技术领域

本发明涉及含有新的蛋白酶的多种洗涤组合物，这些蛋白酶是 羰基水解酶的变种。

背景

酶组成最大一类天然存在的蛋白质。每类酶一般催化(加速反 应而没有被消耗)一种不同的化学反应。有一类被称为蛋白酶的 酶，由于它们具有能够水解(及把一个化合物分解成两个或更多个 较简单的化合物，并把水分子的H和OH部分分别吸收在碎裂的 化学键的两边)其它蛋白质的能力而为人所知。这种水解蛋白质的 能力已被利用来把天然界存在的蛋白酶和经过蛋白质工程加工过的 蛋白酶，作为一种添加剂并入到洗衣用的洗涤剂制品之中。许多衣 服上的污渍是蛋白质性的，因此广谱蛋白酶能使得除去这类污渍的 能力得到重大的改进。

不幸，这些蛋白质在它们的天然的细菌环境中的有效浓度，常 常不能被转移到相对非自然的洗涤环境中。特别是，蛋白酶的特性 诸如热稳定性、pH稳定性、氧化稳定性和底物专一性等，在酶的 自然环境以外不能必然地被优化来加以利用。

蛋白酶的氨基酸序列决定了蛋白酶的特性。蛋白酶氨基酸序列 的变化可能在不同程度上改变酶的性质，甚至可能使酶失活，这取 决于在氨基酸序列中变化的位置、性质和/或数值。已经采用了一 些方法来改变酶的氨基酸序列，企图改进它们的性质，其目的在于 增进蛋白酶在诸如洗衣环境中的洗涤用途时的效率。这些方法包括 改变氨基酸序列来增进热稳定性以及在很不相同的条件下改进氧化 稳定性。

虽然在本领域中已经叙述过种种方法，但仍然继续需要新的有 效的蛋白酶变种来应用于洗涤各种表面。因此本发明的一个目的是 提供一种含有蛋白酶的洗涤组合物，这种蛋白酶是具有改进的解蛋 白活度、底物专一性、稳定性和/或增进的品质特性的羰基水解酶 变种。从以下的详尽描述中，这些目的以及其它目的将很快变得很 明显。

发明概要

本发明涉及洗涤组合物，它含有：

(a)有效量的一种蛋白酶，它是一种具有天然界未曾发现过 的氨基酸序列的羰基水解酶的变种，是通过用不同的氨基酸置换前 体羰基水解酶中的多种氨基酸残基而衍生出来的，其中在前体酶中 被置换的多个氨基酸残基位置相应于位置+76与一种或多种下列 残基位置的结合：+99、+101、+103、+104、+107、+123、 +27、+105、+109、+126、+128、+135、+156、+166、 +195、+197、+204、+206、+210、+216、+217、+218、 +222、+260、+265和/或+274，这里数字标明的位置相应于 天然存在的由解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)得到的 枯草溶菌素中的位置，或相应于在其它羰基水解酶或枯草溶菌素 (诸如迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)枯草溶菌素)中等价的氨基 酸残基；和

(b)一种或多种可与蛋白酶配伍的洗涤组合物材料。

本发明也涉及洗涤需要洗涤的物品的方法，它是通过使所说的 物品与这里描述的是一种羰基水解酶变种的蛋白酶进行接触而完成 的。因此本发明包括一种洗涤织物的方法，它包括最好是在搅拌条 件下，使所说的织物与含有所说的蛋白酶的水溶液进行接触。这方 法可在低于大约60℃以下的温度下进行，但是在直到沸点的洗衣 温度下当然也是很有效的。本发明还涉及洗涤碗碟的方法，即把需 要洗涤的碗碟与这里描述的蛋白酶接触。本发明的方法也涉及人身 洗涤的方法，所说的方法包括把人类或较低等动物身体需要洗涤的 部分与这里描述的蛋白酶接触。

附图简述

图1A～C描绘的是解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的DNA和氨 基酸序列以及这一基因的部分限制基因图谱(Seq.ID No.6)。

图2描绘的是在由解淀粉芽孢杆菌(BPN＇)和迟缓芽孢杆菌 (野生型)得来的枯草溶菌素中保存的氨基酸残基。

图3A和3B描绘的是四种枯草溶菌素的氨基酸序列。最上一 行代表由解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素(有时也称为枯草溶菌素 BPN＇)中析离的枯草溶菌素的氨基酸序列(Seq.ID No.7)。第二 行描绘由枯草杆菌(Bacillus subtilis)析离的枯草溶菌素的氨基酸 序列(Seq.ID No.8)。第三行描绘由地衣芽孢杆菌(B. Licheniformis)析离的氨基酸序列(Seq.ID No.9)。第四行描绘了 由迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)析离的枯草溶菌素(在PCT WO 89/06276中也被称为枯草溶菌素309)的氨基酸序列(Seq.ID No.10)。符号*表明与枯草溶菌素BPN＇比较不存在这一特定的 氨基酸残基。

图4描绘了质粒GGA274的构造。

图5描绘了GGT274的构造，它是为可靠表达用于本申请的 质粒的一个中间体。

图6A和图6B描绘了由迟缓芽孢杆菌析离的枯草溶菌素的 DNA和氨基酸序列(Seq.ID No.11)。成熟的枯草溶菌素蛋白质 是在相应于Ala的密码子GCG(334～336)处开始通过密码子编 码的。

图7A和7B描绘了本发明经优选的实施方案中的DNA和氨 基酸序列(N76D/S103A/V104I)(Seq.ID No.12)。这图中的 DNA已用在位置76的天冬氨酸、在位置103的丙氨酸和在位置 104的异亮氨酸编码时所描述的方法进行修饰。成熟的枯草溶菌素 变种蛋白质是在相应于Ala的密码子GCG(334～336)处开始通 过密码子编码的。

图8描绘了载体pBCDAICAT的构造。

图9描绘了载体pUCCATFNA的构造。

图10表明经优选的突变体酶在液体洗涤剂配方中比野生型的 有更好的稳定性。

发明详述 (1)蛋白酶

本发明包括蛋白酶，它是天然界不存在的羰基水解酶变种，它 和它的氨基酸序列与由之衍生的前体羰基水解酶相比，具有不同的 解蛋白活度、稳定性、底物特异性、pH性能和/或品质特性。前 体羰基水解酶可以是一种天然界存在的羰基水解酶或重组体水解 酶。具体地说，这类羰基水解酶变种具有在天然界未发现过的氨基 酸序列，它是用不同的氨基酸来置换前体羰基水解酶中的多个氨基 酸残基而衍生出来的。这多个前体酶中的氨基酸残基相应于位置 +76以及一种或多种下列残基的位置：+99、+101、+103、 +104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、 +135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、 +216、+217、+218、+222、+260、+265和/或+274，这里 数字标示的位置相应于天然界存在的由解淀粉芽孢杆菌析离的枯草 溶菌素中的位置或其它羰基水解酶或枯草溶菌素，诸如迟缓芽孢杆 菌枯草溶菌素中等价的氨基酸残基的位置。

用于本发明组合物中的羰基水解酶变种是一种蛋白酶，它包括 置换+76位置的氨基酸残基并结合一种或多种别的修饰。最好是 用于本发明的变种蛋白酶包括置换、删除或插入下列组合的氨基酸 残基： 76/99；76/101；76/103；76/104；76/107；76/123； 76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104；76/103/104； 76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103；76/99/101/104； 76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123；76/104/107/123； 76/99/101/103/104；76/99/103/104/123；76/99/101/103/104/123； 76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265；76/103/104/197； 76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126；76/103/104/107； 76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222. 最优选地是用于本发明的变种酶包括置换、删除或插入下列氨基酸 残基的组合，即解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的76/99；76/104； 76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104； 76/99/101/103/104和76/101/104。

编码这类羰基水解酶或枯草溶菌素变种的变种DNA序列是由 编码天然存在的或重组体前体酶的前体DNA序列所衍生的。这种 变种DNA序列是通过修饰前体DNA序列来编码置换一种或多种 特定的、被前体DNA序列编码的相应于解淀粉芽孢杆菌中下列位 置的氨基酸残基或它们的组合而衍生出来的：76、99、101、103、 104、107、123、27、105、109、126、128、135、156、166、 195、197、204、206、210、216、217、218、222、260、265和 /或274。虽然这里为修饰而鉴定的氨基酸残基是按照可应用于解 淀粉芽孢杆菌(它已成为在所有枯草溶菌素中惯常使用的鉴定残基 位置的方法)中的数码标志，但用于本发明的经优选的前体DNA 序列是如图6所示的迟缓芽孢杆菌的DNA序列(Seq.ID No. 11)。

这些变种DNA序列编码插入或取代氨基酸残基76并结合一 种或多种另外的修饰。最好是变种DNA序列编码取代或插入下列 组合的氨基酸残基： 76/99；76/101；76/103； 76/104；76/107；76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103； 76/101/104；76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103； 76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123； 76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123； 76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260；76/103/104/265； 76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126； 76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或76/103/104/222. 最优选地是变种DNA序列编码修饰下列残基的组合：76/99； 76/104；76/99/104；76/103/104；76/104/107；76/101/103/104； 76/99/101/103/104和76/101/104。这些重组体DNA序列编码具有 新的氨基酸序列的羰基水解酶变种，并且一般至少有一种性质是和 被前体羰基水解酶DNA序列编码的酶的同一性质有实质上的不 同。这类性质包括解蛋白活度、底物专一性、稳定性、变化了的 pH特性和/或增进的品质特性等。

这里有用的蛋白酶包括在指明的氨基酸残基位置上用天然存在 的19种L-氨基酸中的任何一种进行置换的产物。这样的置换可 以在任何前体枯草溶菌素(原核生物的、真核生物的、哺乳动物的 等)中进行。贯穿整个本申请书都是用通常的一个和三个字母代号 来表示各个氨基酸的。这样的代号已在Dale，J.W(1989)所著的 “Molecular Genetics of Bacteria”(细菌的分子遗传学)一书的附 录B中认定，John Wiley&Sons，Ltd.出版。

最好是，在每个认定的氨基酸残基位置上进行的置换包括但不 仅限于：在位置76的置换包括D、H、E、G、F、K、P和N；在 位置99的置换包括D、T、N、Q、G和S；在位置101的置换包 括G、D、K、L、A、E、S和R；在位置103的置换包括Q、T、 D、E、Y、K、G、R、S和A；在位置104的置换包括所有19种 天然界存在的氨基酸；在位置107的置换包括V、L、M、Y、G、 E、F、T、S、A、N和I；在位置123的置换包括N、T、I、G、 A、C和S；在位置27的置换包括K、N、C、V和T；在位置 105的置换包括A、D、G、R和N；在位置107的置换包括A、 L、V、Y、G、F、T、S和A；在位置109的置换包括S、K、 R、A、N和D；在位置126的置换包括A、F、I、V和G；在位 置128的置换包括G、L和A；在位置135的置换包括A、F、I、 S和V；在位置156的置换包括D、E、A、G、Q和K；在位置 166的置换包括所有天然界存在的19种氨基酸；在位置195的置 换包括E；在位置197的置换包括E；在位置204的置换包括A、 G、C、S和D；在位置206的置换包括L、Y、N、D和E；在位 置210的置换包括L、I、S、C和F；在位置216的置换包括V、 E、T和K；在位置217的置换包括所有天然界存在的19种氨基 酸；在位置218的置换包括S、A、G、T和V；在位置222的置 换包括所有天然界存在的19种氨基酸；在位置260的置换包括 P、N、G、A、S、C、K和D；在位置265的置换包括N、G、 A、S、C、K、Y和H；在位置274的置换包括A和S。在每个这 样的位置上被置换的特别优选的氨基酸被列出在下面的表I中。在 表I中虽然指明了具体的氨基酸，但应该理解在认定的残基位置上 任何一种氨基酸都可被置换。

  表I 氨基酸    被置换/插入的 残 基     经优选的氨基酸  +76      D，H  +99      D，T，N，G +101      R，G，D，K，L，A，E +103      A，Q，T，D，E，Y，K，G，R +104      I，Y，S，L，A，T，G，F，M，W，D，V，N +107      V，L，Y，G，F，T，S，A，N +123      S，T，I  +27      K +105      A，D +109      S，K，R +126      A，I，V，F +128      G，L +135      I，A，S +156      E，D，Q +166      D，G，E，K，N，A，F，I，V，L +195      E +197      E +204      A，G，C +206      L +210      I，S，C +216      V +217      H，I，Y，C，A，G，F，S，N，E，K +218      S +222      A，Q，S，C，I，K +260      P，A，S，N，G +265      N，A，G，S +274      A，S  

这些包含在迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素的等价于解淀粉芽孢杆菌 枯草溶菌素+76氨基酸残基位置上进行过活体外变更的蛋白酶产 生出枯草溶菌素变种，它呈现出超过其前体枯草溶菌素的稳定性 (例如，经改进的自解蛋白稳定性)(参见表IV和表VI)。

同样，在等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的+99、+101、 +103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、 +128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、 +210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或 +274的残基位置上进行活体外的变更，无论单独地或相互结合并 与+76位置的变更作任意组合，都会产生枯草溶菌素变种，它们 呈现改变了的解蛋白活度、改变了的热稳定性、改变了的pH特 性、改变了的底物专一性和/或改变了的品质特性。

羰基水解酶是能水解含有 键的化合物的蛋白酶，式中的X是氧或氮。它们包括天然界存在 的羰基水解酶以及羰基水解酶的重组体。天然界存在的羰基水解酶 主要包括水解酶，例如肽水解酶诸如枯草溶菌素或金属蛋白酶。肽 水解酶包括α-氨基酰基肽水解酶、肽基氨基酸水解酶、酰基氨基 水解酶、丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶、硫羟蛋白酶、羧基蛋白酶和 金属蛋白酶。丝氨酸、金属、硫羟和羧酸蛋白酶以及内型和外型蛋 白酶都被包括在内。

“重组体羰基水解酶”是指这样的羰基水解酶，其中编码天然 存在的羰基水解酶的DNA序列被修饰以产生一种突变种DNA序 列，它编码时在羰基水解酶氨基酸序列中进行置换、插入或删去一 种或多种氨基酸。合适的修饰方法已在这里被公开，也已在美国专 利4,760,025(RE34,606)、美国专利5,204,015以及美国专利 5,185,258中被公开，这些专利的公开内容在此引入作为参考。

枯草溶菌素是细菌或霉菌的羰基水解酶，它一般地作用是断裂 蛋白质或多肽的肽键。像这里使用的那样，“枯草溶菌素”意指天 然界存在的枯草溶菌素或一种重组体枯草溶菌素。已知有各种微生 物物种能产生和常常分泌出一系列的天然存在的枯草溶菌素。这一 系列中的成员的氨基酸序列不完全是同源的。但是，在这一系列中 的枯草溶菌素呈现出相同或相似类型的解蛋白活度。这类丝氨酸蛋 白酶共享有一种定义催化三单元组的共同的氨基酸序列，以此把它 们与糜蛋白酶相关类别的丝氨酸蛋白酶相区别。枯草溶菌素和糜蛋 白酶相关的丝氨酸蛋白酶二者都有包含天冬氨酸、组氨酸和丝氨酸 的催化三单元组。在枯草溶菌素相关的蛋白酶中，这些氨基酸的相 对次序，从氨基端读到羧基端是天冬氨酸-组氨酸-丝氨酸。但是 在糜蛋白酶相关的蛋白酶中，这种相对次序是组氨酸-天冬氨酸- 丝氨酸。这样，这里的枯草溶菌素是指一种具有枯草溶菌素相关的 蛋白酶的催化三单元组的丝氨酸蛋白酶。实例包括但不限于这里的 图3中所认定的那些枯草溶菌素。

“重组体枯草溶菌素”是指这样一种枯草溶菌素，其中编码这 种枯草溶菌素的DNA系列被修饰以产生一种变种(或突变种) DNA系列，它编码时在天然存在的枯草溶菌素氨基酸序列中置 换、删去或插入一种或多种氨基酸。产生这类修饰的合适的方法， 并且它也可以和这里所公开的方法结合，已被包括在美国专利 4,760,025(RE34,606)、美国专利5,204,015和美国专利 5,185,258的公开内容中。

“非人类羰基水解酶”以及对它们编码的DNA，可以由多种 原核生物的和真核生物的生物体中得到。原核生物的生物体的合适 的实例包括格兰氏阴性生物体诸如大肠杆菌(E.Coli)或假单胞菌 属(Pseudomonas)以及格兰氏阳性细菌诸如微球菌属 (Micrococcus)或杆菌。真核生物的生物体，从中可以得到羰基水 解酶和它们的基因，其实例包括酵母诸如啤酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)、霉菌诸如麴菌(Aspergillus sp.)， 以及非人类哺乳动物来源诸如，例如，小牛(bovine sp.)，从中可 得到编码羰基水解酶凝乳酶的基因。像用枯草溶菌素那样，从各种 有关的物种中可得到一系列的羰基水解酶，这些物种在它们系列的 成员之间含有的氨基酸序列不完全是同源的，但却无论如何呈现出 相同或相似类型的生物活性。例如，这里使用的非人类的羰基水解 酶具有一种功能定义，是专指直接或间接地与原核生物或真核生物 源缔合的羰基水解酶。

一种“羰基水解酶变种”具有从“前体羰基水解酶”的氨基酸 序列衍生的氨基酸序列。前体羰基水解酶(诸如一种枯草溶菌素) 包括天然存在的羰基水解酶(枯草溶菌素)和重组体羰基水解酶 (枯草溶菌素)。羰基水解酶变种的氨基酸序列是由前体水解酶的 氨基酸序列通过置换、删去或插入一种或多种前体氨基酸序列中的 氨基酸而“衍生”出来的。这样的修饰是对前体羰基水解酶(枯草 溶菌素)的氨基酸序列编码的“前体DNA序列”进行的，而不是 修改前体羰基水解酶(枯草溶菌素)的酶本身。这类修改前体 DNA序列的合适的方法包括这里公开的方法以及本领域的技术人 员熟知的方法(参看，例如，EPO328299、WO89/06279以及这 里已引入作为参考的美国专利和申请书)。

这里作为变更，认定了相应于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的位 置+76与一种或多种下列位置组合的具体残基： +99，+101，+103，+104，+107，+123，+27，+105， +109，+126，+128，+135，+156，+166，+195，+197，+204，+206，+210， +216，+217，+218，+222，+260，+265 and/or+274. 最好是修饰的残基是选自下列组合： 76/99；76/101；76/103；76/104；76/107； 76/123；76/99/101；76/99/103；76/99/104；76/101/103；76/101/104； 76/103/104；76/104/107；76/104/123；76/107/123；76/99/101/103； 76/99/101/104；76/99/103/104；76/101/103/104；76/103/104/123； 76/104/107/123；76/99/101/103/104；76/99/103/104/123； 76/99/101/103/104/123；76/103/104/128；76/103/104/260； 76/103/104/265； 76/103/104/197；76/103/104/105；76/103/104/135；76/103/104/126； 76/103/104/107；76/103/104/210；76/103/104/126/265；和/或 76/103/104/222； 最优选的组合是76/99；76/104；76/99/104；76/103/104； 76/104/107；76/101/103/104；76/99/101/103/104；和76/101/104。 这些氨基酸位置数码是指那些在图1中提供的指定给成熟的解淀粉 芽孢杆菌的枯草溶菌素的序列。但用于本发明的蛋白酶并不仅限于 这一特定的枯草溶菌素的突变体，而是扩展为在“等价”于解淀粉 芽孢杆菌枯草溶菌素中特别认定的残基位置上含有氨基酸残基的前 体羰基水解酶。最好是，前体枯草溶菌素是迟缓芽孢杆菌枯草溶菌 素，并且在迟缓芽孢杆菌中相应于上面列出的等价的氨基酸残基位 置上进行置换、删去或插入。

前体羰基水解酶的一个残基(氨基酸)等价于解淀粉芽孢杆菌 枯草溶菌素的一个残基，如果它对于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中 那个具体的残基或残基的部分是同系的(即在一级或三级结构中有 位置的对应性)或类似的(即具有相同或相似的对于结合、反应或 化学相互作用等的功能能力)。

为确立对一级结构的同系性，前体羰基水解酶的氨基酸序列被 直接与解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的一级序列以及特别是一系列已 知是枯草溶菌素中不变更的残基进行比较，这些不变更的残基的序 列是已知的。这里的图2显示了解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素和迟缓 芽孢杆菌枯草溶菌素之间保存的残基。在校准保存的残基并允许进 行必要的插入和删去以维持顺序之后(即避免保存的残基经由任意 的删去和插入而消除)，即定义了等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌 素的一级序列中特定的氨基酸残基。保存的残基的校准最好应保存 100％的这类残基。但是大于75％或甚至少至50％的保存残基的校 准也适宜于定义等价残基。应坚持保存催化三单元组 Asp32/His64/Ser221。

例如，在图3中校准了来自解淀粉芽孢杆菌、枯草杆菌、地衣 芽孢杆菌(carlsbergensis)和迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素的氨基酸 序列，以提供氨基酸序列之间最大量的同系现象。比较这些序列显 示在每种序列中都含有一些保存的残基。这些保存的残基(如 BPN＇和迟缓芽孢杆菌之间)已在图2中被认定。

这样，这些保存的残基即可被用来定义在别的羰基水解酶诸如 来自迟缓芽孢杆菌(1989年7月13日发布的PCT Publication No. WO89/06279)的枯草溶菌素中相应的等价于解淀粉芽孢杆菌枯草 溶菌素中的氨基酸残基，这里经优选的枯草溶菌素前体酶，或称作 pB92(EPO328299)的枯草溶菌素，是和优选的迟缓芽孢杆菌枯 草溶菌素高度同系的。这些枯草溶菌素中有一些的氨基酸序列在图 3A和3B中与解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的序列校准，以产生保存 的残基的最大同系现象。像能看到的那样，与解淀粉芽孢杆菌枯草 溶菌素比较，迟缓芽孢杆菌的序列中有一些删去。这样，例如，对 于在解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中的Val165等价氨基酸，在别的 枯草溶菌素如迟缓芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的就是异亮氨酸了。

这样，例如，解淀粉芽孢杆菌和迟缓芽孢杆菌两种枯草溶菌素 +76号氨基酸位置上的是天冬酰胺(N)。但是在用于本发明的经 优选的枯草溶菌素变种中，等价于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素中 +76号位置的氨基酸则被天冬氨酸置换。为说明的目的，所有这 里为置换认定的氨基酸残基与为每个这类位置进行经优选的置换的 比较被列于表II中。

                  表  II

         +76 +99 +101 +103 +104 +107 +123 杆菌          N   D    S    Q    Y    I    N (野生型) 迟缓芽孢杆菌  N   S    S    S    V    I    N (野生型) 最优选的置换  D   D    R    A   I/Y   V    S

等价残基也可以在三级结构的水平上通过为其三级结构已被X 射线晶体衍射法测定的前体羰基水解酶测定同系物来定义。等价残 基被定义为那些经校准后前体羰基水解酶和解淀粉芽孢杆菌枯草溶 菌素的特定氨基酸残基的两个或多个主链原子(在N上的N、CA 上的CA、C上的C和O上的O)的原子坐标已在0.13纳米之 内、最好是在0.1纳米之内的残基。在最好的模型被定向、并且定 位给出研究中的羰基水解酶与解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的非氢蛋 白质原子的原子坐标的最大重叠后，校准即告完成。最好的模型是 在可获得的最高分辨率时实验衍射数据给出最低R因子的晶体模 型。

其功能类似于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的特定残基的等价残 基，被定义为前体羰基水解酶的那些氨基酸，它可采取这样一种构 象，使它们或者能改变、修饰或起作用于蛋白质的结构，底物结 合，或者以一定的方式催化并归因于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的 一种特定的残基。进一步，它们是前体羰基水解酶(其三级结构已 被X射线晶体衍射法测定)的那些残基，它占据一个类似的位置 到这种程度，使得虽然给定残基的主链原子可能并不满足基于占据 同系的位置时等价性的标准，但至少有两个残基的侧链原子的原子 坐标是位于解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素相应的侧链原子的0.13纳 米以内。解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的三维结构的坐标已陈列于 EPO Publication No.0251446中(等价于美国专利申请SN 08/212,291，它的公开内容在此引入作为参考)，并可用来作为上 述略图，用来在三级结构的水平上测定等价残基。

有一些为置换、插入或删去而认定的残基是保存的残基，而另 外一些则不是。在残基不属于保存残基的情况下，一种或多种氨基 酸的置换仅限于这样的置换，即它产生的变种具有与在天然界中发 现的不相对应的氨基酸序列。在是保存残基的情况下，这样的置换 不应导致一种天然存在的序列。用于本发明的羰基水解酶变种包括 羰基水解酶变种的成熟的形式，也包括这类水解酶变种的原型或预 原型。预原型是优选的构造，因为它能使羰基水解酶变种的表达、 分泌和熟化变得容易。

“原序列”是指连接在羰基水解酶成熟形式的N端部分的氨 基酸序列，当除去它时导致出现羰基水解酶的“成熟”形式。许多 在天然界发现的蛋白酶是转移酶原的产物，并且在不存在后转移过 程时即以这种形式被表达。为生产羰基水解酶变种，具体地说枯草 溶菌素变种的一种经优选的原序列是解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素的 推定的原序列，虽然其它枯草溶菌素的原序列也可被使用。在实例 中，是使用从迟缓芽孢杆菌(ATCC21536)中得到的枯草溶菌素 的推定的原序列。

一种“讯号序列”或“预序列”是指连接在羰基水解酶的N- 端部分或原水解酶的N-端部分的任何氨基酸序列，它可能参与水 解酶的成熟形式或原型的分泌。讯号序列的这种定义是功能性的， 意谓包括所有那些被枯草溶菌素基因的N-端部分或别的在自然条 件下参与使枯草溶菌素或别的羰基水解酶奏效的可分泌的羰基水解 酶编码的氨基酸序列。用于本发明的蛋白酶利用这样的序列如这里 叙述的那样来影响羰基水解酶变种的分泌。在实例中使用的一种经 优选的讯号序列包括熔合到从迟缓芽孢杆菌得到的枯草溶菌素 (ATCC21536)讯号序列的其余部分中的解淀粉芽孢杆菌枯草溶 菌素讯号序列的头七个氨基酸残基。

一种“预原型”的羰基水解酶变种是由可用来连接在水解酶氨 基末端的具有原序列的水解酶的成熟形式以及一种可用来连接在原 序列的氨基末端的“预”或“讯号”序列所组成的。

“表达载体”是指含有一个可用来连接在合适的控制序列上的 DNA序列的DNA构造，这控制序列能在一种合适的宿主中影响所 说的DNA的表达。这样的控制序列包括一种影响转录的始发基 因、一种供选择的操纵序列用来控制这类转录、一种用来编码合适 的mRNA核蛋白体连接位置的序列和控制转录和转译的终止的序 列。这种载体可以是一种质粒、一种噬菌体粒子或简单地就是一种 潜在的基因组插入物。一旦转移进适当的宿主中，这种载体就可复 制并独立地行使宿主基因的功能，或者在某些情况下可以联合到基 因本身中去。在本说明书中，“质粒”和“载体”有时被交替使 用，因为质粒是目前最常使用的载体形式。但是，这里也包括这类 表达载体的其它形式，它起着等价的功能并在本专业中是已知的或 将成为已知的。

用于本发明的“宿主细胞”一般是原核生物或真核生物宿主， 它们最好是用在美国专利4,760,025(RE34,606)中公开的方法处 理过，以使它们不能分泌酶活性的内切蛋白酶。一种经优选的为表 达枯草溶菌素的宿主细胞是杆菌菌株BG2036，它缺乏酶活性的中 性蛋白酶和碱性蛋白酶(枯草溶菌素)。菌株BG2036的构造以 被美国专利5,264,366详尽描述过。别的为表达枯草溶菌素的宿主 细胞包括枯草杆菌I168(也已在美国专利4,760,025(RE 34,606)和美国专利5,264,366中被描述过，它的公开内容在此引 入作为参考)，以及任何合适的杆菌菌株诸如地衣芽孢杆菌和迟缓 芽孢杆菌等。

宿主细胞可用重组体DNA技术构成的载体来进行转化或转 染。这类转化的宿主细胞既能复制编码羰基水解酶的载体，也能表 达所需的羰基水解酶变种。在编码羰基水解酶变种的预型或预原型 的情况下，这类变种当被表达时即典型地被从宿主细胞分泌到宿主 细胞介质中去。

在描述两种DNA区域之间关系时所用的术语“可用来连接 的”简单地意指它们在功能方面是彼此相关的。例如，一种预序列 可用来连接到一种多肽上，如果它的功能是作为讯号序列，参与最 可能涉及讯号序列断裂的蛋白质的成熟形式的分泌。一种始发基因 可用来连接到编码序列上，如果它控制序列的转录；一种核蛋白体 连接位置可用来连接到编码序列上，如果它这样定位可允许进行转 译。

编码天然界存在的前体羰基水解酶的基因可以按照本领域的技 术人员众所周知的一般方法来得到。这种方法一般包括合成具有编 码感兴趣的水解酶区域的推定序列的标记探头、由表达这种水解酶 的生物体中制备基因库，并通过杂交到探头上从库中筛选出感兴趣 的基因。阳性杂交克隆然后被绘图并序列化。用于实例中的迟缓芽 孢杆菌基因可按美国专利5,185,258的实例1中所描述的方法克隆 化，它的公开内容在此引入作为参考。用于实例中的BPN基因可 按RE34,606中实例1中所描述的方法克隆化，它的公开内容在此 引入作为参考。

克隆化的羰基水解酶然后被用来转化宿主细胞以用来表达水解 酶。水解酶基因然后被连接进高拷贝数质粒中。这种质粒在宿主中 在下述意义上复制，即它含有众所周知的为质粒复制所必需的要 素：一种可连接到研究中的基因上的始发基因(它可以基因本身的 同系始发基因来提供，如果它被宿主识别，即被转录的话)、一个 转录终止和多聚腺苷酸化区域(是为由来自某些真核生物宿主细胞 中的水解酶基因的宿主转录的MRNA的稳定性所必需的)、它是 外源的或者可被水解酶基因的内源终止区域提供，合乎需要的是， 一种选择基因诸如一种耐受抗菌素的基因，它通过在含有抗菌素的 介质中生长使被质粒感染的宿主细胞得以连续培养维持。高拷贝数 的质粒也含有一种为宿主的复制来源，通过它能使大量质粒得以在 细胞质中产生而没有染色体的限制。但是，在本发明的范围内也包 括把水解酶基因联合多次拷贝到宿主基因组中去。这可通过用对同 系重组特别敏感的原核生物和真核生物的生物体而变得容易。

用于本发明实例中的基因是天然的迟缓芽孢杆菌基因和天然的 解淀粉芽孢杆菌基因。另外，一种合成的编码天然存在的或突变体 的前体羰基水解酶(枯草溶菌素)的基因也可被产生。在这样一种 方法中，前体水解酶(枯草溶菌素)的DNA和/或氨基酸序列被 测定。此后多次、重叠的合成单股DNA片段即被合成出来，它经 杂交和连接作用而产生一种编码前体水解酶的合成DNA。合成基 因构造的一个实例被发表于美国专利5,204,015的实例3中，它的 公开内容在此引入作为参考。

一旦天然界存在的或合成的前体羰基水解酶基因被克隆化，即 可进行一些修饰来增强超出合成天然界存在的前体羰基水解酶范围 以外的应用。这类修饰包括生产重组体羰基水解酶，如美国专利 4,760,025(RE34,606)和EPO Publication No.0251446所公开的 内容以及这里描述的生产羰基水解酶变种。

下列盒式突变方法可用来使得用于本发明的羰基水解酶变种的 构造和鉴定变得容易，虽然也可使用其它包括位置定向诱变的方 法。首先，天然存在的编码这种水解酶的基因被获得并进行全部或 部分地序列化。然后，序列在想要进行变更(删去、插入或置换) 已编码的酶中一种或多种氨基酸的一点上被校验。评估位于这一点 侧面的序列，看是否存在用一个低聚核苷酸池置换一个短的基因片 段的限制性位点，该低聚核苷酸池当被表达后将编码各种突变体。 这样的限制性位点最好是在水解酶基因中的独一无二的位置，以使 基因片段的置换变得容易。但是，任何在水解酶基因中的不是过分 冗长的方便的限制性位点都可以使用，只要是通过限制消化产生的 基因碎片能被重新装配在适当的序列中。如果在选择的位点的方便 距离内(10至15个核苷酸)不存在限制性位点，可在基因中以这 样的方式通过置换核苷酸来产生这样的位点，即在最终的构造中既 没有读码的改变，也没有编码氨基酸的改变。为改变它的序列以适 合所需要的序列进行的基因改变可按照一般已知的方法通过M13 引物延伸来完成。确定合适的侧面区域位置以及评估得出两个方便 的限制性位点序列所需要的变更的工作，可通过遗传密码的过剩、 基因的限制酶略图以及大量不同的限制酶而成为例行的常规工作。 注意如果能获得方便的位于限制性位点侧面的位点，则上述方法只 需要用来与不含一个位点的侧面区域相连接。

一旦天然存在的DNA或合成的DNA被克隆化，位于要被变 更的位置侧面的限制性位点即用关连限制酶消化，许多末端端基互 补的低聚核苷酸盒带即被连接到基因中。诱变作用通过这种方法而 被简化，因为所有的低聚核苷酸都可这样来合成使具有同样的限制 性位点，并且不必用合成的连接来造成这种限制性位点。

如这里使用的，解蛋白活度被定义为每毫克活性酶中肽键的水 解速率。已存在许多众所周知的实验程序可用来测量解蛋白活度 (参见K.M.Kalisz“Microbial Proteinase”，Advancesin Biochemical Engineering/Biotechnology，A.Fiechter ed.，1988) (“微生物蛋白酶，高等生物化学工程/生物技术”，A.Fiechter 出版，1988)。除了解蛋白活度以外，或者作为一种替代物来修饰 解蛋白活度，本发明的变种酶还可以有其它的经修饰的特性诸如 Km、Kcat、Kcat/Km比率和/或经修饰的底物专一性和/或经修 饰的pH活性特性。这些酶可以为预期存在的特定的底物而进行剪 裁，例如，为诸如洗衣用的水解过程中的底物。

一个目标是保证得到一种与前体羰基水解酶比较具有改变了的 解蛋白活度的变种羰基水解酶，因为这种活度的增加(数值增大) 能更有效地使酶作用于目标底物上。同样感兴趣的是与前体比较， 具有改变了的热稳定性和/或改变了的底物专一性的变种酶。最好 是被变更的羰基水解酶是一种枯草溶菌素。在枯草溶菌素类型的羰 基水解酶中用来得到这样的结果的具体氨基酸位置，等价于解淀粉 芽孢杆菌枯草溶菌素中的+76、+99、+101、+103、+104、 +107、+123、+27、+105、+109、+126、+128、+135、 +156、+166、+195、+197、+204、+206、+210、+216、 +217，+218、+222、+260、+265和/或+274，或者它们的 任意组合，这些氨基酸在实例中提供。在一些场合中，可能需要较 低的解蛋白活度。相反，在另一些场合中则可能需要变种酶的解蛋 白活度比它的前体更高。另外，还可能期望增加或降低(改变)变 种的无论是对碱还是对热的稳定性。在Kcat、Km或Kcat/Km值 方面的增加或降低对于用来测定这些动力学参数的底物是专一性 的。

同样，已经测定，在枯草溶菌素中等价于+76位置并结合一 些其它位置的修饰，对于调制酶的整体稳定性和/或解蛋白活度是 重要的。例如，像在实例中说明的那样，在经优选的蛋白酶中，在 迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素的等价于+76的位置上天冬酰胺(N)可 用天冬氨酸(D)置换，并结合修饰一种或多种下列氨基酸残基： +99、+101、+103、+104、+107、+123、+27、+105、 +109、+126、+128、+135、+156、+166、+195、+197、 +204、+206、+210、+216、+217、+218、+222、+260、 +265和/或+274，以便在得到的变种酶中产生增进了的稳定性 和/或增进的活性。

用于本发明的最优选的蛋白酶已在实例中被陈述。这些包括以 下特定的置换残基的组合：N76D/S99D；N76D/V104I；N76D/ S99D/V104I；N76D/S103A/V104I；N76D/V104I/I107V； N76D/V104Y/I107V以及N76D/S101R/S103A/V104I。这些 置换最好是在迟缓芽孢杆菌(重组体或天然的)枯草溶菌素中进 行，虽然置换也可以在任何一种杆菌的枯草溶菌素中进行。

基于用这种和其它变种枯草溶菌素得到的结果，可明显看出解 淀粉芽孢杆菌羰基水解酶中等价于位置+76、+99、+101、 +103、+104、+107、+123、+27、+105、+109、+126、 +128、+135、+156、+166、+195、+197、+204、+206、 +210、+216、+217、+218、+222、+260、+265和/或 +274上的残基对于这些酶的解蛋白活度、品质和/或稳定性以及 这类变种酶的清洗或洗涤品质是重要的。

下面通过实例来提供来提供用于本发明组合物中的蛋白酶的制 造方法。

蛋白酶制造实例

为枯草杆菌中GG36基因表达的构造

克隆化和为来自迟缓芽孢杆菌的枯草溶菌素基因表达的构造， 基本上和美国专利5,185,258中描述的相同。质粒GGA274(描述 于这里的图4中)进一步用如图5所示的方式进行修饰。在构造 GGA274质粒过程中引入的Pstl位点通过下面将会描述的低聚核苷 酸定向诱变的方法，用一种含有下列序列：5＇ GAAGCTGCAACTCGTTAAA3＇(Seq.ID No.1)的低聚核苷酸除 去。下面画有一横线的“A”残基消除限制酶Pstl的认别序列，并 在位置274上把相应的氨基酸从丙氨酸改变成苏氨酸。在位置274 上的苏氨酸是原来发现在克隆化的迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素基因中 的野生型残基。编码枯草溶菌素的DNA片段被EcoRI和BamHI 消化产物从质粒GGA274或它的衍生物(GGT274被表示在图5 中)上切除。这DNA碎片再被半克隆化回到用作诱变的基于噬菌 体M13的载体，诸如MP19中。诱变之后，EcoRI和HindIII消化 产物，在克隆化之后，即履行工作移动变更过的枯草溶菌素基因回 到表达质粒诸如GGA274中，以便表达和回收变更过的枯草溶菌 素蛋白质。

低聚核苷酸定向的诱变

低聚核苷酸定向诱变是按Zoller，M.等人在(1983)Methods Enzymo1.，100：468～500中描述的方法来进行的。作为一个实 例，一种合成的具有5＇GCTGCTCTAGACAATTCG3＇(Seq.ID No.2)序列的低聚核苷酸被用来改变位置76的氨基酸残基，使它 从天冬酰胺(N)变为天冬氨酸(D)，或N76D。下方画横线的 “G”和“C”残基指示由野生型基因序列发生的变化。CA使亮氨 酸保留在位置+75上并改变这种氨基酸序列来引入一个xbal限制 酶(TCTAGA)的xbal识别位点，同时在GAC处的改变把在+76 位置上的天冬酰胺变成天冬氨酸。

为了在位置99、101、103和104处进行诱变，可依照所需变 更的结合来使用不同的低聚核苷酸。例如，具有序列为5＇ GTATTAGGGGCGGACGGTCGAGGCGCCATCAGCTCGATT3＇ (Seq.ID No.3)的一种低聚核苷酸被用来同时在一个单一的枯草 溶菌素分子中进行下列改变：S99D；S101R；S103A和V104I。相 似地，一种序列为5＇ TCAGGTTCGGTCTCGAGCGTTGCCCAAGGATTG3＇(Seq.ID No.4)的低聚核苷酸和一种序列为5＇ CACGTTGCTAGCTTGAGTTTAG3＇(Seq.ID No.5)的低聚核苷 酸被分别用来产生I107V和N123S。同样，画横线的残基指示由 野生型序列发生的变化，它可产生所期望的或者是氨基酸序列的变 化、或者是限制酶识别序列的变化。

枯草溶菌素变种的解蛋白活度

按照前述低聚核苷酸定向诱变的方法，制造了列在表III上的变 种。每一种这样的枯草溶菌素变种的解蛋白活度也列在表III上。用 P.Bonneau等人(1991)在J.Am.Chem.Soc.，Vol.113，No. 3，P1030所述的方法测量合成的多肽底物丁二酰基-L-丙氨-L -丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰对硝基苯胺水解的动力学参数 Kcat、Km和Kcat/Km。简而言之，把枯草溶菌素储备溶液的小 的等分溶液，加到含有溶解在pH值为8.6的0.1M Tris-HCl缓 冲液中的底物的1厘米比色池中，并恒温在25℃。反应进程用分 光光度法跟踪，即监测在410纳米处反应产物对硝基苯胺的吸光 度。通过一种非线性回归算法使每种反应的反应速率和产物浓度符 合Michaelis-Menten方程，来得到动力学参数。

          表III 测量迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素和变种的 动力学参数Kcat、Km和Kcat/Km 蛋白酶#                                           kcat(s-1)KM(M)kcat/KM                酶变种                                                            (s-1M-1) -    迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素               170    0.00078    2.18×105 -    N76D                                 219    0.0008     2.74×105 1    N76D/S99D                            88     0.00061    1.44×105 2    N76D/S101R                           371    0.0013     2.85×105 3    N76D/S103A                           400    0.0014     2.86×105 4    N76D/V104I                           459    0.0011     4.17×105 5    N76D/I107V                           219    0.0011     1.99×105 6    N76D/N123S                           115    0.0018     6.40×104 7    N76D/S99D/S101R                      146    0.00038    3.84×105 8    N76D/S99D/S103A                      157    0.0012     1.31×105 9    N76D/S99D/V104I                      247    0.00097    2.55×105 10   N76D/S101R/S103A                     405    0.00069    5.90×105 11   N76D/S101R/V104I                     540    0.00049    1.10×106 12   N76D/S103A/V104I                     832    0.0016     5.20×105 13   N76D/V104I/I107V                     497    0.00045    1.10×106 14   N76D/V104Y/I107V                     330    0.00017    1.90×106 15   N76D/V1041/N123S                     251    0.0026     9.65×104 16   N76D/I107V/N123S                     147    0.0035     4.20×104 17   N76D/S99D/S101R/S103A                242    0.00074    3.27×105 18   N76D/S99D/S101R/V104I                403    0.00072    5.60×105 19   N76D/S99D/S103A/V104I                420    0.0016     2.62×105 20   N76D/S101R/S103A/V104I               731    0.00065    1.12×106 21   N76D/S103A/V104I/N123S               321    0.0025     1.23×105 22   N76D/V104I/I107V/N123S               231    0.003      7.70×104 23   N76D/S99D/S101R/S103A/V104I          624    0.00098    6.37×105 24   N76D/S99D/S103A/V104I/N123S          194    0.0043     4.51×104 25   N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S    311    0.0023     1.35×105

列于表III的结果说明，所有试验的枯草溶菌素变种保持着解蛋 白活度。进一步，对数据的详尽分析表明，通过在等价于解淀粉芽 孢杆菌枯草溶菌素中的76、99、101、103、104、107和123这些 氨基酸残基位置上进行各种置换的组合，可以有意义地改变迟缓芽 孢杆菌枯草溶菌素的解蛋白活度。

枯草溶菌素的热稳定性

通过上述低聚核苷酸定向诱变方法制得的本发明的迟缓芽孢杆 菌枯草溶菌素及其变种的观测到的热稳定性的比较被显示在表IV 中。把纯化过的酶在0.1M甘氨酸0.01％Tween-80pH10.0缓冲 液中的浓度为15微克/毫升的溶液，加有或不加50mM CaCl2， 等分到小试管中并在10℃保温5分钟，10°至60℃保温超过1分 钟，在60℃保温20分钟。然后把试管放在冰上10分钟。把试管 中的等分溶液加到含有1.2mM的合成多肽底物丁二酰-L-丙氨 -L-丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰-对硝基苯胺溶解在0.1M  tris-HCl的pH值为8.6的缓冲液中所形成的溶液并恒温在25℃的1 厘米比色池中，以试验酶的活性。最初的线性反应速率是用分光光 度法通过监测反应产物对硝基苯胺在410纳米处的吸光度作为时间 的函数来跟踪的。提供的数据为加热前的百分数活度。列于表IV的 结果指出在加入50mM CaCl2的试验条件下许多变种(26个当中 的24个)呈现出和迟缓芽孢杆菌差不多的热稳定性。在没有加50 mM CaCl2的试验条件下有许多变种(26个当中的19个)其稳定 性明显地要比迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素的更好。进一步，在没有加 50mM CaCl2的试验条件下，变种N76D/S99D、N76D/V104I、 N76D/S99D/V104I、N76D/S103A/V104I、N76D/V104I/ I107V、N76D/V104Y/I107V和N76D/S101R/S103A/V104I 比单一置换的变种N76D要明显地更稳定。

                  表IV

测量迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素及其变种的热稳定性

pH值10，60℃，加入或不加入50mM CaCl2

                               初始活性的保留值％

酶                             -CaCl2     +CaCl2 迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素              2           96 N76D                                34          97 N76D/S99D                           49          98 N76D/S101R                          0           82 N76D/S103A                          26          92 N76D/V104I                          58          98 N76D/I107V                          32          96 N76D/N123S                          0           97 N76D/S99D/S101R                     30          100 N76D/S99D/S103A                     36          100 N76D/S99D/V104I                     48          97 N76D/S101R/S103A                    26          100 N76D/S101R/V104I                    38          100 N76D/S103A/V104I                    58          100 N76D/V104I/I107V                    60          97 N76D/V104Y/I107V                    48          74 N76D/V104I/N123S                    0           98 N76D/I107V/N123S                    16          100 N76D/S99D/S101R/S103A               38          100 N76D/S99D/S101R/V104I               33          100 N76D/S99D/S103A/V104I               38          98 N76D/S101R/S103A/V104I              40          99 N76D/S103A/V104I/N123S              1           98 N76D/V104I/I107V/N123S              3           99 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I         36          99 N76D/S99D/S103A/V104I/N123S         2           95 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S   0           100

用由质粒噬菌体产生的单股DNA

 模板进行低核苷酸定向诱变 A.迟缓芽孢杆菌变种的构造

诱变的实验程序基本上和前面在低聚核苷酸定向诱变中所描述的 相同。单股DNA模板是通过质粒噬菌体方法来产生的。为构造产生 这种单股DNA模板的质粒噬菌体载体，我们首先构造载体 pBCDAICAT。载体构造的流程图被概括于图8中。首先，来自 pC194质粒的编码CAT基因的Clal至Clal碎片(参见Horinouchi，S. 和Weisblum，B.，J.Bacteril.，150：8-15，1982)被克隆化进行 pUC19的多链接区域的Accl位点上(New England BioLabs，Beverly， MA)以制造质粒pUCCHL，并且由GG36DAI编码DNA5＇端的 EcoRI-Dral0.6KB碎片被克隆化进入pBSKS质粒(stratagene.Inc.， San diego，CA)的EcoRI和EcoRV位点，以制造pBC2SK5。质粒 pBC2SK5的单一EcoRI位点通过EcoRI消化而消除，接着被填充到 被T4催化的DNA聚合酶中，并重新连接以产生没有EcoRI位点的 质粒pBC2SK-5R。被克隆化进入pBCSK-5R中的EcoRI-Dral碎 片以Pstl-HindIII碎片的形式被析离并克隆化到pUCCHL(pUC19 多链区的一部分)的Pstl-HindIII位点以产生质粒pUCCHL 5R。 GG36DAI的编码序列被切除成为EcoRI-BamHI碎片并克隆化到 pUCCHL 5R的EcoRI-BamHI位点上以制造pUCCAT。然后把 pUCCAT的大的EcoRI-HindIII碎片克隆化到BS2KS+的EcoRI和 HindIII位点上以产生质粒pBCDAIVCAT。

为产生单股DNA，含有pBCDAICAT的大肠杆菌用噬菌体 R408(可由stratagene，San Diego，CA购得)感染，这可按照 Russel.M.，Kidd，S，和Kelley，M.R.在GENE45：333～338， 1986中所叙述的实验程序来进行。一旦获得单股DNA模板，即可 实施前面在低聚核苷酸定向诱变中叙述过的标准的诱变方法。一些 突变体的构造为说明的目的详述如下：

为构造迟缓芽孢杆菌(GG36)N76D/S103A/V104I/ L217H，可将编码GG36 N76D/S103A/V104I的EcoRI-BamHI DNA碎片用于构造pUCCAT(参见图8)以产生质粒 pBCDAICAT，在按上述实验程序制得单股DNA模板后，即可用 具有下列序列 * *** **x Cla/

5＇TAT GCC AGC CAC AAC GGT ACT TCG ATG GCT3＇(Seq.ID No.13) 的诱变引物来制造L217H。像前面那样，下边画有横线的残基是指 明已进行的核苷酸变化，xclal是指存在的clal位点在诱变后已被消 除。诱变的实验程序已在前面低聚核苷酸定向诱变中描述过。诱变 以后，质粒DNA首先被筛选出消除了Clal位点的，并且那些失去 Clal位点的克隆被拿去进行DNA序列分析以证实在第217号氨基 酸残基位置上实施了把L变为H的DNA序列。 B.BPN＇变种的构造以及它们在枯草杆菌中的表达

解淀粉芽孢杆菌(BPN＇)N76D/Q103A/Y104I/Y217L的构 造除两个连续步骤以外是以相似的方式来进行的。先把N76D引入 BPN＇Y217L以制造BPN＇N76D/Y217L，第二次诱变把BPN＇ N76D/Y217L转化成BPN＇N76D/Q103A/Y104I/Y217L。为产 生第一次诱变所需的单股DNA模板，可用编码BPN＇Y217L枯草 溶菌素的EcoRI-BamHI碎片(是由Y217L质粒衍生的，已被描 述于Wells，J.等人在PNAS，84，5167，1087发表的论文中)来构 造质粒pUCCATFNA(参见图9)。含有BPN＇Y217L的 pUCCATFNA质粒被用来构造pBCFNACAT质粒(图9)。像前 面叙述的那样就产生单股DNA。为产生BPN＇N76D/Y217L，可 用一种具有以下序列的低聚核苷酸引物： * *** **XbaI

5＇C ACA GTT GCG GCT CTA GAT AAC TCA ATC GGT G3＇ (Seq ID No.14) 来产生改变N76D。然后由含有BPN＇N76D/Y217L的 pBCFNACAT质粒来制备单股DNA(N76D诱变后的 pBCFNACAT质粒)并用另一种具有以下序列的低聚核苷酸： * *** **xPvuII

5＇GCT GAC GGT TCC GGC GCT ATT AGT TGG ATC ATT3＇ (Seq.ID No.15) 诱变而得到BPN＇N76D/Q103A/Y104I/Y217L。涉及的克隆 化、单股DNA制备、诱变以及突变体的筛选所有这些步骤都如上 面叙述过的方法来进行。BPN＇基因以及它的变种的表达可通过直 接把质粒DNA(含有不同变种BPN＇基因的pBCFNACAT)连接 到枯草杆菌的缺乏蛋白酶的菌株中来完成，如RE34,606中所描述 的那样。

像每个这些蛋白酶制造实例所教授的那样，已制造了许多变 种。为这些变种测定了动力学数据和稳定性数据。动力学数据是按 前面描述过的方法产生的并被提供于表V中。稳定性数据的产生将 在此详述，结果列于表VI中。

热稳定性试验程序

纯化过的酶被缓冲液交换到0.1M甘氨酸·pH10.0、含有 0.01％Tween-80的缓冲液中，这可通过把酶加到含有用这种缓冲 液平衡过的Sephadex G-25的层析柱上，并用同样的缓冲液把酶 从柱上洗脱下来而实施。

往含有0.1M甘氨酸、0.01％Tween，pH为10.0并恒温在 60℃的缓冲液的试管中，加入经缓冲液交换过的酶，使最终酶的浓 度为15微克/毫升。

在不同时间从60℃的恒温液中取出等分的试样并立即试验酶 的活性，即把它加入一个1厘米的比色池中，其中含有1.2mM合 成肽底物丁二酰基-L-丙氨-L-丙氨-L-脯氨-L-苯丙氨酰 对硝基苯胺的溶解在pH值为8.6并恒温在25℃的0.1M tris-HCl缓冲溶液中而形成的溶液。最初的线性反应速率可通过监测反 应产物对硝基苯胺在410纳米处的吸光度作为时间的函数来进行分 光光度法跟踪。

半衰期，即50％的酶失活所需时间的长度，是通过在60℃恒 温溶液的反应速率作为时间函数的一级图形而测出的。

在表VI中提供的数据是按在相同条件下测定迟缓芽孢杆菌枯草 溶菌素(GG36)半衰期的百分数来表示的。

                        表V

酶                             kcat   KM     kcat/KM

                              (s-1)  (mM)   (s-1M-1) 迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素             170    0.78   2.20E+05 N760/S103G/V104I*                 380    1.4    2.70E+05 N76D/S103A/V104F                   730    0.33   2.20E+06 N76D/S103A/V104N                   790    2.8    2.80E+05 N76D/S103A/V104S                   170    0.83   2.00E+05 N76D/S103A/V104T                   370    1.9    2.00E+05 N76D/S103A/V104W                   880    0.31   2.80E+06 N76D/S103A/V104Y                   690    0.5    1.40E+06 K27R/N76D/V104Y/N123S              500    1.2    4.20E+05 N76D/S101G/S103A/V104I*           620    1.3    4.80E+05 N76D/S103A/V104I/S105A*           550    1.3    4.20E+05 N76D/S103A/V104I/S105D*           440    1.7    2.60E+05 N76D/S103A/V104T/I107A*           120    5.7    2.10E+04 N76D/S103A/V104T/I107L*           310    3.2    9.70E+04 N76D/S103A/V104I/L126A             90     2.2    4.10E+04 N76D/S103A/V104I/L126F             180    1.9    9.50E+04 N76D/S103A/V104I/L126I             100    2.4    4.20E+04 N76D/S103A/V104I/L126V             64     3.2    2.00E+04 N76D/S103A/V104I/S128G*           560    1.7    3.30E+05 N76D/S103A/V104I/S128L*           430    3.8    1.10E+05 N76D/S103A/V104I/L135A             140    0.76   1.80E+05 N76D/S103A/V04I/L135F              390    0.69   5.70E+05 N76D/S103A/V104I/L135I             110    0.73   1.50E+05 N76D/S103A/V104I/L135V             140    0.86   1.60E+05 N76D/S103A/V104I/S156E*           170    2.6    6.50E+04 N76D/S103A/V104I/S166D*           160    3.5    4.60E+04 N76D/S103A/V104I/D197E             510    1.4    3.60E+05 N76D/S103A/V104I/N204A*           530    1.1    4.80E+05 N76D/S103A/V104I/N204G*           580    1.4    4.10E+05 N76D/S103A/V104I/N204C*           370    1.3    2.90E+05 N76D/S103A/V104I/P210I*           500    1.2    4.20E+05 N76D/S103A/V104I/L217H*           80     0.63   1.30E+05 N76D/S103A/V104I/M222A             70     3.1    2.30E+04 N76D/S103A/V104I/M222S             80     3.1    2.60E+04 N76D/S103A/V104I/T260P             660    1.5    4.40E+05 N76D/S103A/V104I/S265N             590    1.3    4.50E+05 K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S        220    1.4    1.60E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E        430    1.1    3.90E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C        400    1.1    3.60E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L        440    1.2    3.70E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V        440    1.2    3.70E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S        760    0.98   7.80E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/7260P        410    1.2    3.40E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A          390   1      3.90E+05 N76D/S103A/V104I/L126F/S265N         170   2.1    8.10E+04 N76D/S103A/V104I/S156E/S166D*       40    6.3    6.40E+03 K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E    410   0.98   4.20E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S    540   0.66   8.20E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S    770   0.79   9.80E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S    610   0.99   6.20E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S    580   0.78   7.40E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P    660   1      6.60E+05 K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A    590   0.89   6.60E+05 K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T  520   1      5.20E+05 274A K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N  460   0.65   7.10E+05 218S     解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素(BPN’)      50    0.14   3.60E+05 BPN’-N76D/Y217L*                   380   0.46   8.30E+05 *带星号的这些突变体是用由噬菌体质粒产生的单股DNA模板进行低聚核苷 酸定向诱变而制出的；所有其它不带星号的则是按前面所叙述的低聚核苷酸 定向诱变方法制出的。

                   表VI

酶                          热稳定性

                        (天然酶的半衰期％) 迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素             100 N76D                               590 N76D/S99D                          840 N76D/S103A                         390 N76D/V104I                         660 N76D/I107V                         710 N76D/N123S                         70 N76D/S99D/S101R                    610 N76D/S99D/S103A                    590 N76D/S99D/V104I                    910 N76D/S101R/S103A                   930 N76D/S101R/V104I                   500 N76D/S103A/V104I                   460 N76D/S103G/V104I*                 370 N76D/S103A/V104F                   480 N76D/S103A/V104N                   230 N76D/S103A/V104S                   230 N76D/S103A/V104T                   370 N76D/S103A/V104W                   280 N76D/S103A/V104Y                   400 N76D/V104I/I107V                   940 N76D/V104Y/I107V                   820 N76D/V104I/N123S                   80 N76D/I107V/N123S                   150 K27R/N76D/V104Y/N123S              100 N76D/S99D/S101R/S103A              570 N76D/S99D/S101R/V104I              1000 N76D/S99D/S103A/V104I              680 N76D/S101G/S103A/V104I*           390 N76D/S101R/S103A/V104I             470 N76D/S103A/V104I/S105A*           360 N76D/S103A/V104I/S105D*           370 N76D/S103A/V104T/I107A*           270 N76D/S103A/V104T/I107L*           230 N76D/S103A/V104I/N123S             110 N76D/V104I/I107V/N123S             220 N76D/S103A/V104I/L126A             270 N76D/S103A/V104I/L126F             950 N76D/S103A/V104I/L126I             410 N76D/S103A/V104I/L126V             320 N76D/S103A/V104I/S128G*           640 N76D/S103A/V104I/S128L*           760 N76D/S103A/V104I/L135A             230 N76D/S103A/V104I/L135F             200 N76D/S103A/V104I/L135I             510 N76D/S103A/V104I/L135V             500 N76D/S103A/V104I/S156E*           120 N76D/S103A/V104I/S166D*           590 N76D/S103A/V104I/D197E             460 N76D/S103A/V104I/N204A*           230 N76D/S103A/V104I/N204G*           240 N76D/S103A/V104I/N204C*           500 N76D/S103A/V104I/P210I*           1370 N76D/S103A/V104I/L217H*           60 N76D/S103A/V104I/M222A             520 N76D/S103A/V104I/M222S             490 N76D/S10A/V104I/T260P              490 N76D/S103A/V104I/S265N             360 K27R/N76D/V104Y/I107V/N123S        210 K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E        120 K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C        110 K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L              380 K27R/N76D/V104Y/N123S/S216V              140 K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S              270 K27R/N76D/V104Y/N123S/T260P              40 K27R/N76D/V104Y/N123S/T274A              60 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I              590 N76D/S99D/S103A/V104I/N123S              110 N76D/S103A/V104I/L126F/S265N             810 N76D/S103A/V104I/S156E/S166D*           220 K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/G197E        90 K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/N218S        250 K27R/N76D/V104Y/N123S/D197E/N218S        270 K27R/N76D/V104Y/N123S/N204C/N218S        460 K27R/N76D/V104Y/N123S/Q206L/N218S        1400 K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T260P        310 K27R/N76D/V104Y/N123S/N218S/T274A        180 N76D/S99D/S101R/S103A/V104I/N123S        90 K27R/N76D/V104Y/Q109S/N123S/N218S/T274   230 K27R/N76D/V104Y/N123S/G195E/D197E/N21    240 解淀粉芽孢杆菌枯草溶菌素(BPN*)          100 BPN＇-N76D/Y217L*                       420 *带星号的这些突变体是用由噬菌体质粒产生的单股DNA模板进行低聚核苷 酸定向诱变而制出的；所有其它不带星号的则是按前面所叙述的低聚核苷酸 定向诱变方法制出的。 (3)洗涤组合物材料

本发明的清洗组合物除前面叙述的漂白剂和蛋白酶以外，也包 括一种或多种可以和蛋白酶配伍的清洗组合物材料。术语“清洗组 合物材料”，像这里使用的，意指任何选自特定类型所需的清洗组 合物以及产物形式(例如液体、颗粒、喷雾组合物)的液体、固体 或气体材料，这些材料也可以和用于组合物中的蛋白酶配伍。清洗 组合物材料的具体选择可通过考虑被清洗的表面、物件或织物以及 所需的在使用过程的清洗条件下组合物的形式(例如通过洗涤剂使 用)而容易地做出决定。术语“可配伍的”，像这里使用的，是指 洗涤组合物材料不致降低蛋白酶的解蛋白活度到这种程度，以致在 正常使用的情形下不再像期望那样有效。具体的洗涤组合物材料将 在后面举例详尽说明。

有效量的一种或多种上述蛋白酶被包括在组合物中，用来洗涤 许多需要除去蛋白质污渍的表面。这样的洗涤组合物包括为洗涤硬 表面的形式不限(例如，液体或颗粒状)的洗涤剂组合物；为洗涤 织物的形式不限(例如，颗粒状、液体和棒状配方)的洗涤剂组合 物；洗碟用组合物(形式不限)；口腔洗涤组合物，形式不限(例 如，牙粉，牙膏和漱口剂配方)；以及假牙洗涤组合物，形式不限 (例如，液体、片状)。像这里所用的，“有效量的蛋白酶”是指 为必须达到的酶活性在具体的洗涤组合物中所需的前面叙述的蛋白 酶的量。这样的有效量能容易地为本领域的技术人员所确定，并且 它基于许多因素，诸如使用的特定的酶的变种、洗涤施用情况、洗 涤组合物的具体组分，以及所需的组合物是液体还是干的(例如颗 粒或条状)等等。

优选地是本发明的洗涤组合物中含有由大约0.0001％至大约 10％的一种或多种蛋白酶，更优选地是含有大约0.001％至大约1 ％、还更优选地是含有大约0.001％至大约0.1％。下面将进一步详 尽讨论可能使用蛋白酶的各种洗涤组合物的一些实例。这里使用的 所有份数、百分数和比率除非特别说明都是以重量计算的。

如这里所使用的，“非织物洗涤组合物”包括硬表面洗涤组合 物、洗碟组合物、口腔用洗涤组合物、假牙洗涤组合物以及人身洗 涤组合物等。 A.用于硬表面、碗碟和织物的洗涤组合物

蛋白酶可用于任何需要有高度起泡性和/或良好的除去不溶性 底物的洗涤剂组合物中。这样，蛋白酶可以和各种通常的组分一起 使用来提供充分配制好的硬表面洗涤剂、洗碗碟组合物、织物洗涤 组合物等。这样的组合物可做成液体、颗粒、条棒等形式、这样的 组合物可被配制成近代“浓缩”的洗涤剂，其中含有多达30％～ 60％的表面活性剂。

这种洗涤组合物可任选地，并且优选地，含有各种阴离子的、 非离子的、两性离子的等类型的表面活性剂。这类表面活性剂存在 的典型浓度为组合物的大约0.1％至大约60％、优选地是大约1％ 至大约35％。

这里使用的表面活性剂的非限制性的实例包括通常的C11～C18 烷基苯磺酸盐、一级和任意的烷基硫酸盐、C10～C18二级(2，3) 烷基硫酸盐，其通式为CH3(CH2)x(CHOSO3)-M+)CH3和 CH3(CH2)y(CHOSO3-M+)CH2CH3，其中x和(y+1)是至少为大 约7的整数，最好是至少为大约9的整数，M是一种水溶性的阳 离子，特别是钠，C10～C18烷基烷氧基硫酸酯(特别是EO 1～7 乙氧基硫酸酯)、C10～C18烷基烷氧基羧酸酯(特别是EO 1～7 乙氧基羧酸酯)、C10～C18烷基聚糖苷以及它们相应的硫酸化的聚 糖苷、C12～C18α-磺化的脂肪酸酯、C12～C18烷基和烷基酚烷 氧化物(特别是乙氧化物和混合的乙氧化/丙氧化物)、C12～C18 三甲铵乙内酯以及磺化的三甲铵乙内酯(“sultaines”)、C10～ C18胺氧化物、C8-C24肌氨酸盐(特别是油酰基肌氨酸盐)、等 等。在这里烷基烷氧基硫酸酯(AES)和烷基烷氧基羧酸酯 (AEC)是优选的。(使用这类表面活性剂结合前面说过的胺氧化 物和/或三甲铵乙内酯或磺化的三甲铵乙内酯表面活性剂也是优选 的，这取决于配方师的需要)。其它通常使用的表面活性剂已被列 出在标准的教科书中。特别有用的表面活性剂包括C10～C18N-甲 基葡糖酰胺，它已被公开于1993年3月16日授予Connor等人的 美国专利5,194,639中，在此引入作为参考。

特别有用的是非离子性表面活性剂一类，它是环氧乙烷与一个 憎水部分的缩合产物，它提供一种其平均的亲水亲油平衡值 (HLB)在5至17、优选地是6至14、更优选地是7至12范围 内的表面活性剂。憎水(亲油)部分在性质上可以是脂肪的或芳香 的，并且与任何特定的憎水基团缩合的聚氧乙烯基的长度可被容易 地调节，以产生一种水溶性的化合物，它在亲水和憎水元素之间具 有所期望的平衡程度。特别优选的是每摩尔醇含有3～8摩尔环氧 乙烷的C9～C15一级醇乙氧化物(或混合的乙氧化/丙氧化物)、 尤其是每摩尔醇含有6～8摩尔环氧乙烷的C14～C15一级醇乙氧化 物、每摩尔醇含有3～5摩尔环氧乙烷的C12～C15一级醇乙氧化 物、以及它们的混合物。

多个其它用于洗涤剂洗涤组合物中的组分也可包括在这里的组 合物中，包括其它活性组分、载体、水溶助长剂、操作助剂、染料 或颜料、液体配方的溶剂等。如果希望额外增强起泡作用，可往组 合物中加入促泡剂诸如C10～C16醇酰胺，使用的典型浓度为大约 1％至大约10％。这类促泡剂的典型类别有一乙醇和二乙醇酰胺。 把这类促泡剂与高度起泡的辅助表面活性剂诸如前面提到的胺氧化 物、三甲铵乙内酯和磺化的三甲铵乙内酯一起使用是有益处的。如 果需要，可溶性的镁盐诸如MgCl2、MgSO4等也可被加入，其浓 度典型地是在大约0.1％至大约2％之间，以提供额外的起泡作 用。

这里的液体洗涤剂组合物可含有水和别的溶剂作为载体。低分 子量的一级或二级醇例如甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇都是合适的溶 剂。为溶解表面活性剂、一元醇是优选的，但是也可以使用那些含 有大约2至大约6个碳原子以及大约2至大约6个羟基的多元醇 (例如1，3-丙二醇、乙二醇、甘油和1，2-丙二醇)。组合物中可 含有大约5％至大约90％、典型地是大约10％至大约50％的这类 载体。

这里的洗涤剂组合物最好是这样来配制，即在水溶液洗涤操作 过程中使洗涤水的pH值在大约6.8至大约11.0之间。这样做成的 产品典型地是在这一范围内配制的。在推荐使用的浓度控制pH的 技术包括使用缓冲剂、碱、酸等，对本领域的技术人员这是众所周 知的。

当配制本发明的硬表面洗涤组合物和织物洗涤组合物使，配方 师可能愿意使用浓度为大约5％至大约50％(重量)的各种增效 剂。典型的增效剂包括1～10微米的沸石、聚羧酸盐诸如柠檬酸盐 和氧联二丁二酸盐、层状硅酸盐、磷酸盐等。其它通常的增效剂已 被列举在标准的配方中。

同样，配方师可能愿意在这样的组合物中使用各种其它的酶， 诸如纤维素酶、脂酶、淀粉酶、过氧化物酶以及蛋白酶，典型地使 用浓度为大约0.001％至大约1％(重量)。在洗衣洗涤剂领域中 各种照顾到洗涤和织物的酶是众所周知的。

各种漂白化合物，诸如过碳酸盐、过硼酸盐等也可被用于这类 组合物中，典型的使用浓度为大约1％至大约15％(重量)。如果 需要，这类组合物也可含有漂白活化剂诸如四乙酰基乙二胺、壬酰 氧基苯磺酸盐等，它们在本领域中也是已知的。使用的浓度典型地 是在大约1％至大约10％(重量)范围内。

各种污垢释出剂，特别是阴离子低聚酯类、各种螯合剂、特别 是氨基膦酸盐和乙二胺二丁二酸盐、各种除尘土污垢剂、特别是乙 氧化的四亚乙基五胺、各种分散剂、特别是聚丙烯酸酯和聚天冬氨 酸酯、各种增白剂、特别是阴离子增白剂、各种染料转移抑制剂、 诸如聚乙烯基吡咯烷酮、各种抑泡剂、特别是聚硅氧烷和二级醇、 各种织物软化剂、特别是绿土和粘土絮凝聚合物(例如聚(氧乙 烯))等也可被用于这类组合物中，使用的浓度范围在大约1％至 大约35％(重量)之间。标准的配方和已公开的专利包含多种这 类常用材料的详尽描述。

酶稳定剂也可用于本发明的洗涤组合物中。这类酶稳定剂包括 丙二醇(含量最好在大约1％至大约10％)、甲酸钠(含量最好在 大约0.1％至大约1％)以及甲酸钙(含量最好在大约0.1％至大约 1％)。 1.硬表面洗涤组合物

像这里使用的“硬表面洗涤组合物”一词是指用来洗涤硬表面 诸如地板、墙壁、浴室瓷砖等的液体和颗粒状洗涤剂组合物。本发 明的硬表面洗涤组合物含有有效量的一种或多种蛋白酶，其含量优 选地为组合物中活性蛋白酶的大约0.0001％至大约10％，更优选 地是大约0.001％至大约5％，最优选地是大约0.001％至大约 1％。除含有一种或多种蛋白酶以外，这类硬表面洗涤组合物典型 地含有一种表面活性剂和一种水溶性的多价螯合增效剂。但是，在 一些特型产物诸如喷雾洗窗剂中有时不用表面活性剂，因为它们可 能在玻璃表面产生薄雾/条纹状残迹。

表面活性剂组分在存在时的含量，可以小至这里的组合物的 0.1％，但典型地是在组合物中含有大约0.25％至大约10％，更优 选地是含有大约1％至大约5％的表面活性剂。

典型地，这种组合物中含有大约0.5％至大约50％的洗涤增效 剂，最好含有大约1％至大约10％。最好是pH值是在大约8至 12范围内。通常的pH调节剂诸如氢氧化钠、碳酸钠或盐酸都可使 用，如果调节是必需的话。

溶剂可被包括在组合物中。有用的溶剂包括、但不限于，乙二 醇醚诸如二乙二醇单己醚、二乙二醇单丁醚、乙二醇单丁醚、乙二 醇单己醚、丙二醇单丁醚、二丙二醇单丁醚，以及二醇类诸如 2，2，4-三甲基-1，3-戊二醇和2-乙基-1，3-己二醇。当使用 时，这类溶剂典型地存在浓度为大约0.5％至大约15％，优选地是 大约3％至大约11％。

另外，高度挥发性的溶剂诸如异丙醇或乙醇也可用于本发明组 合物中，使得当“全强度”施用这种组合物于表面后，表面仍未被 洗净时能让组合物从表面较快地挥发变得容易。当使用时，挥发性 溶剂在组合物中典型存在的浓度为大约2％至大约12％。

本发明的硬表面洗涤组合物实施方案将通过以下非限制性的实 例来阐明。(在下面的实例中，在实例中给“蛋白酶”标上的号码 是指用于本发明组合物中具有前面表III中给出的编号的变种)。

                实例1～6

          液体硬表面洗涤组合物

                        实例编号 组  分           1    2     3     4     5      6 蛋白酶#12        0.05 0.02  0.02  0.03  0.10   0.03 蛋白酶#4         -     -    -     -     0.02   0.02 EDTA**          -     -    2.90  2.90  -      - 柠檬酸钠         -     -    -      -    2.90   2.90 C12烷基苯磺酸钠 1.95  -    1.95   -    1.95   - C12烷基硫酸钠   -     2.20  -     2.20  -     2.20 C12(乙氧基)硫   -     2.20  -     2.20  -     2.20 酸钠*** C12二甲胺氧化物 -     0.50  -     0.50  -     0.50 异丙基苯磺酸钠   1.30  -     1.30  -     1.30  - 己基卡必醇***   6.30  6.30  6.30  6.30  6.30  6.30 水****                    平衡到100％

注** 乙二胺四醋酸四钠盐

***  二乙二醇单己醚

**** 整个配方调节到pH值为7。

在实例1～4中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和13～ 25号、包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白酶来 代替12号蛋白酶，得到基本上类似的结果。

在实例5和6中，也曾用表III、V和VI中列举的用于本发明的 蛋白酶当中的任意组合物来代替12号和4号蛋白酶，也得到基本 类似的结果。

              实例7～12

洗涤硬表面和除去家具霉菌的喷雾组合物

                         实例编号 组  分              7    8    9    10   11   12 蛋白酶#12           0.20 0.05 0.10 0.30 0.20 0.30 蛋白酶#4            -    -    -    -    0.30 0.10 辛基硫酸钠          2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 十二碳烷基硫酸钠    4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 氢氧化钠            0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 0.80 硅酸盐(Na)          0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 香料                0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 0.35 水                            平衡到100％

产物pH值为大约7。

在实例7～10中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。

在实例11和12中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明 的蛋白酶当中的任意组合物来代替12号和4号蛋白酶，也得到基 本类似的结果。 2.洗碗碟组合物

在本发明的另一个实施方案中，洗碗碟组合物含有一种或多种 蛋白酶。像这里所使用的，“洗碗碟组合物”一词是指所有形式的 洗涤碗碟的组合物，包括但不限于，颗粒状的和液体形式的。本发 明的洗碗碟组合物的实施方案可用下面的实例来阐明。

                   实例13～18

                  洗碗碟组合物

                            实例编号 组  分                13    14    15    16    17     18 蛋白酶#12             0.05  0.50  0.02  0.40  0.10   0.03 蛋白酶#4              -     -     -     -     0.40   0.02 C12～C14N-甲基      0.90  0.90  0.90  0.90  0.90   0.90   葡糖酰胺 C12乙氧(1)           12.00 12.00 12.00 12.00 12.00  12.00   硫酸盐 2-甲基-十一           4.50  4.50  -     4.50  4.50   -   碳酸 C12乙氧(2)           4.50  4.50  4.50  4.50  4.50   4.50   羧酸盐 C12醇乙氧化物        3.00  3.00  3.00  3.00  3.00   3.00   (4) C12胺氧化物          3.00  3.00  3.00  3.00  3.00   3.00 异丙基苯磺酸钠        2.00  2.00  2.00  2.00  2.00   2.00 乙醇                  4.00  4.00  4.00  4.00  4.00   4.00 Mg++(以MgCl2        0.20  0.20  0.20  0.20  0.20   0.20   的形式) Ca++(以CaCl2        0.40  0.40  0.40  0.40  0.40   0.40   的形式) 水                               平衡到100％

产物pH值被调节至7。

在实例13～16中，曾用列举在表III中的蛋白酶1-11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。

在实例17和18中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明 的蛋白酶当中的任意组合物来代替12号和4号蛋白酶，也得到基 本类似的结果。

                   实例19

            颗粒状自动洗碗碟组合物 组  分                              A    B    C 柠檬酸                              15.0 -    - 柠檬酸盐                            4.0  29.0 15.0 丙烯酸酯/甲基丙烯酸酯共聚物         6.0  -    6.0 丙烯酸马来酸共聚物                  -    3.7  - 干燥的添加碳酸盐                    9.0  -    20.0 碱金属硅酸盐                        8.5  17.0 9.0 石蜡                                -    0.5  - 苯并二唑                            -    0.3  - Termamyl 60T                        1.5  1.5  1.0 蛋白酶#12(4.6％金属小球)            1.6  1.6  1.6 过碳酸盐(AvO)                       1.5  -    - 过硼酸盐—水合物                    -    0.3  1.5 过硼酸盐四水合物                    -    0.9  - 四乙酰基乙二胺                      3.8  4.4  - 二亚乙基三胺五甲基膦酸(Mg盐)        0.13 0.13 0.13 烷基乙氧基硫酸盐-3倍乙氧化的        3.0  -    - 烷基乙氧丙氧基非离子型表面活性剂    -    1.5    - 抑泡剂                              2.0  -      - Olin SLF18非离子型表面活性剂        -    -      2.0 硫酸盐                             平衡至100％

在实例19A～C中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。在实例19A～C 中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白酶当中的任意 组合物来代替12号蛋白酶，也得到基本类似的结果。 3.织物洗涤组合物

在本发明的另一个实施方案中，织物洗涤组合物含有一种或多 种蛋白酶。像这里所使用的，“织物洗涤组合物”是指所有形式的 用来洗涤织物的洗涤剂组合物，包括但不限于颗粒状的、液体的和 条棒状的。 a.颗粒状的织物洗涤组合物

本发明的颗粒状织物洗涤组合物包含有效量的一种或多种蛋白 酶，其含量最好是组合物中活性酶的重量的大约0.001％至大约10 ％，更优选地是大约0.005％至大约5％，还更优选地是大约0.01 ％至大约1％。除了一种或多种蛋白酶以外，这种颗粒状织物洗涤 组合物中典型地还含有至少一种表面活性剂、一种或多种增效剂以 及，在某些情况下，一种漂白剂。

本发明的颗粒状织物洗涤组合物的实施方案可通过以下实例来 阐明。

                    实例20～23

               颗粒状织物洗涤组合物

                                   实例编号 组  分                         20     21     22     23 蛋白酶#12(4％小球)             0.10   0.20   0.03   0.05 蛋白酶#4(4％小球)              -      -      0.02   0.05 C13线型烷基苯磺酸盐           22.00  22.00  22.00  22.00 磷酸盐(以三聚磷酸钠的形式)     23.00  23.00  23.00  23.00 碳酸钠                         23.00  23.00  23.00  23.00 硅酸钠                         14.00  14.00  14.00  14.00 沸石                           8.20   8.20   8.20   8.20 螯合剂(二乙二三胺五乙酸)       0.40   0.40   0.40   0.40 硫酸钠                         5.50   5.50   5.50   5.50 水                                    平衡到100％

在实例20～21中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。

在实例22和23中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明 的蛋白酶当中的任意组合物来代替12号和4号蛋白酶，也得到基 本类似的结果。

                  实例24～27

             颗粒状织物洗涤组合物

                                  实例编号 组  分                          24    25    26    27 蛋白酶#12(4％小球)              0.10  0.20  0.03  0.05 蛋白酶#4(4％小球)               -     -     0.02  0.05 C12烷基苯磺酸盐                12.00 12.00 12.00 12.00 沸石A(1～10微米)                26.00 26.00 26.00 26.00 2-丁基辛酸                      4.00  4.00  4.00  4.00 C12～C14二级(2，3)烷基硫酸盐  5.00  5.00  5.00  5.00   (钠盐) 柠檬酸钠                        5.00  5.00  5.00  5.00 荧光增白剂                      0.10  0.10  0.10  0.10 硫酸钠                          17.00 17.00 17.00 17.00 填料，水，次要组分                    平衡到100％

在实例24和25中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本上类似的结果。

在实例26和27中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明 的蛋白酶当中的任意组合物来代替12号和4号蛋白酶，也得到基 本类似的结果。

         实例28和29

     颗粒状织物洗涤组合物

                        实例编号 组  分                     28      29 线型烷基苯磺酸盐           11.4    10.70 牛脂烷基硫酸盐             1.80    2.40 C14～C15烷基硫酸盐       3.00    3.10 C14～C15醇7倍乙氧化物    4.00    4.00 牛脂醇11倍乙氧化物         1.80    1.80 分散剂                     0.07    0.1 聚硅氧烷流体               0.80    0.80 柠檬酸三钠                 14.00   15.00 柠檬酸                     3.00    2.50 沸石                       32.5    32.10 马来酸丙烯酸共聚物         5.00    5.00 二亚乙基三胺五亚甲基膦酸   1.00    0.20 蛋白酶#12(4％小球)         0.30    0.30 脂酶                       0.36    0.40 淀粉酶                     0.30    0.30 硅酸钠                     2.00    2.50 硫酸钠                     3.50    5.20 聚乙烯基吡咯烷酮           0.30    0.50 过硼酸盐                   0.50    1.0 酚磺酸盐                   0.1     0.2 过氧化物酶                 0.1     0.1 次要组分                   加到100％

            实例30和31

        颗粒状织物洗涤组合物

                           实例编号 组  分                         30    31 线型C12烷基苯磺酸钠           6.5   8.0 硫酸钠                         15.0  18.0 沸石A                          26.0  22.0 次氯基三乙酸钠                 5.0   5.0 聚乙烯基吡咯烷酮               0.5   0.7 四乙酰基乙二胺                 3.0   3.0 硼酸                           4.0   - 过硼酸                         0.5   1.0 酚磺酸盐                       0.1   0.2 蛋白酶#12(4％小球)             0.4   0.4 填充剂(例如硅酸盐、碳酸盐、    加到100   香料、水)

               实例32

      紧密的颗粒状织物洗涤组合物 组  分                       重量％ 烷基硫酸盐                    8.0 烷基乙氧基硫酸盐              2.0 C25和C45醇3倍和7倍乙氧化物  6.0   的混合物 聚羟基脂肪酸酰胺              2.5 沸石                              17.0 层状硅酸盐/柠檬酸盐               16.0 碳酸盐                            7.0 马来酸丙烯酸共聚物                5.0 污垢释出聚合物                    0.4 羧甲基纤维素                      0.4 聚(4-乙烯基吡啶)-N-氧化物         0.1 乙烯基咪唑和乙烯基吡咯烷酮的共    0.1   聚物 PEG2000                           0.2 蛋白酶#12(4％小球)                0.5 脂酶                              0.2 纤维素酶                          0.2 四乙酰基乙二胺                    6.0 过碳酸盐                          22.0 乙二胺二丁二酸                    0.3 抑泡剂                            3.5 4，4＇-双(2-吗啉基-4-苯胺基-      0.25   s-三嗪-6-基氨基)二苯乙烯   -2，2＇-二磺酸二钠盐 4，4＇-双(2-磺酸基肉桂基)联苯     0.05   二钠盐 水、香料和次要组分               加到100

             实例33

       颗粒状织物洗涤组合物 组  分                      重量％ 线型烷基苯磺酸盐              7.6 C16～C18烷基硫酸盐          1.3 C14-15醇7倍乙氧化物           4.0 椰-烷基-二甲基羟乙基氯化铵    1.4 分散剂                        0.07 聚硅氧烷流体                  0.8 柠檬酸三钠                    5.0 沸石4A                        15.0 马来酸丙烯酸共聚物            4.0 二亚乙基三胺五亚甲基膦酸      0.4 过硼酸盐                      15.0 四乙酰基乙二胺                5.0 绿土                          10.0 聚(氧乙烯)(分子量300,000)     0.3 蛋白酶#12(4％小球)            0.4 脂酶                          0.2 淀粉酶                        0.3 纤维素酶                      0.2 硅酸钠                        3.0 碳酸钠                        10.0 羧甲基纤维素                  0.2 增白剂                        0.2 水、香料和次要组分          加到100

                   实例34

            颗粒状织物洗涤组合物 组  分                             重量％ 线型烷基苯磺酸盐                    6.92 牛脂烷基硫酸盐                      2.05 C14-15醇7倍乙氧化物                 4.4 C12-15烷基乙氧硫酸盐-3倍乙氧化物   0.16 沸石                                20.2 柠檬酸盐                            5.5 碳酸盐                              15.4 硅酸盐                              3.0 马来酸丙烯酸共聚物                  4.0 羧甲基纤维素                        0.31 污垢释出聚合物                      0.30 蛋白酶#12(4％小球)                  0.2 脂酶                                0.36 纤维素酶                            0.13 过硼酸盐四水合物                    11.64 过硼酸盐一水合物                    8.7 四乙酰基乙二胺                      5.0 二亚乙基三胺五亚甲基膦酸            0.38 硫酸镁                              0.40 增白剂                              0.19 香料、聚硅氧烷、抑泡剂              0.85 次要组分                          加到100

在这里的实例28～34的每个实例中，曾用列举在表III中的蛋 白酶1～11号和13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用 于本发明的蛋白酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。也 曾在实例28～34中用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白酶 当中的任意组合物来代替12号蛋白酶，也得到基本类似的结果。 b.液体织物洗涤组合物

本发明的液体织物洗涤组合物包含有效量的一种或多种蛋白 酶，其含量优选地是组合物的活性蛋白酶重量的大约0.0001％至大 约10％，更优选地是大约0.001％至大约1％，最优选地是大约 0.001％至大约0.1％。这样的液体织物洗涤组合物典型地还另外包 含一种阴离子表面活性剂、一种脂肪酸、一种水溶性的洗涤增效剂 以及水。

本发明的液体织物洗涤组合物的实施方案将通过以下的实例来 阐明。

              实例35～39

          液体织物洗涤组合物

                         实例编号 组  分                 35    36    37    38    39 蛋白酶#12              0.05  0.03  0.30  0.03  0.10 蛋白酶#4               -     -     -     0.01  0.20 C12～C14烷基硫酸钠   20.0  20.0  20.0  20.0  20.0 2-丁基辛酸             5.00  5.00  5.00  5.00  5.00 柠檬酸钠               1.00  1.00  1.00  1.00  1.00 C10醇乙氧化物(3)      13.00 13.00 13.00 13.00 13.00 一乙醇胺          2.50  2.50  2.50  2.50  2.50 水/丙二醇/乙醇            平衡到100％   (100∶1∶1)

在实例35～37中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。

在实例38～39中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明 的蛋白酶当中的任意组合物来代替12号和4号蛋白酶，也得到基 本类似的结果。

                实例40～41

            液体织物洗涤组合物

                                 实例编号

组  分                           40   41

C12-14烯基丁二酸                3.0  8.0

柠檬酸一水合物                  10.0 15.0

C12-15烷基硫酸钠                8.0  8.0

C12-15醇2倍乙氧化物的硫酸钠盐   -    3.0

C12-15醇7倍乙氧化物             -    8.0

C12-15醇5倍乙氧化物             8.0  -

二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)       0.2  -

油酸                             1.8  -

乙醇                             4.0  4.0

丙二醇                           2.0  2.0

蛋白酶#12                        0.2  0.2

聚乙烯基吡咯烷酮    1.0    2.0

抑泡剂              0.15   0.15

NaOH                调到pH值为7.5

过硼酸盐            0.5    1.0

酚磺酸盐            0.1    0.2

过氧化物酶          0.4    0.1

水和次要组分        加到100份

在这里的实例40和41的每个实例中，曾用列举在表III中的蛋 白酶1～11号和13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用 于本发明的蛋白酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。也 曾在实例40和41中，用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白 酶当中的任意组合物来代替12号蛋白酶，也得到基本类似的结 果。 c.条棒状织物洗涤组合物

适合于手洗污垢织物的本发明的条棒状织物洗涤组合物包含有 效量的一种或多种蛋白酶，其含量最好是组合物重量的大约 0.001％至大约10％，更优选地是大约0.01％至大约1％。

本发明的条棒状织物洗涤组合物的实施方案可通过以下的实例 来阐明。

               实例42～45

          条棒状织物洗涤组合物

                            实例编号 组  分                     42    43    44    45 蛋白酶#12                  0.3   -     0.1   0.02 蛋白酶#4                   -     -     0.4   0.03 C12～C16烷基硫酸钠       20.0  20.0  20.0  20.00 C12～C14N-甲基葡糖酰胺   5.0   5.0   5.0   5.00 C11～C13烷基苯磺酸钠     10.0  10.0  10.0  10.00 碳酸钠                     25.0  25.0  25.0  25.00 焦磷酸钠                   7.0   7.0   7.0   7.00 三聚磷酸钠                 7.0   7.0   7.0   7.00 沸石A(0.1μ～10μ)         5.0   5.0   5.0   5.00 羧甲基纤维素               0.2   0.2   0.2   0.20 聚丙烯酸酯(MW1400)         0.2   0.2   0.2   0.20 椰脂酸-乙醇胺酰胺          5.0   5.0   5.0   5.00 增白剂、香料               0.2   0.2   0.2   0.2 CaSO4                     1.0   1.0   1.0   1.00 MgSO4                     1.0   1.0   1.0   1.00 水                         4.0   4.0   4.0   4.00 填充剂*                          平衡到100％

注*可选自方便的材料诸如CaCO3、滑石、粘土、硅酸盐 等。

在实例42和43中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表V1中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。

在实例44和45中，也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明 的蛋白酶当中的任意组合物来代替12号和4号蛋白酶，也得到基 本类似的结果。 B.其它的洗涤组合物

除了上面讨论过的硬表面洗涤、碗碟洗涤和织物洗涤组合物以 外，一种或多种蛋白酶也可加入各种其它的需要水解一种不溶性底 物的洗涤组合物中去。这类其它的洗涤组合物包括但不限于，口腔 用洗涤组合物、假牙洗涤组合物以及触点镜头洗涤组合物等。

1.口腔用洗涤组合物

在本发明的另一个实施方案中，药物上可接受量的一种或多种 蛋白酶被包括在组合物中，用来从牙齿或假牙上除去蛋白质性的污 渍。像这里所使用的，“口腔用洗涤组合物”是指洗牙水、牙膏、 牙胶、牙粉、漱口剂、口腔喷雾剂、口腔胶、口香糖、糖锭、香 粉、药片、生物胶、预防膏、牙科用溶液等。优选地是，本发明的 口腔洗涤组合物含有组合物重量的大约0.0001％至大约20％的一 种或多种蛋白酶、更优选地是大约0.001％至大约10％，还更优选 地是大约0.01％至大约5％的蛋白酶，以及一种药物上可接受的载 体。像这里所使用的，“药物上可接受的”意指这一术语所描述的 药物、药剂或惰性组分是适宜于用来和人类和较低等动物的组织相 接触，而没有不应有的毒性、不相容性、不稳定性、刺激性、过敏 性反应等，并有相称的合理的受益/风险比率。

典型地，这种口腔洗涤组合物的口腔洗涤组分的药物上可接受 的口腔洗涤载体组分通常含量为组合物重量的大约50％至大约 99.99％，优选地是大约65％至大约99.99％，更优选地是大约 65％至大约99％。

可被包括在本发明的口腔洗涤组合物中的药物上可接受的载体 组分和供选择的组分，对于本领域的技术人员是众所周知的。有许 多用于口腔洗涤组合物的组合物类型、载体组分和供选择的组分已 被公开于1992年3月17日授权的Seibel的美国专利5,096,700、 1991年7月2日授权的Sampathkumar的美国专利5,028,414、 1991年7月2日授权的Benedict、Bush和Sunberg的美国专利 5,028,415中，所有这些专利都在此引入作为参考。

本发明的口腔洗涤组合物的实施方案将通过以下的实例来阐 明。

              实例46～49

             洗牙水组合物

                                实例编号 组  分                     46      47      48      49 蛋白酶#12                  2.000   3.500   1.500   2.000 山梨醇(70％水溶液)         35.000  35.000  35.000  35.000 PEG-6*                    1.000   1.000   1.000   1.000 硅石牙科磨蚀剂**          20.000  20.000  20.000  20.000 氟化钠                     0.243   0.243   0.243   0.243 二氧化钛                   0.500   0.500   0.500   0.500 糖精钠                     0.286   0.286   0.286   0.286 烷基硫酸钠(27.9％水溶液)   4.000   4.000   4.000   4.000 调味剂                     1.040   1.040   1.040   1.040 羧乙烯基聚合物***       0.300 0.300 0.300 0.300 Carrageenan****         0.800 0.800 0.800 0.800 水                            平衡到100％

注*PEG-6＝分子量为600的聚乙二醇

**   沉淀的硅石被鉴定为J.M.Huber提供的Zeodent 119

***  B.F.Goodrich化学公司提供的Carbopol

**** Hercules化学公司提供的Iota Carrageenan。

在实例46～49中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。在实例46～49中， 也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白酶当中的任意组合 物来代替12号蛋白酶，也得到基本类似的结果。

                  实例50～53

                 漱口剂组合物

              实例编号 组  分      50    51    52    53 蛋白酶#12   3.00  7.50  1.00  5.00 SDA40醇     8.00  8.00  8.00  8.00 调味剂      0.08  0.08  0.08  0.08 乳化剂      0.08  0.08  0.08  0.08 氟化钠      0.05  0.05  0.05  0.05 甘油        10.00 10.00 10.00 10.00 增香剂      0.02  0.02  0.02  0.02 苯甲酸      0.05  0.05  0.05  0.05 氢氧化钠    0.20  0.20  0.20  0.20 染料     0.04 0.04 0.04 0.04 水           平衡到100％

在实例50～53中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。在实例50～53中， 也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白酶当中的任意组合 物来代替12号蛋白酶，也得到基本类似的结果。

                   实例54～57

                   糖锭组合物

                   实例编号 组  分      54       55       56       57 蛋白酶#12   0.01     0.03     0.10     0.02 山梨糖醇    17.50    17.50    17.50    17.50 甘露糖醇    17.50    17.50    17.50    17.50 淀粉        13.60    13.60    13.60    13.60 增香剂      1.20     1.20     1.20     1.20 调味剂      11.70    11.70    11.70    11.70 颜料        0.10     0.10     0.10     0.10 玉米糖浆              平衡到100％

在实例54～57中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。在实例54～57中， 也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白酶当中的任意组合 物来代替12号蛋白酶，也得到基本类似的结果。

                  实例58～61

                 口香糖组合物

                             实例编号 组  分                58       59       60       61 蛋白酶#12             0.03     0.02     0.10     0.05 山梨糖醇晶体          38.44    38.40    38.40    38.40 Paloja胶基*          20.00    20.00    20.00    20.00 山梨糖醇(70％水溶液)  22.00    22.00    22.00    22.00 甘露糖醇              10.00    10.00    10.00    10.00 甘油                  7.56     7.56     7.56     7.56 调味剂                1.00     1.00     1.00     1.00

注*L.A.Dreyfus公司提供。

在实例58～61中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。在实例58～61中， 也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白酶当中的任意组合 物来代替12号蛋白酶，也得到基本类似的结果。 2.假牙洗涤组合物

在本发明的另一个实施方案中，为在口腔外洗涤假牙的假牙洗 涤组合物含有一种或多种蛋白酶。这种假牙洗涤组合物包含有效量 的一种或多种蛋白酶，其含量优选地是组合物重量的大约0.0001％ 至大约50％的一种或多种蛋白酶、更优选地是大约0.001％至大约 35％、还更优选地是大约0.01％至大约20％，以及一种假牙洗涤 载体。各种假牙洗涤组合物形式诸如起泡沫的药片等在本领域内是 众所周知的(参看例如Young的美国专利5,055,305，在此引入作 为参考)，并且为从假牙上除去蛋白质性的污渍而并入一种或多种 蛋白酶一般也是合适的。

本发明的假牙洗涤组合物的实施方案将通过下面的实例来阐 明。

                   实例62～65

              双层起泡假牙洗涤药片

                               实例编号

组  分                  62     63     64      65

酸性层

蛋白酶#12               1.0    1.5    0.01    0.05

酒石酸                  24.0   24.0   24.00   24.00

碳酸钠                  4.0    4.0    4.00    4.00

氨基磺酸                10.0   10.0   10.00   10.00

PEG20.000               4.0    4.0    4.00    4.00

碳酸氢钠                24.5   24.5   24.50   24.50

过硫酸钾                15.0   15.0   15.00   15.00

酸性焦磷酸钠            7.0    7.0    7.00    7.00

焦化硅石                2.0    2.0    2.00    2.00

四乙酰基乙二胺          7.0    7.0    7.00    7.00

蓖麻油酰基磺化丁二酸盐  0.5    0.5    0.50    0.50

调味剂                  1.0    1.0    1.00    1.00

碱性层

过硼酸钠一水合物        32.0   32.0   32.00   32.00

碳酸氢钠                19.0   19.0   19.00   19.00

EDTA           3.0    3.0    3.00    3.00

三聚磷酸钠     12.0   12.0   12.00   12.00

PEG20,000      2.0    2.0    2.00    2.00

过硫酸钾       26.0   26.0   26.00   26.00

碳酸钠         2.0    2.0    2.00    2.00

焦化硅石       2.0    2.0    2.00    2.00

染料/调味剂    2.0    2.0    2.00    2.00

在实例62～65中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。在实例62～65中， 也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白酶当中的任意组合 物来代替12号蛋白酶，也得到基本类似的结果。 3.人身洗涤组合物

在本发明的另一个实施方案中，为洗涤皮肤(以液体和条棒的 形式)的人身洗涤组合物包含一种或多种蛋白酶。这类组合物中蛋 白酶的含量典型地是组合物重量的大约0.001％至大约5％，优选     地是大约0.005％至大约2％，最优选地是大约0.01％至大约0.8 ％。像这里描述的其中包含有蛋白酶的经优选的人身洗涤组合物已 在美国专利申请SN 08/121,623和SN 08/121,624中讲授过，这两 项专利都是Visscher等人在1993年9月14日提出申请的，它们 的公开说明书在此全部引入作为参考。这类组合物将通过以下实例 来阐明。

                       实例66

            含肥皂的液体人身洗涤组合物 组  分                      重量％ 肥皂(钾或钠)                15.00 30％月桂酸酯 30％肉豆蔻酸酯 25％软脂酸酯 15％硬脂酸酯 脂肪酸(按上述比率)            4.50 月桂基肌氨酸钠                6.00 Laureth-3硫酸钠               0.66 椰油酰胺基丙基三甲铵乙内酯    1.33 甘油                          15.00 丙二醇                        9.00 Polyquaternium10              0.80 乙二醇二硬脂酸酯(EDTA)        1.50 对羟基苯甲酸丙酯              0.10 对羟基苯甲酸甲酯              0.20 蛋白酶#12                     0.10 KOH或NaOH            如果必需用来调节pH值 硫酸钙                        3 醋酸                          3 水                       平衡到100

                   实例67

             人身洗涤条状组合物

组  分                   重量％

椰脂酰基羟乙磺酸钠        47.20

鲸蜡酰基硫酸钠            9.14

石蜡                      9.05

钠肥皂(就地形成)          3.67

羟乙磺酸钠                5.51

氯化钠                    0.45

二氧化钛                  0.4

EDTA三钠盐                0.1

Trisodium Etidronate      0.1

香料                      1.20

Na2SO4                  0.87

蛋白酶#12                 0.10

水/次要组分           平衡到100

在实例66～67中，曾用列举在表III中的蛋白酶1～11号和 13～25号，包括其它被描述于表V和表VI中的用于本发明的蛋白 酶来代替12号蛋白酶，得到基本类似的结果。在实例66～67中， 也曾用表III、V和VI中列出的用于本发明的蛋白酶当中的任意组合 物来代替12号和4号蛋白酶，也得到基本类似的结果。

                    实例68

                 洗涤品质试验

用于本发明组合物中的蛋白酶变种的洗涤性能，是通过测量除 去EMPA116棉布小块布样上的污渍(血液/奶/炭黑在棉布上) (Testfabrics.Inc.，Middlesex，NJ07030)来评价的。

把6块剪成3×4-1/2英寸带锯齿边的EMPA116布样放在含 有1000毫升硬度为15gpg(Ca++：Mg++为3∶1重量∶重量)的 水、7克洗涤剂和合适的酶的7243S Terg-O-Tometer型洗涤机 (United States Testing Co.，Inc.，Hoboken，NJ出品)的每个罐中。 所用洗涤剂是德国wfk-Testgewebe GmbH，Adlerstrasse42， Postfach130762，D-47759Krefeld，生产的WFKl洗涤剂：

组 分                    最终配方中的％

沸石A                         25％

硫酸钠                        25％

苏打灰                        10％

线型烷基苯磺酸盐              8.8％

醇乙氧化物(7～8EO)            4.5％

钠肥皂                        3％

硅酸钠(SiO2∶Na2O为3.3∶1)  3％

往这基础洗涤剂中加入以下组分：

组分                    最终配方中的％

过硼酸钠一水合物              13％

共聚物(Sokalan CP5)           4％

TAED(Mykon ATC Green)         3％

酶                            0.5％

增白剂(Tinopal AMS-GX)        0.2％

过硼酸钠一水合物是从Degussa Corporation，Ridgefield-Park. NJ07660买来的。Sokalan CP5是从BASF Corporation，Parsippany， NJ07054买来的。Mykon ATC Green(TAED，四乙酰基乙二胺) 是从英国Warwick International，Limited，Mostyn，Holywell，Clwyd CH8 9HE买来的。Tinopal AMS GX是从Ciba-Geigy Corporation， Greensboro，NC27419买来的。

6块EMPA116布样在60℃在含有酶的洗涤剂中洗涤30分 钟，接着在1000毫升水漂洗两次，每次5分钟。为做标准曲线， 所加酶的最终浓度为0.05至1ppm；为日常分析用，酶的浓度为 0.25ppm。布样被干燥和挤压后，用CR200型Minolta Chroma Meter(Minolta Corporation的产品，Ramsey，NJ07446)基于 L*a*b*标度的L值测量布样的反射度。品质用迟缓芽孢杆菌 (GG36)蛋白酶品质的百分数来报告，它是通过用需要达到同样 除污品质的变种蛋白酶的量来除迟缓芽孢杆菌(GG36)蛋白酶的 量，再乘100计算出来的。数据被列于表VII中。

                    表VII

酶                          洗涤品质 迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素             100 N76D                               310 N76D/S103A                         230 N76D/V104I                         130 N76D/V107V                         160 N76D/S99D/S101R                    370 N76D/S99D/S103A                    290 N76D/S101R/S103A                   130 N76D/S101R/V104I                   300 N76D/S103A/V104I                   320 N76D/S103G/V104I                   160 N76D/S103A/V104F                   210 N76D/S103A/V104N                   110 N76D/S103A/V104T                   170 N76D/V104I/I107V                   210 N76D/S99D/S101R/S103A              220 N76D/S99D/S101R/V104I              140 N76D/S101G/S103A/V104I             170 N76D/S101R/S103A/V104I             150 N76D/S103A/V104I/S105A             170 N76D/S103A/V104T/I107A             120 N76D/S103A/V104T/I107L             110 N76D/S103A/V104I/L126F             110 N76D/S103A/V104I/S128G             280 N76D/S103A/V104I/L135I             160 N76D/S103A/V104I/L135V             160 N76D/S103A/V104I/D197E             170 N76D/S103A/V104I/N204A             160 N76D/S103A/V104I/N204G             150 N76D/S103A/V104I/P210I             470 N76D/S103A/V104I/M222A             100 N76D/S103A/V104I/T260P             280 N76D/S103A/V104I/S265N             190

                     实例69

         在液体洗涤剂配方中蛋白酶的稳定性

在液体洗涤剂配方中对蛋白酶失活稳定性的比较试验，是按照 这里概括的实验程序对迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素和它的变种酶 N76D/S103A/V104I进行的。为研究所用的洗涤剂配方，是从市 场买来的由The Procter&Gamble公司在美国制造的瓶装Tide Ultra液体洗衣洗涤剂。洗涤剂配方必须先经热处理以使其中就地 形成的酶失活。这可通过把这种洗涤剂在96℃保温4.5小时来完 成。把浓度范围在20克/立升酶的迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素和 N76D/S103A/V104I变种酶的浓缩制品加到在室温的、已经过热 处理的Tide Ultra中，使酶在洗涤剂配方中的最终浓度为0.3克/ 立升酶。然后把这种带有酶的、经热处理的洗涤剂在恒温50℃的 水浴中保温。在0、24、46、76、和112小时的时间间隔分别从恒 温试管中取出等分的试样，并通过把试样加到恒温于25℃的1厘 米比色池中来试验酶的活性，比色池中含有1.2mM溶解在0.1M tris-HCl缓冲液中的pH值为8.6的合成肽底物丁二酰-丙氨-丙 氨-脯氨-苯丙氨酰对硝基苯胺。最初的线性反应速率是通过监测 反应产物对-硝基苯胺在410nm处的吸收率作为时间的函数来进 行分光光度法跟踪的。如图10所示，可观察到变种酶N76D/ S103A/V104I比天然的迟缓芽孢杆菌酶具有明显更大的对失活的 稳定性。在特定的试验条件下，在Tide Ultra洗涤剂配方中对两种 酶估算的失活半衰期，对迟缓芽孢杆菌枯草溶菌素为45小时，对 N76D/S103A/V104I变种酶为125小时。

虽然已经描述了本主题发明的具体实施方案，但显然本领域的 技术人员在不偏离本发明的精神和范围下仍能对本主题发明进行各 种变化和修改。在所附的权利要求中，函盖了想要的所有在本发明 范围内的这类修改。

本申请书是1993年10月14日提交的美国申请系列号 08/136,797和1994年5月2日提交的美国申请系列号08/237,938 的部分继续申请，该两项申请在此引入作为参考。

                      序列表 (1)一般讯息： (i)申请人：   Baeck，Andre(NMN)

          Ghosh，Chanchal K.

          Graycar，Thomas P.

          Bott，Richard R.

          Wilson，Lori J.

          Brode，Philip F.，III

          Barnett，Bobby L.

          Rubingh，Donn N. (ii)发明名称：含蛋白酶的洗涤组合物 (iii)序列数目：15 (iv)通信地址：

(A)地址：The Procter&Gamble Company

(B)街道：11810 East River Road

(C)城市：辛辛那提(Cincinnati)

(D)州：奥克拉荷马(OH)

(E)国家：美国(USA)

(F)邮政编码：45253-8707 (v)可读出的计算机：

(A)介质类型：硬盘

(B)计算机：IBMPC兼容的

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：Patentin Release#1.0，版本#1.25    (vi)现行申请日期：

  (A)申请号：

  (B)申请日期：1994年10月13日

  (C)分类：    (viii)代理人/代理商信息：

  (A)姓名：Zerby，Kim William

  (B)登记号：32,323

  (C)参考/摘要：5040R    (ix)电讯信息：

  (A)电话：(513)627-2885

  (B)电传：(513)627-0318 (2)SEQ ID NO：1的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：19碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：1： GAAGCTGCAA CTCGTTAAA                                 19 (2)SEQ ID NO：2的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：18碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：2： GCTGCTCTAG ACAATTCG                       18 (2)SEQ ID NO：3的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：39碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：3： GTATTAGGGG CGGACGGTCG AGGCGCCATC AGCTCGATT    39 (2)SEQ ID NO：4的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：33碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：4： TCAGGTTCGG TCTCGAGCGT TGCCCAAGGA TTG            33 (2)SEQ ID NO：5的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：22碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：5： CACGTTGCTA GCTTGAGTTT AG    22 (2)SEQ ID NO：6的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：1497碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：6： GGTCTACTAA  AATATTATTC  CATACTATAC  AATTAATACA  CAGAATAATC  TGTCTATTGG 60 TTATTCTGCA  AATGAAAAAA  AGGAGAGGAT  AAAGAGTGAG  AGGCAAAAAA  GTATGGATCA 120 GTTTGCTGTT  TGCTTTAGCG  TTAATCTTTA  CGATGGCGTT  CGGCAGCACA  TCCTCTGCCC 180 AGGCGGCAGG  GAAATCAAAC  GGGGAAAAGA  AATATATTGT  CGGGTTTAAA  CAGACAATGA 240 GCACGATGAG  CGCCGCTAAG  AAGAAAGATG  TCATTTCTGA  AAAAGGCGGG  AAAGTGCAAA 300 AGCAATTCAA  ATATGTAGAC  GCAGCTTCAG  TCACATTAAA  CGAAAAAGCT  GTAAAAGAAT 360 TGAAAAAAGA  CCCGAGCGTC  GCTTACGTTG  AAGAAGATCA  CGTAGCACAT  GCGTACGCGC 420 AGTCCGTGCC  TTACGGCGTA  TCACAAATTA  AAGCCCCTGC  TCTGCACTCT  CAAGGCTACA 480 CTGGATCAAA  TGTTAAAGTA  GCGGTTATCG  ACAGCGGTAT  CGATTCTTCT  CATCCTGATT 540 TAAAGGTAGC  AAGCGGAGCC  AGCATGGTTC  CTTCTGAAAC  AAATCCTTTC  CAAGACAACA 600 ACTCTCACGG  AACTCACGTT  GCCGGCACAG  TTGCGGCTCT  TAATAACTCA  ATCGGTGTAT 660 TAGGCGTTGC  GCCAAGCGCA  TCACTTTACG  CTGTAAAAGT  TCTCGGTGCT  GACGGTTCCG 720 GCCAATACAG  CTGGATCATT  AACGGAATCG  AGTGGGCGAT  CGCAAACAAT  ATGGACGTTA 780 TTAACATGAG  CCTCGGCGGA  CCTTCTGGTT  CTGCTGCTTT  AAAAGCGGCA  GTTGATAAAG 840 CCGTTGCATC CGGCGTCGTA GTCGTTGCGG CAGCCGGTAA CGAAGGCACT TCCGGCAGCT 900 CAAGCACAGT GGGCTACCCT GGTAAATACC CTTCTGTCAT TGCAGTAGGC GCTGTTGACA 960 GCAGCAACCA AAGAGCATCT TTCTCAAGCG TAGGACCTGA GCTTGATGTC ATGGCACCTG 1020 GCGTATCTAT CCAAAGCACG CTTCCTGGAA ACAAATACGG GGCGTACAAC GGTACGTCAA 1080 TGGCATCTCC GCACGTTGCC GGAGCGGCTG CTTTGATTCT TTCTAAGCAC CCGAACTGGA 1140 CAAACACTCA AGTCCGCAGC AGTTTAGAAA ACACCACTAC AAAACTTGGT GATTCTTTGT 1200 ACTATGGAAA AGGGCTGATC AACGTACAAG CGGCAGCTCA GTAAAACATA AAAAACCGGC 1260 CTTGGCCCCG CCGGTTTTTT ATTATTTTTC TTCCTCCGCA TGTTCAATCC GCTCCATAAT 1320 CGACGGATGG CTCCCTCTGA AAATTTTAAC GAGAAACGGC GGGTTGACCC GGCTCAGTCC 1380 CGTAACGGCC AACTCCTGAA ACGTCTCAAT CGCCGCTTCC CGGTTTCCGG TCAGCTCAAT 1440 GCCATAACGG TCGGCGGCGT TTTCCTGATA CCGGGAGACG GCATTCGTAA TCGGATC    1497 (2)SEQ ID NO：7的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：275氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：蛋白质    (xi)序列描述：SEQ ID NO：7： Ala  Gln  Ser  Val  Pro  Tyr  Gly  Val  Ser  Gln  Ile  Lys  Ala  Pro  Ala  Leu  1                   5                        10                       15 His  Ser  Gln  Gly  Tyr  Thr  Gly  Ser  Asn  Val  Lys  Val  Ala  Val  Ile  Asp

            20                       25                       30 Ser  Gly  Ile  Asp  Ser  Ser  His  Pro  Asp  Leu  Lys  Val  Ala  Gly  Gly  Ala

       35                       40                       45 Ser  Mer  Val  Pro  Ser  Glu  Thr  Asn  Pro  Phe  Gln  Asp  Asn  Asn  Ser  His

  50                       55                       60 Gly  Thr  His  Val  Ala  Gly  Thr  Val  Ala  Ala  Leu  Asn  Asn  Ser  Ile  Gly 65                        70                        75                      80 Val  Leu  Gly  Val  Ala  Pro  Ser  Ala  Ser  Leu  Tyr  Ala  Val  Lys  Val  Leu

                 85                       90                       95 Gly  Ala  Asp  Gly  Ser  Gly  Gln  Tyr  Ser  Trp  Ile  Ile  Asn  Gly  Ile  Glu

           100                      105                      110 Trp  Ala  Ile  Ala  Asn  Asn  Met  Asp  Val  Ile  Asn  Met  Ser  Leu  Gly  Gly

      115                      120                      125 Pro  Ser  Gly  Ser  Ala  Ala  Leu  Lys  Ala  Ala  Val  Asp  Lys  Ala  Val  Ala

 130                      135                      140 Ser  Gly  Val  Val  Val  Val  Ala  Ala  Ala  Gly  Asn  Glu  Gly  Thr  Ser  Gly 145                      150                       155                     160 Ser  Ser  Ser  Thr  Val  Gly  Tyr  Pro  Gly  Lys  Tyr  Pro  Ser  Val  Ile  Ala

                165                       170                     175 Val  Gly  Ala  Val  Asp  Ser  Ser  Asn  Gln  Arg  Ala  Ser  Phe  Ser  Ser  Val

           180                      185                      190 Gly  Pro  Gly  Leu  Asp  Val  Met  Ala  Pro  Gly  Val  Ser  Ile  Gln  Ser  Thr

      195                      200                      205 Leu  Pro  Gly  Asn  Lys  Tyr  Gly  Ala  Tyr  Asn  Gly  Thr  Ser  Met  Ala  Ser

 210                      215                      220 Pro  His  Val  Ala  Gly  Ala  Ala  Ala  Leu  Ile  Leu  Ser  Lys  His  Pro  Asn 225                      230                      235                      240 Trp  Thr  Asn  Thr  Gln  Val  Arg  Ser  Ser  Leu  Glu  Asn  Thr  Thr  Thr  Lys

                245                      250                      255 Leu  Gly  Asp  Ser  Phe  Tyr  Tyr  Gly  Lys  Gly  Leu  Ile  Asn  Val  Gln  Ala

           260                      265                      270 Ala  Ala  Gln

      275 (2)SEQ ID NO：8的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：275氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：蛋白质    (xi)序列描述：SEQ ID NO：8： Ala  Gln  Ser  Val  Pro  Tyr  Gly  Ile  Ser  Gln  Ile  Lys  Ala  Pro  Ala  Leu  1                   5                        10                       15 His  Ser  Gln  Gly  Tyr  Thr  Gly  Ser  Asn  Val  Lys  Val  Ala  Val  Ile  Asp

            20                       25                  30 Ser  Gly  Ile  Asp  Ser  Ser  His  Pro  Asp  Leu  Asn  Val  Arg  Gly  Gly  Ala

       35                       40                       45 Ser  Phe  Val  Pro  Ser  Glu  Thr  Asn  Pro  Tyr  Gln  Asp  Gly  Ser  Ser  His

  50                       55                       60 Gly  Thr  His  Val  Ala  Gly  Thr  Ile  Ala  Ala  Leu  Asn  Asn  Ser  Ile  Gly 65                        70                       75                       80 Val  Leu  Gly  Val  Ser  Pro  Ser  Ala  Ser  Leu  Tyr  Ala  Val  Lys  Val  Leu

                 85                       90                       95 Asp  Ser  Thr  Gly  Ser  Gly  Gln  Tyr  Ser  Trp  Ile  Ile  Asn  Gly  Ile  Glu

           100                      105                      110 Trp  Ala  Ile  Ser  Asn  Asn  Met  Asp  Val  Ile  Asn  Met  Ser  Leu  Gly  Gly

      115                      120                      125 Pro  Thr  Gly  Ser  Thr  Ala  Leu  Lys  Thr  Val  Val  Asp  Lys  Ala  Val  Ser

 130                      135                      140 Ser  Gly  He   Val  Val  Ala  Ala  Ala  Ala  Gly  Asn  Glu  Gly  Ser  Ser  Gly 145                      150                        155                    160 Ser  Thr  Ser  Thr  Val  Gly  Tyr  Pro  Ala  Lys  Tyr  Pro  Ser  Thr  Ile  Ala

                165                      170                      175 Val  Gly  Ala  Val  Asn  Ser  Ser  Asn  Gln  Arg  Ala  Ser  Phe  Ser  Ser  Ala

           180                      185                      190 Gly  Ser  Glu  Leu  Asp  Val  Met  Ala  Pro  Gly  Val  Ser  Ile  Gln  Ser  Thr

      195                      200                      205 Leu  Pro  Gly  Gly  Thr  Tyr  Gly  Ala  Tyr  Asn  Gly  Thr  Ser  Met  Ala  Thr

 210                      215                      220 Pro  His  Val  Ala  Gly  Ala  Ala  Ala  Leu  Ile  Leu  Ser  Lys  His  Pro  Thr 225                      230                       235                     240 Trp  Thr  Asn  Ala  Gln  Val  Arg  Asp  Arg  Leu  Glu  Ser  Thr  Ala  Thr  Tyr

                245                      250                      255 Leu  Gly  Asn  Ser  Phe  Tyr  Tyr  Gly  Lys  Gly  Leu  Ile   Asn  Val  Gln  Ala

           260                      265                       270 Ala  Ala  Gln

      275 (2)SEQ ID NO：9的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：274氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型   (ii)分子类型：蛋白质   (xi)序列描述：SEQ ID NO：9： Ala  Gln  Thr  Val  Pro  Tyr  Gly  Ile  Pro  Leu  Ile  Lys  Ala  Asp  Lys  Val  1                   5                        10                       15 Gln  Ala  Gln  Gly  Phe  Lys  Gly  Ala  Asn  Val  Lys  Val  Ala  Val  Leu  Asp

            20                       25                       30 Thr  Gly  Ile  Gln  Ala  Ser  His  Pro  Asp  Leu  Asn  Val  Val  Gly  Gly  Ala

       35                       40                       45 Ser  Phe  Val  Ala  Gly  Glu  Ala  Tyr  Asn  Thr  Asp  Gly  Asn  Gly  His  Gly

  50                       55                       60 Thr  His  Val  Ala  Gly  Thr  Val  Ala  Ala  Leu  Asp  Asn  Thr  Thr  Gly  Val 65                        70                       75                       80 Leu  Gly  Val  Ala  Pro  Ser  Val  Ser  Leu  Tyr  Ala  Val  Lys  Val  Leu  Asn

                 85                       90                       95 Ser  Ser  Gly  Ser  Gly  Ser  Tyr  Ser  Gly  Ile  Val  Ser  Gly  Ile  Glu  Trp

           100                      105                      110 Ala  Thr  Thr  Asn  Gly  Met  Asp  Val  Ile  Asn  Met  Ser  Leu  Gly  Gly  Ala

      115                      120                      125 Ser  Gly  Ser  Thr  Ala  Met  Lys  Gln  Ala  Val  Asp  Asn  Ala  Tyr  Ala  Arg

 130                      135                      140 Gly  Val  Val  Val  Val  Ala  Ala  Ala  Gly  Asn  Ser  Gly  Asn  Ser  Gly  Ser 145                      150                       155                     160 Thr  Asn  Thr  Ile  Gly  Tyr  Pro  Ala  Lys  Tyr  Asp  Ser  Val  Ile  Ala  Val

                165                      170                      175 Gly  Ala  Val  Asp  Ser  Asn  Ser  Asn  Arg  Ala  Ser  Phe  Ser  Ser  Val  Gly

           180                 185            190 Ala  Glu  Leu  Glu  Val  Met  Ala  Pro  Gly  Ala  Gly  Val  Tyr  Ser  Thr  Tyr

      195                      200                      205 Pro  Thr  Asn  Thr  Tyr  Ala  Thr  Leu  Asn  Gly  Thr  Ser  Met  Ala  Ser  Pro

 210                      215                      220 His  Val  Ala  Gly  Ala  Ala  Ala  Leu  Ile  Leu  Ser  Lys  His  Pro  Asn  Leu 225                      230                       235                     240 Ser  Ala  Ser  Gln  Val  Arg  Asn  Arg  Leu  Ser  Ser  Thr  Ala  Thr  Tyr  Leu

                245                      250                      255 Gly  Ser  Ser  Phe  Tyr  Tyr  Gly  Lys  Gly  Leu  Ile  Asn  Val  Glu  Ala  Ala

           260                      265                      270 Ala  Gln (2)SEQ ID NO：10的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：269氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)股：单股

(D)拓扑结构：线型 (ii)分子类型：蛋白质 (xi)序列描述：SEQ ID NO：10： Ala  Gln  Ser  Val  Pro  Trp  Gly  Ile  Ser  Arg  Val  Gln  Ala  Pro  Ala  Ala  1                   5                        10                       15 His  Asn  Arg  Gly  Leu  Thr  Gly  Ser  Gly  Val  Lys  Val  Ala  Val  Leu  Asp

           20                       25                        30 Thr  Gly  Ile  Ser  Thr  His  Pro  Asp  Leu  Asn  Ile  Arg  Gly  Gly  Ala  Ser

       35                       40                       45 Phe  Val  Pro  Gly  Glu  Pro  Ser  Thr  Gln  Asp  Gly  Asn  Gly  His  Gly  Thr

  50                       55                       60 His  Val  Ala  Gly  Thr  Ile  Ala  Ala  Leu  Asn  Asn  Ser  Ile  Gly  Val  Leu 65                        70                       75                       80 Gly  Val  Ala  Pro  Ser  Ala  Glu  Leu  Tyr  Ala  Val  Lys  Val  Leu  Gly  Ala

                 85                       90                       95 Ser  Gly  Ser  Gly  Ser  Val  Ser  Ser  Ile  Ala  Gln  Gly  Leu  Glu  Trp  Ala

           100                      105                      110 Gly  Asn  Asn  Gly  Met  His  Val  Ala  Asn  Leu  Ser  Leu  Gly  Ser  Pro  Ser

      115                 120                 125 Pro  Ser  Ala  Thr  Leu  Glu  Gln  Ala  Val  Asn  Ser  Ala  Thr  Ser  Arg  Gly

 130                      135                      140 Val  Leu  Val  Val  Ala  Ala  Ser  Gly  Asn  Ser  Gly  Ala  Gly  Ser  Ile  Ser 145                      150                      155                      160 Tyr  Pro  Ala  Arg  Tyr  Ala  Asn  Ala  Met  Ala  Val  Gly  Ala  Thr  Asp  Gln

                165                      170                      175 Asn  Asn  Asn  Arg  Ala  Ser  Phe  Ser  Gln  Tyr  Gly  Ala  Gly  Leu  Asp  Ile

           180                      185                      190 Val  Ala  Pro  Gly  Val  Asn  Val  Gln  Ser  Thr  Tyr  Pro  Gly  Ser  Thr  Tyr

      195                      200                      205 Ala  Ser  Leu  Asn  Gly  Thr  Ser  Met  Ala  Thr  Pro  His  Val  Ala  Gly  Ala

 210                      215                      220 Ala  Ala  Leu  Val  Lys  Gln  Lys  Asn  Pro  Ser  Trp  Ser  Asn  Val  Gln  Ile 225                      230                      235                      240 Arg  Asn  His  Leu  Lys  Asn  Thr  Ala  Thr  Ser  Leu  Gly  Ser  Thr  Asn  Leu

                245                      250                      255 Tyr  Gly  Ser  Gly  Leu  Val  Asn  Ala  Glu  Ala  Ala  Thr  Arg

           260                      265 (2)SEQ ID NO：11的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：1140碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：11： ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60 AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120 GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT 180 CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT 240 TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300 TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360 CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT 420 GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480 GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540 ATTGCTGCTT TAAACAATTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC 600 GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGTTCGGTCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG 660 GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA 720 AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG 780 GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG 840 GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900 CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC 960 AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA 1020 CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG 1080 AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140 (2)SEQ ID NO：12的讯息：    (i)序列特性：

(A)长度：1140碱基对

(B)类型：核酸

(C)股：单股

(D)拓扑结构：线型 (ii)分子类型：DNA(基因组) (xi)序列描述：SEQ ID NO：12： ATGAAGAAAC CGTTGGGGAA AATTGTCGCA AGCACCGCAC TACTCATTTC TGTTGCTTTT 60 AGTTCATCGA TCGCATCGGC TGCTGAAGAA GCAAAAGAAA AATATTTAAT TGGCTTTAAT 120 GAGCAGGAAG CTGTCAGTGA GTTTGTAGAA CAAGTAGAGG CAAATGACGA GGTCGCCATT 180 CTCTCTGAGG AAGAGGAAGT CGAAATTGAA TTGCTTCATG AATTTGAAAC GATTCCTGTT 240 TTATCCGTTG AGTTAAGCCC AGAAGATGTG GACGCGCTTG AACTCGATCC AGCGATTTCT 300 TATATTGAAG AGGATGCAGA AGTAACGACA ATGGCGCAAT CAGTGCCATG GGGAATTAGC 360 CGTGTGCAAG CCCCAGCTGC CCATAACCGT GGATTGACAG GTTCTGGTGT AAAAGTTGCT 420 GTCCTCGATA CAGGTATTTC CACTCATCCA GACTTAAATA TTCGTGGTGG CGCTAGCTTT 480 GTACCAGGGG AACCATCCAC TCAAGATGGG AATGGGCATG GCACGCATGT GGCCGGGACG 540 ATTGCTGCTT TAGACAACTC GATTGGCGTT CTTGGCGTAG CGCCGAGCGC GGAACTATAC 600 GCTGTTAAAG TATTAGGGGC GAGCGGTTCA GGCGCCATCA GCTCGATTGC CCAAGGATTG 660 GAATGGGCAG GGAACAATGG CATGCACGTT GCTAATTTGA GTTTAGGAAG CCCTTCGCCA 720 AGTGCCACAC TTGAGCAAGC TGTTAATAGC GCGACTTCTA GAGGCGTTCT TGTTGTAGCG 780 GCATCTGGGA ATTCAGGTGC AGGCTCAATC AGCTATCCGG CCCGTTATGC GAACGCAATG 840 GCAGTCGGAG CTACTGACCA AAACAACAAC CGCGCCAGCT TTTCACAGTA TGGCGCAGGG 900 CTTGACATTG TCGCACCAGG TGTAAACGTG CAGAGCACAT ACCCAGGTTC AACGTATGCC 960 AGCTTAAACG GTACATCGAT GGCTACTCCT CATGTTGCAG GTGCAGCAGC CCTTGTTAAA 1020 CAAAAGAACC CATCTTGGTC CAATGTACAA ATCCGCAATC ATCTAAAGAA TACGGCAACG 1080 AGCTTAGGAA GCACGAACTT GTATGGAAGC GGACTTGTCA ATGCAGAAGC GGCAACACGC 1140 (2)SEQ ID NO：13的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：30碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：13： TATGCCAGCC ACAACGGTAC TTCGATGGCT            30 (2)SEQ ID NO：14的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：31碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：14： CACAGTTGCG GCTCTAGATA ACTCAATCGG T           31 (2)SEQ ID NO：15的讯息：    (i)序列特性：

  (A)长度：33碱基对

  (B)类型：核酸

  (C)股：单股

  (D)拓扑结构：线型    (ii)分子类型：DNA(基因组)    (xi)序列描述：SEQ ID NO：15： GCTGACGGTT CCGGCGCTAT TAGTTGGATC ATT         33