人类抗-SOD1抗体
阅读：1014发布：2020-11-13
专利汇可以提供人类抗-SOD1抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且人类抗-SOD1 抗体 提供了也称为超 氧 化物歧化酶1或SOD1的新的人 铜 -锌超氧化物歧化酶、特异性抗体及其 片段 、衍 生物 及其变体以及相关的方法。也公开了涉及SOD1特异性抗体的测定法、 试剂 盒 和载体。所述抗体、免疫球蛋白链以及其结合片段、衍生物和变体可分别应用于靶向免疫 治疗 和诊断的SOD1的药物和诊断组合物。，下面是人类抗-SOD1抗体专利的具体信息内容。
1.一种人类单克隆抗-SOD1抗体，优选其特征在于，所述抗体能够结合错误折叠或聚集的SOD1；并且其中所述抗体结合到生理SOD1二聚体，与生理SOD1二聚体相比，优先识别错误折叠或聚集的SOD1，或基本上不识别生理SOD1二聚体；和/或优选结合人野生型和鼠科的SOD1。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特异性结合SOD1表位，该表位包含或包括氨基酸序列，所述序列如下：DGVADVS （SEQ ID NO: 2），GGPKDEERHVG （SEQ ID NO: 51）， LKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHE FGDNT （SEQ ID NO: 52），IIGRTLV （SEQ ID NO:
53）， LGNVTADKDGV （SEQ ID NO: 54），HEKADDLGKGGNEES （SEQ ID NO: 55）， EDSVISL （SEQ ID NO: 56），KTGNAGS （SEQ ID NO: 57），LGNVTADKDGV （SEQ ID NO: 58） or GGPKDEE （SEQ ID NO: 59）。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或如图1A-lL任何一个示出的在其可变区包含至少一个互补性决定区域（CDR）的SOD1结合片段，优选包括VH和/或VL区的氨基酸序列，如图
1A-lL任何一个所示。
4.一种抗体或其抗原-结合分子，其与权利要求1至3中的任意一项所述的抗体竞争SOD1特异性结合。
5.根据权利要求1至4中的任意一项所述的抗体，其选自包括嵌合鼠-人或鼠源化抗体和/或单链Fv片段（scFv）、F（ab′）片段、F（ab）片段和F（ab’）2片段的组。
6.一种多核苷酸，其至少编码权利要求1至5中的任一项所述的抗体的免疫球蛋白链结合结构域或可变区。
7.一种载体，其包含权利要求6所述的多核苷酸，任选地组合有权利要求6所述的用于编码所述结合分子的其它免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其包含权利要求6所述的多核苷酸或权利要求7所述的载体。
9.根据权利要求1至5中的任意一项所述的抗体，其特征在于：
（i）可检测性标记，优选地，其中所述可检测标记选自包括酶、放射性同位素、荧光团和重金属的组；和/或
（ii）附着至药物。
10.一种组合物，其包含权利要求1至5或9中任意一项所述的抗体、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的细胞，所述组合物优选为：
（i） 一种药物组合物，并且其还包含药学上可接受的载体，优选还包括另外的药物，可用于治疗肌萎缩性侧索硬化；或
（ii） 一种诊断组合物，并可选地包括常规用于基于免疫或核酸诊断方法的试剂。
11.根据权利要求1至5中或9的任意一项所述的抗体或SOD1结合分子具有任何一种化合物基本相同的结合特异性、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的用于预防性或治疗性治疗的细胞，或监测受试者肌萎缩性侧索硬化的治疗进展或反应。
12.一种用于诊断或监测所述受试者的肌萎缩性侧索硬化进展的方法，所述方法包括：
使用权利要求1至5或9所述的至少一种抗体来诊断受试者，在来自受试者的取样中确定错误折叠和/或聚集的SOD1的存在，其中所述错误折叠或聚集的SOD1的存在表示肌萎缩性侧索硬化，与生理SOD1二聚体的水平相比，错误折叠或聚集SOD1水平的提高指示所述受试者的肌萎缩性侧索硬化的进展。
13.一种SOD1结合分子，其包括权利要求1至5或9任意一项所述的抗体的至少一个CDR，用于在人体或动物体中体内检测SOD1，或将治疗和/或诊断剂靶向SOD1，优选地，其中所述体内成像包括正电子发射断层显像（PET）、单光子发射体层摄影术（SPECT）、近红外（NIR）光成像或磁共振成像（MRI）。
14.一种肽，其具有权利要求1至5或9的任意一项所述的抗体特异识别的SOD1的表位，优选地，其中所述的肽包含或包括权利要求2所定义的氨基酸序列或修饰的序列，所述修饰的序列中一个或多个氨基酸被取代、删除和/或添加，其中，所述肽由权利要求1至3的任何一项所述的抗体所识别。
15.一种试剂盒，其用于诊断或监控肌萎缩性侧索硬化的进展，所述试剂盒包括至少一个权利要求1至5中或9的任意一项所述的抗体或SOD1结合分子，所述结合分子具有与其中任何一种化合物基本相同的结合特异性、权利要求6所述的多核苷酸、权利要求7所述的载体或权利要求8所述的细胞和/或权利要求14所述的肽，其中任选地具有试剂和/或使用说明。
人类抗-SOD1抗体
技术领域
[0001] 本发明广泛涉及新型的分子，其特异性地结合至超氧化物歧化酶[Cu-Zn]，也称作超氧化物歧化酶1或SOD1，特别是结合至识别SOD1蛋白和SOD1的错误折叠/聚集形式的人类抗体及其片段、衍生物和变体。另外，本发明涉及药用组合物和诊断组合物，其包括这种结合分子、抗体及其模拟化合物，这两种组合物作为识别血浆和CSF(脑脊液)中的SOD1和错误折叠/聚集的SOD1种的诊断工具，以及同样在治疗与错误折叠/聚集SOD1相关的病症（例如肌萎缩性侧索硬化（ALS），也称作路格里克病，或夏科氏病。）的被动接种策略中都是有价值的。
[0002] 发明背景
[0003] 蛋白累积、修饰和聚集是由许多神经退行性疾病引起的。称作运动神经元疾病的神经退行疾病的亚组特征为运动神经元的逐步退化和死亡。该组病症的一种最普通的成员：肌萎缩性侧索硬化（ALS），是一种演变速度快、常常致命的神经疾病，该疾病攻击负责控制随意肌的神经元，特别是脊髓、脑干和运动皮层中的运动神经元（Bruijn等人，Annu.Rev.Neurosci.27（2004），723-749）。在所有ALS病例的90-95％中，没有明显的相关风险因子，所以疾病的病因不明（散发性ALS，sALS）。所有的ALS病例中仅有5-10％是遗传的（家族性ALS，fALS），它们中大约20％由产生超氧化物歧化酶[Cu-Zn]酶（也称作超氧化物歧化酶1或SOD1）的基因突变所致（Bruijn等人，Annu.Rev.Neurosci.27（2004），723-749；Valentine 等 人，Annu.Rev.Biochem.74（2005），563-593；Andersen，Curr.Neurol.Neurosci.Rep.6（2006），37-46）。
[0004] 人SOD1是一种32kDa的同型二聚体金属酶，它的基因位点位于染色体21上，主要位于细胞质、细胞核和过氧化物酶体中，也位于真核细胞的线粒体膜间腔中。它包含一个结合了催化性铜离子和结构性锌离子的活性位点。SOD1起到抗氧化剂酶的功能作用，抗氧化剂酶能够催化超氧自由基的歧化作用，将其分解为分子氧和过氧化氢，以这种方式降低超氧化物的稳定状态浓度和细胞的氧化应激（Fridovich，Science201（1978），875-879）。
[0005] 已知的散布在SOD1蛋白上的突变超过100种（http://alsod.iop.kcl.ac.uk/；Andersen，Amyotroph.Lateral Scler.Other Motor Neuron Disord.1Suppl.1（2000），S31-42；Andersen等人，Amyotroph.Lateral Scler。Other MotorNeuron Disord.2（2001），
63-69；Gaudette等人，Amyotroph.Lateral Scler.Other Motor Neuron Disord.1（2000），
83-89）但除了D90A突变之外的所有突变都导致显性遗传疾病。突变体SOD1是如何导致ALS的，并没有完全被阐明。然而，一些突变不同地影响了相应的突变体SOD1-蛋白的稳定性、金属离子亲和力和酶活性，另一些则没有（Valentine等人，Annu.Rev.Biochem.74（2005），563-593；Valentine and Hart，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100（2003），3617-3622；
Lindberg 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102，9754-9759；Taylor 等 人，Science296（2005），1991-1995）。然而，疾病的显性遗传与SOD1基因敲除小鼠没有发生ALS这个事实相结合（Reaume等人，Nat.Genet.13（1996），43-47）表明ALS中的SOD1-介导的毒性不是由减少所导致的，而是由突变所导致的一种或多种毒性功能的增益引起的。
63-69；Gaudette等人，Amyotroph.Lateral Scler.Other Motor Neuron Disord.1（2000），
83-89）但除了D90A突变之外的所有突变都导致显性遗传疾病。突变体SOD1是如何导致ALS的，并没有完全被阐明。然而，一些突变不同地影响了相应的突变体SOD1-蛋白的稳定性、金属离子亲和力和酶活性，另一些则没有（Valentine等人，Annu.Rev.Biochem.74（2005），563-593；Valentine and Hart，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100（2003），3617-3622；
Lindberg 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA102，9754-9759；Taylor 等 人，Science296（2005），1991-1995）。然而，疾病的显性遗传与SOD1基因敲除小鼠没有发生ALS这个事实相结合（Reaume等人，Nat.Genet.13（1996），43-47）表明ALS中的SOD1-介导的毒性不是由减少所导致的，而是由突变所导致的一种或多种毒性功能的增益引起的。
[0006] 三种已知的人类突变（G37R，G85R和G93A）已经广泛地在转基因小鼠模型中被表征（Bruijn和Cleveland，Neuropathol.Appl.Neurobiol.22（1996），373 87；Gurney，N.Engl.J.Med.331（1994），1721 1722；Ripps等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA92（1995），689 93；Wong等人，Neuron14（1995），1105 16）。人突变体蛋白的泛普遍表达与内源小鼠SOD1相比在同等水平上或比之高数倍。与野生型人类SOD1的过度表达相反，突变体形式的过度表达导致具有与人类疾病相似的病理学的动物中的ALS的形成。例如，与来自ALS患者的组织相比，已经在神经元和星形胶质细胞中发现在突变体SOD1的聚集体中富含的蛋白质类内含体（Stieber等人，Neurol.Sci.173（2000），53-62），其作为核周体沉积物和高分子复合物与各种线粒体腔室相关（Manfredi和Xu，Mitochondrion5（2005），77-87），并在内质网中（Kikuchi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103（2006），6025-6030）。
[0007] 内含体不仅仅包含SOD1。一种附加的、可能是ALS病原以及这些病原的化合物是TAR DNA-结合蛋白43（TDP-43）。最近报道了在编码TDP-43（TARDBP）的基因中的致病突变出现在家族性和散发性ALS患者中，其似乎至少对3.3％的fALS病例负责（Neumann等人，Science314（2006），130-133；Rutherford等人，PLoS Genet.4（2008），e1000193）。
[0008] 已进一步报道了SOD1是阿尔茨海默病（AD）和帕金森氏病（PD）患者脑髓中的氧化性损伤的主要目标。SOD1的总水平增加了，并且在AD脑髓中发现了与淀粉状老年斑和神经纤维缠结相关的蛋白质聚合物（Choi等人，J.Biol.Chem.280（2005），11648-11655）。
[0009] 导致SOD1聚集的准确机制是未知的。然而，主要假设表明SOD1的聚集是由于突变诱导的构象变化而导致的蛋白质的错误折叠的结果（Bruijn等人，Science281（1998），1851–1854；Chattopadhyay 和 Valentine，Antioxid.Redox.Signal11（2009），1603–
1614；Furukawa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103（2006），7148–7153；Prudencio等人，Hum.Mol.Genet.18（2009），3217–3226；Wang等人，PLoS Biol.6，e170（2008））。神经胶质细胞也将错误折叠的突变体或wtSOD1分泌到细胞外部环境中，在那里它可以引发运动神经元的选择性死亡（Urushitani等人，Nature Neuroscience9（2006）.108-118）。一旦第一症状形成，这就提供了突变体SOD1毒性的非细胞自治性质和疾病的迅速演变的一种可能的解释。
1614；Furukawa等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103（2006），7148–7153；Prudencio等人，Hum.Mol.Genet.18（2009），3217–3226；Wang等人，PLoS Biol.6，e170（2008））。神经胶质细胞也将错误折叠的突变体或wtSOD1分泌到细胞外部环境中，在那里它可以引发运动神经元的选择性死亡（Urushitani等人，Nature Neuroscience9（2006）.108-118）。一旦第一症状形成，这就提供了突变体SOD1毒性的非细胞自治性质和疾病的迅速演变的一种可能的解释。
[0010] 如已经提到的，占所有事件90-95％的ALS的自发形式的病因还不清楚。然而，也有人认为与关于家族性ALS形式的观察类似，野生型（wt）SOD1的错误折叠与大部分散发性的ALS病例相关联（Bosco等人，Nature Neuroscience13（2010），1396-1403）。野生型SOD1是一种经过大量翻译后修饰的主体，如亚基的二聚化、Cys57和Cys146残基之间的亚基内的二硫键的形成，以及铜和锌的配位。这些过程的中断已经全部证明可导致野生型SOD1聚集（Durazo等人，J.Biol.Chem.277（2009），15923–15931；Estévez等人，Science286（1999），2498–2500；Rakhit等人，J.Biol.Chem.279（2004），15499–15504；Lindberg等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101（2004），15893–15898），因此这种聚集提供了一种用于自发性ALS形式的可能的致病模型。
[0011] 靶向突变体或错误折叠SOD1的免疫疗法在动物模型中已经产生了对家族性ALS形式的令人鼓舞的结果。延缓疾病的发作和死亡率的主动免疫削弱了运动神经元损失，并降低了SOD1转基因小鼠中的SOD1水平。
[0012] 寿命期限的延长与抗体滴度有关（Urushitani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA104（2007），2495-2500；Cashman，NDI conference Uppsala2009，Takeuchi 等 人，J Neuropathol Exp Neurol.（2010），1044-1056）。
[0013] 被动免疫延迟了体重损失和后肢反射损伤，并延长了寿命期限（Urushitani 等 人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA104（2007），2495-2500；Cashman，NDI conference Uppsala2009；Gros-Louis Fetal.，J.Neurochem2010）。
[0014] 这些发现说明了与靶向SOD1的主动免疫治疗方法相关的潜在益处。尽管电位高，用于主动和被动免疫治疗的方法可以产生相对于它们于特定的治疗终点的有效性产生变化的效果。如AD的临床小鼠模型中或人中的Aβ定向方法所示，它们也可以与不良反应如自身免疫疾病、脑膜脑炎、增加的大脑淀粉样血管病和诱导大脑出血相关联（Pfeifer等人，Science298（2002），1379；Furlan等人，Brain126（2003），285-291；Wilcock等人，J.Neuroinflammation1:24（2004）；Lee等人，FEBS Lett.579（2005），2564-8；Wilcock等人，Neuroscience144（2007），950-960；Schenk，Nat.Rev.Neurosci.3（2002），824-828；Orgogozo等人，Neurology61（2003），46-54）。在上下文中的ALS，没有出现大量的细胞外蛋白沉积，这可能并不是问题，但是仍然应该考虑。
[0015] 综上所述，迫切需要纠正错误折叠/聚集的SOD1蛋白的有效且安全治疗的新型治疗策略。
[0016] 被动免疫具有通过人免疫系统在进化上最佳化且亲合力成熟化的人类抗体，提供了一种具有高几率良好的有效性、安全性并且有前途的新型治疗途径。
发明内容
[0017] 本发明利用健康人类受试者的SOD1-特异性免疫反应，用于天然抗-SOD1特异性人单克隆抗体的分离。具体地说，根据本发明进行的实验成功地从没有ALS迹象的健康人类受试者中分离单克隆的SOD1-特异性抗体。
[0018] 因此，本发明涉及人类抗体、抗原-结合片段和能够特异性识别SOD1的类似的抗原-结合分子。通过“特异性识别SOD1”、“SOD1上或者是用于SOD1的特异性抗体”和“抗-SOD1抗体”是具体地指、通常地指、并共同地指天然形式的SOD1抗体或错误折叠或聚集SOD1亚型抗体。此处提供的是对于全长、错误折叠和聚集形式的人类抗体。
[0019] 在本发明的特别优选的实施例中,人类抗体或其抗原结合片段显示出抗体的免疫学结合特性，该抗体特征在于如图1中所示的可变区VH和/或VL。
[0020] 抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段，F（ab'）片段，F（ab）片段，以及F（ab'）2片段，或者是任何其它抗原结合片段。在具体的实施例中，见下文，抗体或其片段是人类IgG同种型抗体。可选择地,该抗体是嵌合人-鼠抗体或者是鼠源化抗体，后者对于动物中的诊断方法和研究有特别的作用。
[0021] 此外，本发明涉及组合物，该组合物包含本发明的抗体或其活性片段、或激动剂以及同类分子，或可选地包含相同的拮抗剂，本发明还涉及到免疫治疗和免疫诊断方法,这些方法在预防、诊断或治疗错误折叠/聚集的SOD1相关的疾病中使用本发明中这种组合物，例如，ALS，其中，可以将该组合物的有效量给予其需要的患者。
[0022] 当然，本发明分别地延伸至无限增殖化人类B记忆淋巴细胞中以及B细胞中，如下文定义，该B细胞产生具有清晰和独特特性的抗体。
[0023] 本发明同样涉及多核苷酸，该多核苷酸至少编码一个本发明抗体的免疫球蛋白链的可变区。优选地，如图1所示，所述可变区包含至少一个可变区的VH和/或VL的互补决定区（CDR）。
[0024] 因此，本发明还包括包含所述多核苷酸的载体和以此转化的宿主细胞，以及包括它们制备抗体和制备专用于SOD1的等同结合分子的用途。本领域已知的是，用于重组制备抗体及其模拟化合物的手段和方法，以及用于筛选可以是或者可以不是抗体的结合竞争分子的方法。然而，如本文所述，特别是在人类治疗应用方面，本发明的抗体是人类抗体，在此意义上，所述抗体的应用基本不含针对这种抗体的免疫反应，这种抗体或者被叫做嵌合的抗体甚至是人源化抗体。
[0025] 此外，本文所公开的组合物和方法可用于鉴定样品中的SOD1。所公开的抗-SOD1抗体可用于筛选人类血液、CSF和尿液样品中SOD1的存在，例如，通过使用基于ELISA（酶联免疫吸附试验）的或表面适应性的测定。这里公开的方法和组合物可以有助于错误折叠/聚集的SOD1相关的疾病，例如ALS诊断,并且这些方法和组合物可用于监测疾病进展和治疗功效。
[0026] 因此，本发明的一个具体目标是提供用于治疗、诊断或预防错误折叠/聚集的SOD1相关的疾病的方法，例如，肌萎缩性侧索硬化（ALS）。该方法包括给予受试者人类抗体或抗体衍生物的有效浓度，其中该抗体靶向SOD1。
[0027] 在本发明的另一个方面，本发明提供了一种具有SOD1的表位的肽，可由本发明的抗体特异性地识别。如下文详细的说明和实例中所述，所述的肽包含或由氨基酸序列组成，或者在其修改的序列中，一个或多个氨基酸被取代、删除和/或添加。另外，本发明提供了用于在受试者中诊断肌萎缩性侧索硬化的方法，包括以下步骤：确定在所述受试者的生物样品中，存在能够与所述肽结合的抗体。
[0029] 图1：可变区的氨基酸和核苷酸序列的，即下述人类抗体的重链和κ／λ轻链，所述人类抗体为：NI-204.10D12（A）、NI-204.12G7（B）、NI-204.10A8（C）、NI-204.9F6（D）、NI-204.11F11（E）、NI-204.67E12（F）、NI-204.6H1（G）、NI-204.12G3（H）、NI-204.7G5（I）、NI-204.7B3（J）、NI-204.34A3（K）和NI-204.25H3（L）。构架（FR）和互补性决定区（CDRs）用加了下划线的CDRs表示。同样显示重链接合区（JH）以及轻链连接区（JK）。由于克隆策略，重链和轻链的N-末端处的氨基酸序列潜在地包含FR1中引物诱导的变化，但是它基本上不影响抗体的生物学活性。为了提供共有人类抗体，原始克隆的核苷酸和氨基酸序列与数据库中相关的人种系可变区序列对准并且按照其进行调谐；参见，例如，由MRC中心管理的用于蛋白工程（英国剑桥）的Vbase（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uki）。由于PCR引物，可以认为那些氨基酸潜在地偏离共有种系序列，因此它们在氨基酸序列中已经被替代，这些氨基酸用粗线表示。
[0030] 图2：人类重组抗体的超氧化物歧化酶1-结合特异性。
[0031] （A）在直接的ELISA中重组NI-204.10D12与人类SOD1的特异性结合。（B）在直接的ELISA中重组NI-204.12G7与人类SOD1的特异性结合。（C）在直接的ELISA中重组NI-204.10A8与人类SOD1的特异性结合。（D）在直接的ELISA中重组NI-204.9F6与人类SOD1的特异性结合。
[0032] 图3：重组人类衍生抗-SOD1抗体的EC50测定。（A）ELISA板用重组人类SOD1涂覆，并且用下列重组人类衍生抗体的指定浓度培养，该重组人类衍生抗体为NI-204.10D12（●）,NI-204.10A8（■）,NI-204.9F6（▲）或NI-204.12G7（▼）。
[0033] 具有高亲和力的抗体NI-204.10D12、NI-204.10A8和NI-204.12G7与重组人类SOD1分别地进行结合，该重组人类SOD1带有10.0nM、2.7nM以及0.4nM的EC50。当EC50在奈米摩尔浓度为104.8nM的范围内，NI-204.9F6与重组SOD1结合。
[0034] 图4:在人类SOD1的涂层浓度增加时，EC50分析有利于构象表位的形成。人类抗体NI-204.10D12（A）、NI-204.10A8（B）、NI-204-9F6（C）和NI-204.12G7（D）EC50测定以及在使用直接的ELISA的涂层浓度（▼30μg/ml;▲10μg/ml;■1μg/ml;●0.1μg/ml;重组人类SOD1的涂层浓度）增加时鼠单克隆抗体SOD-172B1对人类重组SOD1结合亲和力(E)。测定的EC50值示于如下的表（F）中。NI-204.10D12抗体（A）和NI-204.12G7抗体（D）优先地靶向人类SOD1的表位，该表位最有可能暴露或形成于高涂层浓度下并且伴随着重组人体SOD1的错误折叠或聚集。NI-204.10A8（B）和NI-204.9F6抗体（C）二者识别人类SOD1表位，该表位存在于生理蛋白质构象中以及存在于错误折叠/聚集的SOD1中。
[0035] 图5:NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7和NI-204.9F6EC50测定和超氧■ ●化物歧化酶1聚集体（ ）的SOD-172B1结合亲和力和使用直接的ELISA的生理二聚体（ ）。
（A）重组NI-204.10D12与错误折叠/聚集的人类SOD1高亲和性结合，而不是与生理人类SOD1二聚体高亲和性结合。（B）NI-204.10A8与人类生理SOD1二聚体以及错误折叠/聚集的人类SOD1高亲和性结合。（C）重组NI-204.12G7与错误折叠/聚集的人类SOD1高亲和性结合，而不是与生理人类SOD1二聚体高亲和性结合。（D）重组NI-204.9F6与错误折叠/聚集的人类SOD1稍微优先结合。（E）没有优先结合到市售的SOD-172B1抗体的错误折叠的/聚集的人类SOD1上。
（A）重组NI-204.10D12与错误折叠/聚集的人类SOD1高亲和性结合，而不是与生理人类SOD1二聚体高亲和性结合。（B）NI-204.10A8与人类生理SOD1二聚体以及错误折叠/聚集的人类SOD1高亲和性结合。（C）重组NI-204.12G7与错误折叠/聚集的人类SOD1高亲和性结合，而不是与生理人类SOD1二聚体高亲和性结合。（D）重组NI-204.9F6与错误折叠/聚集的人类SOD1稍微优先结合。（E）没有优先结合到市售的SOD-172B1抗体的错误折叠的/聚集的人类SOD1上。
[0036] 图6:NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7和NI-209.9F6在SOD1G93A转基因小鼠模型中识别病理超氧化物歧化酶1聚集体。免疫组织化学分析示出了在疾病的临终阶段，在B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因动物的脊髓中，SOD1病理和/或生理SOD1与NI-204.10D12（A）的嵌合检测；与人类NI-204-10A8（B），与人类NI-204.12G7（C），与人类NI-204.9F6（D）以及与EPR1726抗-SOD1（E）抗体的嵌合检测。
[0037] 图7:如肽扫描分析所进行的评估，NI.204.10D12结合到人类SOD1的中央结构域上。抗体结合发生在覆盖氨基酸85-107的肽上。因此，NI.204.10D12结合表位包含氨基酸93-99与序列DGVADVS（SEQ ID NO:2）。
[0038] 图8:重组的人源的抗体NI-204.10D12以相等的亲和力结合到SOD1合成肽，该合成肽具有衍生自人类野生型、G93A人类突变体和野生型小鼠SOD1蛋白的氨基酸序列。这些合成肽覆盖所识别的NI-204.10D12结合表位。
[0039] 图9:在疾病的临终阶段的B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因脊髓的免疫组织化学分析。在疾病的临终阶段,在B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因动物的脊髓中，SOD1病理和/或生理SOD1与NI-204.10D12，50nM（A）;NI-204-12G7，5nM（B）;NI-204.11F11，5nM（C）;NI-204.10A8，50nM（D）;NI-204.67E12，5nM（E）;NI.204.6H1，5nM（F）;NI.204.12G3，50nM（G）;NI.204.7G5，50nM（H）;NI.204.25H3，50nM（I）;NI.204.34A3，50nM（J）;NI.204.7B3，50nM（K）和对照抗体C4F6（L）以及B8H10（M）的检测。
[0040] 图10:（A）B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的Kaplan-Meier的存活曲线，该转基因小鼠被动地用NI-204.10D12抗体进行免疫。B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转●基因小鼠的Kaplan-Meier的存活曲线，该转基因小鼠是用PBS（ ）或NI-204.10D12SOD1-特■
异性抗体（ ）进行心室内的治疗。
异性抗体（ ）进行心室内的治疗。
[0041] （B）在用NI-204.10D12抗体被动免疫时，B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的体重下降的衰减。B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的体重在外科泵移植以后，用确定的基线体重的百分率表示；*p＜0.05，该小鼠用PBS（虚线）或NI-204.10D12SOD1-特异性抗体（实线）进行了心室内治疗。
[0042] 图11：通过用NI-204.10D12抗体被动地免疫，B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠中抓握强度的改进。B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的握力在外科泵移植以后，用基线上抓握强度的百分率表示；*p＜0.05，该小鼠用PBS（虚线）或NI-204.10D12SOD1-特异性抗体（实线）进行了心室内治疗。
[0043] 图12：在长期的NI-204.10D12抗体治疗时，B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的脊髓中的运动神经元损失的衰减。对B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的腰椎脊髓的腹角中的运动神经元进行计数，该转基因小鼠是用PBS或NI-204.10D12SOD1-特异性抗体进行心室内治疗的。（A）运动神经元的计数依靠尼氏染色。数据通过平均值±平均数标准误差来表示。（B）运动神经元的计数依靠NeuN染色。数据代表平均值±SEM;**，p＜0.01。
具体实施方式
[0044] Ⅰ.定义
[0045] 蛋白质沉积、修饰和聚集是许多神经变性疾病的病理方面，例如这些神经变性疾病可以是亨廷顿病、阿尔茨海默（AD）氏病和帕金森病（PD）（Tayloret al.,Science296（2005）,1991-1995）。蛋白质的错误折叠、聚集和沉淀似乎与这些疾病中的神经毒性直接相关。在缺乏分子内二硫键或缺乏结合锌离子的情况下,天然的同源二聚体，铜-锌超氧化物歧化酶（SOD1）蛋白质（野生型和ALS1变体两者）有形成纤维状聚集物的倾向。与错误折叠/聚集的SOD1相关的疾病,例如有肌萎缩性侧索硬化（ALS），也称为Lou Gehrig病或夏科氏病。另外，如前所述，在AD和PD中已发现，SOD1的氧化修饰可能会导致蛋白的错误折叠，并且SOD1的聚集还与AD患者的淀粉样蛋白斑块和神经纤维缠结有关（Choi等人,J.Biol.Chem.280（2005）,11648-11655），这说明在这些疾病的病理中，SOD1可能起到的作用。
[0046] ALS的临床特征是负责控制随意肌的运动神经元的逐渐退化和死亡，特别是脊髓、脑干和运动皮层中的运动神经元。疾病进程快速发展，同时作为标志，肌肉逐渐弱化、消耗（萎缩），和颤搐（肌束震颤）会在60％的患者中发生，并且通常是致命的，大多数情况是呼吸衰竭，并且平均存活时间为三到五年。
[0047] ALS（～90-95％）的大多数情况是偶尔发生的（sALS），剩余的是家族性遗传（fALS）。大约20％的fALS显示了与SOD1基因中的突变相关联的遗传性。ALS的分子机制在大多数情况下仍然是不显著的，然而，一些研究提供的数据显示，异常的SOD1种类可以在sALS和fALS两种患者中发现，这说明所述的异常SOD1种类可能是共同病源（Gruzman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA104（2007）,12524-12529）。
[0048] 在转基因ALS小鼠模型中，与ALS患者的组织相比，富含突变SOD1聚集体的蛋白质夹杂物已经在神经元和星形胶质细胞（Stieber et al.,Neurol.Sci.173（2000）,53-62）中发现，它们分别作为核周体沉积物以及作为大分子复合物与各种线粒体腔室相连（Manfredi and Xu,Mitochondrion5（2005）,77-87），并且也在内质网（Kikuchi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.103（2006）,6025-6030）内部发现了它。此外，错误折叠突变体或wtSOD1也由神经胶质细胞分泌到细胞外环境，其中，它可以引起运动神经元（Urushitani等人，Nature Neuroscience9（2006）108-118）的选择性死亡。一旦第一症状发生，这就为突变SOD1毒性的所观察到的非细胞自主特性以及疾病的迅速进展提供了一种可能的解释。
[0049] 术语“SOD1”可互换使用以特指天然单体或SOD1的二聚体形式。术语“SOD1”通常也用于鉴定SOD1的其它构象异构体，例如，SOD1的低聚物或聚集体。术语“SOD1”总体上也用于指SOD1的所有类型和形式。
[0050] 人类SOD1的蛋白质序列是：
[0051] MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGNVTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ（SEQ ID NO:1）.
[0052] 154个氨基酸的SOD1氨基酸序列可以从文献和相关数据库中获得；参见，例如，Sherman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.80(1983),5465-9；Kajihara et al.，J.Biochem.104(1988)，851-4；GenBank swissprot：locus SODC_HUMAN，accession number P00441。根据SEQ ID NO:1，“野生型”或重组人类SOD1氨基酸序列由上述序列表示。
[0053] 在此公开的人类抗-SOD1抗体将SOD1及其表位，特异性地结合到SOD1的各种构象及其表位上。例如，此处公开的是特异性地结合到SOD1、全长SOD1以及病理上错误折叠/聚集的SOD1上的抗体。正如本文所用，“特异性结合”、“选择性结合”或“优先结合”SOD1的抗体是指不结合其它无关蛋白质的抗体。在一个实例中，此处公开的SOD1抗体可以结合SOD1或其表位，并且显示了在其它蛋白质背景浓度超过两倍的的情况下也不与其它蛋白发生结合。“特异性结合”或“选择性结合”SOD1构象异构体的抗体是指与SOD1所有构象都不结合的抗体，即不结合至少一种其它的SOD1构象异构体。例如，在此公开的抗体在体外和ALS组织中优先结合到SOD1的聚集形式上。由于本发明的人类抗-SOD1抗体已经从一群表现出SOD1-特异性免疫反应的健康的受试者中分离，本发明的SOD1抗体也可称为“人类自动-抗体”以强调这些抗体可以确实是由受试者表达的并且没有从中分离，例如表达噬菌体文库的人免疫球蛋白，它迄今为止代表了一种试图提供人样抗体的通用方法。
[0054] 应当注意，术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个该实体；例如“一种抗体”应理解为是代表一种或多种抗体。因此，这些术语“一个”（或“一种”）、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换使用。
[0055] 本文所用的术语“多肽”指的是包括单个的“多肽”也包括多个的“多肽”，并且该术语是指通过酰胺键（也称为肽键）以线性方式连接的单体（氨基酸）所组成的分子。术语“多肽”是指两个或多个氨基酸任何链或多个链，而不是指产物的特定长度。因此、二肽、三肽、寡肽、“肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”，或用来指两个或多个氨基酸的一个链或很多链的任何其他术语，都包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以用来代替，或者与这些术语中任一项可互换。
[0056] 术语“多肽”还指多肽的后表达修饰产物，包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化和通过已知的保护/阻断基团进行衍生化、溶蛋白性裂解、或通过非天然存在的氨基酸进行的修饰。多肽可从天然生物来源衍生，或通过重组技术产生，但不一定是从指定的核酸序列中翻译而来。它可以用任何方式产生包含通过化学合成。
[0057] 本发明的多肽的大小约为3个或更多个、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25或更多个，50个或更多、75或更多，100个或更多、200或以上、500或更多，1000个或更多、或2,000或更多个氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，虽然并不必然具有这种结构。具有限定的三维结构的多肽称为折叠（结构），不具有限定的三维结构而是采取大量不同构象的多肽称为未折叠（结构）。此处所使用的术语糖蛋白该是指与至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白质，该碳水化合物部分通过氨基酸残基的含氧或含氮侧链附着到蛋白质上，例如，丝氨酸残基或天冬酰胺残基。
[0058] （通过）“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在它的天然环境中的多肽。不需要特殊的纯化水平。例如，分离的多肽能够脱离其天然或自然环境。为本发明目的，重组产生的多肽和在宿主细胞中表达的蛋白质可视为是分离的，正如已经通过任何适合的技术分离出的、分馏或部分或基本上纯化的天然的或重组的多肽。
[0059] 作为本发明的多肽同样包括在内的是上述多肽及其任意组合的片段、衍生物、类似物或变体。当涉及到本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括任何多肽，所述的任何多肽保持相应天然结合分子、抗体或多肽的至少一些抗原-结合特性。除了其他地方讨论的特异性抗体片段以外,本发明的多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，同样包括由于氨基酸取代、缺失、或插入而具有变化的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在或非天然存在。非天然发生的变体可以利用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可包括保守性或非保守性氨基酸的取代、缺失或添加。SOD1特异性结合分子的衍生物，例如，本发明的抗体和抗体多肽是已经改变的多肽以显示在天然多肽上没有找到的附加特征。实例包括融合蛋白。变体多肽在此也可称其为“多肽类似物”。此处所用的结合分子的或者它的片段的、抗体的或抗体多肽的“衍生物”是指其一个或多个残基通过功能性侧基反应而化学衍化的多肽。作为“衍生物”同样包括在内的是这些肽，它们含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸以及鸟氨酸可取代赖氨酸。
[0060] 术语“多核苷酸”试图包含单个核酸以及多个核酸，还指分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA（mRNA）或质粒DNA（pDNA）。多核苷酸可以包含传统的磷酸二酯键或非-传统的键（例如，酰胺键，例如见于肽核酸（PNA））。术语“核酸”是指任何一种或多种核酸区段，例如存在于多核苷酸中的DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指从其天然环境中转移出来的核酸分子、DNA或RNA。例如，为了本发明的目的，编码含在载体内抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它例子包括异源宿主细胞包含的重组多核苷酸或溶液中的（部分或基本上）纯化的多核苷酸。分离的RNA分子包括在体内或体外本发明的多核苷酸的RNA转录本。根据本发明的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或者可以包括调节成分，例如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
[0061] 本文所用的“编码区”是核酸的一部分，其由翻译成氨基酸的密码子组成。虽然“终止密码子”（TAG、TGA、or TAA）不翻译成氨基酸，但它可以视为是编码区的一部分，但任何侧翼的序列，例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等等，都不是编码区的一部分。本发明的两个或更多的编码区可以存在于单个多核苷酸构建体中，例如，在一个载体上，或者在独立的多核苷酸构建体上，例如，在独立的（不同的）载体上。此外，任何载体可以含有单个的编码区，或者可以包括两个或更多的编码区，例如，单一载体可以单独地编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可编码异源编码区，这种异源编码区与编码结合分子、抗体、或其片段、变体或衍生物的核酸是融合的或是非融合的。异源编码区包括但不限于特定元素或基序，如分泌信号肽或异源功能域。
[0062] 在某些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在是DNA的情况下，多核苷酸包含编码多肽的核酸，通常可以包括启动子和/或其它转录或翻译控制元件，这些元件可操作地与一个或更多的编码区连接。可操作的连接是指，当基因产物的编码区，例如多肽，与一个或多个调节序列以使得基因产物的表达受到调节序列的影响或控制的方式连接。如果启动子功能的诱导导致编码所需基因产物的mRNA进行转录，并且如果两个DNA片段之间的自然链接不会干扰表达调节序列指导该基因产物进行表达的能力或干扰DNA模板进行转录的能力，两个DNA片段（如多肽编码区和与其相关的启动子）是“可操作地连接的”，或者是“可操作性地链接的”。因此，如果启动子能够实现核酸的转录，启动子区域就会与编码多肽的核酸进行可操作的连接。该启动子可以是指导DNA仅在预定细胞中进行实际转录的细胞-特异性启动子。除了启动子之外，其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号，也都能可操作地连接多核苷酸以引导细胞-特异性转录。这里公开了合适的启动子和其它转录控制区域。
[0063] 多种转录控制区域是本领域技术人员已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区域，例如，但不限于，来自巨细胞病毒的启动子和增强子片段（立即早期启动子、结合内含子-A）、猿猴病毒40（早期启动子）和反转录病毒（如劳氏肉瘤病毒）。其它转录控制区域包括衍生自脊椎动物基因的那些区域，如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白、以及能够在真核细胞中控制基因表达的其它序列。其他合适的转录控制区域包括组织-特异性启动子和增强子以及淋巴因子-诱导型启动子（例如，由干扰素或白介素诱导的启动子）。
[0064] 类似地，多种翻译控制元件是本领域技术人员已知的。这些包括，但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及衍生自小核糖核酸病毒的元件（特别地是内部核糖体进入位点，或者IRES，也称为CITE序列）。
[0065] 在其它实施例中，本发明的多核苷酸是RNA,例如以信使RNA（mRNA）的形式。
[0066] 本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌肽或信号肽的其它编码区连接，其指导分泌多肽，该多肽是由本发明的多核苷酸编码的。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦成长中的蛋白质链通过粗面内质网的输出开始时，该序列从成熟蛋白质中切除。本领域的普通技术人员了解到，脊椎动物细胞所分泌的多肽通常具有融合到多肽N端上的信号肽，其从完整的或“全长的”多肽上切割下来以产生多肽分泌的或“成熟的”形式。在某些实施例中，可以使用天然信号肽，例如，免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或某种序列的功能性衍生物，这种序列保留了指导可操作地连接于其上的多肽进行分泌的能力。可选地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型-前导序列可以用人组织纤溶酶原激活物（TPA）或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列取代。
[0067] 除非另外说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文中可交换使用。
[0068] 本发明上下文中所用的“结合分子”主要涉及到抗体及其片段，但也可以指结合到SOD1上的其它非-抗体结合分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合物（MHC）分子、伴侣蛋白，例如热激蛋白（HSPs），以及包括细胞-细胞粘附分子，例如钙粘蛋白的成员、整合素、C型凝集素和免疫球蛋白（Ig）超家族。因此，仅为了清楚起见，在不限制本发明的范围的情况下，以下大多数实施例对抗体和抗体样分子进行讨论，它们代表优选的结合分子用于治疗和诊断试剂的开发。
[0069] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换地使用。抗体或免疫球蛋白是SOD1-结合分子，其至少包含重链的可变区，并且通常至少包含重链和轻链的可变区。对脊椎动物系统基本免疫球蛋白结构的理解相对清楚，参见，例如，Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.1988）。
[0070] 如下面将进行更详细的描述，术语“免疫球蛋白”包括在生物化学上可以区分的各种广泛种类的多肽。本领域的技术人员将知道，重链分为γ、μ、α、δ或ε，（γ、μ、α、δ、ε），并且它们之间带有一些亚类（例如，γ1-γ4）。该链的性质是，将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA IgG、或IgE。免疫球蛋白亚类（同种型）例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已很好表征，并已知其赋予功能特化。这些类别和同种型中每一种的经修饰形式对于本领域技术人员而言，依据本发明公开内容是容易辨别的，并相应地属于本发明范围内。所有的免疫球蛋白类别明显处于本发明的范围内，以下讨论将通常针对免疫球蛋白分子的IgG类别。关于IgG，标准免疫球蛋白分子包含分子量约为23,000道尔顿的两个相同的轻链多肽以及分子量为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。这四条链通常通过二硫键以“Y”结构连接，其中，在“Y”口处开始轻链将重链括在内，并持续通过可变区。
[0071] 轻链分为kappa或lambda（κ，λ）。每个重链类别可与κ或λ轻链相结合。当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生成免疫球蛋白时，轻链和重链彼此共价键合，而两条重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键彼此键合。重链氨基酸序列从位于Y形叉端的N端一直到每条链底部的C端。
[0072] 轻链和重链被分成结构区和功能同源区。术语“恒定”和“可变”是功能性用语。在这方面应当理解，轻链（VL）和重链（VH）部分的可变结构域决定抗原的识别和特异性。相反，轻链（CL）和重链（CH1、CH2或CH3）的恒定区赋予重要生物特性，如分泌、经胎盘流动性、Fc受体结合、补体结合等。根据约定，恒定区结构域的编号随着它们远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N-终端部分是可变区，而在C-终端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别构成重链和轻链的羧基-末端。
[0073] 如上所述，可变区使得抗体选择性识别并特异性结合抗原上的表位。即抗体的VL结构域与VH结构域，或者是互补决定区的子集（CRDs）相结合以形成确定三维抗原-结合位点的可变区。这种四聚体抗体结构形成了存在于Y每条臂末端的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由每条VH和VL链上的3个互补决定区（CDRs）来确定。含有足够的结构以特异性结合到SOD1的任何抗体或免疫球蛋白片段，在此可互换地表示为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
[0074] ，在天然存在的抗体中，抗体包括6个高变区，有时称为“互补决定区”或称为存在于每个抗原-结合结构域的“CDRs”，这六个高变区是抗体在水相环境中形成三维构型时特定定位形成抗原结合结构域的短的、不相连的氨基酸序列。“CDRs”侧接四个相对保守的“构架”区域或者侧接显示很低的分子间变异性的“FRs”。构架区大部分采取β折叠构象，而CDRs形成连接β折叠结构的袢，在某些情况下形成β折叠结构的组成部分。因此构架区在形成支架时发生作用，其使CDR通过链间非共价相互作用以正确方向放置。由放置的CDRs形成的抗原-结合结构域定义与免疫反应性抗原上的表位的表面互补性。该互补表面促进了抗体和关联表位的非共价结合。既然它们已经被精确地定义；对于任何给定的重链或轻链可变区，本领域的技术人员容易鉴别出分别含有CDRs和构架区的氨基酸；参见,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,"Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,（1983）;and Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196（1987）,901-917,它们以引用的方式全文并入这里。
[0075] 如果存在两个或更多的本领域内使用或接受的术语的定义，本文所用的术语的定义旨在包括所有这样的含义，除非明确地进行相反的陈述。具体的例子是术语“互补决定区”（“CDR”）的使用,用来描述在重链和轻链多肽可变区内部所发现的非相邻抗原结合部位。这一特定区域已由美国健康和人类服务部的Kabat等人描述，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”（1983）and by Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.,196（1987）,901-917,其在此引用作为参考，其中当互相对比时，这些定义包括氨基酸残基的重叠或子区。然而，对用来指抗体或其变体的CDR的两个定义中的任何一个的应用，旨在处于文中所定义及所用术语的范围之内。容纳了上面所引用的每一篇参考文献所定义的CDR的合适的氨基酸残基，陈述于下表1中作为对照。包含特定CDR的确切残基数目将根据CDR的序列和尺寸改变。考虑到抗体的氨基酸可变区，本领域技术人员能够常规地确定哪个残基包括特定的高变区，或者是确定抗体的人类IgG亚型CDR。
[0076] 表I:CDR定义1
[0077]Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96
[0078] 1表一中所有CDR定义的编号根据Kabat等人所提出的编号约定（见下文）。
[0079] Kabat等人还定义编号体系，该编号体系用于可应用于任何抗体的可变区序列。本领域人员不依赖于超越序列本身的其它任何的试验数据，就可以明确地指定任何可变结构域序列的“Kabat编号”系统。本文所用的“Kabat编号”是指由美国健康和人类服务部的Kabat等人提出的编号系统，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”（1983）。除非另外说明，在本发明的抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物中，涉及的特定的氨基酸残基位置的编号根据的是Kabat编号系统，然而，它只是理论上的，并非可以同样地适用于本发明的每一个抗体。例如，根据第一CDR的位置,下列CDRs可以沿任一方向移动。
[0080] 本发明的抗体或抗原-结合片段，免疫特异性片段、变体、或其衍生物包括，但不限于，多克隆抗体、单克隆抗体、多特异性的、人类、人源化、灵长类、鼠源化或嵌合抗体、单链抗体、表位-结合片段，例如，Fab、Fab'和F（ab'）2、Fd、Fvs、单-链Fvs（scFv）、单-链抗体、二硫化物连接的Fvs（sdFv）、包括VL或VH结构域的片段，由Fab表达文库产生的片段，和抗-独特型（抗-Id）抗体（包括，例如，抗-Id抗体到这里所公开的抗体）。ScFv分子是本领域已知的并且描述于例如美国专利5,892,019中。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型（例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY），类别（例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2）或免疫球蛋白分子的亚类。.
[0081] 在一个实施例中，本发明的抗体不是IgM或具有五价结构的它的衍生物。具体地，在本发明的具体应用，尤其是在治疗使用中，IgMs比起IgG和其它的二价抗体或相应的结合分子效果更差，这是因为由于IgMs的五价结构和缺少亲和力成熟化，使得IgMs经常显示非特异性交叉反应性和非常低的亲和力。
[0082] 在一个特别优选的实施例中，本发明的抗体不是多克隆的抗体，即它实质上包括一个特定抗体种类，而不是从血浆免疫球蛋白样品中获得的混合物。
[0083] 抗体片段，包括单链抗体，可以包含独立或与整体或下列部分组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括SOD1结合片段，它包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任意组合。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。优选的是，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼羊、马或鸡抗体。在另一个实施例中，可变区可以从一些来源（例如，从鲨鱼）中获取。
[0084] 在一个方面中，本发明的抗体是从人类中分离的人单克隆抗体。任选地，采用人类抗体的构架区,并且使其与数据库中人种系可变区序列比对；参见，例如，由蛋白质工程（英国剑桥）MRC中心主办的Vbase（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）。例如，被认为可能偏离真正的种系序列的氨基酸可能是由于在克隆过程中掺入的PCR引物序列。与人工生成的人样抗体，例如，来自噬菌体展现的抗体文库或异种小鼠中的单链抗体片段（scFvs）相比，本发明的人单克隆抗体的特征是（ⅰ）使用人免疫应答而不是动物替代品的免疫应答来获得，即抗体已经产生以响应于人体内的其相关构象中的自然的SOD1。（ii）个体已得到保护或者这对于SOD1的存在来说至少是值得注意的，以及（iii）由于该抗体是人起源的，对自身抗原的交叉-反应的风险被最小化。因此，根据本发明，术语“人单克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”，“人类抗体”和类似术语是用来表示人类来源的SOD1结合分子，即，其已经从人类细胞中分离，该人类细胞例如可以是B细胞或者它的杂交瘤,或者是从人类细胞的mRNA中直接克隆的B细胞的cDNA,例如人的记忆B细胞。人类抗体仍然是“人”，尽管在抗体中进行了氨基酸取代，例如为了提高结合特性。
[0085] 衍生自人类免疫球蛋白文库或分离自一种或多种人类免疫球蛋白转基因但不表达内源性免疫球蛋白的动物的抗体，具体地例如在Kucherlapati的美国专利No.5,939,598中所述，该抗体表示为人样抗体，为了将他们从本发明的真正地人类抗体中鉴别出来。
[0086] 例如，人样抗体的重链和轻链的配对，例如通常分离自噬菌体展示中的合成的和半-合成的抗体的配对，不一定会反映原始配对，因为它发生在最初的人的B细胞中。因此，从通常在现有技术中使用的重组表达文库中获得的Fab和scFv片段可以视为是人工的，并带有对免疫原性和稳定性的所有可能相关的影响。
[0087] 相反，本发明提供了从选择的人类受试者中分离的亲和力-成熟的抗体，其特征在于它们在人体中的治疗用途及其耐受性。
[0088] 本文所用的术语“鼠源化抗体”或“鼠源化免疫球蛋白”指的是一种抗体，该抗体包含一个或多个来自本发明的人抗体的CDRs；以及包含氨基酸替换和/或删除和/或插入的人构架区，所述的插入是基于小鼠抗体序列的。提供CDRs的人免疫球蛋白称为“母体”或“受体”，以及提供构架变更的小鼠抗体称为”供体”。恒定区不必存在，但如果它们存在，通常它们与小鼠抗体恒定区基本相同，即至少约85-90％，优选地约为95％或更多的相同性。因此，在某些实施例中，全长度鼠源化人重链或轻链免疫球蛋白包含小鼠恒定区、人类CDRs以及具有许多“鼠源化的”氨基酸取代的大致的人类构架。典型地，“鼠源化抗体”是一种包含鼠源化可变轻链和/或鼠源化可变重链的抗体。例如，鼠源化抗体不会涵盖典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的完整的可变区是非小鼠的。与亲本抗体相比，通过“鼠源化”的方法已经“鼠源化”的修饰抗体结合到相同的抗原上，作为提供CDRs和通常在小鼠中具有较小免疫原性的亲本抗体。
[0089] 如本文所用，术语“重链部分”包括衍生自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽至少包含以下中的一项：CH1结构域，铰链（例如，上部、中部和/或下部铰链区）结构域、CH2结构域、CH3结构域，或其变体或片段。例如，用于本发明的结合多肽可包含，含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、至少一部分铰链结构域以及CH2结构域的多肽链；含有CH1结构域以及CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、至少一部分铰链结构域以及CH3结构域的多肽链，或含有CH1结构域、至少一部分铰链结构域以及CH2结构域以及CH3结构域的多肽链。在另一个实施例中，本发明的多肽包含含有CH3结构域的多肽链。此外，在本发明中使用的结合多肽可以缺乏至少一部分的CH2结构域（例如，全部或部分的CH2结构域）。如上所述，本领域的普通技术人员可以理解，这些域（例如，重链部分）可以经修饰使得它们在天然存在的免疫球蛋白分子上氨基酸序列不同。
[0090] 在某些抗体，或其抗原-结合片段、变异体、或这里所公开的它的衍生物中，多聚体的一个多肽链的重链部分与多聚体的第二多肽链上的重链部分相同。可替换地，本发明的重链部分-包含的单体不相同。例如，每一单体可以包括形成例如双特异性抗体或双体的不同的靶结合位点。
[0091] 在另一个实施例中，抗体或其抗原-结合片段、变体、或此处公开的它的衍生物是由例如scFvs这种单一多肽链组成，并且是胞内（细胞内）表达，用于体内潜在的治疗性和诊断应用。
[0092] 用于在此公开的诊断和治疗方法中的结合多肽的重链部分可以衍生自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可以包含衍生自IgG1分子的CH1结构域以及衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个例子中，重链部分可包括部分衍生自IgG1分子以及部分衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个例子中，重链部分可包括部分衍生自IgG1分子以及部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
[0093] 如本文所用，术语“轻链部分”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选的是，轻链部分至少包含VL或CL结构域的其中之一。
[0094] 用于抗体的肽或多肽表位的最小尺寸被认为是大约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选包含至少7个，更优选至少是9个，最优选是至少在大约15至大约30个氨基酸之间。由于CDR在它的第三形式下可识别抗原性肽或多肽，包括表位的氨基酸不必是连续的，并且在某些情况下，甚至可以不在相同的肽链上。在本发明中，由本发明的抗体识别的肽或多肽表位包含SOD1的至少4个，至少5个，至少6个，至少7个，更优选的是至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、或在15个左右至30个左右连续或非连续氨基酸序列。
[0095] “特异结合”或“特异性识别”在此可互换地使用，但是通常指的是结合分子，例如，一种抗体通过其抗原-结合结构域结合到表位上，并且指的是该结合在抗原-结合结构域与表位之间需要一定的互补性。根据这个定义，当该抗体结合到一个表位上时，该抗体被称为”特异性地结合”到该表位上，经由其抗原-结合结构域比它结合到随机的、不相关的表位上更容易进行。此处使用术语“特异性的”是用来限定相对亲和力，通过这种相对亲和力某个抗体结合到某个表位上。
[0096] 例如，对于给定的表位，抗体“A”可以认为比抗体“B”具有较高的特异性，或抗体“A”可以认为是结合到具有较高的特异性表位“C”上而不是相关的表位“D”上。
[0097] 如果有的话，术语“免疫结合特性”或带有抗原的抗体的其他的结合特性，在它的所有的语法形式中，是指抗体的特异性、亲和力、交叉-反应性，以及抗体的其它的结合特性。
[0098] 所谓“优先结合”是指结合分子，例如，抗体特异性结合到表位上比其特异性结合到相关的、相似、同源或相似表位更容易。因而，“优先结合”到给定的表位的抗体更有可能结合到该表位而不是结合到相关表位上，即使这样的抗体可以与相关的表位进行交叉-反应。
[0099] 作为非限制性实例，例如抗体这样的结合分子，如果它与所述第一表位结合的解离常数（KD）小于第二表位的抗体的KD，可以视为优选地结合第一表位。在另一个非限制性实施例中，如果它以低于第二表位的抗体的KD至少一个数量级的亲和力来结合第一表位，抗体可以视为优选地结合第一种抗原。在另一个非限制性实施例中，如果它以低于第二表位的抗体的KD至少两个数量级的亲和力来结合第一表位，抗体可以视为优选地结合第一表位。.
[0100] 在另一个非限制性实施例中，例如抗体这样的结合分子，如果它以低于第二个表位的抗体的k（off）的解离速率（k（off））结合第一表位，可以视为其优先地结合第一表位。在另一个非限制性实施例中，如果抗体以低于第二表位抗体的k（off）至少一个数量级的亲和力结合第一表位，该抗体可以视为优先地结合第一表位。在另一个非限制性实施例中，如果抗体以低于第二表位抗体的k（off）至少两个数量级的亲和力结合第一表位，该抗体可以视为优先地结合第一表位。.
[0101] 一种结合分子，例如，抗体或其抗原-结合片段、变体、或此处公开的衍生物可以-2 -1 -2 -1 -3 -1 -3 -1被认为能够以小于或等于5×10 秒 、10 秒 、5×10 秒 或10 秒 的解离速率（k
（off））来结合SOD1或其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可以被认为能够以小于或等-4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 -7 -1
于5×10 秒 、10 秒 、5×10 秒 、或10 秒 、5×10 秒 、10 秒 、5×10 秒 或
-7 -1
10 秒 的解离速率（k（off））结合SOD1或其片段或变体。
（off））来结合SOD1或其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可以被认为能够以小于或等-4 -1 -4 -1 -5 -1 -5 -1 -6 -1 -6 -1 -7 -1
于5×10 秒 、10 秒 、5×10 秒 、或10 秒 、5×10 秒 、10 秒 、5×10 秒 或
-7 -1
10 秒 的解离速率（k（off））结合SOD1或其片段或变体。
[0102] 一种结合分子，例如，抗体或其抗原-结合片段、变体、或此处可公开的衍生物可3 -1 -1 3 -1 -1 4 -1 -1 4 -1 -1
以被认为能够以大于或等于10 米 秒 、5×10 米 秒 、10 米 秒 或5×10 米 秒
结合速率（k（on））来结合SOD1或其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可以被认为能
5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1
够以大于或等于10 米 秒 、5×10 米 秒 、10 米 秒 、5×10 米 秒 或10 米
-1
秒 的结合速率（k（on））结合SOD1或其片段或变体。
以被认为能够以大于或等于10 米 秒 、5×10 米 秒 、10 米 秒 或5×10 米 秒
结合速率（k（on））来结合SOD1或其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可以被认为能
5 -1 -1 5 -1 -1 6 -1 -1 6 -1 -1 7 -1
够以大于或等于10 米 秒 、5×10 米 秒 、10 米 秒 、5×10 米 秒 或10 米
-1
秒 的结合速率（k（on））结合SOD1或其片段或变体。
[0103] 例如抗体这种结合分子，如果该结合分子优选地结合到表位上到如下程度，即它可以在某种程度上，阻挡参考抗体与表位的结合，它就可以被认为能够竞争性地抑制参考抗体与给定表位的结合。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法确定，例如，竞争ELISA试验。抗体可以被认为可以竞争性地抑制参考抗体与给定的表位的结合的至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％。
[0104] 本文所用的术语“亲和性”是指个体表位与结合分子的CDR的结合的强度的测量，例如，免疫球蛋白分子；参见，例如，Harlow等，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988)at pages27-28。如本文所用，术语“抗体亲抗原性”是指免疫球蛋白群与抗原之间所形成的复合物的整体稳定性，即，免疫球蛋白混合物与抗原之间的功能结合强度，例如参见29-34页中的Harlow。抗体亲抗原性涉及到种群中的单独的免疫球蛋白分子与特定表位之间的亲和力，还涉及到免疫球蛋白与抗原的化合价。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构的例如聚合物的抗原之间的相互作用，这种相互作用具有高抗体亲抗原性。抗体对抗原的亲和力或抗体亲抗原性可以使用任何合适的方法通过试验确定，例如，参见Berzofsky et al.,"Antibody-Antigen Interactions"In Fundamental Immunology,Paul,W.E.,Ed.,Raven Press New York,N Y(1984),Kuby,Janis Immunology,W.H.Freeman and Company New York,N Y(1992),和此处所描述的方法。用于测量抗体对抗原的亲和力一般技术包括ELISA、RIA，还有表面等离子体共振。如果在不同条件下，例如，在盐浓度、pH条件下进行测量，所测量的特定抗体-抗原的相互作用的亲和力可以改变。因此，亲和力和其它抗原-结合参数，例如，KD，IC50，优选地使用抗体和抗原的标准溶液，以及一个标准化的缓冲液来进行测量。
[0105] 结合分子，例如，本发明的抗体或其抗原-结合片段、变体或其衍生物也可以根据其交叉活性来进行描述或说明。本文所用的术语“交叉-反应性”是指特异于一个抗原的抗体可以与第二抗原反应的能力；两种不同的抗原性物质之间的相关性的测量。因此，如果抗体结合到不是诱导它形成的表位上，该抗体就是交叉反应性的。交叉反应表位作为诱导表位通常含有许多相同的互补的结构特征，并且在一些情况下，交叉反应表位实际上可以比原始的那些更适合。
[0106] 例如，某些抗体具有一定程度的交叉-反应性，因为它们结合相关的但非-相同的表位，例如表位与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％和至少50％同一性（如使用本领域已知的和这里所描述的方法来进行计算）。如果抗体没有结合到与参考表位具有小于95％、小于90％、小于85％、小于80％、小于75％、小于70％、小于65％、小于60％、小于55％和小于50％同一性的表位上（如使用本领域已知的和这里所描述的方法来进行计算），该抗体可以被认为具有很少或没有交叉反应性。如果它没有结合到该表位的任何其它类似物、直向同源物，或同源物上，可以认为抗体对某些表位具有“高度特异性”。
[0107] 结合分子，例如，本发明的抗体或其抗原-结合片段、变体或其衍生物也可以用它们与SOD1的结合亲和力来描述或说明。优选的结合亲和力包括的那些的解离常数或KD少-2 -2 -3 -3 -4 -4 -5 -5 -6 -6 -7 -7于 5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、-8 -8 -9 -9 -10 -10 -11 -11 -12 -12 -13
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M.如前所述，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚单位结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端的可变区，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一（氨基最末端）恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、10 M、5x10 M、-13 -14 -14 -15 -15
10 M、5x10 M、10 M、5x10 M或10 M.如前所述，各种免疫球蛋白类的恒定区的亚单位结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端的可变区，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一（氨基最末端）恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，并且是免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
[0108] 本文所用的术语“CH2结构域”包括重链分子的部分，例如，该重链分子使用常规的编号方案，大约从抗体的残基244延伸到残基360（残基244至360，Kabat编号系统；以及残基231到340，EU编号系统；见Kabat EA et al.op.cit）。CH2结构域是唯一的，因为它没有与另一结构域进行紧密配对。相反，两条N-连接的分支糖链可以插入到完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。也证明，CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C-末端，并且含有大约108个残基。
[0109] 如这里所使用的，术语“铰链区”包括在重链分子的一部分，该重链分子将CH1结构域结合到CH2结构域上。该铰链区域包含大约25个残基并且其是柔性的，从而允许两个N-终端抗原-结合区独立地移动。铰链区可以细分成三个不同的结构域：上部、中部和下部铰链结构域，参见Roux et al.,J.Immunol.161(1998)，4083-4090。
[0110] 本文所用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含能够形成二硫键或形成与第二硫醇基的桥接的硫醇基团。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区域是通过二硫键连接的，并且在对应使用Kabat的编号系统（位置226或229，EU编号系统）的239和242的位置上，两条重链通过两个二硫键连接。
[0111] 本文所用的术语“连接”和“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语是指通过包括化学偶联或重组方法的任何方法，两个以上的部分或元素的相互结合。“在框架内融合”指两个或多个多核苷酸开放阅读框（ORFs）的结合以形成连续的较长的ORF，这样就保持原始ORFs的正确的翻译读框。因此，重组融合蛋白是含有两个或多个片段的单个蛋白，该片段对应于原始ORFs编码的多肽（其中片段通常实质上不是这样连接的）。虽然可读框通过融合片段连续进行，但是这些片段可以在物理上或者在空间上隔开，例如被框内接头序列隔开。例如，只要“融合的”CDRs共-翻译为连续多肽的一部分，编码免疫球蛋白可变区的CDRs的多核苷酸可以在框内是融合的，但是由编码至少一个免疫球蛋白构架区或附加的CDR区的多核苷酸来进行分离。
[0112] 此处所用的术语“表达”是指一种方法，通过该方法基因产生一种生化，例如，RNA或多肽。该方法包括细胞内基因的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因击倒以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于基因转录成RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）、小发夹RNA（shRNA）、小干扰性RNA（siRNA）或任何其它的RNA产品，以及将这种mRNA到多肽的翻译。如果最终的所需产物是一种生化物质，表达步骤包括该生化物质以及任何前体的创建。基因的表达产生“基因产物”。本文所用的基因产物可以是核酸，例如，基因转录产生的信使RNA，或翻译自转录物的多肽。在此描述的基因产物还包括转录后修饰的核酸，例如，多腺苷酸化，或翻译后修饰的多肽，例如，甲基化，糖基化，脂质的加入、与其它蛋白亚单位的结合，蛋白水解等。
[0113] 如本文所用，术语“样品”是指从受试者或患者中获得的任何生物材料。一方面，样品可包括血液、脑脊髓液（“CSF”），或尿液。在其它方面中，样品可包含全血、血浆、从血液样本中富集的B细胞，以及培养的细胞（例如来自受试者的B细胞）。样品也可包括活体组织或包含神经组织的组织样品。在又一些其它方面，样品可包含全细胞和/或细胞的溶解产物。血液样本可以通过本领域已知的方法进行收集。在一个方面，在4°C下，在200μl（20mMTris,pH.7.5,0.5%诺乃清洁剂,1mM乙二胺四乙酸,1mM苯甲基硫酰氟,0.1M NaCl,IX Sigma蛋白酶抑制剂,and IX Sigma Phosphatase Inhibitors1and2）缓冲液中，颗粒通过漩涡振荡重新悬浮沉淀。伴随间歇涡旋，该悬浮液可以在冰上保持20分钟。在4°C下在15,000x g旋转5分钟后，等份上清液可以是在约-70°C下存储。
[0114] 本文所用的术语“治疗”或“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其特征在于，目的是防止或减缓（减轻）非所需的生理改变或疾病，如肌萎缩性侧索硬化的发展（ALS）。无论是可检测的或不可检测的，有益的或期望的临床结果包括，但不限于，症状的减轻、疾病程度的减轻、稳定（即，不恶化）疾病、延迟或减缓疾病的进展、疾病状态的改善或减轻以及缓解（部分或全部）。，与未接受治疗所预期的存活相比，“治疗”也可以指延长存活。那些需要治疗的包括已经在该状况或病症下的那些，以及易于有该状况或该病症的那些，或要防止该状况或病症显示的那些。
[0115] “受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何的受试者，特别是哺乳动物受试者，例如需要诊断、预后、预防或治疗的人类患者。
[0116] II.抗体
[0117] 正如对实施例中所述抗体的概述，本发明一般涉及人类抗-SOD1抗体及其抗原-结合片段，其优选地显示的免疫学结合特性和/或生物学特性。根据本发明，特别对于SOD1的人单克隆抗体克隆自一群健康人类受试者。
[0118] 根据本发明，在实验的进行过程中，在人类记忆B细胞培养物的条件培养基中的抗体经平行筛选用于结合到重组或错误折叠/聚集的SOD1蛋白质-和牛血清白蛋白（BSA）上。仅对重组的或错折叠/聚集SOD1呈阳性，但是对BSA无反应的B细胞培养物进行了抗体克隆。在第二轮筛选中，对聚合的SOD1呈阳性的B-细胞培养物进行了抗体克隆。
[0119] 对特异性抗体的分离的最初尝试主要集中于健康的人类受试者，该受试者带有与SOD1的高结合活性血浆，并且该尝试提示有血浆中循环SOD1抗体的水平的提高。出乎意料的是，这些尝试不能产生SOD1特异性人类记忆B细胞，并且在本发明中描述的抗体分离自一群健康的人类受试者，该受试者没有经预选定以用于高SOD1血浆反应性，或者是对SOD1具有低血浆反应性。
[0120] 由于该措施，几种抗体可以进行分离。选择的抗体经进一步分析用于类别和轻链子类的测定。源自记忆B细胞培养物的选择的相关抗体消息，随后通过RT-PCR转录、克隆并组合到表达载体中以用于重组生产；参见所附的实施例。在HEK293或CHO细胞中，人类抗体的重组表达，和其对人类重组SOD1（图2和图3）的结合特异性的随后表征，以及他们显著地结合到其病理学上错误折叠/聚集的形式（图4到图6）上，证实首次人类抗体已经克隆成高度特异于SOD1，并且可以显著识别病理学上的SOD1蛋白的错误折叠/聚集形式。如图9所示，第二轮实验证实了上述发现。以及参见表III，其概括了有关本发明的抗体结合亲和力的信息。
[0121] 因此，一般来说，本发明涉及一种分离的天然存在的人单克隆抗-SOD1抗体及其结合片段、衍生物和变体。在本发明的一个实施例中，该抗体能够特异性地结合全长重组SOD1，和/或重组SOD1（见图4和实施例2）的病理学上错误折叠/聚集的形式，生理SOD1-二聚物（参见实施例3和图5）的聚集物，以及体内SOD1聚集物（参见图6和实施例4）。在一个实施例中，本发明的抗体特异性地结合SOD1的C-末端。在另一个实施例中，本发明的抗体特异性地结合SOD1的N-末端。在另一实施例中，本发明的抗体特异性地结合SOD1的中央结构域（汇总见实施例5和表IV）。
[0122] 在一个实施例中，本发明涉及一种抗SOD1抗体或其抗原-结合片段、变体或衍生物，其中作为参考抗体，特异性地结合到SOD1的相同的表位上，该参考抗体选自NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.9F6、NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3和NI-204.25H3组成的组。表位作图在人类SOD1的微管结合结构域中识别序列，包括作为唯一的线性表位的aa93-99DGVADVS（SEQ ID NO:2），这种唯一的线性表位由本发明的抗体NI-204.10D12识别。表位作图在包括aa10-60的SOD1N-末端结构域内识别了一个序列，其中，通过本发明的抗体NI-204.10A8识别的表位是小范围的。另一个作图限制了由本发明的抗体NI-204.10A8识别的一个序列上的表位，该序列包括aa9-55LKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLHGFHVHEFGDNT
[0123] （SEQ ID NO:52）。如 实 施 例5和 其 中 的 表IV所 详 细描 述 的，本 发明的下列抗体的表位也已经绘制出，并且定位在SOD-1序列内，包括：抗体NI-204.12G7aa73-83GGPKDEERHVG（SEQ ID NO:51）；抗体NI-204.11F11aa113-119IIGRTLV（SEQ ID NO:53）；抗体NI-204.6H1aa85-95LGNVTADKDGV（SEQ ID NO:54）；抗体NI-204.
12G3aa121-135HEKADDLGKGGNEES（SEQ ID NO:55）；抗 体 NI-204.7G5aa101-107EDSVISL（SEQ ID NO:56）； 抗 体 NI-204.7B3aa137-143KTGNAGS（SEQID NO:57）；抗 体NI-204.34A3aa85-95LGNVTADKDGV（SEQ ID NO:58）；以及抗体NI-204.25H3aa73-79GGPKDEE（SEQ ID NO:59）。
12G3aa121-135HEKADDLGKGGNEES（SEQ ID NO:55）；抗 体 NI-204.7G5aa101-107EDSVISL（SEQ ID NO:56）； 抗 体 NI-204.7B3aa137-143KTGNAGS（SEQID NO:57）；抗 体NI-204.34A3aa85-95LGNVTADKDGV（SEQ ID NO:58）；以及抗体NI-204.25H3aa73-79GGPKDEE（SEQ ID NO:59）。
[0124] 最有利的是，由本发明的抗体NI-204.10D12识别的表位在其它物种中是高度保守的，例如小鼠和大鼠，对于带有本发明的抗体的各自动物模型提供附加的研究工具。此外，如在实施例4中所证明的和图6中所示，在不想受初始的实验观察结果约束的情况下，本发明的人单克隆NI-204.10D12和NI-204.12G7抗-SOD1抗体，优选的特征在于特异性地结合病理学上错误折叠/聚集的SOD1，而且基本上不识别脊髓组织中生理形式下的SOD1。因此，本发明提供了一组具有结合特异性的人类SOD1抗体，因此其可特别地用于诊断和治疗目的。在本发明的结合特异性方面的进一步的细节和概要综述也参见图9和表III。
[0125] 在一个实施例中，如实施例中所述，本发明的抗体表现出代表性的NI-204.10D12抗体的结合特性。此外，或作为选择地，本发明的SOD1抗体优先地识别病理学上错误折叠/聚集的SOD1，而不是识别生理的SOD1二聚物，特别是当根据实例3和4进行分析的时候。此外或可选地，本发明的抗-SOD1抗体结合到引起人类SOD1的突变体的疾病上，特别是实施例4中所述的那些。在本文中，结合特异性是在图3和图4中如示例性NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7和NI-204.9F6抗体所示的范围中，即具有约为10pM到100nM的半数的最大有效浓度（EC50），如NI-204.10D12和NI-204.10A8所示，最优选的用于野生型-SOD1的EC50约为100pM到10nM，或如NI-204.12G7所示，用于野生型-SOD1的EC50约为10pM到1nM。另外或可替换地，结合特异性可以是在，如实施例8和其中的表III中本发明的示例性抗体所示的范围中，即具有用于野生型（重组）SOD1的约为10pM到100nM的半数最大有效浓度（EC50），如NI-204.7G5和NI-204.7B3所示的最优选的EC50约为100pM到75nM；在10pM到100nM之间，如NI-204.6H1和NI-204.34A3所示的最优选的EC50约为
100pM到10nM；在100pM到10nM之间，如NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.12G3和NI-204.25H3所示的最优选的EC50约为10pM到1nM。
100pM到10nM；在100pM到10nM之间，如NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.12G3和NI-204.25H3所示的最优选的EC50约为10pM到1nM。
[0126] 一些纯化的抗体结合到大批的生物分子上，例如，蛋白质。正如技术人员将领会到是，术语“特异性”在此处用于显示，即除SOD1蛋白或其片段之外的其它生物分子不会显著地结合到抗原-结合分子上，例如，一个本发明的抗体。优选地，结合到除了SOD-1之外的生物分子上的水平导致结合亲和力是到SOD-1的亲和力的至多仅20％或更少，10％或更少，仅5％或更少，仅2％或更少或仅1％或更少（即至少低5、10、20、50或100倍）。
[0127] 因此，优选地，本发明的抗-SOD1抗体优先地结合到病理学形式的SOD1上，例如，如实施例3中通过直接的ELISA所示的以及实施例4中所描述的免疫组化染色脊髓中的病理性错误折叠/聚集的SOD1。在另一个实施例中，如实施例3和实施例2通过直接的ELISA所示，本发明的抗-SOD1抗体优先结合到重组SOD1和病理学上错误折叠/聚集形式的SOD1上。
[0128] 如上所述，也能够发现SOD1聚集体与AD患者的淀粉样老年斑和神经原纤维缠结相关。因此，在一个实施例中，本发明的抗体可以用于治疗阿尔茨海默病。
[0129] 本发明还涉及到抗体或其抗原-结合片段、变体或衍生物，其中该抗体包含抗体抗原-结合结构域，该抗原结合结构域与选自一种组的抗体的抗原结合结构域相同，该组是 由NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.9F6、NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3 和NI-204.25H3组成的组。
[0130] 本发明进一步例示了几个这样的结合分子，例如抗体及其结合片段，其特征在于包括它们的可变区，例如，包含示于图1中的任意一种氨基酸序列的VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区（CDR）上的结合结构域。编码上述可变区的相应的核苷酸序列都列于如下的表II中。一组示例性的VH和/或VL区域的上述氨基酸序列的CDR在图1中示出。然而，正如下面所讨论的，本领域熟练技术人员可完全意识到这样的事实：此外或者可以使用CDR，其在氨基酸序列上不同于图1中所列的那些，如果是CDR2和CDR3的情况下会有一个、两个、甚至更多的氨基酸不同。
[0131] 在一个实施例中，本发明的抗体可以是包含示于图1中的VH和/或VL区域的氨基酸序列的任一种抗体。优选地是，本发明的抗体的特征在于，存在于人类B-细胞中的重链和轻链的同源配对的保存。可以选择的是，本发明的抗体是抗体或其抗原-结合片段、衍生物或变体，它们竞争结合到SOD1上，带有至少一个抗体，所述抗体具有图1中所示的VH和/或VL区域。这些抗体也可以是人，特别是可以用于治疗性应用。可选择地，该抗体是鼠、鼠源化和嵌合的鼠-人抗体，该抗体尤其是用于动物方面的诊断方法和研究。
[0132] 在一个实施例中，本发明的抗体是由单个或寡克隆B-细胞的培养物提供的，所述单个或寡克隆B-细胞是培养的，而且是培养物的上清液，含有所述B-细胞产生的抗体，筛选出其中的抗-SOD1抗体的存在及其亲和力。筛选方法包括以下步骤：敏感组织淀粉样斑块免疫反应性（TAPIR）分析，如国际申请WO2004/095031中所描述的，其公开内容被引入本文以供参考，用于结合到聚集的SOD1上的脑和脊髓切片上的筛选，如国际申请WO2008/081008所描述的；用于肽结合的筛选，该肽衍生自通过SEQ ID NO:1显示的氨基酸序列的SOD1；用于氨基酸序列的重组人类SOD1的结合的筛选，该氨基酸序列是通过SEQ ID NO:1显示的；用于氨基酸序列的生理SOD1-二聚物的聚集物的结合的筛选，该氨基酸序列由SEQ ID NO:1显示，并且其分离了抗体，该抗体结合受到检测，或者它是产生所述抗体的细胞。
[0133] 如上所述，由于在免疫应答时产生，本发明的人类单克隆抗体将会识别表位，该表位是病理上特别相关的，并且，相应地，例如在用于生成小鼠单克隆抗体的免疫过程中，以及在体外筛选噬菌体显示文库中，该表位可以是不容易接触到的或具有较少致免疫性。因此，谨慎地规定，本发明的人类抗-SOD1抗体的表位，是唯一的，并且没有其它抗体存在，所述其它抗体是指能够结合到本发明的人单克隆抗体所识别的表位上的抗体；同样参见图7，其示出了抗体NI-204.10D12的唯一表位，并且表IV示出了抗体NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.11F11、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3和NI-204.25H3的唯一表位。
[0134] 因此，本发明也基本延伸到抗-SOD1抗体以及SOD1结合分子上，该SOD1结合分子与用于特异性结合SOD1的本发明的人类单克隆抗体竞争。本发明更具体地涉及到抗体，或其抗原-结合片段、变体或衍生物，其中，作为选自某组的参考抗体，该抗体特异性地结合到SOD1的相同的表位上，该组是由：NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8、NI-204.9F6、NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3和NI-204.25H3组成的.
[0135] 抗体之间的竞争通过分析来测定，其中，所述被测试的免疫球蛋白抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合，例如SOD1。许多类型的竞争结合试验是已知的，例如：固相直接或间接放射免疫测定（RIA）、固相直接或间接酶免疫分析（EIA），夹心竞争试验；参 见 Stahli et al.,Methods in Enzymology9(1983),242-253;solid phase direct biotin-avidin EIA;see Kirkland et al.,J.Immunol.137(1986),3614-3619and Cheung et al.,Virology176(1990),546-552;solid phase direct labeled assay,solid phase direct labeled sandwich assay;see Harlow and Lane,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press(1988);solid phase direct label RIA using I125label;see Morel et al,Molec.Immunol.25(1988),7-15and Moldenhauer et al.,Scand.J.Immunol.32(1990),77-82。典型地，这样的测定包括使用纯化的SOD1或其结合到固体表面或细胞的聚集体，承受下列其中之一，未标记的测试免疫球蛋白和标记的参考免疫球蛋白，即本发明的人单克隆抗体。在测试免疫球蛋白存在的情况下，竞争性抑制通过测定结合到固相表面或细胞的标记物的量来测量。通常，测试免疫球蛋白是过量存在的。优选地，竞争性结合分析在附加例子中ELISA分析所述的条件下进行。通过竞争分析（竞争性抗体）识别的抗体包括，作为参考抗体结合到相同表位上的抗体，以及结合到相邻表位上的抗体，该相邻表位与通过参考抗体结合的表位足够近以使位阻发生。通常，当竞争性抗体过量存在时，它将抑制参考抗体与共同抗原的特异性结合的至少50％或75％。因此，本发明进一步涉及抗体或其抗原-结合片段、变体或衍生物，其中，该抗体竞争性地抑制选自某组的参考抗体结合到SOD1，该组是由NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8、NI-204.9F6、NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3和NI-204.25H3组成的。
[0136] 在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的多肽包含，基本是由或由免疫球蛋白重链的可变区（VH）组成的，其中，至少一个重链可变区的VH-CDRs或重链可变区的至少两个VH-CDRs与来自此处描述的抗体的参考重链的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性。可选择地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区域与来自此处所述的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的同一性。因此，根据此实施例，本发明的重链可变区具有与图1中所示的组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。尽管图1示出了Kabat系统限定的VH-CDRs，其它的CDR定义，例如Chothia系统限定的VH-CDRs，也包括在本发明中，并且可以容易地通过本领域的技术人员使用图1中所示的数据来进行识别。
[0137] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽，包括，基本包含，或包含免疫球蛋白重链的可变区（VH），其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1中示出的组VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3相同的的多肽序列。
[0138] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽包括，基本包含，或包含免疫球蛋白重链可变区（VH），其中，在任何一个VH-CDR中，除了一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代以外，VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与图1所示组VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3相同的多肽序列。在某些实施方案中，氨基酸取代是保守的。
[0139] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽包括，基本上包含，或包含免疫球蛋白轻链可变区（VL），其中轻链可变区至少一个VL-CDRs或轻链可变区至少两个VL-CDRs至少80％、85％、90％或95％与此处公开的来自抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列相同。可替换的是，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区至少80％、85％、90％或95％与此处公开的来自抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列相同。因此，根据此实施例，本发明的轻链可变区具有与图1所示多肽有关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。尽管图1示出Kabat系统定义的VL-CDRs，其它CDR定义，例如Chothia系统定义的VL-CDRs，也包括在本发明中。
[0140] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽包括，基本上包含，或包含免疫球蛋白轻链可变区（VL），其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1所示组VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3相同的多肽序列。
[0141] 在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的多肽包括，基本上包含，或包含免疫球蛋白轻链可变区（VL），其中，在任何一个VL-CDR中，除了一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代以外，VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有与图1所示组VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3相同的多肽序列。在某些实施方案中，氨基酸取代是保守的。
[0142] 免疫球蛋白或其编码cDNA可以进一步修饰。因此，在另一实施方案中，本发明方法包括以下步骤中任一项，产生嵌合抗体、鼠源化抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或以上任何一种的类似物。相应的方法是本领域技术人员已知的并且已经描述，例如，在Harlow和Lane的"Antibodies,A Laboratory Manual",CSH Press,Cold Spring Harbor(1988)。当所述抗体的衍生物通过噬菌体展示技术获得，BIAcore系统中所采用的表面等离子体共振可用于提高噬菌体抗体的效率，该抗体结合如同本文所述的任一种抗体的表位（Schier，人抗体杂交瘤7（1996）,Human Antibodies Hybridomas，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods183（1995），7-13）。例如，在国际申请WO89/09622中描述了嵌合抗体的生产。人源化抗体的制备方法描述于例如欧洲应用EP-A10239400和国际申请WO90/07861中。根据本发明使用的抗体的另外的源称为异种抗体。异种抗体制备的一般原理，例如小鼠中的人样抗体描述于例如国际专利申请WO91/10741，WO94/02602，WO96/34096和WO96/33735。如上面讨论的，除了完全抗体以外，本发明的抗体可以以各种形式存在，包括，例如，Fv、Fab和F（ab）2以及单链；例如参见国际申请WO88/09344。
[0143] 使用本领域已知的常规技术，可以进一步修饰本发明的抗体或其相应的免疫球蛋白链，例如，通过使用一个或多个氨基酸缺失、插入、取代、添加和/或重组和/或本领域已知单独或组合地任何其它修饰。引入这种以免疫球蛋白链的氨基酸序列为基础的DNA序列修饰方法也是本领域的技术人员已知的，参见，例如，Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.and Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and WileyInterscience,N.Y.（1994）。本发明抗体的修饰包括在一个或多个组成氨基酸上的化学和/或酶衍生作用，包括侧链修饰，主链修饰以及N和C终端修饰，这些终端修饰包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化以及糖类或脂类部分的附连、辅因子等。同样，本发明包括嵌合蛋白的制备，其在一些融合到异种分子的氨基末端中含有所描述的抗体或其片段，如在羧基末端的免疫刺激性配体；例如，在国际申请WO00/30680中，参见相应的技术细节。
[0144] 另外，本发明包括含有上述结合分子的肽，例如含有提及的任一抗体可变区的CDR3区，尤其是重链的CDR3，因为经常观察到重链CDR3（HCDR3）是具有更大程度的变异性和主要参与抗原-抗体相互作用的区域。根据本发明，这样的肽可以通过重组技术容易地合成或生产有用的结合剂。这些方法是本领域的普通技术人员所熟知的。肽可以例如通过使用可商购的自动肽合成仪合成。也可以通过重组技术生产肽，通过将表达肽的DNA掺入表达载体中，并用表达载体转化细胞，以生产肽。
[0145] 因此，本发明涉及任何结合分子，例如，抗体或者其结合片段，其方向朝着本发明的人类抗-SOD1抗体并显示上述性质，即，特异性识别SOD1。通过如本文所述的ELISA和免疫组织化学，参见例如实施例，这种抗体和结合分子可用于测试其结合特异性和亲和性。可以通过蛋白质印迹法测试这些抗体和结合分子的特性。根据本发明，随后实验初步结果的执行揭示了本发明的人类抗-SOD1抗体，特别是抗体NI-204.10D12和NI-204.12G7能够在转基因小鼠过量表达人类G93A SOD1中差异性结合SOD1病状。NI-204.10D12和NI-204.12G7在富神经丝球体中显示出强的结合病理性错误折叠/聚集SOD1的偏好，与在人类肌萎缩性脊髓侧索硬化症中看到的类似，在前角和白质的前柱和侧柱比在后角和填充增稠营养不良性神经突的富神经丝包含物中发现的频率高。也可在胞内分散包含物、Lewy类主体包含物和胞外聚集物中观察到优先结合的抗体，主要由超氧化物歧化酶1的异常聚集物组成；见实施例4和图6。这些实验（见实施例4和图9）的重复支持上述评估，并扩展了关于本发明的另外抗体的结合特异性的初步结果。根据以上观察，本发明的抗体能够揭示ALS模型小鼠腰椎脊髓SOD1病理的不同模式。尤其是抗体NI-204-12G7以及另外的抗体NI-204.11F11、NI.204.6H1、NI.204.12G3、NI.204.25H3、NI.204.34A3和NI.204.7B3可以根据本发明用于SOD1病理显像，包括主要是在运动神经元的细胞质SOD1包含物和细胞外SOD1聚集物。除了本文所示的生化实验（见实施例3和8），这种在动物组织中针对SOD1病理形式的结合特异性还强调了本发明抗体在疾病的治疗和诊断中的可用性，这些疾病与在大脑中出现的错误折叠/聚集SOD1相关。
[0146] 如上所述，在实验中，抗体NI-204.10A8已经显示出与人生理SOD1二聚体和错误折叠/聚集人SOD1相等的结合亲和力。然而，如实施例部分详细说明（实施例8），抗体NI-204.10A8的重复实验显示了对生理和聚合的SOD1的结合亲合力的显著降低。这些发现看来表明所述抗体的存储灵敏度，所述灵敏度可以是至少部分为生理和错误折叠/聚集的SOD1构象所观察到的亲和力的改变负责，从在实施例3计算的20nM、相应的30nM到如表III所示的SOD1的两种形式超过100nm。
[0147] 在这方面，在一个实施方案中，本发明提供了温度和/或存储不敏感的抗体，在延长的储存期间和/或暴露于非生理温度下之后，即低于4℃、特别是存储在大约零下80℃到零下20℃，该抗体至少很大程度上保持它们的结合能力。此外，在一个实施方案中，本发明还提供了温度和/或储存敏感的抗体，其显示出修改的结合亲和力和/或长期贮存后的亲合力。本文所指的亲和性的变化定义为生理学各个错误折叠/聚集的SOD-1蛋白从区别到非区别结合的改变。
[0148] 关于初步染色结果，如果使用适宜浓度的抗体，在图9中示出的所有抗体显示了胞内分散的内含物、扩散的细胞质结构和液泡结构的染色情况。与参考抗体B8H10（图9M）相比对大量聚集物的染色将本发明的抗体分成了两组：抗体NI204-12G7、NI204-11F11、NI204-6H1、NI204-12G3、NI204-7G5、NI204-25H3、NI204-34A3和NI204-7B3（图9B、C、F、G、H、I、J和K），在脊髓的腹角对这些聚集物进行染色，而抗体NI204-10D12、NI204-10A8和NI204-67E12（图9A、D和E）没有对这些结构进行染色，与对于可溶呈特异性的参考抗体C4F6（（图9L）类似，人类SOD1突变体的错误折叠形式（Bosco等人，2010，Nat Neuroscience13（11）；1396-1403）。另外，抗体NI204-10D12、NI204-6H1和NI204-7G5显示了在脊髓部分背角的胶状质中的扩散染色。
[0149] 作为直接由培养B记忆细胞或B细胞得到免疫球蛋白的可替换物，细胞可用作随后的表达和/或遗传操作的重排重链和轻链位置的来源。重排抗体基因可以从适当的mRNAs反转录产生cDNA。如果需要的话，该重链恒定区可以与不同的同工型区交换或一起消除。可变区可以被连接来编码单链Fv区域。多个Fv区域可以被连接来赋予结合能力给多于一个目标或者嵌合重链和轻链组合可以被采用。一旦获得了遗传物质，以上所述的保留了结合所需目标物能力的类似物的设计是简单明了的。克隆抗体可变区域和重组抗体的产生的方法对于本领域技术人员是已知的，并在例如以下的专利文献中被描述，Gilliland等人，Tissue Antigens47（1996），1-20；Doenecke等人，Leukemia11（1997），1787-1792。
[0150] 一旦获得了适当的遗传物质，如果需要的话，对其进行修饰来编码类似物，编码序列至少包括那些编码，重链和轻链的可变区可插入到包含在载体上的表达系统内，该载体可以被转染到标准的重组宿主细胞内。可以使用多种这样的宿主细胞用于有效的处理，然而，优选的是哺乳动物细胞。典型地，哺乳动物细胞系可用于这一目的，包括但不限于CHO细胞、HEK293细胞或NSO细胞。
[0151] 然后抗体或其类似物的生产通过在合适的培养条件下培养被修改的重组宿主来进行，该培养过程用于宿主细胞的生长和编码序列的表达。然后抗体通过从培养物中分离而回收。该表达系统优选地被设计为包括信号肽，以使所得到的抗体分泌到培养基中；然而，在细胞内生产也是可能的。
[0152] 根据以上所述，本发明还涉及编码本发明的抗体或等同结合分子的多核苷酸，优选地抗体的情况是，至少一个抗体的免疫球蛋白链的可变区被描述。典型地，由多核苷酸编码的所述可变区包括至少一个所述抗体的可变区的VH和/或VL的互补决定区（CDR）。
[0153] 本领域技术人员将易于理解，抗体的可变结构域具有上述的可变结构域，该可变结构域用于构建其它的多肽或所需特异性和生物学功能的抗体。因此，本发明还包括包含至少一种上述的可变结构域的CDR的多肽和抗体，其有利地与在附加的例子中描述的抗体具有基本上相同的或相似的结合特性。本领域技术人员知道，通过使氨基酸在CDRs内替换或在高变环（Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196（1987），901-917）内替换可以增强结合亲和力，其与由Kabat定义的CDRs部分重叠；参见，例如，Riechmann，等人，Nature332（1988），323-327。因此，本发明还涉及抗体，其中所提到的一个或多个CDRs包括一个或多个、优选地不超过2个氨基酸替换。优选地，本发明的抗体包括在一个或两个其免疫球蛋白链中的两个或三个如图1所示的可变区域的CDRs。
[0154] 本领域的普通技术人员所知道的结合分子，例如，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物可以包括介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，将补体的C1成分与抗体恒定区结合可以活化补体系统。补体的活化在细胞病原体的调理和溶解中是重要的。补体活化也刺激炎症反应，可能还涉及自身免疫过敏反应。此外，抗体经由Fc区域可以与各种细胞上的受体结合，在抗体Fc区域上的Fc受体结合位点结合到细胞上的Fc受体（FcR）上。有多种Fc受体，其对于不同类别的抗体是特异性的，包括IgG（γ受体），IgE（ε受体），IgA（α受体）和IgM（μ受体）。抗体与细胞表面Fc受体的结合引发许多重要的多种生物学反应，包括内吞和破坏抗体包被的颗粒、清除免疫复合物、通过杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞（称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC）、释放炎症介质、胎盘转移以及控制免疫球蛋白合成。
[0155] 因此，本发明的某些实施例包括：抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物，其中一个或多个恒定区域的至少一部分缺失或被改变，以提供所需的生化特征，如与具有大约相同免疫原性的完整的未改变的抗体相比，降低效应子功能、非共价二聚化的能力、增加定位SOD1聚集物和沉积物位点的能力、降低血清的半衰期或增加血清的半衰期。例如，本文描述的用于在诊断和治疗方法中使用的某些抗体是缺失结构域的抗体，其包含类似于免疫球蛋白重链的多肽链，但其缺少至少一个或多个重链结构域的一部分。例如，在某些抗体中，改变的抗体恒定区的一个完整的结构域将会缺失，例如，全部或部分的CH2结构域将会缺失。在其它实施例中，本文描述的用于在诊断和治疗方法中使用的某些抗体具有恒定区，例如，IgG重链恒定区，其被改变来消除糖基化作用，本文其它地方称为未经糖基化或“agly”抗体。这种“agly抗体可以通过酶促方式制备或者通过对在恒定区中的共有糖基化位点（一个或多个）工程处理来制备。不受理论的限制，有人认为“agly”抗体在体内具有改进的安全性与稳定性分布。生产具有所需的效应子功能的非糖基化抗体的方法在例如国际申请WO2005/018572中发现，其均通过引用整体并入。
[0156] 在本文所描述的某些抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物中，可以使用本领域已知的技术使Fc部分发生突变以减少效应子功能。例如，缺失或失活（通过点突变或其它方法）恒定区结构域可以降低循环修饰的抗体与Fc受体的结合，从而增强SOD1定位。在其它情况下，符合本发明的恒定区的修饰可减缓补体结合，从而降低血清半衰期以及与缀合的细胞毒素的非特异性结合。恒定区的其它修饰可用于修改二硫键的连接或寡糖成分，因提高抗原特异性和抗体柔性而增强定位。利用公知的免疫学技术无需过多实验，很容易测定和定量该修饰所引起的生理学特性、生物可利用度以及其它生物化学效应，例如SOD1定位、生物分布和血清半衰期。
[0157] 在本文描述的某些抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物中，对于替代的蛋白质序列Fc部分可以突变或者被替换来增加抗体细胞的摄取，例如经由Fcγ受体、LRP或Thy1受体通过增强抗体的受体介导的内吞作用或通过“超抗体技术”，据说其可以使抗体能够穿梭融入到活细胞中，而不损害它们（Expert Opin.Biol.Ther.（2005），237-241）。例如，使用本领域已知的技术可以设计出抗体结合区的融合蛋白的产生，和细胞表面受体或结合到SOD1和细胞表面受体的特定序列的双或多特异性抗体的同源蛋白质配体。
[0158] 在本文描述的某些抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物中，对于替代的蛋白质序列Fc部分可以突变或者被替换或者抗体可以进行化学修饰来提高其血脑屏障的渗透。
[0159] 本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物的修改形式可以使用本领域已知的技术从完整的前体或者亲本抗体中制备。本文中更详细地讨论了示例性技术。本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物可以通过使用本领域已知的技术来制备或制造。在某些实施例中，抗体分子或其片段是“重组产生的”，即，是使用重组DNA技术产生的。在本文中更详细的描述了制备抗体分子或其片段的示例性技术。
[0160] 本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物也包括修饰的衍生物，例如任何类型的分子与抗体的共价连接，使得共价连接不妨碍抗体特异性地结合到其同源抗原表位上。例如，但非限制性的是，抗体衍生物包括已经修改了的抗体，例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质连接等。许多化学修改的任何一种都可以通过已知的技术来执行，该已知的技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一种或多种非典型氨基酸。
[0161] 在特别优选的实施例中，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物不会在待治疗的动物体内例如在人体内引起有害的免疫应答。在某些实施例中，本发明的结合分子，例如抗体或抗原-结合片段，来自患者，例如病人，并随后用于他们源自的同一物种，例如人类，去缓和或最小化有害免疫应答的发生。
[0162] 除免疫可也以用来降低抗体的免疫原性。本文所用的术语“除免疫”包括改变抗体用来修改T细胞表位，参见，例如，国际专利申请WO98/52976and WO00/34317。例如，对来自起始抗体的VH和VL序列进行了分析，并且来自每个V区域的人类T细胞表位“布局图”显示了与互补决定区（CDRs）有关的表位的位置和序列内的其它关键残基。为了在改变最终抗体的活性存在较低风险的情况下识别备选地氨基酸替换，对来自T细胞表位图的单独的T细胞表位进行了分析。一系列的可选择的VH和VL序列被设计为包括组合的氨基酸替换，随后这些序列被掺入到一系列的结合多肽中，例如，用于在本文公开的诊断和治疗方法中使用的SOD1-特异性抗体或及其免疫特异性片段，然后检测其功能。通常地，产生并检测在12到24之间的变异抗体。包括修改的V和人类C区域的完整的重链和轻链基因被克隆到表达载体中，并且随后的质粒被引入到用于生产全部抗体的细胞系中。然后将抗体在适当的生化和生物试验中进行比较，从而最佳变体得到鉴别。
[0163] 单克隆抗体可使用本领域已知的各种技术制备，包括使用杂交瘤细胞，重组体和噬菌体显示技术或其组合。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤技术生产，包括本领域已知的和例如Harlow等人，Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988);Hammerling 等 人 ,in:Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Elsevier,N.Y.,563-681(1981)中教导的技术，所述文献以其全部内容引入这里作为参考。本文所用的术语“单克隆抗体”不局限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指衍生自单克隆的抗体，包括任何真核、原核或噬菌体克隆，并不是产成它的方法。因此，术语“单克隆抗体”不局限于通过杂交瘤技术生产的抗体。在某些实施例中，本文所述的本发明的抗体来源于人的B细胞，这些B细胞通过转化Epstein-Barr病毒而无限增殖，正如本文所描述的。
[0164] 在已知的杂交瘤方法中（Kohler等人，Nature256（1975），495），来自哺乳动物的相对短命或致命的淋巴细胞，例如本文所述的衍生自人类受试者的B细胞，与永生的肿瘤细胞系（例如，骨髓瘤细胞系）融合，而形成永生的并能够产生B细胞遗传编码的抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。通过对单独品系选择、稀释和重生长，所得的杂交体被分离为单一的遗传品系，所述各单独品系包含用于形成单一抗体的特定基因。它们因而可产生同质针对目的抗原的抗体，并鉴于其纯遗传家系而被称为“单克隆”。
[0165] 以此方式制得的杂交瘤细胞被植入合适的培养基（优选地含有一种或多种抑制未融合的母体骨髓瘤细胞生长或存活的物质）并在其中生长。本领域技术人员应当理解，用于杂交瘤形成、筛选和生长的试剂、细胞系和培养基可以从多种商业来源获得，标准方法已经建立。通常地，生长杂交瘤细胞的培养基需分析其产生抗目标抗原的单克隆抗体。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过体外测定，比如如本文所述的免疫沉淀反应，放射免疫测定（RIA）或酶联免疫吸附测定（ELISA）来确定。当鉴定出产生所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，这些克隆可以通过有限稀释法进行亚克隆并且通过标准方法，参见例如（Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,pp.59-103(1986)）。还将理解可通过常规的纯化操作例如蛋白-A、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中分离由亚克隆所分泌的单克隆抗体。
[0166] 在另一个实施例中，淋巴细胞可以通过显微操作和可变基因分离来选择。例如，外周血单个核细胞可以从免疫的或天然免疫的哺乳动物（例如人类，并在体外培养了约7天）中分离出来。培养物经筛选用于符合筛查标准的特异性IgGs。来自阳性孔中的细胞可以被隔离。单个的产生Ig的B细胞可以通过FACS或通过在互补的溶血蚀斑试验中识别出他们而被分离出来。可以将产生Ig的B细胞微操作到试管中，且VH和VL基因可以使用例如RT-PCR来扩增。VH和VL基因可以被克隆到抗体表达载体上并转染到细胞中（例如真核或原核细胞）进行表达。
[0167] 另外，可以利用熟练技术人员所熟知的技术选择并培养产生抗体的细胞系。这些技术记载于多种实验室手册和主要出版物中。在这方面，适用于如下所述的本发明的技术在Current Protocols in Immunology,Coligan等人Eds.,Green Publishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)中进行了描述，其整体引入本文作为参考，包括补充。
[0168] 识别特异性表位的抗体片段可以通过已知的技术产生。例如，Fab和F（ab'）2片段可以重组产生或通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割并使用酶如木瓜蛋白酶（来产生fab片段）或胃蛋白酶（来产生F（ab'）2片段）产生。F（ab'）2片段含有可变区、轻链恒定区和重链CH1结构域。这种片段足以用于例如涉及与免疫球蛋白的免疫特异性部分耦合来检测如放射性同位素的试剂的免疫诊断程序中。
[0169] 如本文所述的人类抗体对于治疗人类患者是尤为理想的。本发明的人类抗体是从例如健康的人类受试者中分理出来的，由于这些健康的人类受试者的年龄，他们被怀疑存在发展成神经变性疾病的危险，例如ALS，或具有疾病还具有异常稳定的疾病进程或异常疾病的轻微形式的患者。然而，尽管可以稳妥地期待老年健康受试者和无症状受试者比年轻的受试者更规律的发展保护抗-SOD1抗体，后者也可以用作用于获得本发明的人类抗体的来源。对于易患家族性形式的ALS症状但由于他们的免疫系统功能比老年人的更有效而保持无症状的年轻的患者尤其是这样。
[0170] 在一个实施例中，本发明的抗体包括至少一个抗体分子的重链或轻链CDR。在另一个实施例中，本发明的抗体包括至少两个来自一个或多个抗体分子的CDRs。在另一个实施例中，本发明的抗体包括至少三个来自一个或多个抗体分子的CDRs。在另一个实施例中，本发明的抗体包括至少四个来自一个或多个抗体分子的CDRs。在另一个实施例中，本发明的抗体包括至少五个来自一个或多个抗体分子的CDRs。在另一个实施例中，本发明的抗体包括至少六个来自一个或多个抗体分子的CDRs。本文描述了包括至少一个可以包括在受试者抗体内的CDR的示例性抗体分子。
[0171] 本发明的抗体可通过本领域已知的用于抗体的合成的任何方法生产，尤其是通过本文描述的化学合成，或者优选通过本文描述的重组表达技术。
[0172] 在一个实施例中，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物包括合成恒定区，其中一个或多个结构域是部分或全部缺失的（“缺失结构域的抗体”）。在某些实施例中，相容的修饰抗体包含结构域缺失的构建体或变体，其中去除了整个CH2结构域（ΔCH2构建体）。对于其它的实施例，短连接肽可用来代替缺失的结构域以为可变区域提供灵活和自由的移动。本领域技术人员应当理解，因CH2结构域对抗体代谢速率具有调节特性而特别优选此种构建体。结构域缺失的构建体源于使用编码IgG1人类恒定结构域的载体，例如，参见国际专利申请WO02/060955和WO02/096948A2。这个载体被改造为缺失CH2结构域并提供一种表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。
[0173] 在某些实施例中，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物是微抗体。微抗体可以使用本领域描述的方法制备，参见，例如，美国专利5，837，821或国际申请WO94/09817。
[0174] 在一个实施例中，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物包括免疫球蛋白重链，该免疫球蛋白重链具有缺失或替换的一些或甚至单个氨基酸只要其允许单体亚单元之间具有关联性。例如，在CH2结构域的选定区域中单个氨基酸的突变可能足以充分降低Fc的结合，从而增强SOD1定位。类似地，理想的是仅仅删除一个或多个恒定区结构域的一部分，所述结构域控制所要调节的效应子功能（例如补体结合）。恒定区的这种部分缺失可以改进抗体的选定特性（血清半衰期），并使与该恒定区结构域有关的其它所需功能保持完整。此外，如上面所提到的，通过突变或替换可增强所得构建体性能的一个或多个氨基酸，可以合成本公开抗体的恒定区。在这方面，有可能破坏由保守的结合位点提供的活性（例如Fc结合），同时基本保持改变的抗体的构型和免疫原性特征。在其它实施例中，包含在恒定区添加一个或多个氨基酸，以增强所需的特征，例如效应器功能或提供更高的细胞毒性、或附着碳水化合物。在这些实施例中，可能需要插入或复制来自所选恒定区结构域的特定序列。
[0175] 本发明还提供了抗体，其含有、基本由或由本文所述的抗体分子（例如，VH区域和/或VL区域）的变体（包括衍生物）组成，其抗体或片段免疫特异性的结合到SOD1上。可以使用本领域技术人员已知的标准技术将突变导入到编码抗体的核苷酸序列中，包括但不限于导致氨基酸替换的位点-定向诱变和PCR-介导诱变。优选地，变体（包括衍生物）相对于参考VH区域，VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区域，VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3编码小于50个氨基酸替换、小于40个氨基酸替换、小于30个氨基酸替换、小于25个氨基酸替换、小于20个氨基酸替换、小于15个氨基酸替换、小于10个氨基酸替换、小于5个氨基酸替换、小于4个氨基酸替换、小于3个氨基酸替换、或小于2个氨基酸替换。“保守氨基酸取代”是指用具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基来替代原来的氨基酸残基。具有带有相似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中定义。这些家族包括具有基本侧链（例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸）、酸性侧链（例如，天冬氨酸、谷氨酸）、不带电荷的极性侧链（例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、无极性侧链（例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、带β-支链的侧链（例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族侧链（例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸）的氨基酸。可替换地，突变可随机导入编码序列的全部或部分中，例如通过饱和诱变导入，可通过筛选所产生的突变体的生物活性来鉴定仍保持活性（例如，结合SOD1的能力）的突变体。
[0176] 例如，可以将突变仅引入到框架区域或仅引入到抗体分子的CDR区域。引入的突变可以是沉默的或中性错义突变，例如，对抗体结合抗原的能力没有影响或有很小影响，实际上一些这种突变在什么情况下都不会改变氨基酸的序列。这些类型的突变可以用于优化密码子的用途或提高杂交瘤抗体的生产。本发明的编码抗体的优化的密码子编码区在本文的其它地方公开。另外，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大部分的沉默的和中性错义突变的位置可能在框架区域中，而大部分的非中性错义突变的位置很可能在CDR中，尽管这不是绝对的要求。本领域的普通技术人员将能够设计和测试具有所需特性例如不改变抗原结合活性或改变结合活性（例如提高抗原结合活性或改变抗体特异性）的突变分子。诱变之后，所编码的蛋白质可以常规地表达并且所编码的蛋白质的功能和/或生物学活性（例如，免疫特异性的结合至少一个SOD1的表位的能力）可以通过使用本文所描述的技术来确定，或通过本领域已知的常规修改技术来确定。
[0177] III.多聚核苷酸编码抗体
[0178] 多聚核苷酸编码抗体或其抗原-结合片段、变体或衍生物可以由任何多聚核糖核苷酸或脱氧多聚核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，多核苷酸编码抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物可以由单链和双链DNA、单链和双链区混合的DNA、单链和双链RNA、单链和双链区混合的RNA、包含DNA和RNA的杂交分子组成，该杂交分子可以是单链的，或更典型是双链的或单链和双链区的混合物。此外，多核苷酸编码抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物可由包括RNA或DNA或即包括RNA又包括DNA的三链区域组成。多核苷酸编码抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物可以包含一个或多个修饰的碱基或者为了稳定性或其他原因被修饰的DNA或RNA骨架。“修饰”碱基包括，例如三苯甲基化碱基与稀有碱基（如次黄嘌呤核苷）。对DNA和RNA可以进行多种修饰，因此“多核苷酸”包含化学、酶或代谢修饰的形式。
[0179] 编码源于免疫球蛋白（例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分）的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸可以通过将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入到免疫球蛋白的核苷酸序列中，使得一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失被引入到编码的蛋白质中来产生。通过标准技术，例如定位诱变和PCR-介导的诱变，可以导入突变。优选地，在一个或多个非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸取代。
[0180] 众所周知，可以利用标准技术，例如异硫氰酸胍抽提然后离心或层析沉淀，从原始B细胞、杂交瘤细胞或其它转化细胞中分离RNA。理想的是，可通过标准技术从总RNA分离mRNA，如在寡脱氧胸苷酸纤维素上层析。适当的技术在现有技术中被熟知。在一个实施例中，按照熟知的方法使用逆转录酶和DNA聚合酶，可以同时或分别制备编码抗体的轻链和重链的cDNA。PCR可通过共有恒定区引物或通过更为特异性的引物来启动，所述引物基于已公开的重链和轻链DNA及氨基酸序列。如上所述，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在此情况下，可用共有引物或更大的同源探针筛选文库，如人类恒定区探针。
[0181] 可以使用本领域已知的技术，以及与前文中重组DNA技术相关的文献详述的众所周知的标准技术相一致的限制，从细胞中分离DNA、特别是质粒DNA。当然，可以在分离过程或随后的分析中的任何时候，根据本发明合成DNA。
[0182] 在一个实施例中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包括、基本由或由下列组成，编码免疫球蛋白重链可变区域（VH）的核酸，其中至少一个重链可变区域的CDRs或至少两个重链可变区域的VH-CDRs与本文描述的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的相似性。另外，VH的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3区域与本文描述的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的相似性。因此，根据此实施例，本发明的重链可变区域具有与图1示出的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。
[0183] 在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包括、基本包括或包括编码具有轻链可变区域（VL）的免疫球蛋白的核酸，其中至少一个轻链可变区域的VL-CDRs或至少两个轻链可变区域的VL-CDRs与本文描述的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的相似性。另外，VL的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3区域与本文描述的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列具有至少80％、85％、90％或95％的相似性。因此，根据此实施例，本发明的轻链可变区域具有与图1示出的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。
[0184] 在另一个实施例中，本发明提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包括、基本包括或包括编码免疫球蛋白重链可变区域（VH）的的核酸，在该重链可变区域（VH）中的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区域具有与图1示出的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团相同的多肽序列。
[0185] 如本领域所公知的，两种多肽或两种多核苷酸之间的“序列同一性”是通过将一种多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二种多肽或多核苷酸的序列相比来确定的。如这里讨论的，任何特定的多肽是否与另一种多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的相似性可以使用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定，例如但不限于，BESTFIT程序（Wisconsin Sequence Analysis Package,Version8for Unix,Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI53711)。BESTFIT利用Smith和Waterman的局部同源算法，Advances in Applied Mathematics2(1981),482-489，找到两个序列之间的最佳同源区段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序测定特定序列是否是与本发明的参照序列具有例如95％同一性时，参数的设置当然应使得在参照多肽序列的全长的基础上计算同一性的百分比以及允许不超过参照序列氨基酸总数5％的同源性缺口。
[0186] 在本发明的一个优选实施例中，多核苷酸包括、基本包括或包括具有如表II所示的抗-SOD1抗体的VH或VL区域的多核苷酸序列的核酸。在这方面，本领域的技术人员将容易理解，至少编码了轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码两个免疫球蛋白链或仅一个免疫球蛋白链的可变结构域。
[0187] 表II：SOD1特定抗体的VH和VL区域的核苷酸序列。
[0188]
[0189]
[0190]
[0191]
[0192] 如其它地方所描述的，本发明还包括本发明的多核苷酸片段。本发明也考虑了编码本文所述的融合多核苷酸、Fab片段和其它衍生物的另外一些多核苷酸。
[0193] 多核苷酸可以通过现有技术中任何已知的方法来生产或制备。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码该抗体的多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸装配而成，如在Kutmeier等人，BioTechniques17(1994),242，中所描述的那样，简而言之，该装配过程涉及包含编码该抗体的序列的一部分的重叠的寡核苷酸的合成，对那些寡核苷酸进行退火和连接处理，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
[0194] 可选择地，编码抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物的多核苷酸可以从合适的核酸来源中产生。如果不能获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列是已知的，则编码该抗体的核酸通过使用与序列的3’和5’端杂交的合成引物PCR扩增，或通过使用对特定基因序列的寡核苷酸探针克隆来鉴别例如，来自编码该抗体的cDNA文库的cDNA克隆可以化学合成或从一个合适来源（例如，抗体cDNA文库或从其产生的cDNA文库或核酸，优选地是从任何表达SOD1-特异性抗体的组织或细胞中分离出来的聚乙烯A+RNA，如选择用来表达该抗体的杂交瘤细胞）获得。由PCR产生的扩增的核酸可以使用本领域熟知的任何方法被克隆到可复制的克隆载体中。
[0195] 一旦确定了抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，它的核苷酸序列可使用本领域熟知的用于操作核苷酸序列的方法来操作，例如，重组DNA技术、位点定向诱变、PCR等，（参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)and Ausubel 等 人 ,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1998)），其整体引入作为参考，来产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如用来产生氨基酸替换、删除和/或插入。
[0196] IV.抗体多肽的表达
[0197] 为了提供本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物而操作所分离的遗传物质以后，通常将编码该抗体的多核酸插入表达载体用于引入宿主细胞，所述宿主细胞可用于产生所需量的抗体。在本文中描述了抗体或片段、衍生物或类似物的重组表达，例如，结合到靶分子上的抗体的重链或轻链。一旦获得了编码本发明的抗体分子，或抗体的重链或轻链或其部分（优选地，含有重链或轻链可变区）的多核苷酸，用于生产该抗体分子的载体可以利用本领域熟知的技术通过重组DNA技术产生。因此，本文描述了通过表达含有编码核苷酸序列的抗体的多核苷酸来制备蛋白的方法。本领域技术人员熟知的方法，可用于构建含有抗体编码序列和合适的转录和翻译调控信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术，合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了含有可操作地与启动子连接、编码本发明的抗体分子、或其重链和轻链、或其重链或轻链的可变结构域的核苷酸序列的可复制载体。这种载体可包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列（参见，如国际申请WO86/05807和WO89/01036和美国专利5，122，464），而且可以把抗体的可变区克隆到这种载体中用于表达整个重链或整个轻链。
[0198] 本文使用的术语“载体”或“表达载体”是指按照本发明使用的载体，作为在宿主细胞中引入并表达目的基因的运载工具。如本领域技术人员所了解的，这种载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。通常地，适于本发明的载体包含选择标记、合适的限制性位点以便于克隆目的基因、以及能够进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。对于本发明的目的，可以使用很多表达载体系统。例如一类载体利用来自动物病毒的DNA元件，所述动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒（RSV，MMTV或MOMLV）或SV40病毒。其它包括使用内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，有DNA整合入其染色体的细胞可通过引入一个或多个标记来进行选择，所述标记允许选择转染的宿主细胞。标记可为营养缺陷型宿主提供原养，提供杀虫剂抗性（例如抗生素）或对重金属如铜的抗体。可以将可选择标记基因直接连接到有待表达的DNA序列，或通过共转化引入相同的细胞。为最理想地合成mRNA，可能还需要额外的元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
[0199] 在特别优选的实施例中，将克隆的可变区基因连同上述的重链和轻链恒定区基因（优选人的）一起插入表达载体。在一个实施例中，这是利用在美国专利6，159，730中公开的Biogen IDEC，Inc.名为NEOSPLA的专门表达载体进行。该载体包含巨细胞病毒的启动子/增强子、小鼠β球蛋白的主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因以及前导序列。发现该载体在插入可变区和恒定区基因、转染CHO细胞、然后进行含有培养基的G418筛选和甲氨喋呤扩增之后，产生很高的抗体表达水平。当然，能够激发在真核细胞中表达的任何表达载体都可以在本发明中使用。合适的载体的例子包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2（可以从Invitrogen、San Diego、CA中获得）和质粒pCI（可以从Promega、Madison、WI中获得）。一般来说，为那些表达出适当较高水平如果是免疫球蛋白的重链和轻链而筛选出大量的转换细胞是常规实验，所述实验可以通过，例如，机器人系统来进行，。载体系统也在美国专利5，736，137and5，658，570中讲述了，所述专利各以其整体引入本文作为参考。这一系统提供高表达水平，例如大于30pg/细胞/天。其它示例性载体系统在例如美国专利6，413，777中公开。
[0200] 在其它优选的实施例中，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物可以利用多顺反子构建体进行表达，例如在美国专利申请出版物2003-0157641A1中所公开的构建体，在此全文引入。在这些表达系统中，多个目的基因产物，例如抗体的重链和轻链可以从单个多顺反子构建体中产生。这些系统有利地利用了内部核糖体进入位点（IRES）以提供相对抗体的高水平。兼容的IRES序列在引入本文的美国专利6，193，980中公开。本领域技术人员应当理解，该表达系统可用于有效产生本发明公开的所有抗体。
[0201] 通常地，一旦制备了编码该抗体的单体亚单元的载体或DNA序列，可将表达载体引入适宜的宿主细胞。将质粒引入宿主细胞可通过多种本领域技术人员熟知的技术完成。这些包括但不限于转染，转染包括使用 或脂质转染胺试剂的脂质转染、原生质体融合、磷酸钙沉淀、细胞与折叠的DNA融合、显微注射和完整病毒的感染。典型地，通过标准磷酸钙共沉淀方法将质粒引入宿主细胞。携带表达构建体的宿主细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白合成情况。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定（ELISA），放射免疫测定（RIA），或荧光激活的细胞分选分析（FACS），免疫组化等。
[0202] 通过常规技术把表达载体转移到宿主细胞，然后通过常规技术培养转染细胞来生产用于本文描述的方法的抗体。因此，本发明包括含有编码本发明的抗体、或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞，可操作地与异源启动子连接。如下所述，在用于表达双链抗体的优选实施例中，编码重链和轻链的载体可以在宿主中共表达以表达整个免疫球蛋白分子。
[0203] 宿主细胞可以与本发明的两个表达载体共转染，其中第一载体编码来自多肽的重链，而第二载体编码来自多肽的轻链。这两个载体可以含有相同的选择标记以使多肽的重链和轻链相等的表达。可替换地，可以使用编码重链和轻链多肽的单一载体。在这种情况下，轻链优选置于重链之前以避免毒性游离重链的过量；参见Proudfoot、Nature322（1986），Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77（1980），2197。重链和轻链的编码序列可以包括cDNA或基因组DNA。
[0204] 本文所用的“宿主细胞”是使用重组DNA技术和编码至少一个异源基因来构建港载体的细胞。在对从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可以互换使用，表示抗体的来源，除非另外清楚指明。换句话说，从“细胞”中回收多肽是指从离心下来的完整细胞，或从含有培养基和悬浮的细胞的细胞培养物中回收。
[0205] 多种宿主-表达载体系统可用于表达在本文描述的方法中使用的抗体分子。这些宿主表达系统是一种媒介物，通过它可产生感兴趣的编码序列，并随后被纯化，但也是一种细胞，当用合适的核苷酸编码序列转化或转染时，它们可在原位表现出本发明的抗体分子。这些包括但不局限于微生物，如用重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达含有编码序列的抗体的载体转化的细菌（例如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌）；用重组酵母表达含有编码序列的抗体的载体转化的酵母（例如，酵母菌，毕赤酵母）；用重组病毒表达含有编码序列的抗体的载体（例如杆状病毒）感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV）感染的植物细胞系统；或用重组质粒表达含有编码序列的抗体的载体（例如，Ti质粒）转化的植物细胞系统或哺乳动物细胞系统（例如COS，CHO，NSO，BLK，293，3T3细胞），该哺乳动物细胞系统含有重组表达构建体，该重组表达构建体含有衍生自哺乳动物细胞（例如，金属硫蛋白启动子）或哺乳动物病毒（例如，腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5k启动子）的基因组的启动子。尤其对整个重组抗体分子的表达，优选地，细菌细胞，如大肠杆菌，更优选地，真核细胞，用于重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，与载体一起，（所述载体如来自人巨细胞病毒的主要立即早基因启动子元件）是用于抗体的有效的表达系统，参见，例如，Foecking等人，Gene45(1986),101;Cockett et al.,Bio/Technology8(1990),2。
[0206] 用于蛋白表达的宿主细胞系常常来源于哺乳动物；相信本领域技术人员能优先确定特定的宿主细胞系，其最适于目的基因产物在其中表达。示例性宿主细胞系包括但不局限于，CHO（中国仓鼠卵巢）、DG44和DUXB11（中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR minus）、HELA（人子宫颈腺癌）、CVI（猴肾细胞系）、COS（具有SV40T抗原的CVI衍生物）、VERY，BHK（幼仓鼠肾）、MDCK，WI38，R1610（中国仓鼠成纤维细胞）、BALBC/3T3（小鼠成纤维细胞）、HAK（仓鼠肾细胞系）、SP2/O（小鼠骨髓瘤）、P3x63-Ag3.653（小鼠骨髓瘤）、BFA-1c1BPT（牛内皮细胞）、RAJI（人淋巴细胞）以及293（人肾）。特别优选的是CHO和293细胞。宿主细胞系通常可从商业服务、美国组织培养物保藏中心或公开的文献中得到。
[0207] 另外，可选择一宿主细胞株，能调节插入序列的表达，或者以所需的特别方式，修饰和加工基因产物。对蛋白质产物的这种修饰（如糖基化）和加工（如裂解）对于蛋白质功能可能是重要的。不同宿主细胞具有特征性的和特定的机制对蛋白质和基因产物进行翻译后加工和修饰。可以选择合适的细胞系或宿主系统来确保对被表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用真核宿主细胞，它具有对基因产物的初级转录物、糖基化和磷酸化作适当加工的细胞机器。
[0208] 对于长期、高效地产生重组蛋白，可优选稳定的表达。例如，可以工程设计稳定表达该抗体分子的细胞系。不使用包含病毒复制起点的表达载体，而可以使用可选择性标记，和被合适的表达控制成分（例如启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等）控制的DNA转化宿主细胞。在导入外源DNA后，将构建的细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转到选择性培养基中。重组质粒中的可选择标记赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定整合入其染色体中并生长形成转化灶，由此可将其克隆并扩增成细胞系。这种方法可有利地用于工程设计稳定表达该抗体分子的细胞系。
[0209] 可以使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶（Wigler等人，Cell，11（1977），223），次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Szybalska&Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA48（1992），202）和腺嘌呤磷酸核糖转移酶（Lowy等人，Cell，22（1980），817）基因可以在tk-、hgprt-或aprt-细胞中采用。同样，可以将抗代谢物抗性用作选择以下基因的基础：dhfr，它能产生对氨甲蝶呤（Wigler等人，Natl.Acad.Sci.USA77（1980），
357；O'Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78（1981），1527）的抗性；gpt，它能产生对霉酚酸（Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78（1981），2072）的抗性；neo，它能产生对氨基糖苷G-418（Goldspiel等人，Clinical Pharmacy12（1993），488-505；Wu和Wu，Biotherapy3（1991），87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32（1993），
573-596；Mulligan，Science260（1993），926-932； 和 Morgan 和 Anderson，Ann.Rev.Biochem.62（1993），191-217；TIB TECH11（1993），155-215）的抗性；和hygro，它能产生对潮霉素（Santerre等人，Gene30（1984），147）的抗性。可用的本领域公知的有关重组DNA技术的方法在Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&；
Sons，NY（1993）；Kriegler，Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual，Stockton Press，NY（1990），和在第12和13章，Dracopoli等编，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY（1994）；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150:1（1981）中有描述，其全部内容通过引用结合于此。
357；O'Hare等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78（1981），1527）的抗性；gpt，它能产生对霉酚酸（Mulligan&Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78（1981），2072）的抗性；neo，它能产生对氨基糖苷G-418（Goldspiel等人，Clinical Pharmacy12（1993），488-505；Wu和Wu，Biotherapy3（1991），87-95；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32（1993），
573-596；Mulligan，Science260（1993），926-932； 和 Morgan 和 Anderson，Ann.Rev.Biochem.62（1993），191-217；TIB TECH11（1993），155-215）的抗性；和hygro，它能产生对潮霉素（Santerre等人，Gene30（1984），147）的抗性。可用的本领域公知的有关重组DNA技术的方法在Ausubel等编，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley&；
Sons，NY（1993）；Kriegler，Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual，Stockton Press，NY（1990），和在第12和13章，Dracopoli等编，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley&Sons，NY（1994）；Colberre-Garapin等人，J.Mol.Biol.150:1（1981）中有描述，其全部内容通过引用结合于此。
[0210] 通过载体扩增可以提高抗体分子的表达水平，作为参考，见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Academic Press,NewYork,Vol.3.(1987)。当在表达抗体的载体系统中的标记物扩增时，宿主细胞培养物中存在的抑制剂的水平的增加将增加该标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与抗体基因有关，所以抗体的产量也会增加；见Crouse等人，Mol.Cell.Biol.3（1983），257。
[0211] 在体外制备可使得规模增大以得到大量所需的多肽。在组织培养的条件下的哺乳动物细胞培养技术为本领域已知，包括均匀悬浮培养，例如在气升反应器或持续搅拌反应器中，或者固定化或俘获细胞培养，例如在中空纤维、微囊中、琼脂糖微粒或陶瓷芯上。如果必要和/或需要，多肽溶液，例如在合成铰链区多肽的优先生物合成之后或在本文描述的进行HIC层析步骤之前或之后，可以通过常规的色谱方法纯化，例如凝胶过滤、离子-交换层析、在DEAE-纤维素上层析或（免疫-）亲和层析。
[0212] 编码本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物的基因也可以在非哺乳动物细胞中表达，如细菌或昆虫或酵母或植物细胞。易于摄取核酸的细菌包括肠杆菌科，例如大肠杆菌或沙门氏菌菌株；芽胞杆菌科，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。还将理解当在细菌中表达时，异源多肽通常成为包含体的组成部分。异源多肽必须分离、纯化和然后组装成功能分子。其中抗体的四价形式是所需的，然后将亚单元自组装成四价抗体，参见，例如，国际申请WO02/096948。
[0213] 在细菌系统中，许多表达载体可被有利地挑选，这取决于被表达的抗体分子的用途。例如，当生产大量的这些蛋白质以产生抗体分子的药物组合物时，希望使用可指导易于纯化的高含量融合蛋白质产物的表达的载体。这种载体包括但不限于，大肠杆菌表达载体pUR278（Ruther等人，EMBO J.2（1983），1791），其中抗体编码序列可以在框架中以lacZ编码区域单独地连接于载体中，以便产生融合蛋白；pIN载体（Inouye&Inouye，Nucleic Acids Res.13（1985），3101-3109；Van Heeke&Schuster，J.Biol.Chem.24（1989），5503-5509）等。pGEX载体也可用谷胱甘肽S-转移酶（GST）将外来蛋白表达为融合蛋白。这些融合蛋白通常是可溶的，通过吸附和结合于谷胱甘肽-琼脂糖珠的基质，随后在谷胱甘肽存在下洗脱，易于从裂解的细胞中纯化。pGEX载体被设计成包括凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
[0214] 除了原核生物之外，也可以使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母是最常用的真核微生物，尽管通常许多其它菌株也可用，例如，毕赤酵母。例如，对于酿酒酵母中表达，例如常用质粒YRp7（Stinchcomb等人，Nature，282：（1979），39；Kingsman等人，Gene，7：（1979），141；Tschemper等人，Gene，10：（1980），157）。该质粒已含有TRP1基因，其提供对缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株的选择标记，如ATCC44076或PEP4-1（Jones，Genetics，85：（1977），12）。作为酵母宿主细胞基因组的特征，trpl的损坏通过在缺乏色氨酸的环境下的生长为检测转化提供了一个有效的环境。
[0215] 在昆虫系统中，夜蛾核型多角体病毒（AcNPV）通常用作载体来表达外源基因。该病毒生长在草地夜蛾细胞中。该抗体编码序列可以单独地被克隆到病毒的非必需区域（例如多角体蛋白基因）并且处于AcNPV启动子（例如多角体蛋白启动子）的控制下。
[0216] 一旦本发明的抗体分子已经重组表达，本发明的所有抗体、它们的二聚体、单个轻链和重链、或其它免疫球蛋白形式可按照本领域的标准过程纯化，该标准过程包括例如通过层析（如离子交换、亲合，尤其是通过用于蛋白质A后的特异性抗原的亲合，和分级柱层析）、离心、差别溶解度，例如硫酸铵沉淀、或任何用于蛋白纯化的标准技术，参见，例如，范围，“Protein Purification”，Springer Verlag，N.Y.（1982）。可替换地，优选地用于增加本发明的抗体的亲和力的方法公开于美国专利出版物2002-0123057A1中。
[0217] V.融合蛋白及其缀合物
[0218] 在某些实施例中，抗体多肽包括氨基酸序列或一种或多种通常不是抗体相关的部分。下面更详细地描述了示例性的修饰。例如，本发明的单链fv抗体片段可以包括一个柔性接头序列或者可以被修改以增加一个功能部分（例如，PEG、药物、毒素、标记例如荧光、放射性元素、酶、核磁、重金属等）。
[0219] 本发明的抗体多肽可包括、基本上由或由融合蛋白组成。融合蛋白是嵌合分子，该嵌合分子包括例如具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白SOD1-结合结构域，和至少一个异源部分，即通常不与其天然连接的部分。该氨基酸序列正常情况下存在于不同的蛋白质中，并在融合多肽中结合在一起了；或者在正常情况下它们位于同一蛋白质中，但在融合多肽中有了新的排列。融合蛋白可以通过，如化学合成，或制造和翻译其中肽区按所需关系加以编码的多核苷酸而产生。
[0220] 术语“异源的”可以应用到多核苷酸或多肽，意思是指多核苷酸或多肽衍生自一种实体，该实体截然不同于正被比较实体的其余部分。例如，本文所用的融合至抗体或抗原-结合片段、变体、或其类似物上的“异源多肽”来源于相同物种的非免疫球蛋白多肽，或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
[0221] 正如在此文别处详细讨论的那样，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体、或其衍生物可进一步重组融合至异源多肽N-或C-末端或化学缀合（包括共价和非-共价缀合）至多肽或其它组合物。例如，抗体可重组融合或缀合至在检测测定中用作标记的分子和效应分子如异源多肽、药物、放射性核素或毒素，参见，例如国际申请WO92/08495；WO91/14438；WO89/12624；美国专利5，314，995；和欧洲专利申请EP0396387。
[0222] 本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物可由通过肽键或修饰的肽键，即肽等配物互相连接的氨基酸组成，且可含有20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。抗体可以被自然过程例如翻译后加工修饰，或被本领域技术人员公知的化学修饰技术所修饰。这些修饰方法在基础课本、更为详细的专著、及大量文献中有很好的描述。修饰可以发生在抗体内的任何地方，包括多肽主链，氨基酸侧链，以及氨基端或羧基端、或碳水化合物部分。可以理解同样类型的修饰可以相同或不同程度地出现在给定抗体的多个位置。此外，给定抗体可以含有许多类型的修饰。例如，抗体可因遍在蛋白化作用而可能是分枝状的，它们可能是有或没有分枝的环状。循环的、分枝化的以及分枝循环的抗体可以由于翻译后自然加工所致，也可以由合成方式产生。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血素分子的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基、共价交联形成、半胱氨酸形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化、γ羧化、糖基化、GPI锚着形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移-RNA介导的蛋白质中插入氨基酸例如精氨酰化，以及遍在蛋白化，参见，例 如，Proteins-Structure And Molecular Properties，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York2nd Ed.,(1993);Posttranslational Covalent Modification Of Protein，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press,New York，纽约，pgs.1-12（1983）；Seifter等人，Meth.Enzymol.182（1990），626-646；Rattan等人，Ann.NY Acad.Sci.663（1992），48-62）。
[0223] 本发明还提供了融合蛋白，该融合蛋白包括抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物，和异源多肽。在一个实施例中，本发明的融合蛋白包括、基本由或由下列组成，具有本发明的抗体的任何一个或多个VH区域的氨基酸序列或本发明的抗体的任何一个或多个VL区域的氨基酸序列的多肽或其片段或变体，和异源多肽序列。在另一个实施例中，用于在本文所公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白包括、基本由、或由下列组成，具有抗体或片段、变体或衍生物的任何一个、两个、三个VH-CDRs的氨基酸序列的多肽或抗体或片段，变体或衍生物的任何一个、两个、三个VL-CDRs的氨基酸序列的多肽和异源多肽序列。在一个实施例中，融合蛋白包括具有本发明的抗体或其片段、衍生物或变体的VH-CDR3的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列，融合蛋白特异性地结合到SOD1上。在另一个实施力中，融合蛋白包括具有本发明的抗体或其片段、衍生物或其变体的至少一个VH区域的氨基酸序列和本发明的抗体的至少一个VL区域的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。优选地，融合蛋白的VH和VL区域对应于特异性结合SOD1的单个源抗体（或scFv或Fab片段）。在另一个实施例中，用于在本文所公开的诊断和治疗方法中使用的融合蛋白包括具有抗体的任何一个、两个、三个或多个VH CDRs的氨基酸序列，和抗体或其片段或变体的任何一个、两个、三个或多个VLCDRs的氨基酸序列的多肽，和异源多肽序列。优选地，两个、三个、四个、五个、六个或多个VH-CDR（s）或VL-CDR（s）对应于本发明的单个源抗体（或scFv或Fab片段）。编码这些融合蛋白的核酸分子也包含在本发明中。
[0224] 文献中报道的示例性融合蛋白包括融合的T细胞受体（Gascoigne等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84（1987），2936-2940；CD4（Capon等人，Nature337（1989），525-531；Traunecker等人，Nature339（1989），68-70；Zettmeissl等人，DNA Cell Biol.USA9（1990），
347-353；和Byrn 等 人，Nature344（1990），667-670）；L-selectin（homing receptor）（Watson等人，J.Cell.Biol.110（1990），2221-2229；和Watson等人，Nature349（1991），
164-167）；CD44（Aruffo等人，Cell61（1990），1303-1313）；CD28和B7（Linsley等人，J.Exp.Med.173（1991），721-730）；CTLA-4（Lisley等人，J.Exp.Med.174（1991），561-569）；CD22（Stamenkovic等人，Cell66（1991），1133-1144）；TNF receptor（Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88（1991），10535-10539；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27（1991），
2883-2886；和Peppel等人，J.Exp.Med.174（1991），1483-1489（1991）；和IgE receptor a（Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.115（1991），AbstractNo.1448）。
347-353；和Byrn 等 人，Nature344（1990），667-670）；L-selectin（homing receptor）（Watson等人，J.Cell.Biol.110（1990），2221-2229；和Watson等人，Nature349（1991），
164-167）；CD44（Aruffo等人，Cell61（1990），1303-1313）；CD28和B7（Linsley等人，J.Exp.Med.173（1991），721-730）；CTLA-4（Lisley等人，J.Exp.Med.174（1991），561-569）；CD22（Stamenkovic等人，Cell66（1991），1133-1144）；TNF receptor（Ashkenazi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88（1991），10535-10539；Lesslauer等人，Eur.J.Immunol.27（1991），
2883-2886；和Peppel等人，J.Exp.Med.174（1991），1483-1489（1991）；和IgE receptor a（Ridgway和Gorman，J.Cell.Biol.115（1991），AbstractNo.1448）。
[0225] 如本文别处所讨论的那样，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体、或其衍生物使用本领域已知的方法可以与异源多肽融合以增加多肽在体内的半衰期或用于免疫测定。例如，在一个实施例中，PEG可与本发明的抗体缀合以增加它们在体内的半衰期；参见，例如，Leong等人，Cytokin16（2001），106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54（2002），531；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions30（2002），512.
[0226] 此外，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物可以与标记序列如肽融合以便于它们的纯化或检测。在优选的实施例中，标记氨基酸序列可以是六个组氨酸的肽（HIS），如在pQE载体（QIAGEN，Inc.，9259Eton Avenue，Chatsworth，Calif，91311）中提供的标签等，其中的许多是商业上可获得的。如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86（1989），821-824所述，例如，六个组氨酸为所述融合蛋白提供了简便的纯化。用于纯化的其它的肽标记包括但不限于“HA”标记，其对应于来自流感血凝素蛋白（Wilson等人，Cell37（1984），767）的一个表位和“flag”标记。
[0227] 融合蛋白可以使用本领域熟知的方法来制备，参见例如美国专利5，116，964和5，225，538。可根据经验选择融合的精确位点以优化融合蛋白的分泌或结合特性。然后，将编码融合蛋白的DNA转染到宿主细胞中进行表达。
[0228] 本发明的抗体可以用在非共轭的形式，或结合于至少多个分子中的一个，例如以改善分子的治疗性能，便于目标检测，或用于患者的成像或治疗。当进行纯化时，在纯化之前或之后，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体、或其衍生物可以是标记的或共轭的。特别地，本发明的抗体或抗原-结合片段、变体、或其衍生物可以与治疗剂、前体药物、肽、蛋白质、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药物剂、或PEG结合。
[0229] 免疫毒素的缀合物，其包括传统抗体，已经在现有技术中广泛描述。该毒素可通过传统的耦合技术耦合到抗体或含有蛋白毒素部分的免疫毒素可以作为融合蛋白来生产。本发明的抗体可用相应的方法来获得这样的免疫毒素。这种免疫毒素的例子是由Byers，Seminars Cell.Biol.2（1991），59-70和Fanger，Immunol.，Today12（1991），51-54描述的那些例子。
[0230] 本领域的技术人员应知道根据所选的共轭的药剂可通过很多技术制备缀合物。例如，带有生物素的缀合物可以通过例如SOD1结合多肽与如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯等生物素活性酯反应来制备。类似地，与荧光标记的缀合物可以在有偶联剂如本文所列的那些偶联剂的存在下进行制备，或通过与异硫氰酸酯优选异硫氰酸荧光素反应而制备。本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物的缀合物按照类似的方式制备。
[0231] 本发明进一步包括与诊断剂或治疗剂结合的本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物。诊断上抗体可用于，例如，证明神经变性疾病的存在以指示患上神经变性疾病的风险，以监测神经变性疾病的发展或恶化，即，一种疾病，其显示出错折叠的/聚合的SOD1的发生或与之相关，作为临床检测方法的一部分，来例如，确定给定的治疗和/或预防疗法的功效。可将抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物与可检测的物质相偶联以使检测易于进行。可检测的物质的例子包括各种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质、使用了各种正电子发射X线断层摄影术的正电子发射金属，和非放射性顺磁金属离子，对于本发明所述的可以与用作诊断剂的抗体结合的金属离子参见美国专利4，741，900。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶，或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；合适的荧光物质的例子包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的例子包括鲁米诺；生物发光物质的例子包括萤光素酶、萤光素和水母
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发光蛋白；而合适的放射性物质的例子包括 I，I， In或 Tc。
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发光蛋白；而合适的放射性物质的例子包括 I，I， In或 Tc。
[0232] 抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物也可以通过将其偶联至化学发光的化合物而可检测地标记。检测在化学反应过程中产生的光就可以确定化学发光标记的抗体。特别有用的化学发光化合物例如是鲁米诺、异鲁米诺、染色吖啶翁酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯。
[0233] 本发明的抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物能够可检测地标记的一种方法是将其与酶相连并使用连接的产物用于酶免疫测定（EIA）（Voller，A.，"The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)"Microbiological Associates Quarterly Publication，Walkersville，Md，Diagnostic Horizons2（1978），1-7）；Voller 等 人，J.Clin.Pathol.31（1978），507-520；Butler，Meth.Enzymol.73（1981），482-523；Maggio，E.（ed.），Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，Fla.（1980）；Ishikawa，E.等人，（编），Enzyme Immunoassay，Kgaku Shoin，Tokyo（1981）。酶与抗体结合时，其又将以这样一种方式与适当的底物优选为发色的底物反应以便产生一能够被，例如分光光度法、荧光法或目测等方法，检测到的化学分子部分。可用于可检测地标记抗体的酶包括但不局限于：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸、脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，检测的方法可用比色法，这种方法给酶配一显色底物。也可通过目测法比较底物与用类似方法制备的标准物的酶反应程度，即可进行检测。
[0234] 还可用任何其它免疫测定法作检测。例如，通过放射性标记抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物，可以使用放射免疫分析（RIA）（参见，例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques,The Endocrine Society,(March,1986)，可用于检测抗体，其在此引入作为参考）来检测抗体。放射性同位素可以通过包括但不限于γ粒子计数器、闪烁计数器或放射自显影术的方式检测。
[0235] 抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物还可以利用发荧光金属例如152EU或者其它的镧系进行可检测地标记。这些金属可以利用金属螯合基团例如二乙烯三胺五乙酸（DTPA）或者乙二胺四乙酸（EDTA）来附着于抗体。
[0236] 用来连接各种分子到抗体或抗原-结合片段、变体或其衍生物上的技术是本领域技术人员所熟知的，参见，例如，Arnon等人，“在癌症治疗中用于药物的免疫目的的单克隆抗体”，在单克隆抗体和癌症治疗中，Reisfeld等人.（编），pp.243-56（Alan R.Liss，Inc.（1985）；Hellstrom等人，“用于药物传送的抗体”，在控制药物传送中，（第二版），Robinson等人，（编），MarcelDekker，Inc.，pp.623-53（1987）；Thorpe，“癌症治疗中的细胞毒性剂的抗体载体:A Review”，在单克隆抗体'84:生物和临床应用，Pinchera等人.（编），pp.475-506（1985）；“分析,结果和在癌症治疗中利用放射性同位素标记的抗体来治疗的未来预期”，在用于癌症检测和治疗的单克隆抗体中,Baldwin等人.（编），学术出版社pp.303-16（1985），和Thorpe等人，“抗体毒素缀合物的制备和细胞毒性特性”，白喉破伤风百日咳菌苗.Rev.62（1982），119-158。
[0237] 如上所述，在某些实施例中，提高结合分子例如结合多肽例如抗体或免疫特异性片段的稳定性或功效的部分是共轭的。例如，在一个实施例中，PEG可与本发明的结合分子缀合以增加它们在体内的半衰期；Leong等人，Cytokine16（2001），106；Adv.in Drug Deliv，Rev.54（2002），531；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions30（2002），512。
[0238] VI.组合物及使用方法
[0239] 本发明涉及组合物，该组合物包括上述的SOD1结合分子，例如，本发明的抗体或抗原-结合片段、衍生物或变体，或本发明的多核苷酸、载体或细胞。本发明的组合物还可包括药物可接受的载体。此外，本发明的药物组合物还可以包括试剂，如诸如白细胞介素或干扰素，取决于药物组合物的预期用途。在治疗神经变性疾病时示出了错误折叠/聚集的SOD1疾病的发生或相关，例如，肌萎缩性侧索硬化、老年痴呆症或帕金森症，附加的试剂可以从基团中选出，该基团由小有机分子、抗-SOD1抗体及其他们的组合组成。因此，在特定优选的实施例中，本发明涉及SOD1结合分子的使用，例如本发明的抗体或抗原-结合片段，或具有基本上相同的结合特异性的结合分子的使用，本发明的多核苷酸、载体或细胞用于制备对神经变性疾病的预防和治疗处理的药物或诊断组合物监测神经变性疾病或在受试者中对神经变性疾病治疗时的应答的进程或用于确定患者患上神经变性疾病的风险。
[0240] 因此，在一个实施例中，本发明涉及一种治疗神经变性疾病的方法，该神经变性疾病的特征在于脑中的和中枢神经系统中的SOD1的异常的聚集和/或沉积，该方法包括给予需要治疗的对象治疗有效量的任何一种上述的本发明的SOD1结合分子、抗体、多核苷酸、载体或细胞。术语“神经变性疾病”包括但不限于此类疾病，如肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏疾病（AD）、肌萎缩性侧索硬化/帕金森病 痴呆综合症（ALS-PDC）、唐氏综合症和帕金森疾病（PD）。术语“神经-肌肉病症”包括但不限于此类疾病，如肌萎缩性侧索硬化（ALS）。除非另有说明，否则术语神经变性和神经性可互换地使用。限于肌萎缩性侧索硬化的描述，术语神经变性、神经性和神经-肌肉可互换地使用。
[0241] 本发明的治疗方法的一个特别优点在于一个这样的事实，即本发明的抗体来源于健康的人类受试者的B细胞或B记忆细胞，该健康的人类受试者没有发生如ALS的相关错误折叠/聚集的SOD1的疾病的迹象，因此，伴有一定的可能性，能够预防与错误折叠/聚集的SOD1相关的临床表现的疾病，或消除临床表现的疾病发生的风险，或延缓临床表现的疾病的发作或恶化。通常地，本发明的抗体也已经成功的变成成熟的体细胞，即相对于选择性和有效性的优化通过抗体的可变区域的体细胞变化以高亲和力结合到目标SOD1分子上。
[0242] 这种知识也具有很大的医学重要性，所述知识即在体内的细胞，例如在人体内的细胞，就自动免疫生物学或变应性的反应而言没有通过相关的或其它生理蛋白或细胞结构被激活，因为这意味着显著增加在临床测试中成功存活的机会。可以说，在至少一个人类受试者中的预防性或治疗性抗体的临床前和临床开发之前已经阐述了效率、可接受性和耐受性。因此，可以期望的是，本发明的人类抗-SOD1抗体的两个靶细胞的结构特异性功效可以作为治疗试剂，其副作用的可能性的降低显著地增大了其临床的成功可能性。
[0243] 本发明还提供了包括一个或多个装有一种或多种上述成分（例如本发明的抗-SOD1抗体、结合片段、衍生物或其变体、多核苷酸、载体或细胞）的容器的药物和诊断包装或试剂盒。与这类容器有关的可以是一个用药须知，由政府机构撰写，所述机构管理药物或生物制品的制造、使用或销售，用药须知反映了人体用药的制备、使用或销售的管理机构的许可。另外或可替换地，试剂盒包括在适当的诊断试验中使用的试剂和/或使用说明。组合物，例如本发明的试剂盒当然特别适合于对伴随有错误折叠/聚集的SOD1的情况下的疾病的风险评估、诊断、预防和治疗，并且特别可用于治疗例如肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏疾病（AD）、肌萎缩性侧索硬化/帕金森–痴呆综合症（ALS-PDC）、唐氏综合症和帕金森疾病（PD）。
[0244] 本发明的药物组合物可以根据本领域中熟知的技术来制备，参见例如，The Science and Practice of Pharmacy（2000）Remington:the University of Sciences in Philadelphia，ISBN0-683-306472。本领域熟知的合适的药物载体例子包括磷酸盐缓冲溶液、水、乳剂如油/水乳剂、各种类型的增湿剂、灭菌溶液等。包括这种载体的组合物可通过熟知的常规方法制成。可以合适的剂量将这些药物组合物给予受试者。施用合适的组合物可通过不同的方式实现，例如，通过静脉注射、腹腔注射、皮下注射、肌肉注射、鼻内给药、局部或真皮内给药或脊髓或脑递送。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包括纯化水溶液或其它具有防腐剂和等渗剂的活性剂溶液。此类制剂优选地将pH和等渗状态调整到与鼻粘膜相容。直肠或阴道用制剂可以制备成带有适当载体的栓剂。
[0245] 此外，本发明包括在颅骨上钻一个小孔来施用本发明的药物的现有标准（虽然幸运的是不经常的）程序，在一个优选方面，结合分子，特别是抗体或基于本发明抗体的药物可以穿过血脑屏障，其允许静脉注射或口服。
[0246] 将由主治医生和临床因素确定给药方案。众所周知，在医学领域，对于任何一个病人，剂量取决于许多因素，包括病人的体型、体表面积、年龄、施加的特定化合物、性别、时间和给药途径、一般健康和同时服用的其它药物。一个典型的剂量可以例如在0.001到1000μg的范围内（或在这个范围内是核酸表达或用于抑制表达）；然而，预期到剂量低于或高于这个范围，尤其是考虑到上述因素。一般来说，宿主体重的剂量范围可以例如从约
0.0001-100mg/kg，更通常为0.01-5mg/kg（例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg，等等）。例如剂量可以1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。在上述范围内的剂量中间物也包括在本发明的范围内。在每日，隔天，每周或根据由实证分析确定的任何其它安排下可以给予对象这类剂量。一个示例性治疗需要在很长一段时期里按多个剂量施药，例如，至少六个月。额外的示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3到6个月一次施药。示例性剂量时间表包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在某些方法中，同时给药两个或两个以上不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，施加给每个抗体的剂量在指示的范围内。可以通过定期评估监控进程。肠胃外投药的准备包括注射用无菌的水或无水溶液、悬浮液和乳液。非水溶液的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，注射有机酯如油酸乙酯。水载体包括水、酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的媒体。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液，或固定油。静脉内的媒介物包括流体和营养补充液，电解质补充液（如基于林格氏葡萄糖的那些）等。防腐剂和其它添加剂也可以存在，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，根据药品成分不同的预期用途本发明药品成分可能包括进一步的制剂，如多巴胺或精神病药理学药物。
0.0001-100mg/kg，更通常为0.01-5mg/kg（例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg，等等）。例如剂量可以1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内，优选至少1mg/kg。在上述范围内的剂量中间物也包括在本发明的范围内。在每日，隔天，每周或根据由实证分析确定的任何其它安排下可以给予对象这类剂量。一个示例性治疗需要在很长一段时期里按多个剂量施药，例如，至少六个月。额外的示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3到6个月一次施药。示例性剂量时间表包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg，隔天30mg/kg或每周60mg/kg。在某些方法中，同时给药两个或两个以上不同结合特异性的单克隆抗体，在这种情况下，施加给每个抗体的剂量在指示的范围内。可以通过定期评估监控进程。肠胃外投药的准备包括注射用无菌的水或无水溶液、悬浮液和乳液。非水溶液的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，注射有机酯如油酸乙酯。水载体包括水、酒精/水溶液，乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的媒体。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液，或固定油。静脉内的媒介物包括流体和营养补充液，电解质补充液（如基于林格氏葡萄糖的那些）等。防腐剂和其它添加剂也可以存在，例如抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，根据药品成分不同的预期用途本发明药品成分可能包括进一步的制剂，如多巴胺或精神病药理学药物。
[0247] 此外，在本发明的一个优选实施例中，制药成分可能制定为一个疫苗，例如，如果本发明的药品成分对于被动免疫包含一个抗SOD1抗体或结合片段、派生物或变体。正如在背景部分提到的，据报道，聚合的SOD1物种细胞外地存在于血浆和CSF（Gruzman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA104（2007），12524-12529）和使用带有人源化小鼠抗体主动和被动接种的在转基因小鼠线中的研究，揭示了大脑中减少的SOD1聚合脑水平，减缓行为障碍进程和延迟死亡（Urushitani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA104（2007），2495-2500）。因此，谨慎的预期本发明中人类抗-SOD1抗体的被动免疫和等效SOD1结合分子将有助于规避一些主动免疫疗法概念的不利影响，如已在背景技术部分中讨论的。因此，当前抗-SOD1抗体和本发明它们的等同物尤其将特别有效地用作疫苗，用于预防或改善显示出的疾病，所述疾病或由错误折叠/聚合的SOD1引起，例如肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默氏病（AD）、肌萎缩性侧索硬化症/帕金森病和痴呆复合症（ALS-PDC）、Down综合征或帕金森病。
[0248] 在一个实施例中，有利的是使用本发明抗体的重组双特异性或多特异性构建体。作为参考，见Fischer和Léger，Pathobiology74（2007），3-14。这样的双特异性分子可以是设计成靶向SOD1，带有一个结合臂和另一个病理实体如Aβ或者α-突触核蛋白或带有第二结合臂的SOD1病理构象。可选地，第二结合臂可以设计成靶向存在于血脑屏障的蛋白质，以便于抗体渗透进入大脑。
[0249] 在一个实施例中，有利的是使用本发明的抗体重组Fab（rFab）和单链片段（scFvs），这可能更易于透过细胞膜。例如，Robert等人，Protein Eng.Des.Sel.（2008）Oct16；S1741-0134，提前在线公开，描述了单克隆抗体WO-2的嵌合重组Fab（rFab）和单链片段（scFvs）的应用，单克隆抗体WO-2在Aβ的N末端区域识别表位。工程化片段能够（i）防止淀粉样蛋白纤维化，（ii）解聚预先形成的Aβ1-42原纤维和（iii）抑制体外Aβ1-42低聚物介导的神经毒性，像完整IgG分子一样有效。使用缺乏效应子功能的小Fab和scFv工程化抗体格式所感知的优点，包括更有效地穿过血脑屏障的通道和减少触发炎性副作用的风险。此外，除了scFv和单域抗体保留完整长度抗体的结合特异性，可以将它们表达为单一基因和哺乳动物细胞胞内的同胞内抗体，具有折叠改变、互动、修改或靶的亚细胞定位可能性，参见综述，例如Miller和Messer，Molecular Therapy12（2005），394–401。
[0250] 在不同的方法Muller等人，Expert Opin.Biol.Ther.（2005），237-241中描述称为”超级抗体技术”的技术平台，据说允许抗体穿梭融入到活细胞中，而不损害它们。这样的细胞-穿透抗体打开了诊断和治疗的新窗口。已经创造出用于这些抗体的术语”TransMabs”。
[0251] 在另一个实施方案中，可能需要同时施用或顺序施用其它抗体，用于治疗与错误折叠的/聚集SOD1发生有关的疾病。在一个实施例中，附加抗体是由本发明的药物组合物组成。抗体的例子可以用于治疗对象，包括但不限于抗体靶向β-淀粉样蛋白、α突触核蛋白、TDP-43和tau。
[0252] 在另一实施例中，可能需要同时施用或顺序施用其它抗体，用于治疗与错误折叠/聚集的SOD1发生有关的疾病。在一个实施方案中，附加药剂包含在本发明的药物组合物中。可以用于治疗对象的神经保护药剂的例子包括但不限于，乙酰胆碱酯酶抑制剂、谷氨酸能受体拮抗剂、激酶抑制剂、HDAC抑制剂、抗发炎剂、双丙戊酸钠或其它任意组合。可以用于伴随本发明药物组合物的其它神经保护剂实例在本领域有描述，参见，例如国际申请WO2007/011907。在一个实施方案中，附加药剂是多巴胺或多巴胺受体激动剂。
[0253] 治疗有效剂量或量是指足以改善症状或疾病的活性成分的量。在细胞培养物或实验动物中，这种化合物的毒性和疗效可以通过标准药学方法测定，例如LD50（使群体的50％致死的剂量）和ED50（在群体的50％中治疗有效的剂量）。治疗和毒性作用之间的剂量比率是治疗指数，并且其可以表示为比值LD50/ED50。优选地，在如下情况，例如肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏病（AD）、肌萎缩性侧索硬化/帕金森病 痴呆综合症（ALS-PDC）、唐氏综合征、帕金森病，在组合物中治疗剂的存在量足以恢复或保持正常行为和/或认知属性。
[0254] 根据如上所述，显然，本发明包括任何使用结合分子的SOD1，所述结合分子至少包括上述抗体的一个CDR，如上所述，特别是用于诊断和/或治疗与错误折叠/聚集的SOD1有关的疾病，特别是肌萎缩性侧索硬化（ALS）。优选地，所述结合分子是本发明的抗体或其免疫球蛋白链。另外，本发明涉及上文所提及的任一种抗体的抗-独特型抗体。这些是抗体或结合位于靠近抗原-结合位点的抗体可变区的独特抗原肽序列的其它结合分子，并且对于，例如，检测对象样品中的抗-SOD1抗体是有用的。
[0255] 在另一个实施方案中，本发明涉及一种诊断组合物，包含任一上述SOD1结合分子、抗体、抗原-结合片段、多核苷酸、载体或本发明的细胞以及可选的、用于检测的合适的方法，例如在基于免疫或核酸的诊断方法中常规使用的试剂。本发明的抗体是，例如，适用于在免疫测定中，其中它们可以在液相中使用或结合到固相载体。可以利用本发明抗体的免疫测定实例是以直接或间接方式地竞争性和非竞争性免疫测定。这种免疫测定的实例是放射免疫测定（RIA）、三明治（免疫测定试验）、流式细胞术和对蛋白质印迹试验。本发明的抗原和抗体可以结合到许多不同的载体，并且在此用于分离细胞特异性结合。已知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡萄聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。对于本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不可溶的。多种不同的标记物和标记方法为本领域技术人员所公知。能用于本发明的标记类型的例子包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也可参见上文讨论的实施例。
[0256] 通过进一步的实施例，SOD1结合分子、特别是本发明的抗体也可以用于个体失调的诊断方法中，所述方法通过从测试个体中获得体液样品，可以是血液样品、淋巴样品或任何其它体液样品，并在能够形成抗体-抗原复合物的条件下让体液样品与本发明的抗体接触。此类复合物的水平然后通过本领域已知的方法确定，其形成的水平显著高于指示测试个体中疾病的对照样品的水平。以相同的方式，通过本发明抗体结合的特异抗原也可以使用。因此，本发明涉及体外免疫测定，其包括结合分子，例如，本发明的抗体或抗原-结合片段。
[0257] 在本文中，本发明还涉及为此目的而特别设计的装置。例如，可以使用基于抗体的阵列，例如加载有本发明特异识别SOD1的抗体或等效抗原-结合分子。在Kusnezow等人，Mol.Cell Proteomics5（2006），1681-1696中总结了微阵列免疫测定的设计。因此，本发明也涉及微阵列，其加载有根据本发明识别的SOD1结合分子。
[0258] 在一个实施方案中，本发明涉及在患者中一种诊断涉及错误折叠/聚集的SOD1的疾病的方法，所述方法包括确定SOD1和/或错误折叠和/或聚集的SOD1的在一个样品中的存在，所述样品来自被诊断的具有至少一个本发明中的抗体的患者，一个SOD1结合片段或SOD1结合分子，具有任何一种化合物基本相同的结合特异性，其中病理性错误折叠和/或聚集的SOD1的存在指示神经变性失调，且较生理SOD1二聚体形式的水平而言病理性错误折叠和/或聚集的SOD1水平的提高指示患者中神经变性失调的进展。
[0259] 待诊断受试者的疾病可能没有症状或处于潜伏期。优选的是，对照受试者患有涉及错误折叠/聚集的SOD1的疾病，例如，肌萎缩性侧索硬化、阿尔茨海默氏病（AD）、肌萎缩性侧索硬化/帕金森病-痴呆综合症（ALS-PDC）、唐氏综合征或帕金森病，其中，病理性错误折叠和/或聚集的SOD1和参考标准之间的水平的相似性表明待诊断患者患有神经变性疾病。可替换地，或另外，作为第二对照，对照患者未患神经变性疾病，其中，生理的SOD1二聚物和/或病理性错误折叠和/或聚集的SOD1和参考标准的水平之间的差异表明待诊断受试者患有神经变性疾病。优选地，待诊断受试者和对照受试者按年龄匹配。待分析的样品可以是怀疑含有病理性错误折叠和/或聚集的SOD1的任何体液，例如血液、CSF、或尿液样品。
[0260] 生理SOD1二聚物和/或病理性错误折叠和/或聚集的SOD1的水平可通过本领域已知的任何合适方法评估，这些方法包括：例如，通过一种或多种技术分析SOD1，包括蛋白质印迹、免疫沉淀法、酶联免疫吸附试验（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）、荧光激活细胞分类术（FACS）、双向凝胶电泳、质谱（MS）、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质（MALDI-TOF）、表面增强的激光解吸电离-飞行时间（SELDI-TOF）、高效液相色谱（HPLC）、快速蛋白液相色谱法（FPLC）、多维液相色谱法（LC），还有串联质谱（MS/MS）和激光密度测定法。优选地，SOD1的体内显像包括正电子发射断层显像（PET）、单光子发射断层显像（SPECT）、近红外（NIR）光成像或磁共振成像（MRI）。
[0261] 基于抗体的方法用于检测SOD1和诊断或监测与错误折叠/聚集SOD1例如ALS有关疾病的发展，使用抗体和相关的装置监测这种疾病的治疗，该装置可适于遵照本发明，也描述于国际专利申请WO2007/098607和WO2007/025385，发明所公开的所有内容引入本文以作参考。可以如描述的那样来采用这些方法，但是使用本发明的SOD1特异性抗体、结合片段、衍生物或变体。
[0262] VII.带有构象特异性SOD1表位的肽
[0263] 在另一方面，本发明涉及肽，其具有本发明的任何抗体特异识别的SOD1的表位。优选地，这种肽包含或由如下所示的氨基酸序列组成：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58或者SEQ ID NO:59，或者修饰的序列，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加，其中肽可以为本发明的任何抗体所识别，所述抗体优选地为NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8、NI-204.11F11、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3和抗体NI-204.25H3。
[0264] 在本发明一个实施例中，这样的肽可以在受试者中用于诊断与错误折叠/聚集的SOD1例如ALS相关的疾病，包括如下步骤：在所述受试者的生物样品中确定与肽结合的抗体的存在，并通过测量识别本发明上述肽的抗体水平和比较可比较年龄和性别的健康个体中发现的测量水平，用于在受试者中诊断该疾病。特异于本发明所述肽的测定抗体的升高水平将在受试者中指示诊断与错误折叠/聚集的SOD1有关的疾病。如前文所述，本发明的肽可以分别配制在阵列、试剂盒和组合物。
[0265] 这些和其它实施方案是公开的，并包含在本发明的描述和实施例中。使用例如电子设备可从公共图书馆和数据库检索到关于根据本发明使用的任何一种材料、方法、用途和化合物的其它文献。例如可利用由在美国国立卫生研究院的美国国家生物技术信息中心和/或美国国立医学图书馆拥有的公共数据库“Medline”。例如为欧洲分子生物学实验室（EMBL）的部分的欧洲生物信息研究所（EBI）的数据库和网址对本领域技术人员来说是已知的，并且也可通过使用国际互联网检索引擎获得。在Berks，TIBTECH12（1994），352-364中提供了生物技术学的专利信息的综述和用于回顾搜索和最新文献通报的专利信息的相关来源的纵览。
[0266] 上述公开内容一般性地描述了本发明。除非另有说明，本文所用术语是由《牛津生物化学和分子生物学字典》，牛津出版社，1997年，2000年修订，2003再次印刷，ISBN0198506732所提供的定义。在本说明书的正文中引用了一些文献。在说明书末尾和权利要求书前面可发现完整的文献目录引用。所有引用的参考资料（包括在整个本申请中引用的文献来源、发行的专利、公布的专利申请书和厂商的详述、技术说明书等）的内容明确地在此引用作为参考；然而，不承认引用的任何资料对于本发明确实是现有技术。
[0267] 可通过参考下列特定的实施例获得更完全的理解，所述实施例在此处只是为了说明而提供，从而不希望限定本发明的范围。
[0268] 实施例
[0269] 本发明下面的实施例进一步说明本发明，但是不应以任何方式对本发明的范围进行限制。实施例1至7中的实验的展示和描述相关于抗体NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8、NI-204.9F6、NI-204.11F11、NI-204.67E12、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3和NI-204.25H3作为克隆的，例如不用调节到人可变重链和轻链的种系（GL）序列的框架1（FR1）Ig-可变区；参见图1。
[0270] 材料和方法
[0271] 常规方法例如此处所用的方法的详细描述可见于引用的文献中；还可参见Beers和Berkow编著的”The Merck Manual of and Therapy”，第七版（Merck&Co.，Inc.2003）。
[0272] 除非另外指出，本发明的实践将使用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围之内。为了进一步详细描述本发明实践中使用的一般技术，从业者可参考细胞生物学和组织培养的标准教科书和综述；也可参见实施例中列举的参考文献。分子和细胞生物化学一般方法可以在标准教科书中找到，如分子克隆：实验室手册，第三版（Sambrook等人，海港实验室出版社，2001）；精编分子生物学实验指南，第4版（Ausubel等编，John Wiley&Sons1999）；DNA克隆，卷I和卷II（Glovered编，1985）；寡核苷酸合成（Gait编，1984）；核酸杂交（Hames和Higgins编，1984）；转录和翻译（Hames和Higgins编，1984）；动物细胞培养（Freshney和Alan，Liss，Inc.，1987）；哺乳动物细胞的基因转移载体（Miller和Calos编）；分子生物学现代实验指南和精编分子生物学实验指南，第3版（Ausubel等人编）；
重组DNA方法（Wu编，学术出版社）。哺乳动物细胞的基因转移载体（Miller和Calos编著，
1987，冷泉港实验室）；酶学方法，卷154和卷155（Wu等人编）；固定化细胞和酶（IRL出版社，
1986）；Perbal，分子克隆应用指南（1984）；论文，酶学方法（学术出版社，Inc.，N.Y.）；细胞免疫化学方法和分子生物学（Mayer和Walker编，学术出版社，伦敦，1987）；实验免疫学手册、卷I-IV（Weir和Blackwell编，1986）。蛋白方法（Bollag等人，John Wiley&Sons1996）；
用于基因治疗的非病毒载体（Wagner等编，学术出版社，1999）；病毒载体（Kaplitt&Loewy编，学术出版社，1995）；免疫学方法手册（Lefkovits编，学术出版社，1997）；细胞和组织培养生物技术实验流程（Doyle&Griffiths，John Wiley和Sons，1998）。本公开中提到的基因操作的试剂、克隆载体和基因操作试剂盒可从商业供应商例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech中获得。细胞培养和媒介收集的一般性技术概述于大规模哺乳动物细胞培养中（Hu等人，Curr.Opin.Biotechnol.8（1997），148）；血清培养基（Kitano，生物技术17（1991），73）；大规模哺乳动物细胞培养（Curr.Opin.生物技术2（1991），375）；哺乳动物细胞悬浮培养（Birch等人，生物处理工艺19（1990），251）；从cDNA阵列中提取信息，Herzel等人，CHAOS11（2001），98-107。
重组DNA方法（Wu编，学术出版社）。哺乳动物细胞的基因转移载体（Miller和Calos编著，
1987，冷泉港实验室）；酶学方法，卷154和卷155（Wu等人编）；固定化细胞和酶（IRL出版社，
1986）；Perbal，分子克隆应用指南（1984）；论文，酶学方法（学术出版社，Inc.，N.Y.）；细胞免疫化学方法和分子生物学（Mayer和Walker编，学术出版社，伦敦，1987）；实验免疫学手册、卷I-IV（Weir和Blackwell编，1986）。蛋白方法（Bollag等人，John Wiley&Sons1996）；
用于基因治疗的非病毒载体（Wagner等编，学术出版社，1999）；病毒载体（Kaplitt&Loewy编，学术出版社，1995）；免疫学方法手册（Lefkovits编，学术出版社，1997）；细胞和组织培养生物技术实验流程（Doyle&Griffiths，John Wiley和Sons，1998）。本公开中提到的基因操作的试剂、克隆载体和基因操作试剂盒可从商业供应商例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech中获得。细胞培养和媒介收集的一般性技术概述于大规模哺乳动物细胞培养中（Hu等人，Curr.Opin.Biotechnol.8（1997），148）；血清培养基（Kitano，生物技术17（1991），73）；大规模哺乳动物细胞培养（Curr.Opin.生物技术2（1991），375）；哺乳动物细胞悬浮培养（Birch等人，生物处理工艺19（1990），251）；从cDNA阵列中提取信息，Herzel等人，CHAOS11（2001），98-107。
[0273] SOD1特异性B细胞的识别和相应抗体的克隆的方法
[0274] 除非下面另有说明，通常执行SOD1特异性B细胞的识别和抗SOD1抗体的分子克隆，抗SOD1抗体显示感兴趣的特异性以及它们的重组表达和功能表征，如公布为WO2008/081008的国际申请PCT/EP2008/000053的实施例和补充方法部分所述，其公开内容在此引入作为参考。在本申请内提供了一种新的方法用于鉴定SOD1特异性B细胞和SOD1抗体的分子克隆，SOD1抗体显示出感兴趣的特异性以及它们的重组表达和功能表征。如上在一个实施例中所述，本发明的单个或寡克隆B-细胞培养物进行培养，培养物的上清液含有B细胞生产的抗体，上清液筛选出其中新抗-SOD1抗体的存在性和亲和力。筛选方法包括以下步骤：生物敏感组织淀粉样蛋白斑免疫活性（TAPIR）试验如WO2004/095031所述，其公开内容的全文以引用的方式并入本文中；在转基因小鼠脊髓组织上筛选，转基因小鼠表达SOD1病理聚集体的突变人类SOD1形式，如实施例4和图6所示；筛选衍生自SEQ ID NO:1代表的氨基酸序列的SOD1的肽的结合，类似如在实施例5和图7所示，肽归因于抗体NI-204.10D12的表位确认实验；筛选用于结合SEQ ID NO:1所代表的氨基酸序列的完全长度的SOD1，并且分离抗体，其中检测到结合或细胞产生所述抗体，如国际专利WO2008/081008，和实施例1和图2、5和7所述。
[0275] SOD1抗原
[0276] 重组人类SOD1购自biomol（汉堡，德国）。如果没有另外提及，来自人类红细胞的野生型SOD1（生理二聚物）以及所有其它的试剂都购自Sigma-Aldrich（布赫斯，瑞士）。
[0277] 人类SOD1抗体筛选
[0278] 酶联免疫吸附测定：
[0279] 96孔微量培养板（康宁）通过重组人类SOD1（biomol，汉堡，德国）或与BSA（Sigma-Aldrich，布赫斯，瑞士）进行包被，稀释至浓度为包被缓冲液（15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.42和pH9.6）中3.3μg/ml或5μg/ml，在4℃，过夜。可替换地，使用96孔微量培养板（康宁）包被有体外氧化的人类SOD1，其在包被缓冲液（15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.42）中的浓度为34μg/ml。在PBS-T pH7.6中洗涤平板，非-特异性结合位点被封闭1小时，在室温下用PBS/0.1％的包含2％的BSA（Sigma-Aldrich，布赫斯，瑞士）的吐温-20。B细胞条件培养基从记忆B细胞条件培养基转移到ELISA平板中，并在室温下温育1小时。
在PBS-T中洗涤ELISA平板,结合的测定使用辣根过氧化物酶（HRP）-偶联抗-人免疫球蛋白多克隆抗体（Jackson ImmunoResearch，Newmarket，UK），随后在标准的比色测定中测定HRP的活性。仅已经显示出抗体的结合的B细胞培养物进行抗体克隆，所述抗体包含在介质中以重组SOD1而非BSA。
在PBS-T中洗涤ELISA平板,结合的测定使用辣根过氧化物酶（HRP）-偶联抗-人免疫球蛋白多克隆抗体（Jackson ImmunoResearch，Newmarket，UK），随后在标准的比色测定中测定HRP的活性。仅已经显示出抗体的结合的B细胞培养物进行抗体克隆，所述抗体包含在介质中以重组SOD1而非BSA。
[0280] 多阵列 微量培养板筛选
[0281] 在PBS中，标准96孔10-光斑多光斑板（Meso Scale Discovery，USA）上涂覆30μg/ml的SOD1（biomol，汉堡，德国）。非特异性结合位点是在室温下封闭1小时，用含有3％BSA的PBS-T，接着使用B细胞条件培养基培养，在室温下1小时。在PBS-T中洗涤平板，然后用结合抗-人类多克隆抗体的磺基-标记温育（Meso Scale Discovery，USA）。
用PBS-T洗涤后，通过使用扇区成像器6000的电致化学发光测量，检测到抗体结合（Meso Scale Discovery，USA）。
用PBS-T洗涤后，通过使用扇区成像器6000的电致化学发光测量，检测到抗体结合（Meso Scale Discovery，USA）。
[0282] SOD1抗体的分子克隆
[0283] 含有记忆B细胞的样品获自健康人体对象。收获选择性记忆b细胞培养物的活体B细胞，并且制备mRNA。然后通过使用嵌套PCR方法获取免疫球蛋白重链和轻链序列。
[0284] 引物的组合代表人免疫球蛋白种系所有组成成分的全部序列家族，用于前导肽、V段和J段的扩增。使用在5’端前导肽-特异性引物和在3’端恒定区-特异性引物进行第一轮扩增（Smith等人，Nat Protoc.4（2009），372-384）。对于重链和K轻链，在5’端使用V-片段-特异性引物，并在3’端使用J段-特异性引物，进行第二轮扩增。对于λ轻链，在5’端使用v-片段-特异性引物，并在3’端使用C-区-特异性引物，进行第二轮扩增（Marks等人，Mol.Biol.222（1991），581-597；de Haard等人，J.Biol.Chem.26（1999），18218-18230）。
[0285] 对于拥有理想的特异性的抗体克隆的鉴定是通过完全抗体的重组表达在ELISA上完成。当将抗体可变重链和轻链序列“在正确的阅读框”插入进表达载体时，实现完整的人IgG1抗体或嵌合IgG2a抗体的重组表达，该表达载体补足可变区序列，通过在5’端码前导肽的序列和3’端编码适当的恒定区的序列，。为此，引物包含限制性位点设计用以促进可变重链和轻链序列的克隆进入抗体表达载体。重链免疫球蛋白的表达通过将框架中的免疫球蛋白重链RT-PCR产品插入重链表达载体，其中承载有信号肽和人免疫球蛋白γ1或小鼠免疫球蛋白γ2a的恒定区。通过将框架内的κ轻链RT-PCR-产品插入到提供信号肽的轻链表达载体，κ轻链免疫球蛋白得到表达，通过将框架内的λ轻链RT-PCR产品插入λ轻链表达载体，人κ轻链免疫球蛋白λ轻链免疫球蛋白的恒定区得到表达，其中λ轻链表达载体提供信号肽和人或小鼠λ轻链免疫球蛋白的恒定区。
[0286] 在共转染到Ig-重链表达载体和κ或λIg-轻-链表达载体的HEK293或CHO细胞（或任何其它人或小鼠源合适接受的细胞系）后，获得功能性重组单克隆抗体。重组人单克隆抗体随后从使用标准蛋白A柱纯化的条件培养基中纯化。重组人单克隆抗体可以在使用瞬时或稳定转染细胞无限量产生。直接利用Ig表达载体或通过Ig可变区重新克隆分成不同的表达载体，可以建立产生重组人单克隆抗体的细胞系。衍生物如F（ab）、F（ab）2和scFv也可以从这些Ig可变区产生。
[0287] 抗体
[0288] 根据制造商使用协议，使用小鼠单克隆抗-SOD1抗体72B1（圣克鲁兹生物技术，圣克鲁兹，美国）和兔单克隆抗-SOD1抗体EPR1726（宜百康，伯林盖姆，美国）。本发明的抗体式重组的人或嵌合SOD1抗体是：NI-204.10D12，NI-204.10A8，NI-204.12G7，NI-204.9F6，NI-204.11F11，NI-204.67E12，NI-204.6H1，NI-204.12G3，NI-204.7G5，NI-204.7B3，NI-204.34A3和NI-204.25H3。它们在HEK293或CHO细胞中表达，从条件培养基中纯化，并且除非另有说明直接用于随后的应用中。在实施例1至4中使用本发明纯化的重组抗体。
[0289] 直接ELISA
[0290] 96孔微量培养板（Costar，康宁，美国）用稀释至浓度为3.3μg/ml的重组SOD1蛋白（biomol，Hamburg，Germany）包被，在碳酸ELISA包被缓冲液（15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.42）中，4℃过夜。非特异性结合位点封闭在室温下2小时,其中PBS含2％的BSA（Sigma-Aldrich，布赫斯，瑞士）和0.5％的吐温20。使用驴抗-人IgGγ抗体结合HRP（杰克逊，免疫研究，纽马克特，英国），测定本发明的人抗体的结合（NI-204.10D12，NI-204.9F6，NI-204.12G7和NI-204.10A8），然后在标准比色试验中进行HRP测量。通过使用GraphPad Prism软件（圣地亚哥，美国）的非线性回归，估算EC50值。
[0291] 转基因小鼠
[0292] B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠系用于确认本发明的SOD1抗体（及其具有结合特异性的分子）。
[0293] 所述转基因小鼠系对于ALS是非常好地建立和表征的小鼠模型。在这种ALS小鼠模型的脊髓中的神经病理学标志是存在富神经丝球状体，类似于在人类肌萎缩性侧索硬化中见到的，在前角和白质的前柱和侧柱中发现的频率比后角的较高，存在加厚营养不良性神经炎，其填充有免疫反应性富神经丝内含物、核周体液泡、胶质细胞增生和星形细胞增生的运动神经元退化。细胞内分散的包含物、类Lewy体包含物和细胞外聚集物（主要由超氧化物歧化酶1蛋白的异常聚集物组成）是附加的神经病理学标志。
[0294] 实施例1：人类SOD1-抗体的目标验证和结合特异性
[0295] 为了验证SOD1作为分离抗体公认的目标，如上所述进行直接的ELISA试验。对于示例性重组人NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.9F6和NI-204.10A8抗体，96孔微量培养板（Costar，康宁，美国）通过与重组人类SOD1（biomol，汉堡，德国）或与稀释至浓度为3.3μg/ml的BSA（Sigma-Aldrich，布赫斯，瑞士）进行包被，在碳酸盐ELISA包被缓冲液（15mM Na2CO3，35mMNaHCO3，pH9.42）中，并测试了抗体的亲和力。示例性NI-204.10D12，NI-204.12G7，NI-204.9F6和NI-204.10A8抗体通过ELISA特异性结合至人类SOD1。没有观察到结合至BSA；见图2。
[0296] 为了确定示例性抗体NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.9F6和NI-204.10A8的半数最大有效浓度（EC50），附加的用不同的抗体浓度的直接ELISA实验被施行。在碳酸盐ELISA包被缓冲液（15mM Na2CO3，35mMNaHCO3，pH9.42）中，96孔微量培养板（Costar，康宁，美国）通过稀释至浓度为3.3μg/ml的重组人类SOD1（biomol，汉堡，德国）进行包被，并且测试了抗体的亲和力。使用与HRP偶联的驴抗人IgGγ抗体（杰克逊免疫研究，纽马克特，英国）测定结合，随后测定标准比色试验中的HRP活性。
[0297] 通过使用GraphPad Prism软件（圣地亚哥，美国）的非线性回归，估算EC50值。重组人衍生抗体NI-204.10D12、NI-204.10A8和NI-204.12G7结合具有高亲和力，以重组分别具有10.0nM、2.7nM和0.4nM的EC50的人超氧化物歧化酶1。抗体NI-204.9F6在纳摩尔范围（104.8nM）以EC50结合重组人超氧化物歧化酶1；见图3。NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8和NI-204.9F6抗体因此适合用于家族性ALS的人衍生药物的候选物，可以在建立的过度表达超氧化物歧化酶1突变体的转基因小鼠模型中研究。
[0298] 实施例2：EC50分析用于增加人超氧化物歧化酶1（SOD1）的涂层浓度，因此优选形成构象性表位
[0299] 为了确定NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7和NI-204.9F6对于构象表位的结合能力，进行了直接ELISA实验，在包被缓冲液中使用了有四种不同的涂覆浓度（0.1；1；10或30μg/ml）的人重组SOD1（biomol，汉堡，德国）。原发抗体人NI-204.10D12、人NI-204.10A8、人NI-204.9F6和鼠单克隆抗体SOD-172B1（圣克鲁兹生物技术，圣克鲁兹，美国）稀释至指定浓度（图4）并且室温下温育1小时。使用羊抗-鼠IgG抗体（杰克逊免疫研究，纽马克特，英国）或者与HRP偶联的驴抗-人IgGγ抗体（杰克逊免疫研究，纽马克特，英国）测定结合，随后测定标准比色试验中的HRP活性。通过使用GraphPad Prism软件（圣地亚哥，美国）的非线性回归，估算EC50值。
[0300] 使用直接SOD1ELISA，测定指示抗体效力的半数最大有效浓度（EC50），用于人重组SOD1低和高的涂层浓度。观察到重组N1-N2204.10D12与24nM的EC50的高亲和性结合，用于人类SOD1蛋白的高涂层密度（10或30μg/ml）（图4A和F）。在人类SOD1较低的包覆浓度，观察到亲和力显著降低，同时NI-204.10D12的EC50相应增加接近25倍（图4A和F）。观察到重组NI-204.12G7与0.4nM的EC50的高亲和性结合，用于人类SOD1蛋白的高涂层密度（10或30μg/ml）（图4D和F）。在人类SOD1较低的包覆浓度，观察到亲和力显著降低，同时NI-204.12G7的EC50相应增加接近195倍（图4D和F）。相反，这个NI-204.10A8抗体已经在人类SOD1蛋白的低涂层密度（0.1-1μg/ml）时结合高亲和性，其中EC50分别为96nM和19nM（图4B和F）。在10μg/ml的人SOD1蛋白的涂层密度时，观察到NI-204.10A8结合亲和力进一步增加，EC50减少至2nM（图4B和F）。NI-204.9F6抗体显示对重组人类SOD1蛋白的结合性，与NI-204.10A8抗体中的非常相似（图4C）。然而，NI-204.9F6结合亲和力比NI-204.10A8抗体已确定的结合亲和力低得多（图4B、C和F）。
[0301] 市售的SOD-172B1抗体在较低的人类SOD1涂层密度时没有显示出强烈降低的结合亲合性（图4D）。
[0302] 随着人超氧化物歧化酶1涂层浓度的增加，NI-204.10D12抗体的EC50分析在SOD1高涂层浓度时显示出强亲和力增益。当在10μg/ml涂层处测量24nM的EC50，对于低密度（0.1μg/ml）SOD1涂层这个值增加接近25倍，表示了亲和力相当大的下降。类似于NI-204.10D12，NI-204.12G7抗体的EC50分析在SOD1的高涂层浓度处显示非常强的亲合力增益。当在10μg/ml涂层处测量0.4nM的EC50，对于低密度（0.1μg/ml）SOD1涂层这个值增加接近195倍，表示了亲和力相当大的下降。这些发现可能由在ELISA板上的高局部浓度处重组人类SOD1可能的自发聚集解释，指向暴露于SOD1错误折叠或聚集形成的NI-204.10D12和NI-204.12G7抗体表位。相反，在低涂层浓度（0.1μg/ml）下有高结合亲合性，在NI-204.10A8抗体的高涂层浓度下（10μg/ml）有亲和力的增益，这表明，此抗体可以识别存在于生理蛋白质构象的人类SOD1的表位。NI-204.9F6在SOD1的所有浓度下显示出较低的结合亲和力，然后NI-204.10A8在亲合性高的涂层浓度下具有少量的增益，表明这种抗体也可以识别存在于生理构造中的人类SOD1表位。
[0303] 实施例3：生理SOD1二聚体和体外错误折叠/聚集的SOD1的结合分析
[0304] 金属催化的氧化反应用于诱导体外超氧化物岐化酶1聚集物（根据Rakhit等人，J Biol Chem.279（2004），15499-504）。来自人类红细胞（二聚物）的野生型SOD1以及所有其它的试剂都购自Sigma-Aldrich（布赫斯，瑞士）。对于聚集，10μM人类SOD1在10mM三氨基甲烷乙酸盐缓冲液中温育，pH7.0，含有4mM的抗坏血酸和0.2mM的CuCl2，在37℃下进行48小时。作为对照，10μM人类SOD1在10mM三氨基甲烷乙酸盐缓冲液中温育，pH7.0，在37℃下进行48小时。
[0305] 在浓度为34μg/ml的涂层缓冲液（15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.42）中，96孔微量培养板（康宁）包被有生理人类SOD1二聚物或体外集合人类SOD1二聚物。非特异性结合位点封闭在室温下1小时，其中PBS/0.1% -20含2％的BSA（Sigma-Aldrich，布赫斯，瑞士）。原发抗体人NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8、NI-204.9F6和鼠单克隆抗体SOD-172B1（圣克鲁兹生物技术，圣克鲁兹，美国）稀释至指定浓度，并且在室温下温育1小时。使用山羊抗-小鼠IgG抗体（杰克逊免疫研究，纽马克特，英国）或与HRP偶联的驴抗-人IgGγ抗体（杰克逊免疫研究，纽马克特，英国）决定结合，随后测定标准比色试验中的HRP活性。通过使用GraphPad Prism软件（圣地亚哥，美国）的非线性回归，估算EC50值。
[0306] 人NI-204.10D12（图5A）和NI-204.12G7（图5C）抗体分别用15nM和3.6nM的EC50优先结合错误折叠/聚集的人类SOD1。人NI-204.9F6（图5D）抗体用127nM的EC50稍微优先结合错误折叠/聚集的人超氧化物歧化酶1。这些发现表明NI-204.10D12、NI-204.12G7和NI-204.9F6抗体优先靶向人类SOD1的表位，其暴露处于错误折叠/聚集的病理相关的构象但不是人超氧化物歧化酶1的生理形式。
[0307] 相反，NI-204.10A8抗体分别用19.1nM和29.5nM的EC50结合相等亲和性的人生理SOD1二聚体和错折叠/聚集的人类SOD1（图5B）。这些发现表明NI-204.10A8抗体靶向人类SOD1的表位，其暴露于错误折叠的/聚集的病理相关构象和人超氧化物歧化酶1的生理形式。
[0308] 市售的SOD-172B1抗体结合具有几乎相等亲和力的人生理SOD1二聚体和错误折叠/聚集的人类SOD1；参见图5E。
[0309] 金属催化氧化诱导SOD1聚集体具有与体内ALS超氧化物歧化酶1聚集体相同的性质。NI-204.10D12（图5A）和NI-204.12G7（图5C）显示出与人类SOD1如错误折叠/聚集的SOD1的治疗相关的病理形式的显著结合。结合SOD1聚集体似乎是优于生理二聚物。NI-204.9F6（图5D）显示了略微优先结合人超氧化物歧化酶1的治疗相关病理形式。然而，错误折叠/聚集的SOD1的NI-204.9F6抗体结合亲和力低于NI-204.10D12和NI-204.12G7抗体已确定的亲和力。
[0310] 有趣的，对照NI-204.10D12、NI-204.12G7和NI-204.9F6抗体，NI-204.10A8抗体（图5B）不显示出SOD1聚集物相对于生理二聚体的优先结合。该抗体在低纳摩尔范围内以高亲和力结合两个SOD1类。
[0311] 这些结果突出了人衍生的NI-204.10D12和NI-204.12G7的抗体在治疗上有吸引力的特点，这些抗体针对SOD1蛋白质病理学上相关的构象，以及NI-204.10A8抗体具有不同于NI-204.10D12和NI-204.12G7抗体的生物化学特性。因此，人衍生的NI-204.10A8代表用于A1S的潜在治疗性抗体，具有与分子NI-204.10D12和NI-204.12G7不同的特性。
[0312] 随着人超氧化物歧化酶1的涂层浓度的增加，这些发现进而与结合分析相一致。
[0313] 实施例4：在转基因小鼠脊髓组织中结合到SOD1病理性聚集体的NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8和NI-204.9F6的结合评估
[0314] 在疾病末期，B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠脊髓在磷酸盐缓冲的4％低聚甲醛溶液中固定，嵌入石蜡，并且切割成5-μm的切片。在甲酸预处理之后，这些切片用不同的抗-超氧化物歧化酶1抗体培育：嵌合NI-204.10D12（50nM）、人NI204-10A8（50nM）、人NI-204.12G7（20nM）、人NI-204.9F6（50nM）和EPR1726抗-SOD1（Epitomics，1∶10000），接着与生物素化的驴抗-小鼠或生物素化的驴抗-人类或生物素化的驴抗-兔第二抗体（杰克逊免疫研究欧洲有限公司；1:250）培育。抗体信号用Vectastain ABC试剂盒（载体实验室）放大，并用二氨基联苯胺（Dako）检测。
[0315] NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10D12和NI-204.9F6结合至超氧化物歧化酶1，表征为在疾病末期B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的脊髓切片的免疫组织化学分析。
[0316] NI-204.10D12主要示出SOD1病理学的扩散的染色以及胞内分散的夹杂物；参见图6A。
[0317] NI-204.12G7显示SOD1病理学的显著染色，SOD1病理学包括细胞质SOD1夹杂物，主要是在运动神经元，以及细胞外SOD1聚集体（图6C）。
[0318] NI-204.10A8显示SOD1病理学的显著染色，SOD1病理学包括细胞质SOD1内含物，主要是在运动神经元，以及细胞外SOD1聚集体（图6B）。此外，该抗体似乎能以高灵敏度识别生理SOD1，如脊髓组织的强分散染色所示（图6B）。
[0319] 这些发现与三种抗体的生化结合性质相一致：NI-204.10D12和NI-204.12G7抗体表现出优先强结合至错误折叠/聚集的SOD1和NI-204.10A8抗体显示出与生理SOD1二聚体和错误折叠/聚集的SOD1相等的结合亲和性。
[0320] 在检测的染色条件下，NI-204-9F6抗体反应非常弱，主要检测细胞内SOD1和细胞内分散的内含物；参见图6D。
[0321] 市售的EPR1726抗SOD-1抗体特别检测人类SOD1而不是小鼠SOD1，以高灵敏度结合生理SOD1及病理SOD1聚集体；参见图6E。
[0322] 为了测试本发明的所有抗体，重复上述实验。如图9所示，在B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的腰椎脊髓中，人衍生的SOD1特异性抗体显示SOD1病理的不同模式，例如分散的、细胞内夹杂物、胞质内含物和较大的主要是细胞外的SOD1聚集物。
[0323] 如果使用适宜浓度的抗体，示于图9的所有抗体显示出胞内分散夹杂物的染色、弥散细胞质结构和液泡结构。与参考抗体B8H10（图9M）相差无几的更大的聚集物的染色可将本发明的抗体分成两组。，抗体NI-204.12G7(图9B),NI-204.11F11(图9C),NI-204.6H1( 图 9F),NI-204.12G3( 图 9G),NI-204.7G5( 图 9H),NI-204.25H3( 图
9I),NI-204.34A3(图9J)and NI-204.7B3(图9K)在脊髓的腹角力染色这些聚集体，而NI-204.10D12（图9A）、NI-204.10A8（图9D）和NI-204.67E12（图9E）不给这些结构染色，类似于参考抗体C4F6（（图9L），这是特定用于突变人类SOD1（Bosco等人，2010，Nat Neuroscience13（11）；1396-1403）的可溶性、错误折叠形式。另外，在脊髓部分的背角，抗体NI-204.10D12、NI-204.6H1和NI-204.7G5在胶状质中示出了扩散的染色。
9I),NI-204.34A3(图9J)and NI-204.7B3(图9K)在脊髓的腹角力染色这些聚集体，而NI-204.10D12（图9A）、NI-204.10A8（图9D）和NI-204.67E12（图9E）不给这些结构染色，类似于参考抗体C4F6（（图9L），这是特定用于突变人类SOD1（Bosco等人，2010，Nat Neuroscience13（11）；1396-1403）的可溶性、错误折叠形式。另外，在脊髓部分的背角，抗体NI-204.10D12、NI-204.6H1和NI-204.7G5在胶状质中示出了扩散的染色。
[0324] 此外，一些抗体似乎能以高灵敏度识别生理SOD1，如脊髓组织的强扩散染色（NI-204.10D12（图9A）、NI-204.10A8（图9D）和NI-204.67E12（图9E））所示。
[0325] 可市 购C4F6（MediMabs，Canada；#MM-0070-2）和 B8H10（MediMabs，Canada；#MM-0070）抗体用作对照抗体。温育C4F6抗体或B8H10抗体，接着温育生物素化的马抗-小鼠第二抗体（Vector Laboratories；1：250）。抗体信号用Vectastain ABC设备（载体实验室）放大，并用二氨基联苯胺（Dako）检测。这种染色显示两个不同的染色模式：C46A抗体显示点状/弥散的染色（图9L），而B8H10抗体主要染色粒状SOD1夹杂物和SOD1聚集物（图
9M）。
9M）。
[0326] 结论
[0327] 这些数据证明，在B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠模型中，NI-204抗体识别病理超氧化物岐化酶1的结构。
[0328] 实施例5：NI-204抗体表位图谱
[0329] 重叠肽的扫描用于表位图谱。人超氧化物歧化酶1的整个序列合成总共36条线性15-嵌合肽，其中在单独肽（JPT肽技术，柏林，德国）之间有11个aa重叠并点样到硝酸纤维素膜上。在甲醇中活化该膜5分钟，然后在室温下用TBS洗涤10分钟。非特异性结合位点在室温下用 （Carl Roth GmbH+Co.KG，卡尔斯鲁厄，德国）封闭2小时。人NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.11F11、NI-204.6H1、NI-204.12G3，NI-204.7G5，NI-204.7B3、NI-204.34A3相应的NI-204.25H3抗体（1μg/ml）在室温下用温育3小时。使用共轭的驴抗人IgGγ第二抗体的HRP来测定第一抗体的结
合。用ECL和ImageQuant350检测印迹（通用电气医疗集团，Otelfingen，瑞士）。
合。用ECL和ImageQuant350检测印迹（通用电气医疗集团，Otelfingen，瑞士）。
[0330] 为了映射超氧化物歧化酶1蛋白器内的表位，NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.11F11、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3相应通过NI-204.25H3抗体识别这些蛋白质，使用肽扫描膜，其中36种15氨基酸肽（11个氨基酸在肽之间重叠）覆盖整个超氧化物歧化酶1蛋白序列。如图7示例性示出，观察到NI-204.10D12显著结合到肽编号22、23和24，指示该抗体识别的表位是定位于SOD1中央结构域。NI-204.10D12结合表位因此预测定位于SOD1氨基酸93-99。NI-204.10D12结合中央结构域，该结构域含有序列DGVADVS（SEQ ID NO:2）的脂肪和下划线的氨基酸93-99。本发明类似经鉴定的人衍生SOD1-特异性抗体的结合表位总结于下表IV中，这些抗体包括NI-204.10D12、NI-204.10A8、NI-204.12G7、NI-204.11F11、NI-204.6H1、NI-204.12G3、NI-204.7G5、NI-204.7B3、NI-204.34A3和NI-204.25H3。
[0331] 表IV：在人类SOD1的蛋白序列指示的氨基酸中不同人类SOD1-特异性抗体识别出的结合表位。
[0332]
[0333] ND：使用肽点技术没有鉴定结合表位
[0334] 实施例6：NI-204.10D12结合野生型、G93A突变体和鼠SOD1衍生肽
[0335] 链霉抗生物素蛋白涂覆的96孔微量培养板（Fischer Scientific）用生物素化的肽（JPT肽技术，柏林，德国）覆盖，在浓度50μg/ml的PBS中，于4℃下过夜，这些肽覆盖结合超氧化物歧化酶1蛋白质的表位的假定的NI-204.10D12。非特异性结合位点是在室温下用包含2％BSA（Sigma-Aldrich，布赫斯，瑞士）的PBS/0.1％吐温-20封闭1小时。第一抗体嵌合NI-204.10D12稀释至指定浓度并在室温下培养1小时。使用与HRP偶联的羊抗-鼠IgG抗体（杰克逊免疫研究，纽马克特，英国）测定结合，随后测定标准比色试验中的HRP活性。
[0336] 嵌合重组NI-204.10D12抗体以浓度依赖的方式结合至具有氨基酸序列的合成肽，覆盖所识别的衍生自野生型人、G93A人和鼠过氧化物歧化酶1蛋白的NI-204.10D12结合表位（图8）。NI-204.10D12结合具有相等的亲和力的三种不同SOD1种。在人超氧化物歧化酶1的NI-204.10D12表位中的位置93，氨基酸交换连接到ALS的家族性形式。这些发现表明NI-204.10D12抗体是用于治疗散发性和熟悉ALS合适的候选药物。
[0337] 实施例7：本发明的抗体体内试验
[0338] 如上所述，在转基因小鼠系中使用基于直接心室内输注抗-人类SOD1抗体的被动免疫的研究已经显示出通过延长的寿命和衰减运动神经元损失，这种治疗能够减轻SOD1fALS小鼠模型的疾病（Urushtani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.104（2007），2495-2500；Gros-Louis等人，J.Neurochem.（2010）113，1188 1199）。与此相反，主动疫苗接种方法不能赋予显著保护（Urushtani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.104（2007），
2495-2500）。然而，主动接种可能不是特别适用于人类，因为相当一部分老年人口预计是接种疫苗的非应答者。此外，可能难以控制有关SOD1-定向免疫应答的潜在副作用。如上述小鼠抗体，本发明的SOD1结合分子可以合理地预计实现相似的SOD1聚集物的脑水平降低，因为它们具有相似的针对病理性错误折叠/聚集的SOD1种的结合特异性。
2495-2500）。然而，主动接种可能不是特别适用于人类，因为相当一部分老年人口预计是接种疫苗的非应答者。此外，可能难以控制有关SOD1-定向免疫应答的潜在副作用。如上述小鼠抗体，本发明的SOD1结合分子可以合理地预计实现相似的SOD1聚集物的脑水平降低，因为它们具有相似的针对病理性错误折叠/聚集的SOD1种的结合特异性。
[0339] 然而，由于人类免疫系统内的进化优化和亲和力成熟，本发明的抗体提供一种有价值的治疗工具，由于其分离自健康人受试者，很有可能有极好的安全性特征并缺乏免疫原性。描述于上述关于人抗体而不是小鼠抗体的文献中的试验方法提供对这些所期望的治疗效果的确认。具体地，待筛选的抗体可以多种可能的途径施加于动物，如腹膜内抗体注射、颅内注射、心室内脑输注，并且进行用于治疗效果的试验。
[0340] Aβ和SOD1（G93A）突变的共同表达导致在双转基因小鼠中缓冲液-不溶性SOD1聚集物增加，表明Aβ在ALS发展中的潜在作用（Li等人，老化细胞，5（2006），153-165）。上述提及的应用可能性的任一种也可以在β淀粉样蛋白制剂先前脑注射进入SOD1转基因鼠脑之后，以评价Aβ诱导SOD1病理现象的治疗功效。
[0341] 本发明的抗体治疗效果的评估和确定可以通过监测体重变化实施，归因于肌肉萎缩的出现和动物总存活时间。B在肌肉萎缩出现之前，可以测试协调或执行中的各种运动损伤，用于作为治疗结果的延迟发生。这可通过标准行为试验实施，例如旋转杆、抓牢强度测试、延伸反射测试、爪握紧耐力测试、Y形迷宫，新目标识别测试或开放场地活动，例如（Crawley，J.N.（2000）What'sWrong with My Mouse?：Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice，Wiley-Liss，New York）。
[0342] 此外，可以使用组织化学方法，其中包括监控有毒胞内夹杂物的形成、对运动神经元脊髓切片的染色和计数，脊髓上的总人类SOD1染色和/或生物化学测定，根据顺序脊髓萃取的可溶性和不溶性SOD1水平（Urushtani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.104（2007），2495-2500）。
[0343] 实施例8：对天然SOD1二聚体、氧化/变性的SOD1和重组SOD1的结合分析
[0344] 方法
[0345] 体外超氧化物歧化酶1聚集物
[0346] 金属催化的氧化反应用于诱导体外超氧化物岐化酶1聚集物（根据Rakhit等人，J Biol Chem.279（2004），15499-15504）。来自人类红细胞的天然SOD1（二聚物）以及所有其它的试剂都购自Sigma-Aldrich（布赫斯，瑞士）。用于聚集，10μM人类SOD1在10mM三氨基甲烷乙酸盐缓冲液中温育，其中pH7.0，含有4mM的抗坏血酸和0.2mM的CuCl2，在37℃下进行48小时。作为对照，10μM人类SOD1在10mM三氨基甲烷乙酸盐缓冲液中温育，其中pH7.0，在37℃下进行48小时。
[0347] 体外超氧化物歧化酶1变性
[0348] 根据 等人，J Neurochem.117（2011），91-99，进行超氧化物歧化酶1变性反应。来自人类红细胞的天然SOD1（二聚物）以及所有其它的试剂都购自Sigma-Aldrich（布赫斯，瑞士）。为了变性，23μM人类SOD1在3.5M盐酸胍和25mM乙二胺四乙酸EDTA中温育，其中pH值7.0，于22℃下4小时。使用含有5mM乙二胺四乙酸的PBS对变性溶液透析，pH值7.0，20,000g下离心以去除SOD1聚集物，并收集含有上清液的变性SOD。
[0349] 直接ELISA
[0350] 在浓度为20μg/ml的涂层缓冲液（15mM Na2CO3，35mM NaHCO3，pH9.42）中，96孔微量培养板（康宁）包被有天然人类SOD1二聚物，或者体外变性/氧化人类SOD1或重组SOD1（Biomol，德国）。非特异性结合位点封闭在室温下1小时，使用含2％BSA的PBS/0.1% -20（Sigma-Aldrich，布赫斯，瑞士）。一级抗体稀释至指定浓度并在室温下温育1小时。使用与HRP偶联的驴抗-人IgG Fc-特异性抗体或与HRP偶联的山羊抗-小鼠IgG（H+L）-特异性抗体测定结合，随后测定标准比色试验中的HRP活性。
[0351] EC50测定
[0352] 通过使用GraphPad Prism软件（圣地亚哥，美国）的非线性回归，估算EC50值。
[0353] 结果
[0354] 对于天然人类SOD1二聚体、变性/氧化人类SOD1和重组SOD1的不同的人衍生SOD1-特异性抗体的EC50，通过直接ELISA测定，直接ELISA具有在20μg/ml的浓度下不同的SOD1种的涂层。用于不同SOD1种的人衍生的SOD1-特异性抗体所测定的结合亲和力总结于下表III。
[0355] 表III：用于不同SOD1种的不同的衍生人-SOD1-特异性抗体的结合亲和力[0356]
[0357] ND:未测定
[0358] 人类SOD1-特异性抗体优先结合重组和变性/聚集的人超氧化物歧化酶1，其中EC50的范围从低皮摩尔至低毫微皮摩尔值。这些发现表明大多数NI-204抗体优先靶向人类SOD1的表位，其暴露于病理学相关的氧化/变性的错误折叠的构象但不是人超氧化物歧化酶1天然形式的构象。仅抗体NI-204.67E12、NI-204.10A8和NI-204.9F6不区别不同SOD1种，其中NI-204.67E12抗体在皮摩尔具有高总结合亲和力，并且抗体NI-204.10A8和NI-204.9F6的亲和力在纳摩尔范围。
[0359] 结论
[0360] 金属催化的氧化诱导的超氧化物岐化酶1聚集物和展开的SOD1拥有与ALS相关的体内超氧化物歧化酶1聚集物相似或相同的性能。几种人衍生的SOD1特异性抗体显示出显著的结合以治疗相关的人类超氧化物歧化酶1的错误折叠形式，例如未折叠/氧化的SOD1。与未折叠/氧化的超氧化物歧化酶1结合似乎优于天然二聚体。这些结果突出了本发明的人-衍生的SOD-1抗体在治疗上有吸引力的性能，这些抗体靶向过氧化物歧化酶1蛋白的病理性相关构象。
[0361] 其间，若干个月的延迟之后，已经执行实施例3和8。期间，抗体NI-204.10D12、NI-204.12G7、NI-204.10A8和NI-204.9F6已经保存于4℃，或优选在-20℃或-80℃，在磷酸盐缓冲盐水少量等份中，没有CaCl2和MgCl2，pH7.4（Invitrogen），以使几个月的冻融造成的损坏减到最少。
[0362] 其中，有关结合亲和力大致类似的数据是在两个实验中获得的，抗体NI-204.10A8显示了生理和聚合的SOD-1巨大的结合亲和力的损失，所述损失如表III所示，对于两种形式的SOD-1从实施例3计算的20nM、相应的30nM到超过100nM。
[0363] 已知蛋白质在冷冻过程中经历冰-水表面变性、低温浓缩和冷变性，这会导致稳定性损失，参见例如，Kolhe和Badkar，Biotechnology Progress27（2011），494 504；Hawe等人，Eur J Pharm Sci.38（2009），79-87；LuY等人，J Pharm Sci.97（2008），1801-1812；以及Glick SM，J Clin Endocrinol Metab.37（1973），461-462。在这方面，本发明提供的抗体展示不同的稳定性性质，其中，一些抗体（例如，NI-204.10D12和NI-204.12G7）可以在使用前存储至少几个月的长时间周期，其中，其它抗体（例如，NI-204.10A8）应当在制备后使用，不应当进行冷冻步骤。
[0364] 实施例9：NI-204.10D12治疗功效：体内概念证明
[0365] 在转基因小鼠系中使用基于直接心室内抗-人类SOD1抗体输注的被动免疫的方法的研究已经显示这种治疗能够通过延长寿命和衰减运动神经元损失减轻SOD1fALS小鼠模型的疾病（Urushtani等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.104（2007），2495-2500；Gros-Louis等人，J.Neurochem.（2010）113，1188 1199）。
[0366] B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠系用于评估人衍生SOD-1抗体的治疗功效。这种转基因小鼠系是非常好地建立和表征的ALS的小鼠模型。NI-204.10D12抗体治疗效果的评估和确定通过监测体重变化实施，这些变化归因于动物肌肉萎缩的出现和总存活时间。在肌肉萎缩发作之前，检测由于延迟发生的性能中的运动损伤，作为通过爪夹紧耐久性测试的处理结果。此外，组织化学方法用于脊髓切片运动神经元染色和计数，以评估NI-204.10D12介导的运动神经元损失的衰减。为了避免鼠-抗-人抗体在长期治疗方案期间应答，NI-204.10D12抗体的嵌合版本用于在这项研究中，包括融合到鼠标Ig2a常数域的NI-204.10D12人类变量域。
[0367] 方法
[0368] 用于脑输注的Alzet 微型渗透泵的手术植入
[0369] 60天大的B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠接受深麻醉（芬太尼、咪达唑仑/medetomidin），制造小的中线切口以暴露颅骨，并且在小鼠背面的肩胛区制备一个皮下袋，以使填充有抗体溶液或PBS的无菌 微型泵（ALZET渗透泵，库比蒂诺，加利福尼亚，美国，模型1004，1.5cm的长度，0.6cm的直径和称重0.4g空重）插入。然后将小鼠头固定在立体定位设备，骨缝合连接前囟用作在颅骨中钻孔的参考点，并降低 脑输注药盒3的套管插入左侧脑室；根据前囟协调；AP，-0.2mm；ML，0.9mm；和DV，2.5mm。在放置插管之后，放置两个小螺钉在颅骨内，施加牙科粘固剂稳固地附接到颅骨。纳洛酮（56952（Swissmedic）、OrPha Swiss GmbH，Küsnacht，Switzerland）、flumazenill（48280（Swissmedic）、Roche Pharma（Schweiz）、Reinach，Switzerland）/atipamezol（60562（Swissmedic）、Dr.E. AG，Bern，Switzerland）和 metacam（Boehringer Ingelheim，Germany）作为解毒剂和术后止痛剂进行皮下给药，另外在1周内于饮用水中提供美洛昔康和丁丙诺啡（41931，44100（Swissmedic），利洁时医疗，英国）/phenylbutazon（42726（Swissmedic），Streuli Pharma AG，Uznach，瑞士）/氨基比林/青霉素G（56271（Swissmedic），Grünenthal Pharma AG，Glarus；瑞士）/二双氢链霉素（42790（Swissmedic），Streuli Pharma AG，Uznach，瑞士），作为止痛剂/抗生素。手术后，小鼠在隔热垫上饲养3天，湿食物放置在笼底，以促进回收和以减少漏失。
[0370] 渗透微型泵模型1004按照恒定灌输速率0.11μl/小时＝2.64μl/天将抗体或PBS溶液泵送至侧脑室，，总共持续28天。在泵中的抗体溶液的浓度选择为等于
0.1mg/kg体重/天。
0.1mg/kg体重/天。
[0371] 泵改变
[0372] 每隔28天，微型渗透泵进行交换。B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠通过吸入麻醉剂（3.5%Sevofluran（53211（Swissmedic），Abbott AG，巴尔，瑞士））进入深麻醉，在高于泵处制造一个小切口，这个泵从大脑输注插管脱离，并取出。插入一个新近填充泵，连接至输液插管，并使用伤口夹闭合切口位点。
[0373] 握力分析
[0374] 使用握力表设备（Ugo Basile，Comero，Italy；Cat.No.:47106）测定小鼠的握力。该系统提供了连接到传感器的栅极。动物降低直到所有四只爪子抓住该栅极，然后轻轻向后拉，直到释放夹紧。通过三次试验，动物所实现的最大握力用电子方式记录。
[0375] 临床终点
[0376] 严重无能运动神经元疾病的临床终点通过下述方式定义：一侧横向躺着的小鼠不能在15秒内校正身体。通过对于在实验期间任何给定的时间点未达到预定的运动神经元疾病的临床端点的小鼠的Kaplan-Meier生存分析，测试存活概率。
[0377] 免疫组织化学和运动神经元计数
[0378] 在疾病晚期，B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因老鼠的脊髓固定在磷酸盐缓冲4%多聚甲醛溶液，用石蜡包埋，切成5-μm切片。对于尼氏染色（0.5%Cresylviolet溶液（Sigma-Aldrich，C5042）），切片在尼氏溶液中室温下染色3小时，然后用蒸馏水洗涤3分钟。根据标准方案，进一步加工切片。对于NeuN染色，在甲酸预处理后，切片用单克隆NeuN抗体，1:1000稀释（MAB377；Milipore）培养。使用标准DAB检测系统放大抗体信号。使用自动Leica BondMaxTM染色系统进行NeuN染色（Leica，Wetzlar，Germany）。
[0379] Nissl-或NeuN-阳性神经元具有大于30μm的直径，在每种动物8腰脊髓切片的腹侧角计数，各部分间隔100μm分开。
[0380] 结果
[0381] 为了评估靶向SOD1的人类衍生抗体的药物治疗效果，在60天龄开始的B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因老鼠中，通过直接脑室脑输注，三个月长期施用NI-204.10D12抗体。在接受慢性NI-204.10D12输液的老鼠中，慢性204.10D12抗体治疗显著地延长SOD1转基因动物的寿命11天，平均生存时间为164±3天，对比在赋形剂处理组中老鼠的153±4天处（p<0.05；图10（A））。此外，在整个疾病过程中对比PBS治疗对照组，B6.Cg-Tg（SOD1*G93A）1Gur/J转基因小鼠的慢性NI-204.10D12治疗会导致体重损失的严重的延误（图10（B））。在SOD1转基因小鼠中的疾病进展过程中，观察到的严重进行的运动障碍通过NI-204.10D12治疗得到改善，证据是相对于载体控制组来说，抗体治疗组握力性能明显提高（图11）。在腰椎脊髓腹角的运动神经元互补物的定量分析，显示了NI-204.10D12处理的动物与载体处理的动物相比明显的运动神经元的衰减损失，表明NI-204.10D12处理可以防止突变SOD-1过度表达介导的运动神经元的变性（图12）。这些结果突出了人类衍生的SOD1-特异性抗体的长远治疗效果，这些抗体基于慢性给药可以推迟疾病发作、延长存活、提高体重和运动原性能和改善神经元变性。人类衍生的SOD1-特异性抗体因此是治疗ALS有希望的新的候选药物。
[0382] 实施例10SOD1抗体的IgG种系家族分类
[0383] 不同的人类SOD1特异抗体的可变区的序列分析允许NI-204抗体分类成种系IgG家族（表V）。
[0384] 为了提供人类NI-204抗体成为种系V段家族的分类，原来的可变区的核苷酸序列与数据库Vbase中的人类种系序列对齐（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uki），该数据库Vbase由MRC蛋白工程中心主持（剑桥，英国）。通过重链基因座和轻链的Vbase输入数值，指定种系（见以下表V）。
[0385] 表Ｖ：根据种系免疫球蛋白序列比较进行NI-204抗体家族分类（抗体名称的最后一个字符指示它们的类型：H-heavy，K-kappa，L-lambda）
[0386]抗体 V段种系家族分类
NI-204.10D12H VH3-74
NI-204.10D12K DPK24
NI-204.12G7H VH1-46
NI-204.12G7L 3a.119B4/V2-11+
NI-204.11F11H VH3-15
NI-204.11F11K Vg/38K
NI-204.10A8H VH1-69
NI-204.10A8K DPK9/012
NI-204.67E12H VH3-23
NI-204.67E12K HK102/V1+
NI-204.6H1H VH4-34
NI-204.6H1L V2-17+
NI-204.12G3H VH3-33
NI-204.12G3H IGGLL150/V2-17+
NI-204.7G5H VH3-30/3-30.5
NI-204.7G5L 3p.81A4/V2-7+
NI-204.7B3H VH3-74
NI-204.7B3L V2-17+
NI-204.34A3H LSG6.1（V3-15）
NI-204.34A3L 3p.81A4/V2-7+
NI-204.25H3H VH4-59
NI-204.25H3L 1b.366F5/DPL5
NI-204.9F6H VH3-23
NI-204.9F6L 3r.9C5/DPL23
NI-204.10D12H VH3-74
NI-204.10D12K DPK24
NI-204.12G7H VH1-46
NI-204.12G7L 3a.119B4/V2-11+
NI-204.11F11H VH3-15
NI-204.11F11K Vg/38K
NI-204.10A8H VH1-69
NI-204.10A8K DPK9/012
NI-204.67E12H VH3-23
NI-204.67E12K HK102/V1+
NI-204.6H1H VH4-34
NI-204.6H1L V2-17+
NI-204.12G3H VH3-33
NI-204.12G3H IGGLL150/V2-17+
NI-204.7G5H VH3-30/3-30.5
NI-204.7G5L 3p.81A4/V2-7+
NI-204.7B3H VH3-74
NI-204.7B3L V2-17+
NI-204.34A3H LSG6.1（V3-15）
NI-204.34A3L 3p.81A4/V2-7+
NI-204.25H3H VH4-59
NI-204.25H3L 1b.366F5/DPL5
NI-204.9F6H VH3-23
NI-204.9F6L 3r.9C5/DPL23
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