技术领域
[0001] 本
发明涉及一种微生物
土壤修复剂及其制备方法，属于土壤修复技术领域。
背景技术
[0002] 随着工业化
进程的不断加快，矿产资源的不合理开采及其
冶炼排放、长期对土壤进行污
水灌溉和
污泥施用、人为活动引起的大气沉降、化肥和
农药的施用等原因，造成了
土壤污染严重。土壤是人类社会生产活动的重要物质
基础，是不可缺少、难以再生的自然资源。没有处理的污染场地将是化学
定时炸弹，一旦大面积爆发将会对国家可持续发展造成难以估量的影响，因此必须对土壤污染的
预防和污染土壤修复予以高度重视。因此有必要妥善管理并加以修复，使其得到合理利用。
[0003] 土壤修复是指利用物理、化学和生物的方法转移、吸收、降解和转化土壤中的污染物，使其浓度降低到可接受水平，或将有毒有害的污染物转化为无害的物质。从根本上说，污染土壤修复的技术原理可包括为：(1)改变污染物在土壤中的存在形态或同土壤的结合方式，降低其在环境中的可
迁移性与生物可利用性；(2)降低土壤中有害物质的浓度。目前，理论上可行的修复技术有
植物修复技术、微
生物修复技术、
化学修复技术、物理修复技术和综合修复技术等几大类。其中
微生物修复技术以其特有的优点受到越来越多人的关注。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种微生物土壤修复剂，该土壤修复剂可以高效降解土壤中的有机污染物，降低土壤中重金属含量，改善土壤肥
力，促进植物的生长，提高
农作物产量和品质。
[0005] 本发明还提供了一种微生物土壤修复剂的制备方法。
[0006] 本发明采用以下技术方案：
[0007] 一种微生物土壤修复剂，它是由以下重量份的原料制成：复合微生物菌剂5-15份、
吸附载体5-10份、腐植酸10-20份、
硅藻土30-40份。
[0008] 其中，所述复合微生物菌剂是采用下述方法制备得到的：
[0009] (1)在无菌条件下，经过灭菌的容器中，将五原假黄单胞菌CGMCC No：1.10978按照液体培养基
质量的3％接种到液体培养基中，于22-25℃下振荡培养3天，得到
种子菌液；
[0010] (2)将步骤(1)所得的种子菌液按照液体培养基质量的7％接种到液体培养基中，于 28-30℃下避光振荡培养7-10天得到
发酵菌液，直接
冷冻干燥得到菌粉A；
[0011] (3)将菌粉A与枯草芽孢杆菌按照5:1的重量比混合得到复合微生物菌剂。
[0012] 所述液体培养基是由以下组分制成：蛋白胨10-15份、
酵母粉3-6份、
磷酸二氢
钾1-3份、纳米复合添加剂1-3份、纯化水100-120份。
[0013] 所述纳米复合添加剂是采用下述方法制备得到的：将鱼类下脚料完全
粉碎，然后与水等重量比混合，向混合料中按混料总重1000U/g加入胰蛋白酶酶解，调节pH值在6.0-7.5，升温至42-45℃酶解20-24h，酶解完成后用纳滤膜进行纳滤得到多肽液；向多肽液中按体积比 2:1的比例加入1M的亚硒酸钠溶液，调节pH在5.0～5.5，升温至60-65℃螯合反应4-
6小时后得到多肽螯合液；将
碳纳米管用5％的稀
硝酸浸泡处理12小时，然后将处理过的
碳纳米管浸泡于上述多肽螯合液中超声处理30-40分钟后离心后所得固体滤渣即为纳米复合添加剂。
[0014] 所述超声处理
频率为90-100KHz。
[0015] 所述吸附载体是采用下述方法制备得到的：
[0016] (a)取100g木
棉浸渍到100ml由硝酸
铝乙醇溶液和硝酸
铁乙醇溶液的
混合液中浸渍 30分钟，然后超声处理20分钟，取出烘干后于450℃
煅烧1小时，得到混合物；
[0017] (b)将上述制备所得的混合物浸渍到50ml 25％硝酸锰溶液中1小时，然后取出烘干后置于650℃煅烧1小时，得到最终的吸附载体。
[0018] 优选的，所述硝酸铝乙醇溶液浓度为0.8mol/L，硝酸铁乙醇溶液浓度为0.3mol/L。
[0019] 一种微生物土壤修复剂的制备方法，它包括以下步骤：
[0020] (1)将鱼类下脚料完全粉碎，然后与水等重量比混合，向混合料中按混料总重1000U/g 加入胰蛋白酶酶解，调节pH值在6.0-7.5，升温至42-45℃酶解20-24h，酶解完成后用纳滤膜进行纳滤得到多肽液；向多肽液中按体积比2:1的比例加入1M的亚硒酸钠溶液，调节pH在 5.0～5.5，升温至60-65℃螯合反应4-6小时后得到多肽螯合液；将碳纳米管用5％的稀硝酸浸泡处理12小时，然后将处理过的碳纳米管浸泡于上述多肽螯合液中超声处理
30-40分钟后离心后所得固体滤渣即为纳米复合添加剂，备用；
[0021] (2)制备液体培养基：将蛋白胨10-15份、酵母粉3-6份、磷酸二氢钾1-3份、纳米复合添加剂1-3份、纯化水100-120份混合后搅拌均匀，然后于0.1MPa，121℃灭菌处理15-30 分钟即得到液体培养基；
[0022] (3)复合微生物菌剂的制备：在无菌条件下，经过灭菌的容器中，将五原假黄单胞菌 CGMCC No：1.10978按照液体培养基质量的3％接种到步骤(2)所制备的液体培养基中，于22-25℃下振荡培养3天，得到种子菌液；将所得的种子菌液按照液体培养基质量的7％接种到液体培养基中，于28-30℃下避光振荡培养7-10天得到发酵菌液，直接冷冻干燥得到菌粉A；将菌粉A与枯草芽孢杆菌按照5:1的重量比混合得到复合微生物菌剂；
[0023] (4)吸附载体的制备：取100g木棉浸渍到100ml由硝酸铝乙醇溶液和硝酸铁乙醇溶液的混合液中浸渍30分钟，然后超声处理20分钟，取出烘干后于450℃煅烧1小时，得到混合物；将上述制备所得的混合物浸渍到50ml 25％硝酸锰溶液中1小时，然后取出烘干后置于650℃煅烧1小时，得到最终的吸附载体，备用；
[0024] (5)按重量份称取步骤(3)所得的复合微生物菌剂、步骤(4)所得吸附载体、腐植酸、
硅藻土，然后置于预混机中45r/min，混合15-20分钟后，分装即得成品。
[0025] 优选的，所述步骤(4)中硝酸铝乙醇溶液浓度为0.8mol/L，硝酸铁乙醇溶液浓度为 0.3mol/L。
[0026] 优选的，所述步骤(1)中超声处理频率为90-100KHz。
[0027] 本发明所用到的五原假黄单胞菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC No：1.10978。枯草芽孢杆菌购自山东泰邦农业发展股份有限公司，有效活菌数≥10亿/克。
[0028] 本发明的复合微生物菌剂采用特定培养基在特定条件下培养制备复配而成，其中的五原假黄单胞菌在特制的液体培养基中经过2次培养，液体培养基中添加的纳米复合添加剂会在菌种培养的过程中提供大量有机养分的同时还能增加菌种的选择性，有利于纯化菌种，还可以有效吸附某些死菌和菌体代谢产物，提高了菌体繁育环境，培养得到的菌种活性高，与枯草芽孢杆菌复配后，大量有益活性微生物作用于土壤，可显著提升
土壤肥力，改善土壤结构，降低土壤中重金属和有机污染物的含量。本发明所用到的吸附载体具有特殊的中空管状结构，具有高的
比表面积，其自身对重金属和有机污染物具有良好的吸附能力，同时它还可以使大量微生物附着于吸附载体之上，为微生物提供了良好的栖息环境，提高了微生物活性，进一步提高了微生物对土壤的修复效果，复合微生物菌剂与吸附载体相辅相成，缺一不可，共同修复土壤，可以使土壤污染情况显著改善。
[0029] 本发明的有益效果是：本发明所制备的微生物土壤修复剂可显著提高受污染土壤中有机质含量，调节土壤菌群结构及土壤酸
碱性，提高土壤透气性，改善土壤理化性质。可以有效降解土壤中有机污染物及重金属铅、铬、砷等的含量，提高土壤肥力，作物增产增收效果显著。
具体实施方式
[0030] 下面结合具体
实施例对本发明做进一步的详细说明。
[0031] 实施例1
[0032] 一种微生物土壤修复剂，它是由以下重量份的原料制成：复合微生物菌剂5份、吸附载体5份、腐植酸10份、硅藻土30份。
[0033] 上述微生物土壤修复剂的制备方法如下：
[0034] (1)将鱼类下脚料完全粉碎，然后与水等重量比混合，向混合料中按混料总重1000U/g 加入胰蛋白酶酶解，调节pH值在6.0，升温至42℃酶解24h，酶解完成后用纳滤膜进行纳滤得到多肽液；向多肽液中按体积比2:1的比例加入1M的亚硒酸钠溶液，调节pH在5.0～5.5，升温至60℃螯合反应6小时后得到多肽螯合液；将碳纳米管用5％的稀硝酸浸泡处理
12小时，然后将处理过的碳纳米管浸泡于上述多肽螯合液中超声处理30-40分钟后离心后所得固体滤渣即为纳米复合添加剂，备用；超声处理频率为90KHz；
[0035] (2)制备液体培养基：将蛋白胨10份、酵母粉3份、磷酸二氢钾1份、纳米复合添加剂1份、纯化水100份混合后搅拌均匀，然后于0.1MPa，121℃灭菌处理15-30分钟即得到液体培养基；
[0036] (3)复合微生物菌剂的制备：在无菌条件下，经过灭菌的容器中，将五原假黄单胞菌 CGMCC No：1.10978按照液体培养基质量的3％接种到步骤(2)所制备的液体培养基中，于22-25℃下振荡培养3天，得到种子菌液；将所得的种子菌液按照液体培养基质量的7％接种到液体培养基中，于28-30℃下避光振荡培养7-10天得到发酵菌液，直接冷冻干燥得到菌粉A；将菌粉A与枯草芽孢杆菌按照5:1的重量比混合得到复合微生物菌剂；
[0037] (4)吸附载体的制备：取100g木棉浸渍到100ml由硝酸铝乙醇溶液和硝酸铁乙醇溶液的混合液中浸渍30分钟，然后超声处理20分钟，取出烘干后于450℃煅烧1小时，得到混合物；将上述制备所得的混合物浸渍到50ml 25％硝酸锰溶液中1小时，然后取出烘干后置于650℃煅烧1小时，得到最终的吸附载体，备用；其中，硝酸铝乙醇溶液浓度为0.8mol/L，硝酸铁乙醇溶液浓度为0.3mol/L。
[0038] (5)按重量份称取步骤(3)所得的复合微生物菌剂、步骤(4)所得吸附载体、腐植酸、硅藻土，然后置于预混机中45r/min，混合15-20分钟后，分装即得成品。
[0039] 实施例2
[0040] 一种微生物土壤修复剂，它是由以下重量份的原料制成：复合微生物菌剂15份、吸附载体10份、腐植酸20份、硅藻土40份。
[0041] 上述微生物土壤修复剂的制备方法如下：
[0042] (1)将鱼类下脚料完全粉碎，然后与水等重量比混合，向混合料中按混料总重1000U/g 加入胰蛋白酶酶解，调节pH值在7.5，升温至45℃酶解20h，酶解完成后用纳滤膜进行纳滤得到多肽液；向多肽液中按体积比2:1的比例加入1M的亚硒酸钠溶液，调节pH在5.0～5.5，升温至65℃螯合反应4小时后得到多肽螯合液；将碳纳米管用5％的稀硝酸浸泡处理
12小时，然后将处理过的碳纳米管浸泡于上述多肽螯合液中超声处理30-40分钟后离心后所得固体滤渣即为纳米复合添加剂，备用；超声处理频率为100KHz；
[0043] (2)制备液体培养基：将蛋白胨15份、酵母粉6份、磷酸二氢钾3份、纳米复合添加剂3份、纯化水120份混合后搅拌均匀，然后于0.1MPa，121℃灭菌处理15-30分钟即得到液体培养基；
[0044] (3)复合微生物菌剂的制备：在无菌条件下，经过灭菌的容器中，将五原假黄单胞菌 CGMCC No：1.10978按照液体培养基质量的3％接种到步骤(2)所制备的液体培养基中，于22-25℃下振荡培养3天，得到种子菌液；将所得的种子菌液按照液体培养基质量的7％接种到液体培养基中，于28-30℃下避光振荡培养7-10天得到发酵菌液，直接冷冻干燥得到菌粉A；将菌粉A与枯草芽孢杆菌按照5:1的重量比混合得到复合微生物菌剂；
[0045] (4)吸附载体的制备：取100g木棉浸渍到100ml由硝酸铝乙醇溶液和硝酸铁乙醇溶液的混合液中浸渍30分钟，然后超声处理20分钟，取出烘干后于450℃煅烧1小时，得到混合物；将上述制备所得的混合物浸渍到50ml 25％硝酸锰溶液中1小时，然后取出烘干后置于650℃煅烧1小时，得到最终的吸附载体，备用；其中，硝酸铝乙醇溶液浓度为0.8mol/L，硝酸铁乙醇溶液浓度为0.3mol/L。
[0046] (5)按重量份称取步骤(3)所得的复合微生物菌剂、步骤(4)所得吸附载体、腐植酸、硅藻土，然后置于预混机中45r/min，混合15-20分钟后，分装即得成品。
[0047] 实施例3
[0048] 一种微生物土壤修复剂，它是由以下重量份的原料制成：复合微生物菌剂10份、吸附载体8份、腐植酸15份、硅藻土35份。
[0049] 上述微生物土壤修复剂的制备方法如下：
[0050] (1)将鱼类下脚料完全粉碎，然后与水等重量比混合，向混合料中按混料总重1000U/g 加入胰蛋白酶酶解，调节pH值在7.0，升温至43℃酶解22h，酶解完成后用纳滤膜进行纳滤得到多肽液；向多肽液中按体积比2:1的比例加入1M的亚硒酸钠溶液，调节pH在5.0～5.5，升温至62℃螯合反应5小时后得到多肽螯合液；将碳纳米管用5％的稀硝酸浸泡处理
12小时，然后将处理过的碳纳米管浸泡于上述多肽螯合液中超声处理30-40分钟后离心后所得固体滤渣即为纳米复合添加剂，备用；超声处理频率为95KHz；
[0051] (2)制备液体培养基：将蛋白胨12份、酵母粉5份、磷酸二氢钾2份、纳米复合添加剂2份、纯化水110份混合后搅拌均匀，然后于0.1MPa，121℃灭菌处理15-30分钟即得到液体培养基；
[0052] (3)复合微生物菌剂的制备：在无菌条件下，经过灭菌的容器中，将五原假黄单胞菌 CGMCC No：1.10978按照液体培养基质量的3％接种到步骤(2)所制备的液体培养基中，于22-25℃下振荡培养3天，得到种子菌液；将所得的种子菌液按照液体培养基质量的7％接种到液体培养基中，于28-30℃下避光振荡培养7-10天得到发酵菌液，直接冷冻干燥得到菌粉A；将菌粉A与枯草芽孢杆菌按照5:1的重量比混合得到复合微生物菌剂；
[0053] (4)吸附载体的制备：取100g木棉浸渍到100ml由硝酸铝乙醇溶液和硝酸铁乙醇溶液的混合液中浸渍30分钟，然后超声处理20分钟，取出烘干后于450℃煅烧1小时，得到混合物；将上述制备所得的混合物浸渍到50ml 25％硝酸锰溶液中1小时，然后取出烘干后置于650℃煅烧1小时，得到最终的吸附载体，备用；其中，硝酸铝乙醇溶液浓度为0.8mol/L，硝酸铁乙醇溶液浓度为0.3mol/L。
[0054] (5)按重量份称取步骤(3)所得的复合微生物菌剂、步骤(4)所得吸附载体、腐植酸、硅藻土，然后置于预混机中45r/min，混合15-20分钟后，分装即得成品。
[0055] 对比例1
[0056] 一种微生物土壤修复剂，其原料组成与制备方法同实施例3，唯一不同的是：复合微生物菌剂的制备过程中所用到的液体培养基中不含有纳米复合添加剂成分及相应制备方法的步骤。
[0057] 对比例2
[0058] 一种微生物土壤修复剂，其原料组成与制备方法同实施例3，唯一不同的是：不含有吸附载体及相应的吸附载体的制备步骤。
[0059] 对比例3
[0060] 一种土壤修复剂，其原料组成与制备方法同实施例3，唯一不同的是：不含有复合微生物菌剂及相应的制备方法的步骤。
[0061] 对比例4
[0062] 一种微生物土壤修复剂，其原料组成与制备方法同实施例3，唯一不同的是：其复合微生物菌剂仅含有菌粉A。
[0063] 对比例5
[0064] 一种微生物土壤修复剂，其原料组成与制备方法同实施例3，唯一不同的是：其复合微生物菌剂仅含有枯草芽孢杆菌。
[0065] 为了进一步验证本发明的微生物土壤修复剂对土壤的具体修复效果，选取了山东省东营市广饶县某处盐碱地农田作为试验田，土壤性质：pH 9.12，30厘米土壤耕层含盐量0.6％，有机质含量6.48g/kg，有益微生物含量4.8×107CFU/g。将试验地随机划分为等面积的7
块，其中6块试验地分别使用实施例3、对比例1-5所制备的微生物土壤修复剂，一块试验地作为空白对照组，不施用任何土壤修复剂。各组微生物土壤修复剂的用法和用量均相同，翻耕土壤时随翻入土即可，15kg/亩。待施用土壤修复剂3个月后测定每块试验地的理化性质。具体结果如表1所示。
[0066] 表1土壤理化性质测试结果
[0067]
[0068] 从上述表1可以看出，本发明制备的微生物土壤修复剂可以显著改善土壤盐碱性，土壤有机质含量和有益微生物含量显著提升，土壤性质得到显著改善。
[0069] 本发明还进一步研究了该微生物土壤修复剂对重污染土壤种植农作物小麦的影响。选取山东省莒南县某处土壤板结现象和重
金属离子超标较严重的一片土地作为小麦种植试验田， 2017年至2018年连续2年在该试验田上研究本发明的土壤修复剂的应用效果；试验前该土壤中铅含量为265.8mg/kg，铬含量为65.2mg/kg，砷含量为185.5mg/kg，挥发性酚类化合物含量0.612mg/kg。试验田划分为相同大小的7块，每块试验田中小麦
播种量、肥水管理等基本田间管理措施均相同，唯一不同的是每年在种植前翻耕土壤时与基肥一样将土壤修复剂随翻入土，用量15kg/亩。将试验地随机划分为等面积的7块，其中6块试验地分别使用实施例 3、对比例1-5所制备的微生物土壤修复剂，一块试验地作为空白对照组，不施用任何土壤修复剂。连续两年统计小麦产量及病虫害发生率，结果如表2所示。同时于
2018年
收获小麦后对土壤中的重金属离子和挥发性酚类化合物的含量进一步进行检测，其试验结果见表3。
[0070] 表2小麦产量及病虫害统计
[0071]
[0072] 表3土壤中重金属含量和有机污染物含量测试结果
[0073] Pb(mg/kg) Cd(mg/kg) As(mg/kg) 挥发性有机酚
实施例3 66.5 21.7 56.5 0.035
对比例1 213.6 49.7 169.3 0.512
对比例2 243.8 55.2 169.4 0.563
对比例3 227.6 48.3 154.1 0.412
对比例4 196.3 47.9 148.2 0.542
对比例5 242.6 50.1 163.1 0.523
空白对照 267.6 66.2 188.3 0.615
[0074] 从上述表2和表3的内容可以看出，本发明制备的微生物土壤修复剂对土壤中重金属铅、铬、砷的含量及挥发性酚类化合物的含量具有明显的降低效果。这说明本发明的土壤修复剂对污染土壤具有良好的修复作用，连续使用数年可以显著提高土壤的肥力，提高作物产量和品质，降低病虫害发生率，具有良好的市场推广价值。
