家蝇MSP蛋白在抗菌方面的应用
阅读：177发布：2020-05-15
专利汇可以提供家蝇MSP蛋白在抗菌方面的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及 家蝇 MSP蛋白在抗菌方面的应用，属于 生物 技术领域。家蝇MSP蛋白，具有SEQ ID NO:1所示的 氨 基酸序列。生物信息学分析结果显示：MSP基因ORF全长495bp，编码164个氨基酸，理论分子量17.4kDa，等电点为6.09；整个多肽链表现为亲 水 性。体外抗菌试验结果显示，MSP蛋白对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及白假丝 酵母 菌均有抑制作用，相应的MIC值分别为0.3mg/ml、0.2mg/ml及0.002mg/ml，对白假丝酵母菌显示了突出的抗菌活性。家蝇MSP蛋白有望成为临床上新型的抗生素。，下面是家蝇MSP蛋白在抗菌方面的应用专利的具体信息内容。
家蝇MSP蛋白在抗菌方面的应用
技术领域
背景技术
[0002] 昆虫的免疫系统和高等动物免疫系统具有较为相似的生理功能，均包括免疫防御、免疫稳定和免疫监视。与大多数哺乳动物相比，昆虫没有T/B淋巴细胞及免疫球蛋白等后天性免疫系统，因此缺乏特异性地抗原抗体反应。昆虫的先天免疫，也称天然免疫，机体受病原体入侵时能够快速的识别并对病原体做出相应的反应。先天性免疫反应主要是由细胞膜或细胞质的模式识别受体参与识别病原体相关分子模式，包括细胞免疫和体液免疫。血细胞的包围、吞噬等称为细胞免疫，以及细菌识别蛋白、抗菌多肽、丝氨酸蛋白酶、蛋白酶抑制剂、酚氧化作用等，称为体液免疫。抗菌肽(Antimicrobial peptide，AMP)是昆虫免疫体系重要的组，成部分，是生物体内一些具有抗菌活性的小分子多肽特点包括热稳定、杀菌范围广、作用机制独特等，机体在经过感染或免疫刺激下诱导产生抗菌肽，不仅对细菌有很强的杀伤能力，对真菌、病毒、原虫以及肿瘤细胞等都具有一定的杀灭活性，而且在免疫调节、激素调节及刺激伤口愈合等方面有重要作用。部分抗菌肽由于自身具有抗菌功能而成为昆虫先天性免疫系统的重要效应分子。
[0003] 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及白假丝酵母菌均是医院感染的常见病原菌。随着抗生素的广泛使用及滥用，使得抗生素的耐药性逐年增强，因此临床上对于新型抗生素的需求非常迫切。抗菌肽广泛存在于动植物、昆虫及人体内，是生物体内具有抵御外界微生物感染的一类特殊的小分子多肽。昆虫抗菌肽具有热稳定性强、诱导源的非专一性和抗菌谱广等特点，有望开发成一类新型的多肽抗生素。人工合成肽的成本较高，限制了其应用前景。因此，利用基因克隆技术获取克隆表达基因是获取昆虫抗菌肽的理想途径。目前，已有部分昆虫抗菌肽被证实具有杀菌或抑菌作用，且作用机制独特。
[0004] 家蝇(双翅目，蝇科)是一种广泛分布于自然界的蝇科生物，其幼虫、成虫均生活在潮湿及有机物富集的环境,可以携带并传播多种病原体，包括细菌、真菌、病毒、寄生虫。然其自身并不发生疾病。家蝇能够对微生物感染作出快速有效的免疫应答，这表明家蝇具有抗病原微生物的先天性免疫系统。相关研究表明，家蝇幼虫粉可作为传统中医治疗骨髓炎、压疮、 疳积等的重要成分。由于其可以分泌一些活性物质，比如抗菌肽、凝集素、溶菌酶等，因此其幼虫被一些印度土著人用于治疗创伤感染。家蝇具有独特的免疫防御系统，微生物刺激后可产生抗菌肽。因此家蝇可作为抗菌肽发展的重要资源。
发明内容
[0005] 本发明提供一种家蝇唾液腺蛋白MSP，对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及白假丝酵母菌均有抑制作用，尤其对于白假丝酵母菌有很强的抑制作用，有望成为临床上新型的抗生素。
[0006] 家蝇唾液腺蛋白MSP，具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0007] 编码家蝇唾液腺蛋白MSP的基因。
[0008] 所述基因具有如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列。
[0009] 一种表达载体，其含有上述编码家蝇唾液腺蛋白MSP的基因。
[0010] 所述表达载体的骨架载体为pET-28a。
[0011] 家蝇唾液腺蛋白MSP在制备抗菌药物中的应用。
[0012] 所述菌为大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及白假丝酵母菌。
[0013] 本发明人对从微生物诱导的家蝇转录组数据库中筛选出的差异高表达基因唾液腺蛋白MSP，进行cDNA克隆，经PCR扩增后，得到了495bp左右的特异性MSP基因片段；生物信息学分析结果显示：MSP基因ORF全长495bp，编码164个氨基酸，理论分子量17.4kDa，等电点为6.09；整个多肽链表现为亲水性；属于分泌蛋白；主要分布在细胞外(包括细胞壁)。对MSP编码蛋白的磷酸化位点进行分析，有5个丝氨酸、3个苏氨酸、1个色氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。二级结构，主要以α-螺旋，不规则卷曲和延伸链为蛋白最大量的结构元件。构建pET-28a(+)-MSP重组质粒，转入大肠埃希菌Transetta(DE3)表达载体中，经IPTG诱导后，以包涵体形式表达重组蛋白，经尿素裂解，镍柱纯化，成功获得纯化的MSP重组蛋白。将纯化后的MSP蛋白与免疫血清(一抗)及HRP-羊抗兔-IgG(二抗)进行Western blot鉴定，获得一清晰条带，条带大小与预计相符；质谱鉴定分析结果显示，纯化蛋白序列与MSP序列一致。
[0014] 体外抗菌试验结果显示，MSP蛋白对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌及白假丝酵母菌均有抑制作用，相应的MIC(minimal inhibitory concentration)值分别为0.3mg/ml、0.2mg/ml及0.002mg/ml，对白假丝酵母菌显示了突出的抗菌活性。MSP作用于白假丝酵母菌
12h后，扫描电镜结果显示，菌体发生断裂，大小不一，24h后，菌体严重凹凸不平，穿孔现象明显。
附图说明
12h后，扫描电镜结果显示，菌体发生断裂，大小不一，24h后，菌体严重凹凸不平，穿孔现象明显。
附图说明
[0015] 图1MSP基因cDNA片段的扩增
[0016] M:DNA Marker DL 2000；1、2:MSP PCR扩增产物
[0017] 图2重组质粒pET-28a(+)-MSP双酶切鉴定图
[0018] M:DNA Marker DL 2000；1:MSP PCR扩增产物；2:pET-28a(+)-MSP重组质粒双酶切；3:pET-28a(+)-MSP重组质粒
[0019] 图3MSP重组蛋白诱导表达图
[0020] M：蛋白质分子量标准marker；1：未诱导质粒；2：诱导质粒；3：未诱导重组质粒；4：诱导重组质粒；5：重组质粒破碎上清；6：重组质粒破碎后沉淀；7：纯化蛋白[0021] 图4MSP重组蛋白His标签鉴定图
[0022] 图5MSP重组蛋白免疫原性分析图
[0023] 图6MSP对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线
[0024] 图7MSP对大肠埃希菌的时间-杀菌曲线
[0025] 图8MSP对白假丝酵母菌的时间-杀菌曲线
[0026] 图9MSP作用于白假丝酵母菌电镜图
[0027] 注：正常组：a(×15000)，b(×2500)；氟康唑作用24h组：c(×15000)，d(×5000)；MSP蛋白作用12h组：e(×15000)，f(×5000)；MSP蛋白作用24h组：g(×15000)，h(×5000)。
具体实施方式
[0028] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0029] 1材料与方法
[0030] 1.1材料
[0031] 1.1.1实验家蝇
[0033] 1.1.2实验动物
[0035] 1.1.3实验质粒和菌株
[0036] PMD19-T克隆载体、Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell克隆感受态细胞及Transetta(DE3)Chemically Competent Cell表达感受态细胞均购买于北京全式金 生物技术有限公司，pET28a(+)载体由本实验室保存。金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠埃希菌(ATCC25923)及白假丝酵母菌(ATCC10231)均为贵州医科大学微生物教研室王涛老师惠赠，公众可以从该教研室得到。
[0037] 1.1.4主要试剂
[0038] DNA标志物DL2000、BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、Ex Taq酶、T4DNA ligase、DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、Trizol；蛋白质分子量标准(低)marker、彩色预染蛋白质分子量标准marker、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，焦碳酸二乙酯(DEPC)，RNA保护剂(均购自大连宝生物TaKaRa公司)；乙酸、溴化乙锭(EB)、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺，过硫酸铵(APS)、考马斯亮蓝R-250、异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)(均购自贵州爱瑞特生物科技有限公司)；His Band Purification Kit(Novagen公司)；滤纸、甘氨酸、琼脂粉、琼脂糖(sigma公司)、甘油、氯化钠、尿素、氨苄青霉素、卡那霉素、50×TAE电泳缓冲液、2×SDS蛋白上样缓冲液、吐温20、0.22μm PVDF膜、磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)、96孔板、甲醇、LB培养基、滤纸、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、沙氏固体培养基、沙氏液体培养基、氟康唑、1640培养基、二甲亚砜(DMSO)、溴化乙啶(EB)溶液、抗His单克隆鼠抗体、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP(均购自贵州索莱宝贸易有限公司)。
[0039] 1.1.5主要溶液的配制
[0040] 1.1.5.1 1×TAE电泳缓冲液：取50×TAE电泳缓冲液20ml加双蒸水定容至1000ml，室温贮存。
[0041] 1.1.5.2氨苄青霉素溶液：将0.5g氨苄青霉素干粉加至盛有8ml高压蒸馏水的小烧杯中溶解，定容至10ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装，浓度为50mg/ml，-20℃保存。
[0042] 1.1.5.3卡那霉素溶液：将0.5g卡那霉素干粉加至盛有8ml高压蒸馏水的小烧杯中溶解，定容至10ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装，浓度为50mg/ml，-20℃保存。
[0043] 1.1.5.4LB液体培养基：2.5g LB培养基干粉加入蒸馏水至100ml，高压灭菌121℃、20min，贮存于4℃。
[0044] 1.1.5.5营养肉汤培养基：1.8g营养肉汤培养基干粉加入蒸馏水至100ml，高压灭菌121℃、15min，4℃保存备用。
[0045] 1.1.5.6营养琼脂培养基：2.5g营养琼脂培养基干粉，加入蒸馏水至100ml，高压灭菌115℃、20min，4℃保存备用。
[0046] 1.1.5.7LB固体培养基：2.5g LB培养基干粉、琼脂粉2g，加入蒸馏水至100ml，高压灭菌121℃、20min，贮存于4℃。
[0047] 1.1.5.8沙氏固体培养基：5g沙氏固体培养基干粉，加入蒸馏水至100ml，高压灭菌121℃、15min，4℃保存备用。
[0048] 1.1.5.9沙氏液体培养基：5g沙氏液体培养基干粉加入蒸馏水至100ml，高压灭菌121℃、15min，4℃保存备用。
[0049] 1.1.5.10IPTG溶液：2.4g IPTG溶解于8ml高压双蒸水中，定容至10ml，0.22μm滤器过滤除菌，分装，浓度为24mg/ml，-20℃贮存。
[0050] 1.1.5.11 10％过硫酸铵溶液：1g过硫酸铵溶解于8ml高压双蒸水中，定容至10ml，分装，-20℃长期贮存，4℃保存1-2周。
[0051] 1.1.5.12 10×SDS-PAGE缓冲液：将15.1gTris碱、94g甘氨酸及5g SDS加入盛有800ml双蒸水的烧杯中，搅拌混匀，再加双蒸水定容至1000mL，使用时稀释至1×。
[0053] 1.1.5.14裂解液：将1.2114g Tris和14.61g NaCl加至盛有400ml去离子水的烧杯中搅拌混匀，用HCl调节pH至8.0，去离子水定容至500ml。
[0054] 1.1.5.15电转液：将3.03g Tris碱及14.4g甘氨酸加至盛有600ml双蒸水的烧杯中搅拌混匀，加双蒸水定容至900ml，再加入100ml甲醇混匀。
[0055] 1.1.5.16封闭液：0.5g脱脂奶粉，加PBS缓冲液至10ml，现用现配，4℃放置。
[0056] 1.1.5.17PBST洗膜液：100μl吐温20，加PBS缓冲液至1000ml。
[0058] 1.1.6主要仪器及设备
[0059] 超净工作台(苏州净化设备有限公司)电热培养箱(上海博讯实业)；PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)；冷冻高速离心机(美国德国Eppendorf公司)；Milli-Q超纯水仪(法国Millipore Pharmacia公司)；恒温水浴培养箱(上海跃进医疗器械厂)；HITACHI S-3400N扫描电镜(日本HITACHI公司)、稳压稳流电泳仪(美国GE公司)；酶标仪(Gene有限公司，型号G-BOX)；PB203-E型电子精密天平(上海梅特勒托利多仪器公司)；超声波破碎仪(中国新芝公司)；超低温冰箱(日本三洋公司)；核酸蛋白分析仪(美国Bio-Tek公司)；TS-1型脱色摇床(江苏其林贝尔仪器公司)；凝胶成像系统IQuant400(美国Amersham Pharmacia公司)；凝胶成像系统(美国SynGene公司)；2.5μl、10μl、20μl、100μl、1000μl微量加样器(德国Eppendorf公司)。
[0060] 1.2方法
[0061] 1.2.1MSP基因的生物信息学分析
[0062] 运用NCBI软件分析cDNA序列和开放阅读框；Protparam分析预测蛋白质的理化性质等；ProtScale分析蛋白质的疏水性质；采用Singl P进行信号肽预测；TMHMM对跨膜区进行分析；Target P对蛋白进行亚细胞定位。运用NetPhos2.0Server程序分析磷酸化位点。Hopfield神经网络(HNN)软件预测蛋白质的二级结构。
[0063] 1.2.2MSP引物设计和cDNA制备
[0064] 利用Primer5.0和DNA Club软件根据MSP基因编码序列，分析设计MSP克隆及表达引物，由大连宝生物TaKaRa公司合成。引物序列如下：
[0065] 表1实验所用引物
[0066]
[0067] 取家蝇第2天幼虫，显微注射1×108cfu/ml白假丝酵母菌12h后，Trizol法提取家蝇3龄幼虫的RNA，逆转录cDNA，以家蝇3龄幼虫cDNA为模板。在0.2ml Epp管中配制10μl反应体系：
[0068]
[0069] 放入PCR仪中反应，条件为：42℃，2min，反应结束后，在0.2ml Epp管中配制20μl反应体系：
[0070]
[0071] 放入PCR仪中反应：37℃15min，85℃5sec，4℃，反应结束后，-20℃保存备用。
[0072] PCR扩增体系如下：
[0073]
[0074] 轻弹混匀，瞬离。PCR条件：94℃5min，94℃30s，58℃45s，72℃45s，30个循环；72℃10min。1.5％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定。用DNA凝胶回收试剂盒回收并纯化目的产物(详细操作见TaKaRa胶回收试剂盒说明书)。
[0075] 1.2.3MSP基因和PMD19-T载体的连接
[0076]
[0077] 16℃连接30min，冰浴5min。
[0078] 1.2.4转化及培养
[0079] 取5μl连接产物加至50μl Trans1-T1克隆感受态细胞中，移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min，加入LB培养基补足至1ml，37℃200rpm培养1.5h。取50μl菌液涂布于LB固体培养基平板(氨苄青霉素抗性)培养16h，行PCR对单克隆进行鉴定。
[0080] 1.2.5MSP-PMD19-T重组克隆质粒的鉴定
[0081] 将PCR鉴定为阳性的单克隆菌接种于含有氨苄青霉素抗性的LB培养液中(Amp：LB为1:1000)，37℃，220rpm，培养12-16h，将菌液送上海生工进行测序。
[0082] 1.2.6MSP-PMD19-T重组克隆质粒的提取(参照百泰克质粒提取试剂盒进行操作)[0083] 1.2.7MSP-PMD19-T重组克隆质粒PCR扩增
[0084] 将MSP-PMD19-T重组克隆质粒运用MSP表达引物进行PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定，并对产物进行胶回收纯化。
[0085] 1.2.8pET-28a(+)-MSP重组表达质粒的构建
[0086] 分别将MSP纯化产物与pET-28a(+)载体质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶双酶切。酶切体系如下：
[0087]
[0088] 轻混，瞬离，37℃水浴锅中酶切5h。
[0089] MSP基因和pET-28a(+)载体的连接
[0090]
[0091] 16℃连接18h。取连接产物5μl加入到50μl大肠埃希菌Transetta(DE3)表达感受态细胞中，移液器轻轻吹打混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，加入LB培养基补足至1ml，37℃、200rpm、1.5h。取50μl菌液涂布于LB固体培养基平板(卡那霉素抗性)培养16h，行PCR对单克隆进行鉴定。
[0092] 1.2.9pET-28a(+)-MSP重组表达质粒阳性克隆的鉴定
[0093] 挑选单菌落接种于含卡那霉素LB培养液中37℃，220rpm，培养12-16h，以菌液为模板，分别使用MSP表达上游引物和下游引物对菌液行PCR鉴定。
[0094] 1.2.10MSP基因诱导表达、纯化
[0095] 取鉴定阳性的菌液加入含有卡那霉素的LB液体培养基中诱导表达，在A600＝0.5时加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，30℃、220rpm诱导表达24h，离心收菌，加入少量去离子水进行稀释，取等体积稀释样品与2×SDS-PAGE上样缓冲液混合，沸水浴中加热8min，8000rpm离心3min，行SDS-PAGE电泳分析(SDS-PAGE凝胶电泳的配制详见说明书)。80V电压跑完浓缩胶后，将电压调至120V。之后将胶块放入考马斯亮蓝中进行振荡染色30min，沸水浴中加热15min进行脱色。
[0096] 1.2.11MSP诱导菌液的裂解及重组蛋白可溶性的分析
[0097] 将诱导表达的菌液4℃、12000rpm离心2min进行收菌，弃上清。每克湿菌加入5ml裂解液，移液器吹打混匀。-20℃反复冻融3次(最后一次冻存过夜)。冰水混合物中超声破碎(160W，超声5s，停5s，循环99次)后，4℃、12000rpm离心20min，分装上清和沉淀，分别将上清和沉淀样品处理后行12％SDS-PAGE，判断MSP重组蛋白的存在情况(上清或是沉淀中)。
[0098] 1.2.11破包涵体
[0099] 将超声破碎后沉淀菌体加入20ml 8M尿素缓冲液充分混匀，置于摇床上平摇孵育3h，彻底溶解，16000rpm离心15min后弃不溶成分，将上清转至透析袋中进行透析，以透析袋置于盛有200ml含6M尿素的结合缓冲液的烧杯中，4℃透析6h后，加入40ml裂解液至烧杯中混匀，继续透析6h，浓度从6M降至5M。依次加入相应的裂解液将透析外液中的尿素浓度由5M递减为4M、3M、2M后透析时间更改为12h，再递减至1M、0M。然后收集透析袋内液体，用0.45μm滤器过滤后收集液体，透析袋内液体即为MSP蛋白。
[0100] 1.2.12重组蛋白MSP的纯化(具体操作根据带His·Tag的Ni-IDA Agarose蛋白纯化说明书进行)，分别取各收集的液体30μl加入1×SDS上样缓冲液沸水加热7-8min后行12％SDS-PAGE判断重组蛋白纯化的效果。
[0101] 1.2.13多克隆抗体的制备
[0102] 1)待新西兰大白兔在新环境中稳定后，进行耳缘静脉取血，收集血清作为阴性对照，取血量为5ml。取血后以MSP作为抗原注射。
[0103] 2)抗原经弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂充分乳化后才能注射。将MSP纯化蛋白与佐剂等体积混合后，置于振荡器上剧烈振荡使抗原充分乳化，待水相和油相不分层时即可注射。首次免疫用弗氏完全佐剂，剂量为300μg，以后免疫用弗氏不完全佐剂，每隔一周进行加强 免疫一次，剂量为200μg，背部及四肢皮下多点注射。共免疫4次。最后一次取血为心脏取血，取血量为50ml。
[0104] 3)血清的分离：用普通抗凝生化管盛血，倾斜放置于4℃沉淀过夜，次日早晨用移液器吸取上清至1.5ml离心管中4℃，4000rcf离心10min，上清即为所需血清，分装后-20℃保存。
[0105] 1.2.14免疫血清的初步纯化
[0106] 1)挑取一个经pET-28a(+)质粒转化的大肠埃希菌Transetta(DE3)单菌落，接种到含卡那霉素LB液体培养基中，37℃、220rpm振摇过夜。取菌液加入含有卡那霉素的LB液体培养基中诱导表达，在A600＝0.5时加入IPTG至终浓度0.5mmol/l，30℃、220rpm诱导表达24h。
[0107] 2)将菌液于4℃、8000rpm离心20min，弃上清，加入裂解液重悬沉淀菌体后冰上超声破碎(160W，超声5s，停5s，循环99次)。4℃、13000rpm离心20min，收集上清即pET-28a(+)表达后Transetta(DE3)裂解液。
[0108] 3)按每100μl血清中加入pET-28a(+)表达后Transetta(DE3)裂解液900μl，4℃平缓振摇过夜。次日4℃、13000rpm离心20min，收集上清。上清液再按1:5的比例加入pET-28a(+)表达后Transetta(DE3)裂解液，4℃平缓振摇过夜。次日4℃、13000rpm离心20min，收集上清即为纯化血清，分装成小份，-20℃保存备用。
[0109] 1.2.15重组蛋白MSP的鉴定及免疫学分析
[0110] 1.2.15.1Western blot方法
[0111] 以MSP重组蛋白为样品行12％SDS-PAGE后，切掉凝胶上的浓缩胶，浸泡在电转液中。根据凝胶大小剪6-8张定性滤纸和1张PVDF膜，滤纸＜凝胶＜PVDF膜。滤纸直接浸泡于电转液中，PVDF膜则先置于100％甲醇中浸泡10s，去离子水5min，再置于电转液浸泡15min。按顺序安装孔板，黑孔板、凝胶纤维支持垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、凝胶纤维支持垫、白孔板，每层均要注意排除气泡。按正负极标示正确放入电泳槽内。冰水浴，恒压100V转移1-1.5h。电转移结束后，将凝胶置于考马斯亮蓝R250染液中染色，以检查蛋白质是否完全转移。100％甲醇干燥PVDF膜10s，室温放置20-30min，置于封闭液中，4℃封闭过夜。次日以PBST漂洗3次，5min/次。剪下标记好的重组蛋白条带，置于PBS稀释配制好的一抗溶液中，室温孵育2h。PBST漂洗3次，5min/次。置于PBS稀释配制的二抗溶液中室温孵育1h后PBST漂洗5次，5min/次。显色：(a)ECL显色：将PVDF膜置于新鲜配制的ECL显色液中，置于凝胶成像系统中曝光显示条带，4℃保存。(b)DAB显色：分别取A、B、C液各500μl混合，将PVDF膜置于混合液中，去离子水终止反应，待干燥后观察并拍照，避光保存。
[0112] 1.2.15.2Western blot鉴定纯化重组蛋白MSP
[0113] 一抗为小鼠来源的抗His单克隆抗体(1：1000)，羊抗小鼠IgG-HRP(1：2000)为二抗，行Western blot鉴定纯化重组蛋白MSP。
[0114] 1.2.15.3重组蛋白MSP免疫原性分析
[0115] 以初步纯化的新西兰大白兔抗重组蛋白MSP血清和初次免疫前新西兰大白兔阴性血清为一抗(1：100稀释)，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗(1：3000稀释)，并设置相应对照，行Western blot分析重组蛋白MSP免疫原性。
[0116] 1.2.15.4重组蛋白MSP质谱鉴定
[0117] 将MSP蛋白按常规方法行12％SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色30min后脱色，切去脱色后凝胶上蛋白条带，置于1.5ml离心管中，送上海生工进行质谱测序。
[0118] 1.2.16重组蛋白MSP的MIC的测定
[0119] 1.2.16.1BCA法测定蛋白含量(按BCA蛋白定量试剂盒说明进行操作)
[0120] 1.2.16.2重组蛋白MSP对于金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的MIC的测定[0121] 将菌液在营养琼脂培养基上转种2次，确保纯度及活力。挑取4～5个单菌落接种于5ml营养肉汤培养基中，37℃，220rpm培养6h。采用麦氏比浊法将菌液用生理盐水调至0.5麦
2 3
氏比浊标准，再用营养肉汤稀释至5×10 ～2.5×10cfu/ml，备用。阴性对照组为正常生长菌液，阳性对照组为氨苄青霉素。将阳性对照组药物用高压双蒸水稀释至浓度为5mg/ml，纯化后MSP蛋白浓度分别为1.2mg/ml备用。取96孔板，用营养肉汤倍比稀释MSP蛋白和氨苄青霉素，50μl/孔，氨苄青霉素最终浓度范围为0.1μg/ml至0.5mg/ml，MSP蛋白最终浓度范围为
0.3mg/ml至0.001mg/ml。分别每孔加入50μl的已制备的菌液，混匀，37℃孵育18h。
2 3
氏比浊标准，再用营养肉汤稀释至5×10 ～2.5×10cfu/ml，备用。阴性对照组为正常生长菌液，阳性对照组为氨苄青霉素。将阳性对照组药物用高压双蒸水稀释至浓度为5mg/ml，纯化后MSP蛋白浓度分别为1.2mg/ml备用。取96孔板，用营养肉汤倍比稀释MSP蛋白和氨苄青霉素，50μl/孔，氨苄青霉素最终浓度范围为0.1μg/ml至0.5mg/ml，MSP蛋白最终浓度范围为
0.3mg/ml至0.001mg/ml。分别每孔加入50μl的已制备的菌液，混匀，37℃孵育18h。
[0122] 1.2.16.3重组蛋白MSP对于白假丝酵母菌的MIC的测定
[0123] 将白假丝酵母菌在沙氏固体培养基上转种2次，确保其纯度和活力。挑取经24小时培养的单克隆菌，加入生理盐水中，将白假丝酵母菌菌液浓度调整至1×106～5×106cfu/ml，用沙氏液体培养基将菌液稀释200倍后，再稀释10倍，使得菌液浓度调至5×102～2.5×103cfu/ml作为起始浓度备用。阴性对照组为正常生长菌液，阳性对照组为氟康唑。将阳性对照组药物溶解于DMSO中，用1640稀释至浓度为5.12μg/ml，纯化后MSP蛋白浓度为0.6mg/ml备用。取96孔板，1640倍比稀释MSP蛋白和氟康唑，50μl/孔，氟康唑最终浓度范围为0.08μg/ml至2.56μg/ml，MSP蛋白最终浓度范围为0.15mg/ml至0.001mg/ml。分别每孔加入50μl的已制备的菌液，混匀，37℃孵育48h。
[0124] 1.2.16.4MIC测定结果的判断标准
[0125] 结果参照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)中液体稀释法的判定标准，待测菌最低抑 菌浓度(MIC)为肉眼未见细菌生长的药物最低浓度。
[0126] 1.2.17重组蛋白MSP对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及白假丝酵母菌时间-杀菌曲线的测定
[0127] 取培养过夜的菌液，用生理盐水及相应培养基将菌液调至1×106～5×106cfu/ml。取96孔板，将100μl的菌液加至900μl的含有培养基和药物/MSP蛋白的混合液中，即稀释10倍，约1×105cfu/ml，混匀。阴性对照管加入相应体积的培养基，空白对照孔加培养基，金黄色葡萄球菌阳性对照为氨苄青霉素，浓度为1/2倍MIC，大肠埃希菌阳性对照为氨苄青霉素，浓度为1/3倍MIC，白假丝酵母菌阳性对照为氟康唑，浓度为0.1mg/ml，实验组为MSP蛋白，浓度为0.1mg/ml。37℃，120rpm，恒温培养，取不同时间点测A值(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌测A600值，白假丝酵母菌测A562值)。每组重复实验3次。以不同取样时间(h)为横坐标，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌以A600值为纵坐标，白假丝酵母菌以A562值为纵坐标，绘制时间-杀菌曲线。
[0128] 1.2.18MSP蛋白对白假丝酵母菌损伤的扫描电镜观察
[0129] 将MSP蛋白加入浓度为1×106cfu/ml的白假丝酵母菌菌液中，使MSP蛋白终浓度分别为0.1mg/ml，混匀后置于37℃培养箱中分别培养12h和24h，1000rpm离心5min，弃上清，用PBS缓冲液将沉淀菌液洗涤2次，弃上清，往沉淀菌液中加入3％戊二醛固定至少3h后，再次用PBS缓冲液洗涤2次，依次用50％、75％和100％乙醇对沉淀菌液进行脱水，将沉淀菌液涂载玻片上干燥，离子溅射仪喷金，扫描显微镜观察。另设正常对照及药物对照(氟康唑反应终浓度为0.1mg/ml)。
[0130] 2结果
[0131] 2.1MSP基因的序列分析
[0132] 通过BLAST对MSP基因进行同源性分析，该基因与致倦库蚊唾液腺蛋白的相似性为36％，与埃及伊蚊假设蛋白的相似性为38％。
[0133] 利用NCBI的ORF Finder程序对MSP做开放性阅读框分析，MSP基因ORF
[0134] 全长495bp，起始密码子为ATG，编码164个氨基酸，终止密码子为TAA(见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示)。
[0135] 利用Protparam分析预测MSP蛋白理论分子量17.4kDa，等电点为6.09；ProtScale分析MSP蛋白为亲水性蛋白，MSP基因编码的蛋白多肽链第32位具有最低的分值-1.667(最强的亲水性)，第11-12位具有最高的分值2.844(最强的疏水性)，整个多肽链表现为亲水性。
[0136] 运用Singl P进行信号肽预测显示：信号肽剪切位点位于第21-22位氨基酸之间，属于分泌蛋白。TMHMM对跨膜区进行分析显示：MSP蛋白有跨膜区域。
[0137] 对MSP编码蛋白的亚细胞定位分析结果显示，其分布主要在细胞外(包括细胞壁)，可能 性为66.7％；其次为液泡，可能性为22.2％；分布在线粒体的可能性为11.1％。
[0138] 对MSP编码蛋白的磷酸化位点进行分析，可能成为蛋白激酶磷酸化的位点包括5个丝氨酸、3个苏氨酸、1个色氨酸。
[0139] HNN软件预测蛋白质的二级结构结果显示：主要以α–螺旋，不规则卷曲和延伸链为蛋白最大量的结构元件。
[0140] 2.2MSP基因扩增鉴定结果
[0141] MSP基因经PCR扩增后，获得了495bp左右的特异条带(图1)。将MSP与载体pET-28a(+)经双酶切，连接，成功构建pET-28a(+)-MSP重组质粒(图2)。
[0142] 2.3重组蛋白MSP的表达及纯化
[0143] 将转化成功的重组表达质粒进行诱导表达，超声破碎后分别将上清和沉淀行SDS-PAGE电泳分析，MSP重组蛋白表达于沉淀中，上清无表达。将破碎后沉淀进行破包涵体复性，复性后蛋白进行柱纯化，约18kDa处有一特殊条带出现(图3)，与预期分子量一致。而未经诱导与空载体未诱导菌株均无特殊条带存在，因此表明目的蛋白重组表达成功。
[0144] 2.4重组蛋白MSP的鉴定及免疫原性分析
[0145] 用小鼠来源的抗His单克隆抗体为一抗，羊抗小鼠IgG-HRP为二抗，行western blot结果显示条带大小与预计相符(图4)。以初步纯化的新西兰大白兔抗MSP重组蛋白血清和初次免疫前新西兰大白兔阴性血清为一抗，以HRP标记的羊抗兔IgG为二抗，行western blot分析显示：MSP重组蛋白具有免疫原性(图5)。质谱鉴定分析结果显示：纯化蛋白序列与MSP序列一致。
[0146] 2.5MSP蛋白对于金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及白假丝酵母菌的MIC
[0147] 分别以氨苄青霉素对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的抑菌效果作阳性对照，氨苄青霉素对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.063μg/ml，氨苄青霉素对大肠埃希菌的MIC值为0.031μg/ml，以氟康唑对白假丝酵母菌的抑菌效果作阳性对照，氟康唑对白假丝酵母菌的的MIC值为0.032μg/ml，MSP蛋白对金黄色葡萄球菌的MIC值为0.2mg/ml，对大肠埃希菌的MIC值为0.3mg/ml，对白假丝酵母菌的MIC值为0.002mg/ml，由此看出MSP蛋白对于白假丝酵母菌抗菌效果较好。
[0148] 2.6重组蛋白MSP对于金黄色葡萄球菌的时间-杀菌曲线
[0149] 如图6所示，阴性对照组的金黄色葡萄球菌呈正常上升生长，阳性对照组及MSP组菌液的生长明显受到了抑制，菌液A值几乎保持在平直状态。MSP蛋白对金黄色葡萄球菌在作用4h后开始发挥作用，细菌数量没有明显增长。
[0150] 2.7重组蛋白MSP对于大肠埃希菌的时间-杀菌曲线
[0151] 如图7所示，阴性对照组的大肠埃希菌呈直线生长，阳性对照组及MSP组菌液的生长明显受到了抑制。MSP蛋白对大肠埃希菌在培养4h起逐步发挥抗菌作用，细菌数量随着培养时间的延长没有明显变化，生长曲线总体呈平直趋势。
[0152] 2.8重组蛋白MSP对于白假丝酵母菌的时间-杀菌曲线
[0153] 如图8所示，由于白假丝酵母菌为真菌，生长速度较为缓慢，因此12h前各组菌液的生长速度较一致，12h后阴性对照组的白假丝酵母菌呈直线生长，阳性对照组及MSP组与阴性对照组相比菌液的生长明显受到了抑制。氟康唑和MSP蛋白在白假丝酵母菌生长的整个过程中均发挥抗菌作用。
[0154] 2.9扫描电镜分析重组蛋白MSP对白假丝酵母菌的作用
[0155] 如图9所示，正常情况下，白假丝酵母菌形态完整，呈圆形或椭圆形，菌体饱满，表面光滑，假菌丝细长。氟康唑作用24h后，菌落正常形态发生改变，菌体散落，菌细胞皱缩，菌体细胞表面粗糙，凹凸不平，菌细胞呈碎片状。MSP蛋白作用12h白假丝酵母菌出现菌体大小不一，断裂、不完整，作用24h病变严重，菌体严重被破坏，未见完整细胞，菌体粗糙，严重凹凸不平，菌体破裂后胞质流失，穿孔现象明显。
[0156] 3结论
[0157] 经生物信息学分析，MSP基因ORF全长495bp，编码164个氨基酸，等电点为6.09，为酸性蛋白，理论分子量17.4kDa，与抗菌肽相比，分子量较大。经BLAST比对发现MSP与致倦库蚊唾液腺蛋白有36％的相似性，故将其命名为唾液腺蛋白。疏水性是决定抗菌肽活性的重要参数之一，可促进抗菌肽与膜之间的作用，增强抗菌肽整体的疏水性可使抗菌效力也相应增加。MSP基因编码的蛋白多肽链表现为亲水性，这为将来分子结构的改造提供了空间。MSP基因编码的蛋白有信号肽，属于分泌蛋白；MSP蛋白有跨膜区域，与典型的膜作用型的抗菌肽相似。基因编码蛋白的亚细胞定位分析结果推测该蛋白主要分布在细胞质。MSP存在可能成为蛋白激酶磷酸化的位点，推测其在信号转导中可能发挥作用。MSP二级结构预测主要有3种类型，α–螺旋，不规则卷曲及延伸链。α–螺旋结构主要是通过在细菌细胞膜上形成电势依赖通道，改变细胞膜的通透性，使细胞内容物泄露而对革兰氏阳性菌及阴性菌具有广谱抗菌活性。MSP具有抗菌肽的共同特性，即α–螺旋结构。pET-28a(+)表达载体具有T7启动子，表达产物的C末端带有6-His Tag，在菌体中的含量明显高于其他蛋白质组分。大肠埃希菌Transetta(DE3)感受态可补充大肠埃希菌缺乏的6种稀有密码子(GGA、CCC、CUA、AGG、AGA、AUA)对应的tRNA，提高外源基因，尤其是真核基因在原核系统的表达水平，提示该表达系统较适于目的基因的表达，这为表达的融合蛋白的纯化及制备抗体提供了方便。相关研究表明，大多数抗菌蛋白是以包涵体的形式在大肠埃希菌中高效表达。MSP在大肠埃 希菌Transetta(DE3)中以包涵体的形式表达，获取蛋白的途径较上清可溶性表达繁琐，需经过变性、复性，且影响因素较多，如尿素浓度、裂解液PH值等。经破包涵体、亲和层析柱纯化，SDS-PAGE分析，显示纯化获得较满意效果。将纯化蛋白进行western blot鉴定，结果显示条带大小与预计相符，质谱鉴定结果示纯化蛋白序列与MSP序列一致，提示MSP蛋白获取成功，具有免疫原性，为其功能的研究奠定了基础。
[0158] 本次研究发现，MSP蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌及白假丝酵母菌均有抑制作用，MSP蛋白对金黄色葡萄球菌的MIC值0.2mg/ml，对大肠埃希菌的MIC值为0.3mg/ml，对白假丝酵母菌的MIC值为0.002mg/ml，尤其对白假丝酵母菌的抗菌作用较强。通过时间-杀菌曲线证明MSP蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌作用4h后发挥作用，对白假丝酵母菌作用12h后发挥作用，曲线总体呈平直趋势，与已知抗菌肽快速发挥抑菌或杀菌作用不同。抗菌肽对不同细菌的抑菌活力有差异，推测其可能与细胞结构差异有关。凡是能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质均能损伤细胞壁使菌体破裂。不同的细胞表面的物理化学性质差异很大，而细胞膜是大多数抗菌肽发挥作用的重要靶点。目前关于抗真菌肽杀菌机制的认识还不是很清楚，以与病原体细胞膜选择性结合引起膜结构破坏所致为主，抗菌肽不同作用机制也不同。鉴于重组MSP蛋白对抗真菌活性较为突出，本发明进一步探讨了其对真菌的抗菌机制。MSP蛋白作用于白假丝酵母菌的扫描电镜发现，与阴性对照相比较，MSP组发生了明显的病理变化，随着作用时间的延长，病变程度越严重，主要以细胞表面病变及穿孔为主，提示MSP蛋白作用靶位点可能是细胞表面结构细胞壁或者细胞膜，可能通过破坏菌体细胞表面结构，从而降低白假丝酵母菌的粘附作用。因此，MSP蛋白是一种新型的抗菌蛋白。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种家蝇引诱剂 | 2020-05-11 | 216 |
| 家蝇幼虫功能诱导营养粉及制备方法 | 2020-05-17 | 672 |
| 家蝇及其幼虫规模化无菌养殖方法 | 2020-05-17 | 777 |
| 一种家蝇诱杀剂 | 2020-05-11 | 186 |
| 家蝇及其幼虫规模化无菌养殖方法 | 2020-05-18 | 243 |
| 一种家蝇诱杀剂 | 2020-05-11 | 852 |
| 家蝇MSP蛋白在抗菌方面的应用 | 2020-05-16 | 843 |
| 一种家蝇幼虫的分离方法 | 2020-05-16 | 765 |
| 家蝇幼虫的工业化培养设备 | 2020-05-16 | 176 |
| 一种家蝇幼虫饲料 | 2020-05-14 | 701 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
家蝇热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈