国仓鼠卵巢CHO细胞，HEK293、BHK、NS0和Sp2/0，优选的哺乳动物宿主细胞是中国仓鼠卵巢CHO细胞。
9.根据权利要求7所述的哺乳动物细胞表达系统，其中所述的转染方法包括磷酸钙法，电转法，脂质体转染，优选的转染方法是电转法。
10.根据权利要求7所述的哺乳动物细胞表达系统，其中所述的筛选方法包括针对筛选标记的抗生素筛选和针对扩增标记基因的药物加压筛选。
哺乳动物细胞表达系统
技术领域
背景技术
[0002] 治疗用重组蛋白(包括抗体)目前已广泛应用于临床，许多治疗性重组蛋白药物，如人组织型纤溶酶原激活剂、促红细胞生成素(Erythropoietin，简称EPO)、凝血因子VIII和单克隆抗体CD20等为了保持其生物活性往往需要特定的翻译后修饰(如糖基化)，而原核生物或者低级的真核生物细胞表达系统缺少复杂的翻译后修饰功能，因此哺乳动物表达系统尤其是CHO细胞(Chinese hamster ovary，中国仓鼠卵巢细胞)表达系统常用于重组蛋白药物生产。
[0003] 然而，由于哺乳动物细胞中目标蛋白表达水平低、筛选高产稳定的细胞株耗时耗力、细胞培养成本高等因素，致使利用哺乳动物细胞生产蛋白质药物的成本较高、周期长。建立哺乳动物细胞高效表达系统是目前重组蛋白药物研究和生产的主要瓶颈之一。
[0004] 哺乳动物细胞表达系统是应用表达载体将目标基因转染到哺乳动物宿主细胞并整合到宿主细胞染色体上，随着宿主细胞的转录翻译，目标基因得到有效表达。因此，哺乳动物细胞表达系统的关键要素包括表达载体、宿主细胞、转染和筛选方法，其中表达载体和细胞株筛选方法是目标蛋白得以稳定高效表达的最重要因素。
[0005] 传统的哺乳动物细胞表达载体通常包含四个表达框，分别用于表达目标基因、哺乳动物细胞抗性筛选标记基因(如博来霉素，Zeocin，简称ZEO)、扩增选择性标记基因(如二氢叶酸还原酶，dyhidrofolate reductase，简称DHFR)以及在大肠杆菌中复制增殖基因，每个表达框都含有各自独立的启动子和终止子，位于上述表达基因的上下游。表达载体进入细胞后，编码蛋白通过细胞的转录和翻译机制以及必要的翻译后修饰产生。对于哺乳动物宿主细胞来说，外源基因序列的整合必然会影响到宿主细胞的正常生长，宿主细胞会通过一系列的机制来抵御外源基因的整合。由于传统表达载体含有4个表达框，载体一般大于8kb，不利于外源基因整合到宿主细胞染色体上，增加宿主细胞的负担并导致外源基因对宿主细胞的伤害。因此缩减载体的大小，对于目标基因的高效稳定表达具有重要意义。另外，由于外源基因非特异性的整合，载体过大会造成其各元件整合到宿主细胞基因组的不同位置，给后期的筛选工作带来很大的不便。例如，用抗性筛选得到的细胞很可能是仅仅整合并表达了抗性筛选基因的细胞，而不表达目标蛋白的细胞。因此减小载体大小还有利于减少筛选到假阳性的几率。
[0006] 哺乳动物细胞筛选方法是获得高产量稳定表达细胞的另一重要因素。筛选是采用选择性标记来筛选表达目标基因的细胞克隆，为此，需要将标记基因和目标基因连接在同一载体中，将载体转染到宿主细胞中，实现目标基因和标记基因的共同表达。传统的表达载体的标记基因和目标基因表达水平相近，有可能筛选到的是表达标记基因的细胞，而不是10
表达目标基因的细胞。因而常规筛选需要在10 数量级以上个细胞中筛选到高表达稳定单克隆细胞，获得稳定高表达目标基因的细胞株至少需要6-9个月的时间，耗费大量的时间和成本，制约了重组蛋白药物的大规模生产，因此高效哺乳动物细胞表达系统是目前重组蛋白药物产业化急需解决的技术难题。
表达目标基因的细胞。因而常规筛选需要在10 数量级以上个细胞中筛选到高表达稳定单克隆细胞，获得稳定高表达目标基因的细胞株至少需要6-9个月的时间，耗费大量的时间和成本，制约了重组蛋白药物的大规模生产，因此高效哺乳动物细胞表达系统是目前重组蛋白药物产业化急需解决的技术难题。
发明内容
[0007] 本发明的表达系统通过分子生物学技术构建和优化哺乳动物细胞新型表达载体，利用该表达载体将目标基因转染到宿主细胞，经筛选后获得高表达目标基因的工程细胞株。应用本发明的表达系统可实现目标蛋白在哺乳动物细胞中的高效稳定表达。
[0008] 本发明的一个目的是提供一种新型哺乳动物细胞表达载体。
[0009] 具体说，本发明的表达载体是利用分子生物学技术构建和优化的一种新型哺乳动物表达载体，该表达载体仅含单个表达框，不含有任何目标蛋白在哺乳动物表达系统中不必要的冗余序列，利用一个启动子实现目标基因和标记基因的表达，本发明的哺乳动物细胞表达载体比传统的表达载体至少小3kb。同时，本发明表达载体中在标记基因和目标基因中间引入了IRES(Internal ribosome entry site，内部核糖体进入位点)序列，该序列可弱化下游标记基因的表达，从而在标记基因表达的同时，确保目标基因得以高效稳定的表达。
[0010] 具体来说，本发明的表达载体是多个基因或基因片段重要元件的优化组合，所述表达载体由以下元件或序列组成，且最好以下列顺序排列：
[0011] a)一个强启动子
[0012] b)目标基因的克隆位点
[0013] c)合成的IRES序列
[0014] d)扩增标记基因
[0015] e)FMDV IRES序列
[0016] f)合成的大肠杆菌EM7元件
[0017] g)筛选标记基因
[0018] h)转录终止子
[0019] i)一个启动在大肠杆菌中起始复制的PUC序列。
[0020] 所述的一个强启动子是病毒启动子，如CMV(cytomegalovirus，巨细胞病毒)、SV40(Simian virus40，猴空泡病毒40)、RSV(Rous sarcoma virus，肉瘤病毒)、MLV(Murine leukovirus，小鼠白血病病毒)、MPSV(myeloproliferative sarcoma virus，骨髓增殖肉瘤病毒)，和/或非病毒启动子(如人铁蛋白重链核心启动子)以及其他调控序列的组合。优选的强启动子是CMV启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO：l所示。
[0021] 所述的目标基因的克隆位点是，用于克隆目标基因的多个限制性内切酶位点。
[0022] 所述合成的IRES序列是本领域内已知的GTX同源结构域蛋白的多个重复的5’非翻译区域的一部分，具有IRES的功能，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
[0023] 所 述 的 扩 增 标 记 基 因 是 本 领 域 内 已 知 的DHFR序 列 或GS序 列(Glutaminesynthetase，谷氨酰胺合成酶)。DHFR催化了二氢叶酸转化为四氢叶酸。氨甲喋呤(MTX)抑制二氢叶酸还原酶，因此转染DHFR缺陷型宿主细胞，能够通过扩增DHFR基因来形成对MTX的抗性。
[0024] 所述的FMDV IRES序列是本领域已知的来自口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，简称FMDV)的IRES序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0025] 所述的合成的大肠杆菌EM7元件为人工合成的EM7元件，该元件仅含有66个碱基序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0026] 所述的单个筛选标记基因是本领域内已知的任何一个合适的选择性抗性标记基因，如ZEO、G418、PUR(puromycin，嘌呤霉素)、HYP(Hygromycin，潮霉素)，优选的抗性基因包括抗ZEO、HYP(Hygromycin，潮霉素)；所述的单个筛选标记基因或是本领域内已知的任何一个荧光标记基因，优选的包括GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)、RFP(Red Fluorescent Protein，红色荧光蛋白)。
[0027] 所述的转录终止子是本领域内已知的终止序列，如BGH(bovine growth hormone，牛生长激素)终止子、SV40终止子或HSV TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因)终止子。
[0028] 所述的一个启动在大肠杆菌中起始复制的PUC序列是本领域内已知的启动在大肠杆菌中起始复制的PUC起始序列。
[0029] 本发明的另一个目的是提供一种高效稳定的哺乳动物细胞表达系统。
[0030] 具体说，该表达系统利用本发明新型的高效表达载体，将目标基因转染到合适的哺乳动物宿主细胞，产生外源蛋白在哺乳动物细胞中的高效表达。本发明的哺乳动物表达系统包括：A.本发明的新型高效表达载体；B.宿主细胞；C.将含有目标基因的表达载体转染到宿主细胞；D.通过筛选获得稳定细胞株。
[0031] 所述的表达载体仅含单个表达框，是多个基因或基因片段重要元件的优化组合，其结构是与上述的本发明的表达载体结构相同。
[0032] 所述的宿主细胞选自CHO(Chinese Hamster Ovary，中国仓鼠卵巢细胞)，HEK293、BHK、NS0和Sp2/0，优选的宿主细胞是CHO细胞。
[0034] 所述的筛选方法是利用一个选择性标记来筛选表达目的基因的宿主细胞，选择性标记包括筛选标记包括HYP、ZEO、PUR、DHFR、GS，或GFP。
[0035] 本发明的哺乳动物细胞表达系统与常规的哺乳动物细胞表达系统比较，具有以下优点和效果：
[0036] 本发明表达载体仅含有单个哺乳动物细胞表达框，相对于含有多个表达框的传统表达载体，大大缩减了载体大小，减轻哺乳动物宿主细胞不必要的负担，并减小假阳性克隆的概率，提高目标基因在宿主细胞中的表达水平。同时，本发明载体中在目标基因和标记基因之间引入了合成的IRES序列，并将这些基因序列进行优化组合，可显著弱化下游标记基因的表达，如在相同浓度标记基因DHFR药物MTX加压时，本发明表达系统的目标基因的拷贝数远远高于传统表达系统，从而更容易获得高表达稳定的目标基因。常规方法需要从至3 2
少10 几何阶数的初筛克隆细胞中筛选到高表达目标蛋白的细胞克隆，而本发明只需从10几何阶数的初筛克隆细胞中便可筛选到高表达目标蛋白的细胞克隆。换言之，利用常规表达系统在哺乳动物细胞中获得重组蛋白的最优表达水平需要6-9个月，而利用本发明表达系统只需3-4个月内便可获得高表达目标蛋白的细胞株。
附图说明
少10 几何阶数的初筛克隆细胞中筛选到高表达目标蛋白的细胞克隆，而本发明只需从10几何阶数的初筛克隆细胞中便可筛选到高表达目标蛋白的细胞克隆。换言之，利用常规表达系统在哺乳动物细胞中获得重组蛋白的最优表达水平需要6-9个月，而利用本发明表达系统只需3-4个月内便可获得高表达目标蛋白的细胞株。
附图说明
[0037] 附图强调了本发明的原则，不一定成比例。
[0038] 图1：本发明实施例l构建的表达载体示意图。
[0039] A)传统的哺乳动物细胞表达载体的结构图pA。表达载体pA含有四个独立的表达框，各元件的排列顺序如下：(1)CMV启动子；(2)目标基因克隆位点；(3)BGH终止子；(4)EF1-α启动子；(5)DHFR扩增基因；(6)HSV TK终止子；(7)SV40启动子；(8)ZEO抗性基因；r
(9)SV40终止子；(10)PUC复制起点；(11)大肠杆菌骨架和氨苄抗性基因(Amp)。
(9)SV40终止子；(10)PUC复制起点；(11)大肠杆菌骨架和氨苄抗性基因(Amp)。
[0040] B)本发明的哺乳动物细胞表达载体pB。表达载体pB仅包括单个表达框，各元件的排列顺序如下：(1)CWV启动子；(2)目标基因克隆位点；(3)合成的GTX IRES序列；(4)DHFR扩增基因序列；(5)FDMV IRES序列；(6)EM7元件；(7)ZEO抗性基因；(8)SV40终止子；(9)PUC复制起点。
[0041] 图2：实施例2中的Western Bloting检测结果。比较了利用传统表达系统(pA-EPO)和本发明表达系统(pB-EPO)初筛细胞克隆表达目标蛋白EPO的水平。
[0042] 图3：实施例2中通过传统表达系统(pA-EPO)和本发明表达系统(pB-EPO)表达目标蛋白EPO的表达量比较。
具体实施方式
[0043] 实施例1：哺乳动物细胞表达载体的构建
[0044] 方法：通过分子生物学技术，如限制性酶切、DNA连接、大肠杆菌转化和克隆筛选按照《分子克隆实验指南》(第三版，黄培堂译，科学出版社)等标准方法构建传统表达载体pA和本发明高表达载体pB。具体操作方法如下：以Invitrogen公司pcDNA3.1载体为模板，人工合成EF1-α启动子、DHFR、HSV TK终止子及其他调控序列的融合序列(1.8kb)并在其末端分别添加SpeI和NaeI的酶切位点。将该合成的融合序列采用T4DNA连接酶连接到经SpeI和NaeI双酶切的pcDNA3.1，通过大肠杆菌转化，并进行单克隆筛选得到传统载体pA(图1)。
[0045] 为了构建本发明表达载体pB，利用限制性内切酶BgIII和ScaI双酶切去掉pcDNA3.1载体上的大肠杆菌中的骨架序列(1.4kb)，用Klenow酶将粘性末端补齐后再用T4DNA连接酶连接。限制性内切酶SmaI及KpnI双酶切已删除大肠杆菌骨架序列的pcDNA载体，去除BGH终止子、SV40启动子序列(1.5kb)，同时人工合成末端含SmaI及KpnI的GTXIRES、DHFR、FWDV IRES及E7的融合序列(1.3kb)，用T4DNA连接酶将酶切的载体与人工合成的融合序列连接。通过大肠杆菌转化和克隆筛选得到本发明载体pB。
[0046] 结果：图1显示了传统的哺乳动物细胞表达载体的结构示意图pA(7.4kb)和本发明所构建的哺乳动物表达载体pB(4kb)。
[0047] 传统表达载体pA含有四个独立的表达框。表达载体各元件的排列顺序如下：
[0048] a)CMV启动子
[0049] b)目标基因克隆位点
[0050] c)BGH终止子
[0051] d)EF1-α启动子
[0052] e)DHFR扩增基因序列
[0053] f)HSV TK终止子
[0054] g)SV40启动子
[0055] h)ZEO抗性基因
[0056] i)SV40终止子
[0057] j)PUC ori复制起点
[0058] k)大肠杆菌骨架序列和氨苄抗性基因(Ampr)序列
[0059] 本发明表达载体pB仅含单个表达框，由以下元件或序列组成，且以如下顺序排列：
[0060] a)CMV启动子
[0061] b)目标基因克隆位点
[0062] c)合成的GTX IRES序列
[0063] d)DHFR扩增标记基因
[0064] e)FMDV IRES序列
[0065] f)ZEO抗性基因
[0066] g)SV40终止子
[0067] h)PUC ori复制起点
[0068] 与含有多个表达框的传统哺乳动物细胞表达载体比较，本发明表达载体pB仅含一个表达框，只使用一个CMV启动子，同时删除了大肠杆菌中的骨架序列及其他多余的启动子和终止子序列，比传统载体至少小3kb。
[0069] 实施例2：EPO蛋白在传统表达系统和本发明表达系统中表达量的比较[0070] 2.1.构建含有目标基因的表达载体：根据NCBI已有的序列信息人工合成EPO的编码序列，并通过引入相应的酶切位点(NheI和HindIII)将其分别克隆至实施例1构建的表达载体pA和pB中，获得含有目标基因的表达载体pA-EPO及pB-EPO。
[0071] 2.2.DNA转染至CHO-dhfr-悬浮细胞株：将上述含有目标基因的表达载体pA-EPO-和pB-EPO，以及表达载体对照pA和pB分别转染到DHFR酶缺陷的CHO细胞(CHO-dhfr)中。
- 6
CHO-dhfr 细胞为悬浮培养，转染时细胞密度为1.5×10/m]，转染体积为30ml。转染方法按照Lipofectamine2000(购自Invitrogen)使用说明操作。
- 6
CHO-dhfr 细胞为悬浮培养，转染时细胞密度为1.5×10/m]，转染体积为30ml。转染方法按照Lipofectamine2000(购自Invitrogen)使用说明操作。
[0072] 2.3.EPO在不同表达系统中表达水平的比较：
[0073] 方法：上述DNA转染至CHO-dhfr-细胞后，摇瓶培养48小时，分别取样观察细胞活力，活力大于90％可以进行种板。用新鲜的选择培养基(含100μg/ml Zeocin)重悬离心后的细胞，以1000-5000个/孔种在96孔板中。转染20天可见明显的克隆生长。分别挑选转染了4种DNA的全部细胞克隆于另外的96孔板中，用不含抗性的悬浮培养基培养3天，取上清用ELISA测定96孔板中EPO的表达，以此计算阳性克隆率。
[0074] 将培养了4种DNA的细胞克隆96孔板的上清分别收集并混合后做Western Blotting，用于检测4种转染了不同DNA的细胞表达。根据ELISA测定结果，分别选择5-10个转染了pA-EPO和pB-EPO表达载体的最高OD读数的克隆进行扩增，扩增时用不含抗性的7
悬浮培养基培养。当各个克隆扩增至细胞数大于1×10 时，为了提高目的基因的拷贝数和目标基因的稳定表达，各个克隆采用MTX加压筛选方法。
悬浮培养基培养。当各个克隆扩增至细胞数大于1×10 时，为了提高目的基因的拷贝数和目标基因的稳定表达，各个克隆采用MTX加压筛选方法。
[0075] 转染了pA-EPO的细胞克隆用梯度MTX(50nM、500nM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM)进行逐步加压筛选，每次接种于96孔板的细胞密度为每孔100-500个，每个梯度的筛选时间为10-15天，并用ELISA检测较高表达的1-2个克隆用于下一梯度MTX加压，最终得到稳定表达的细胞株。转染了pB-EPO的细胞克隆用梯度MTX(500nM、2μM、5μM)进行逐步加压筛选，每次接种于96孔板的细胞密度为每孔100-500个，每个梯度的筛选时间为10-15天，并用ELISA检测较高表达的1-2个克隆用于下一梯度MTX加压，最终得到稳定表达的细胞株。
[0076] 两种转染了含目标基因的表达载体的细胞克隆分别保种5×107细胞总数后扩增6
至100ml，密度以1×10/ml开始，每日检测细胞的密度和表达量，连续培养10天，记录下各个细胞克隆的每日的细胞密度及表达水平，并绘制生长和表达曲线。
至100ml，密度以1×10/ml开始，每日检测细胞的密度和表达量，连续培养10天，记录下各个细胞克隆的每日的细胞密度及表达水平，并绘制生长和表达曲线。
[0077] 结果：经过初步抗性筛选得到的克隆，ELISA分析表明，本发明表达系统的阳性克隆率为82％，传统表达载体的阳性克隆率仅为15％，即本发明的表达系统假阳性率显著低于传统表达系统(P＜0.05)。
[0078] Western Blotting的结果表明(图2)，与阴性对照(pA、pB)相比，转染了pA-EPO和pB-EPO的细胞能检测到目标基因的表达，而本发明表达系统pB-EPO的目标基因表达水平明显高于传统表达系统pA-EPO。
[0079] 经过MTX加压筛选得到稳定表达pA-EPO和pB-EPO的细胞株，连续培养10天测得的细胞表达量如图3和表1所示，本发明表达系统(pB-EPO)从第4天开始表达量明显比传统表达系统(pA-EPO)的EPO蛋白表达量高，到第10天时pB-EPO表达系统表达量为96.3mg/L，而传统表达系统pA-EPO表达量仅为15.5mg/L。
[0080] 更重要的是，由于本发明表达系统标记基因DHFR弱化表达，在相同浓度MTX加压时，本发明表达系统的目标基因的拷贝数远远高于传统表达系统，从而导致本发明表达系统的假阳性远远低于传统表达系统，并且表达水平更高。因此传统表达系统需要MTX加压梯度更多，至少需要32周才能获得稳定表达的细胞株。而本发明表达系统由于其阳性率高，MTX加压梯度少，仅需要15周便得到了高表达目标蛋白的细胞株(表1)。
[0081] 表1.传统表达系统和本发明实施例1的表达系统各参数对比
[0082]
[0083] 上述结果表明，本发明表达系统可显著提高目标基因的表达水平，并大大减少筛选到高表达稳定细胞的时间和工作量。
[0084] 实施例3：EPO蛋白在含有不同启动子载体的表达系统中表达量的比较[0085] 3.1.实验方法：构建含有目标基因的表达载体的实验方法、DNA转染至-CHO-dhfr 悬浮细胞以及稳定细胞筛选方法与实施例2的操作方法相同。为了构建在目标基因前构建含有不同启动子的表达载体，将实施例2含EPO目标基因表达载体pB中的CMV启动子分别替换成人工合成的MPSV启动子和RSV启动子，然后将构建的上述含有不同启动-
子和EPO的表达载体pB-EPO分别转染到DHFR酶缺陷的CHO细胞(CHO-dhfr)中，经Zeocin选择培养基初筛和MTX梯度加压筛选后获得稳定表达细胞株。
子和EPO的表达载体pB-EPO分别转染到DHFR酶缺陷的CHO细胞(CHO-dhfr)中，经Zeocin选择培养基初筛和MTX梯度加压筛选后获得稳定表达细胞株。
[0086] 3.2.结果：经过筛选获得了稳定表达目标基因EPO的细胞株，如表2结果所示，利用本发明的表达系统，三种启动子获得稳定细胞株所需要的时间是相似的。而ELISA分析结果显示含CMV启动子的表达系统中EPO蛋白表达量为96.3mg/L，明显高于含RSV启动子的表达系统中EPO表达量50.6mg/L和含MPSV启动子的表达系统中EPO表达量68.1mg/L。
[0087] 表2.EPO蛋白在不同启动子作用下表达量的比较
[0088]启动子 最高表达水平(mg/L) 筛选周期(周)
CMV 96.3 15
RSV 50.6 18
MPSV 68.1 17
CMV 96.3 15
RSV 50.6 18
MPSV 68.1 17
[0089]
[0090] 实施例4：EPO蛋白在不同宿主细胞中表达量的比较
[0091] 4.1.将实施例2构建的含目标基因EPO表达载体pA和pB分别转染至下列宿主细胞，包括CHO-dhfr细胞、BHK细胞和HEK293细胞。转染方法以及获得稳定细胞筛选方法与实施例2的操作方法相同。
[0092] 4.2.结果：经过筛选获得了六个稳定细胞株，ELISA分析结果显示，在传统表达系统和本发明表达系统中，EPO蛋白在CHO宿主细胞中的表达量都明显高于在BHK细胞和HEK293细胞中的表达量，并且本发明表达系统中EPO蛋白的表达量明显高于传统表达系统(表3)。
[0093] 表3.传统表达系统和本发明表达系统在不同宿主细胞中表达量(mg/L)的比较[0094]宿主细胞 传统表达系统 本发明的表达系统
CHO 15.5 96.3
BHK 9.5 65.4
HEK293 12.0 82.3
CHO 15.5 96.3
BHK 9.5 65.4
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