基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法
专利汇可以提供基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于细胞图像 传感器 的贝类腹泻性毒素检测分析方法，该方法构建高性能且成本低廉的细胞图像传感器，采用 图像采集 、RGB图像转灰度图像、图像二值化、图像矩阵化和峰值检测 算法 计算检测出心肌细胞机械搏动时搏动图像的变化，实现心肌细胞机械搏动的速率、幅度和搏动间隙的检测；通过检测细胞图像传感器对不同浓度的贝类腹泻性毒素的标准样品工作液的响应，构建标准图谱；通过细胞图像传感器对未知浓度的贝类腹泻性毒素的响应，与标准图谱的比对结果，半定量地计算出毒素浓度；较现有的贝类腹泻性毒素检测分析方法，本发明具有成本低廉、操作简便且能够进行毒素毒 力 的长时间及直观化的评估。，下面是基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法专利的具体信息内容。
1.一种基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法，该方法在贝类腹泻性毒素检测分析系统上实现，所述贝类腹泻性毒素检测分析系统包括：CCD摄像头（1）、心肌细胞传感器培养板（1）、倒立显微镜（3）和计算机（5）；其中，心肌细胞传感器培养板（1）固定在倒立显微镜（3）的载物台上；CCD摄像头（1）固定在倒立显微镜（3）上方；CCD摄像头（1）通过USB连接线（4）与计算机（5）连接；其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）心肌细胞的培养：获取待测心肌细胞，在高糖培养基中培养，制成细胞悬液；经过活细胞计数后，将原细胞悬液配制成170,000个/ml的细胞悬液；最后在心肌细胞传感器培养板（1）中任意选择一个孔中加入100µl细胞悬液，使孔中细胞数量为17000个/孔，将心肌细胞传感器培养板（1）置于培养箱培养96小时，使得心肌细胞良好贴附于心肌细胞传感器培养板（1）上，构建出细胞图像传感器；
（2）配制待测腹泻性毒素的工作液：用二甲基亚砜(DMSO)配制成200µg/L的标准样品溶液储存液，用高糖培养基依次稀释储存液，得到至少三个不同浓度梯度的工作液；
（3）对照组心机细胞机械搏动状态检测：首先将心肌细胞传感器培养板1放置在倒立显微镜（3）的在载物台上，使用40倍物镜和10倍目镜，调整倒立显微镜（3）载物台的位置和调焦旋钮，在视野中能清晰看到心肌细胞；通过计算机（5）控制CCD摄像头（1）进行心机细胞搏动图像采集，然后计算心机细胞机械搏动曲线；最后通过心机细胞机械搏动曲线计算对照组搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数，具体包括以下子步骤：
（3.1）将采集的心肌细胞搏动图像的第一帧作为对照帧图像；
（3.2）将对照帧图像进行灰度化，采用的灰度化公式为：
Gray=R×0.299+G×0.587+B×0.114
其中，Gray指图像像素二值化后的灰度值，R、G和B分别指原始图像像素红、绿和蓝通道的值；
（3.3）采用大律法对步骤3.2灰度化后的图像进行二值化，将T记为图像前景和背景的分割阈值，w0记为前景像素点数与图像总像素点数的比例，图像前景平均灰度为u0；w1为背景像素点数与图像总像素点数的比例，图像背景平均灰度为u1；将u记为图像的总平均灰度，计算公式为u=w0×u0+w1×u1；G记为最大类间方差，从最小灰度到最大灰度值遍历T，依
2 2
据计算公式G=w0×(u0-u)+w1×(u1-u)，当T使得G最大时，取此时的T为最佳的分割阈值；
然后依据T，将图像像素灰度值小于T的取为0，图像像素灰度值大于T的取为1，实现灰度图像的二值化；
（3.4）采集随后的心肌细胞搏动图像的序列帧图像作为实时帧图像，按照步骤（3.2）和（3.3）对实时帧图像进行灰度化和二值化处理；
（3.5）将灰度化后的实时帧图像与灰度化后的对照帧图像做图像减法，获得减法图像；
然后将减法图像进行图像像素点的矩阵化，获得图像矩阵，此时矩阵元素值为-1、0和1三者其中之一；
（3.6）对图像矩阵元素进行绝对值化，然后对绝对值化后的图像矩阵进行元素求和，其和即为搏动图像差异值；
（3.7）以时间为横坐标，步骤3.6计算出的实时帧图像的搏动图像差异值为纵坐标绘制曲线，该曲线即为心肌细胞机械搏动曲线；
（3.8）对心肌细胞机械搏动曲线进行小波变换，采用7层多尺度分析方法；
（3.9）将7层多尺度分析结果中的近似分量A7、细节分量D1、D2和D3进行置零，然后采用小波逆变换重构心肌细胞机械搏动曲线，即去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线；
（3.10）计算去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的均方差，并将其定为阈值：将去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线中大于阈值的位点记为1，小于阈值的位点记为0，然后再进行差分，曲线结果数值为1、0和-1三者之一；其中曲线值为1的位点为波峰位点的左边缘，曲线值为-1的位点为波峰位点的右边缘；
（3.11）依据步骤（3.10）得出的左边缘和右边缘位点，求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最大值，最大值位点即为波峰位点；求出其区间去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最小值，最小值位点即为波谷位点；最大值与最小值的差即为心肌细胞机械搏动幅度；连续的波峰位点之间的时间间隔比值，即为心肌细胞机械搏动间隙；
（3.12）每隔30秒统计波峰位点个数、搏动幅度和搏动间隙，将统计波峰位点个数记为
30秒内心肌细胞搏动的平均速率；以时间为x轴，心肌细胞搏动的平均速率为y轴，构建心肌细胞搏动平均速率曲线；以时间为x轴，搏动幅度为y轴，构建心肌细胞搏动幅度曲线；
以时间为x轴，心肌细胞搏动间隙为y轴，构建心肌细胞搏动间隙曲线；
（4）构建待测毒素的标准图谱：将步骤（2）稀释后的体积为20µl的不同浓度梯度的工作液分别加入心肌细胞传感器培养板（1）中，重复步骤（3），检测心肌细胞在不同浓度梯度的工作液作用下的搏动曲线、搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数；将所得的搏动速率、搏动幅度和搏动间隙与步骤（3）对照组所得的相同参数采用归一化处理，即以对照组的每个时间点的状态参数作为基准，药物作用下的状态参数与同一时刻对照组的基准相比，进行归一化计算；通过归一化计算结果构建待测毒素的心肌细胞搏动速率、搏动幅度和搏动间隙的标准图谱；
（5）配制待测海洋水产品贝类腹泻性毒素样品溶液：根据国标GB/T 5009.212-200制备样品溶液，所述1ml样品溶液中含有的腹泻性毒素相当于20g去壳的待测海洋水产品所含有的腹泻性毒素；
（6）检测分析待测海洋水产品贝类腹泻性毒素的毒力：重复步骤（3），获得样品溶液的搏动速率、搏动幅度和搏动间隙曲线，与步骤（4）所建立的标准图谱比对，即可得出样品溶液的浓度区间；然后通过步骤（5）的1ml样品溶液含有的腹泻性毒素相当于20g去壳的待测海洋水产品所含有的腹泻性毒素的关系，得出贝类腹泻性毒素含量，通过搏动速率、搏动幅度和搏动间隙曲线变化，分析贝类腹泻性毒素毒性对心肌细胞随时间变化的影响。
基于细胞图像传感器的贝类腹泻性毒素检测分析方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）配制待测腹泻性毒素的工作液：用二甲基亚砜(DMSO)配制成200µg/L的标准样品溶液储存液，用高糖培养基依次稀释储存液，得到至少三个不同浓度梯度的工作液；
（3）对照组心机细胞机械搏动状态检测：首先将心肌细胞传感器培养板放置在倒立显微镜的在载物台上，使用40倍物镜和10倍目镜，调整倒立显微镜载物台的位置和调焦旋钮，在视野中能清晰看到心肌细胞；通过计算机控制CCD摄像头进行心机细胞搏动图像采集，然后计算心机细胞机械搏动曲线；最后通过心机细胞机械搏动曲线计算对照组搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数，具体包括以下子步骤：
（3.1）将采集的心肌细胞搏动图像的第一帧作为对照帧图像；
（3.2）将对照帧图像进行灰度化，采用的灰度化公式为：
Gray=R×0.299+G×0.587+B×0.114
其中，Gray指图像像素二值化后的灰度值，R、G和B分别指原始图像像素红、绿和蓝通道的值；
（3.3）采用大律法对步骤3.2灰度化后的图像进行二值化，将T记为图像前景和背景的分割阈值，w0记为前景像素点数与图像总像素点数的比例，图像前景平均灰度为u0；w1为背景像素点数与图像总像素点数的比例，图像背景平均灰度为u1；将u记为图像的总平均灰度，计算公式为u=w0×u0+w1×u1；G记为最大类间方差，从最小灰度到最大灰度值遍历T，依
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据计算公式G=w0×(u0-u)+w1×(u1-u)，当T使得G最大时，取此时的T为最佳的分割阈值；
然后依据T，将图像像素灰度值小于T的取为0，图像像素灰度值大于T的取为1，实现灰度图像的二值化；
（3.4）采集随后的心肌细胞搏动图像的序列帧图像作为实时帧图像，按照步骤（3.2）和（3.3）对实时帧图像进行灰度化和二值化处理；
（3.5）将灰度化后的实时帧图像与灰度化后的对照帧图像做图像减法，获得减法图像；
然后将减法图像进行图像像素点的矩阵化，获得图像矩阵，此时矩阵元素值为-1、0和1三者其中之一；
（3.6）对图像矩阵元素进行绝对值化，然后对绝对值化后的图像矩阵进行元素求和，其和即为搏动图像差异值；
（3.7）以时间为横坐标，步骤3.6计算出的实时帧图像的搏动图像差异值为纵坐标绘制曲线，该曲线即为心肌细胞机械搏动曲线；
（3.8）对心肌细胞机械搏动曲线进行小波变换，采用7层多尺度分析方法；
（3.9）将7层多尺度分析结果中的近似分量A7、细节分量D1、D2和D3进行置零，然后采用小波逆变换重构心肌细胞机械搏动曲线，即去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线；
（3.10）计算去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的均方差，并将其定为阈值：将去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线中大于阈值的位点记为1，小于阈值的位点记为0，然后再进行差分，曲线结果数值为1、0和-1三者之一；其中曲线值为1的位点为波峰位点的左边缘，曲线值为-1的位点为波峰位点的右边缘；
（3.11）依据步骤（3.10）得出的左边缘和右边缘位点，求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最大值，最大值位点即为波峰位点；求出其区间去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最小值，最小值位点即为波谷位点；最大值与最小值的差即为心肌细胞机械搏动幅度；连续的波峰位点之间的时间间隔比值，即为心肌细胞机械搏动间隙；
（3.12）每隔30秒统计波峰位点个数、搏动幅度和搏动间隙，将统计波峰位点个数记为
30秒内心肌细胞搏动的平均速率；以时间为x轴，心肌细胞搏动的平均速率为y轴，构建心肌细胞搏动平均速率曲线；以时间为x轴，搏动幅度为y轴，构建心肌细胞搏动幅度曲线；
以时间为x轴，心肌细胞搏动间隙为y轴，构建心肌细胞搏动间隙曲线；
（4）构建待测毒素的标准图谱：将步骤（2）稀释后的体积为20μl的不同浓度梯度的工作液分别加入心肌细胞传感器培养板中，重复步骤（3），检测心肌细胞在不同浓度梯度的工作液作用下的搏动曲线、搏动速率、搏动幅度和搏动间隙状态参数；将所得的搏动速率、搏动幅度和搏动间隙与步骤（3）对照组所得的相同参数采用归一化处理，即以对照组的每个时间点的状态参数作为基准，药物作用下的状态参数与同一时刻对照组的基准相比，进行归一化计算；通过归一化计算结果构建待测毒素的心肌细胞搏动速率、搏动幅度和搏动间隙的标准图谱；
（5）配制待测海洋水产品贝类腹泻性毒素样品溶液：根据国标GB/T 5009.212-200制备样品溶液，所述1ml样品溶液中含有的腹泻性毒素相当于20g去壳的待测海洋水产品所含有的腹泻性毒素；
（6）检测分析待测海洋水产品贝类腹泻性毒素的毒力：重复步骤（3），获得样品溶液的搏动速率、搏动幅度和搏动间隙曲线，与步骤（4）所建立的标准图谱比对，即可得出样品溶液的浓度区间；然后通过步骤（5）的1ml样品溶液含有的腹泻性毒素相当于20g去壳的待测海洋水产品所含有的腹泻性毒素的关系，得出贝类腹泻性毒素含量，通过搏动速率、搏动幅度和搏动间隙曲线变化，分析贝类腹泻性毒素毒性对心肌细胞随时间变化的影响。
图3是本发明细胞图像传感器检测大田软海绵酸(OA)的搏动曲线结果图；
图4是本发明OA毒性分析的搏动速率结果图；
图5是本发明OA毒性分析的搏动幅度结果图；
图6是本发明OA毒性分析的搏动间隙结果图；
图中：CCD摄像头1、细胞图像传感器2、倒立显微镜3、USB连接线4、计算机5。
具体实施方式
（1）心肌细胞的培养：将大鼠心脏心尖部置于预冷的高糖培养基(DMEM)中；然后将漂洗后的心尖组织在预冷的DMEM中去除心房和血管组织；之后在5ml玻璃瓶中加入2ml预冷
3
的平衡盐溶液(HBSS)，将心尖转移到HBSS中，剪成1mm 的小块，加入胶原酶溶液，该胶原酶溶液由质量分数为0.07%胰蛋白酶和质量分数为0.05%小鼠胶原酶II在HBSS中混合而成；
在玻璃瓶中，经胶原酶溶液消化后的残余组织块中加入5ml含有体积百分比10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，收集上清液置于含有体积百分比10%FBS的DMEM培养基中；将混合后的上清液800rpm离心5min，在沉淀中加入5ml高糖培养基轻轻吹打以重悬细胞；将重悬的心肌细胞过200目细胞筛，并将细胞收集到5ml高糖培养基，组成新的细胞悬液放入50ml离心管中；将细胞悬液收集到培养瓶中，进行差速贴壁2次，每次45min，以去除纤维细胞和其它细胞；之后将差速贴壁后的心肌细胞悬液转移到50ml离心管中进行细胞计数；而后吸取100µl细胞悬液，混合加入100µl台盼蓝染液并置于室温下，1min后进行活细胞计数；经过计数后，将培养瓶中的细胞悬液配制成170,000个/ml的细胞悬液；最后在心肌细胞传感器培养板1中任意选择一个孔中加入100µl细胞悬液，使孔中细胞数量为17000个/孔，将心肌细胞传感器培养板1置于培养箱培养96小时，使得心肌细胞良好贴附于心肌细胞传感器培养板1上，构建出细胞图像传感器。
（3.2）将对照帧图像进行灰度化，采用的灰度化公式为：
Gray=R×0.299+G×0.587+B×0.114
其中，Gray指图像像素二值化后的灰度值，R、G和B分别指原始图像像素红、绿和蓝通道的值；
（3.3）采用大律法对步骤3.2灰度化后的图像进行二值化，将T记为图像前景和背景的分割阈值，w0记为前景像素点数与图像总像素点数的比例，图像前景平均灰度为u0；w1为背景像素点数与图像总像素点数的比例，图像背景平均灰度为u1；将u记为图像的总平均灰度，计算公式为u=w0×u0+w1×u1；G记为最大类间方差，从最小灰度到最大灰度值遍历T，依
2 2
据计算公式G=w0×(u0-u)+w1×(u1-u)，当T使得G最大时，取此时的T为最佳的分割阈值；
然后依据T，将图像像素灰度值小于T的取为0，图像像素灰度值大于T的取为1，实现灰度图像的二值化；
（3.4）采集随后的心肌细胞搏动图像的序列帧图像作为实时帧图像，按照步骤（3.2）和（3.3）对实时帧图像进行灰度化和二值化处理；
（3.5）将灰度化后的实时帧图像与灰度化后的对照帧图像做图像减法，获得减法图像；
然后将减法图像进行图像像素点的矩阵化，获得图像矩阵，此时矩阵元素值为-1、0和1三者其中之一；
（3.6）对图像矩阵元素进行绝对值化，然后对绝对值化后的图像矩阵进行元素求和，其和即为搏动图像差异值；
（3.7）以时间为横坐标，步骤3.6计算出的实时帧图像的搏动图像差异值为纵坐标绘制曲线，该曲线即为心肌细胞机械搏动曲线；
（3.8）对心肌细胞机械搏动曲线进行小波变换，采用7层多尺度分析方法；
（3.9）将7层多尺度分析结果中的近似分量A7、细节分量D1、D2和D3进行置零，然后采用小波逆变换重构心肌细胞机械搏动曲线，即去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线；
（3.10）计算去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的均方差，并将其定为阈值：将去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线中大于阈值的位点记为1，小于阈值的位点记为0，然后再进行差分，曲线结果数值为1、0和-1三者之一；其中曲线值为1的位点为波峰位点的左边缘，曲线值为-1的位点为波峰位点的右边缘；
（3.11）依据子步骤（3.10）中得出的左边缘和右边缘位点，求出其区间中去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最大值，最大值位点即为波峰位点；求出其区间去基线降噪后的心肌细胞机械搏动曲线的最小值，最小值位点即为波谷位点；最大值与最小值的差即为心肌细胞机械搏动幅度；连续的波峰位点之间的时间间隔比值，即为心肌细胞机械搏动间隙；
（3.12）每隔30秒统计波峰位点个数、搏动幅度和搏动间隙，将统计波峰位点个数记为
30秒内心肌细胞搏动的平均速率；以时间为x轴，心肌细胞搏动的平均速率为y轴，构建心肌细胞搏动平均速率曲线；以时间为x轴，搏动幅度为y轴，构建心肌细胞搏动幅度曲线；
以时间为x轴，心肌细胞搏动间隙为y轴，构建心肌细胞搏动间隙曲线。
（5）配制待测海洋水产品贝类腹泻性毒素样品溶液：根据国标GB/T 5009.212-2008制备样品溶液：将待测洋水产品置于均质杯内，加3倍体积量丙酮搅拌至少5min；将搅拌好的混合物倒入布氏漏斗中抽滤，收集抽提液；将抽提液移入500ml的圆底烧瓶中，调整旋转蒸发器，水浴温度为56℃±1℃，减压浓缩去除丙酮直至在液体表面分离出油状物；将浓缩液移入分液漏斗内，以100ml～200ml乙醚洗下粘壁部分，轻轻振荡（不能生成乳浊液），静置分层后去除水层（下层）；用相当乙醚半量体积的蒸馏水洗乙醚层两次，再将乙醚层移入
250ml或500ml的圆底烧瓶中，减压浓缩（旋转蒸发器，35℃±1℃）去除乙醚；以质量分数为0.1%的二甲基亚砜（DMSO）的细胞培养基溶液将全部浓缩物在刻度试管中稀释到10ml，充分振摇，制成均匀DSP-0.1%DMSO细胞培养基溶液，即待测样品溶液；1ml样品溶液含有的腹泻性毒素相当于20g去壳的待测海洋水产品所含有的腹泻性毒素；
（6）检测分析待测海洋水产品贝类腹泻性毒素的毒力：重复步骤（3），获得样品溶液的搏动速率、搏动幅度和搏动间隙曲线，与步骤（4）所建立的标准图谱比对，即可得出样品溶液的浓度区间；然后通过步骤（5）的1ml样品溶液含有的腹泻性毒素相当于20g去壳的待测海洋水产品所含有的腹泻性毒素的关系，得出贝类腹泻性毒素含量，通过搏动速率、搏动幅度和搏动间隙曲线变化，分析贝类腹泻性毒素毒性对心肌细胞随时间变化的影响。
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