组合疗法
阅读：427发布：2020-10-11
专利汇可以提供组合疗法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了 治疗 有需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者依次施用有效量的针对人ICOS的药剂和有效量的针对人PD1或人PD-L1的药剂。本发明还提供了抗ICOS 抗体 或其 抗原 结合 片段 和抗PD1抗体或其抗原结合片段，其依次用于治疗有需要的人中的癌症。本发明提供了抗ICOS抗体或其抗原结合片段和抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其依次用于治疗有需要的人中的癌症。，下面是组合疗法专利的具体信息内容。
1.治疗有需要的患者中的癌症的方法，所述方法包括向所述患者依次施用有效量的针对人ICOS的药剂和有效量的针对人PD1或人PD-L1的药剂，其中在施用针对人ICOS的药剂之后，施用针对人PD1或人PD-L1的药剂。
2.权利要求1的方法，其中所述针对人ICOS的药剂是抗ICOS抗体或其抗原结合部分。
3.权利要求2的方法，其中所述抗ICOS抗体是ICOS激动剂。
4.权利要求2或3的方法，其中所述抗ICOS抗体包含：包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VH结构域；和包含与如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VL结构域。
5.权利要求2-4中任一项的方法，其中所述抗ICOS抗体包含：包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的VH结构域和包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。
6.权利要求1的方法，其中所述针对人PD1的药剂是抗PD1抗体或其抗原结合部分。
7.权利要求6的方法，其中所述抗PD1抗体是PD1拮抗剂。
8.权利要求6或7的方法，其中所述抗PD1抗体是派姆单抗。
9.权利要求6或7的方法，其中所述抗PD1抗体是纳武单抗。
10.权利要求1的方法，其中所述针对人PD-L1的药剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合部分。
11.权利要求10的方法，其中所述抗PD-L1抗体是PD1拮抗剂。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用所述针对人ICOS的药剂或抗ICOS抗体或其抗原结合部分。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用所述针对人PD1或人PD-L1的药剂、或者抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PD-L1抗体或其抗原结合部分。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述癌症选自结肠直肠癌（CRC）、胃癌、食管癌、子宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、肾细胞癌（RCC）、EC鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、胰腺癌和前列腺癌。
15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述针对人ICOS的药剂或抗ICOS抗体或其抗原结合部分作为静脉内（IV）输注施用。
16.权利要求26至33中任一项的方法，其中所述针对人PD1或人PDL1的药剂、或者抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PDL1抗体或其抗原结合部分作为静脉内（IV）输注施用。
17.权利要求1-16中任一项的方法，其中在开始施用所述针对人ICOS的药剂或者抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后的选自1周、2周、3周和4周的时间点，起始所述针对人PD1或人PDL1的药剂、或者抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PDL1抗体或其抗原结合部分的开始施用。
18.权利要求1至17中任一项的方法，其中将所述针对人ICOS的药剂或者抗ICOS抗体或其抗原结合部分，以及所述针对人PD1或人PDL1的药剂、或者抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PDL1抗体或其抗原结合部分施用于所述人，直至所述人显示疾病进展或不可接受的毒性。
19.抗ICOS抗体或其抗原结合片段和抗PD1抗体或其抗原结合片段，其依次用于治疗有需要的人中的癌症，其中在施用所述抗ICOS抗体之后施用所述抗PD1抗体。
20.抗ICOS抗体或其抗原结合片段和抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其依次用于治疗有需要的人中的癌症，其中在施用所述抗ICOS抗体之后施用所述抗PD-L1抗体。
21.如权利要求15-16中任一项中所请求保护的抗PD1抗体或抗PD-L1抗体，其中所述抗PD1抗体或抗PD-L1抗体是PD-1拮抗剂。
22.如权利要求19和21中任一项中所请求保护的抗PD1抗体，其中所述抗PD1抗体是派姆单抗。
23.如权利要求19和21中任一项中所请求保护的抗PD1抗体，其中所述抗PD1抗体是纳武单抗。
24.如权利要求19-23中任一项中所请求保护的抗ICOS抗体，其中所述抗ICOS抗体是针对ICOS的激动剂抗体。
25.如权利要求19-24中任一项中所请求保护的抗ICOS抗体，其中所述抗ICOS抗体包含：包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VH结构域；和包含与如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VL结构域。
26.如权利要求19-25中任一项中所请求保护的抗ICOS抗体，其中所述抗ICOS抗体包含：包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的VH结构域和包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。
27.如权利要求19-26 19-2中任一项中所请求保护的抗ICOS抗体，其中每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用所述抗ICOS抗体。
28.如权利要求19-27中任一项中所请求保护的抗PD1抗体或抗PD-L1抗体，其中每周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次施用所述抗PD1抗体或抗PD-L1抗体。
29.如权利要求19和21-28中任一项中所请求保护的抗ICOS抗体和抗PD1抗体、或如权利要求20-29中任一项中所请求保护的抗ICOS抗体和抗PD-L1抗体，其中所述癌症选自结肠直肠癌（CRC）、胃癌、食管癌、子宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、肾细胞癌（RCC）、EC鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、胰腺癌和前列腺癌。
30.抗ICOS抗体或其抗原结合部分和抗PD1抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中依次施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分和所述抗PD1抗体或其抗原结合部分，并且其中在施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用所述抗PD1抗体或其抗原结合部分。
31.抗ICOS抗体或其抗原结合部分和抗PDL1抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中依次施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分和所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分，并且其中在施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分。
32.编码抗ICOS抗体或其抗原结合部分的多核苷酸，其中将所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分与抗PD1抗体或其抗原结合部分依次施用于癌症患者，并且其中在施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用所述抗PD1抗体或其抗原结合部分。
33.编码抗ICOS抗体或其抗原结合部分的多核苷酸，其中将所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分与抗PDL1抗体或其抗原结合部分依次施用于癌症患者，并且其中在施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分。
34.编码抗PD1抗体或其抗原结合部分的多核苷酸，其中将所述抗PD1抗体或其抗原结合部分与抗ICOS抗体或其抗原结合部分依次施用于癌症患者，并且其中在施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用所述抗PD1抗体或其抗原结合部分。
35.编码抗PDL1抗体或其抗原结合部分的多核苷酸，其中将所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分与抗ICOS抗体或其抗原结合部分依次施用于癌症患者，并且其中在施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分。
36.载体，其包含权利要求32-35中任一项的多核苷酸。
37.宿主细胞，其包含权利要求36的载体。
38.制备抗ICOS抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：a）在合适的条件下培养包含权利要求32或33的多核苷酸的宿主细胞，以表达所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分；
和b）分离所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分。
39.制备抗PD1抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：a）在合适的条件下培养包含权利要求34的多核苷酸的宿主细胞，以表达所述抗PD1抗体或其抗原结合部分；和b）分离所述抗PD1抗体或其抗原结合部分。
40.制备抗PDL1抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：a）在合适的条件下培养包含权利要求35的多核苷酸的宿主细胞，以表达所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分；和b）分离所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分。
组合疗法
发明领域
[0002] 发明背景癌症免疫是多步骤过程，其被一系列负免疫检查点和正共刺激受体（其当有效触发时
可以实现抗肿瘤应答）严格调控（Mellman，I.，等人（2011）Cancer Immunotherapy Comes of Age. Nature 480（7378），480-489）。然而，肿瘤已经建立各种机制来通过改变免疫浸润物的应答性来规避免疫清除。在一些情况下，肿瘤将高度依赖于单一机制，并且在这些情况下，有可能用单药免疫调节疗法实现显著的临床活性（Hoos，A.（2016）. Development of immuno-oncology drugs - from CTLA4 to PD1 to the next generations. Nat Rev Drug Discov. 15（4），235-47）。然而，由于肿瘤经常利用多种、重叠和冗余的机制来阻断抗肿瘤免疫应答，因此可能需要组合疗法以在各种各样的肿瘤类型间获得持久的效力。因此，需要新的免疫靶向疗法来改善所有癌症的治疗。
可以实现抗肿瘤应答）严格调控（Mellman，I.，等人（2011）Cancer Immunotherapy Comes of Age. Nature 480（7378），480-489）。然而，肿瘤已经建立各种机制来通过改变免疫浸润物的应答性来规避免疫清除。在一些情况下，肿瘤将高度依赖于单一机制，并且在这些情况下，有可能用单药免疫调节疗法实现显著的临床活性（Hoos，A.（2016）. Development of immuno-oncology drugs - from CTLA4 to PD1 to the next generations. Nat Rev Drug Discov. 15（4），235-47）。然而，由于肿瘤经常利用多种、重叠和冗余的机制来阻断抗肿瘤免疫应答，因此可能需要组合疗法以在各种各样的肿瘤类型间获得持久的效力。因此，需要新的免疫靶向疗法来改善所有癌症的治疗。
[0003] 因此，需要用于治疗疾病、特别是癌症的免疫调节剂的给药的组合治疗和策略。
[0005] 图2是显示本文所述的抗ICOS抗体/抗PD1抗体同时和分阶段给药研究的研究程序的示意图。在图2的底部显示的是列出在该研究中使用的抗体的表格。
[0006] 图3是显示同时或在依次阶段（例如，导入剂量/后续剂量）用抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠组、以及用对照治疗的组的平均肿瘤体积的图，如附图图例中所示。
[0007] 图4是显示用同时给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠组、以及用对照治疗的组的平均肿瘤体积的图，如附图图例中所示。
[0008] 图5是显示用分阶段给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠组、以及用对照治疗的组的平均肿瘤体积的图，如附图图例中所示。
[0009] 图6是显示用分阶段给药的抗PD1抗体和抗ICOS抗体治疗的小鼠组（其中抗PD1抗体作为导入剂量，且抗ICOS抗体作为后续剂量）、以及用对照治疗的组的平均肿瘤体积的图，如附图图例中所示。
[0010] 图7是显示用分阶段给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠组（其中抗ICOS抗体作为导入剂量，且抗PD1抗体作为后续剂量）、以及用对照治疗的组的平均肿瘤体积的图，如附图图例中所示。
[0011] 图8A-8C是组图，其显示用同时给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠、以及用对照治疗的组的个体肿瘤体积，如相应的附图图例中所示。图8A显示组1（左）和组2（右）中的小鼠的个体肿瘤体积。图8B显示组3（左上）、组4（右上）和组5（下）中的小鼠的个体肿瘤体积。图8C显示组6（左）和组7（右）中的小鼠的个体肿瘤体积。
[0012] 图9A-9C是组图，其显示用分阶段给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠、以及用对照治疗的组的个体肿瘤体积，如相应的附图图例中所示。图9A显示组1（左）和组2（右）中的小鼠的个体肿瘤体积。图9B显示组8（左上）、组9（右上）和组10（下）中的小鼠的个体肿瘤体积。图9C显示组11（左上）、组12（右上）和组13（下）中的小鼠的个体肿瘤体积。
[0013] 图10是显示所有组（组1-13）中的小鼠存活率的图。组中的小鼠用同时或分阶段给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体进行治疗、或用对照进行治疗，如附图图例中所示。
[0014] 图11是显示用同时给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠组、以及用对照治疗的组的存活率的图，如附图图例中所示。
[0015] 图12是显示用分阶段给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠组、以及用对照治疗的组的存活率的图，如附图图例中所示。
[0016] 图13是显示用分阶段给药的抗PD1抗体和抗ICOS抗体治疗的小鼠组（其中抗PD1抗体作为导入剂量，且抗ICOS抗体作为后续剂量）、以及用对照治疗的组的存活率的图，如附图图例中所示。
[0017] 图14是显示用分阶段给药的抗ICOS抗体和抗PD1抗体治疗的小鼠组（其中抗ICOS抗体作为导入剂量，且抗PD1抗体作为后续剂量）、以及用对照治疗的组的存活率的图，如附图图例中所示。
[0018] 图15：抗人ICOS激动剂单克隆抗体的开发（A）H2L5与二聚人ICOS结合。（B）人ICOS-L与二聚人ICOS结合。（C）H2L5（20 µg/mL）与来自健康供体的CD4（**P=0.0011，t=4.183，df=13）和CD8（**P= 0.0078，t=3.686，df=7）T细胞结合。每个符号代表分开的人供体，水平线指示中值，并且条是四分位距。（D）代表性蛋白质印迹，其证实在用H2L5处理后，在纯化的活化T细胞中的AKT信号传导的诱导。来自用（12.5 µg/mL）结合的H2L5和抗CD3处理48小时的健康供体PBMC的（E）CD69+ CD4（*P=0.0142，t=
3.416 df=6）或CD8（**P=0.0012，t=5.734 df=6）T细胞的定量以及（F）Ki67+ CD4（*P=
0.0190，t=3.809 df=4）或CD8（*P=0.0255，t=3.474 df=4）T细胞的定量。（G，H）（G）来自用（12.5 µg/mL）结合的H2L5和抗CD3处理24小时（**P=0.0041，t=4.510 df=6）或48小时（*P=
0.0375，t=2.661 df=6）的健康主体的PBMC培养上清液的可溶性IFN-γ的定量。（H）用（10 µg/mL）结合的H2L5和抗CD3处理72小时的NSCLC癌症患者PBMC的上清液的可溶性IFN-γ的定量。（I，K）通过双尾未配对t检验分析的，在所示处理后，来自健康供体CD3+ T细胞的（I）T-Bet（TBX21）（*P=0.0156，t=2.974 df=9）和（J）颗粒酶B（GZMB）（**P=0.0020，t=4.292 df=9）（K）L-选择素（SELL）（*P=0.0161，t=2.955 df=9）的RNA表达的定量。H2L5诱导来自解聚的肿瘤细胞悬浮液的细胞因子产生和T细胞活化的浓度依赖性增加。用H2L5 +/-抗CD3或同种型对照包被板。培养6天后的（L）IFN-γ，（M）CD8+ OX40+，（N）CD8+ CD25+。条 = 通过单因素Anova的组中值p < 0.05，通过单因素Anova的**P < 0.05 ***P < 0.0005，****P <
0.000。虚线 = CD3 + 同种型IgG4 10μg/mL。关于肿瘤类型参见图S7。
3.416 df=6）或CD8（**P=0.0012，t=5.734 df=6）T细胞的定量以及（F）Ki67+ CD4（*P=
0.0190，t=3.809 df=4）或CD8（*P=0.0255，t=3.474 df=4）T细胞的定量。（G，H）（G）来自用（12.5 µg/mL）结合的H2L5和抗CD3处理24小时（**P=0.0041，t=4.510 df=6）或48小时（*P=
0.0375，t=2.661 df=6）的健康主体的PBMC培养上清液的可溶性IFN-γ的定量。（H）用（10 µg/mL）结合的H2L5和抗CD3处理72小时的NSCLC癌症患者PBMC的上清液的可溶性IFN-γ的定量。（I，K）通过双尾未配对t检验分析的，在所示处理后，来自健康供体CD3+ T细胞的（I）T-Bet（TBX21）（*P=0.0156，t=2.974 df=9）和（J）颗粒酶B（GZMB）（**P=0.0020，t=4.292 df=9）（K）L-选择素（SELL）（*P=0.0161，t=2.955 df=9）的RNA表达的定量。H2L5诱导来自解聚的肿瘤细胞悬浮液的细胞因子产生和T细胞活化的浓度依赖性增加。用H2L5 +/-抗CD3或同种型对照包被板。培养6天后的（L）IFN-γ，（M）CD8+ OX40+，（N）CD8+ CD25+。条 = 通过单因素Anova的组中值p < 0.05，通过单因素Anova的**P < 0.05 ***P < 0.0005，****P <
0.000。虚线 = CD3 + 同种型IgG4 10μg/mL。关于肿瘤类型参见图S7。
[0019] 图16：抗体同种型和FcγR接合对于H2L5功能是至关重要的（A）来自用不同同种型的可溶性H2L5以5 µg/ml处理6天的健康主体的PBMC。如通过
CFSE稀释相对于同种型对照测量的增殖（倍数变化）。（B，C）来自健康主体的PBMC，具有或不具有NK细胞耗尽；用（B）不同同种型的可溶性H2L5以（5 µg/mL）处理6天。（C）不同同种型（10 µg/mL）的可溶性H2L5持续24小时，以及使用NIR活/死染料，通过流式细胞术测定的死细胞百分比。包括已知诱导ADCC介导的T细胞杀死的抗CD52抗体作为阳性对照。（D）在新鲜解离的患者TIL上的ICOS表达。来自CD4、CD8、Treg和Teff细胞群体的ICOS的中值荧光强度。（肿瘤类型实心三角形 = NSCLC（6），实心圆圈 = CRC（4），实心菱形 = 膀胱（2），实心正方形 = 头/颈（1），空心三角形 = RCC（4），空心圆圈 = 子宫内膜（2），空心菱形 = 前列腺（1），空心正方形 = 甲状腺（1）；通过单因素Anova的p < 0.05）。插图显示来自子宫内膜癌患者的CD4（红色）、CD8（橙色）和Tre（g 蓝色）上的ICOS表达的直方图。
CFSE稀释相对于同种型对照测量的增殖（倍数变化）。（B，C）来自健康主体的PBMC，具有或不具有NK细胞耗尽；用（B）不同同种型的可溶性H2L5以（5 µg/mL）处理6天。（C）不同同种型（10 µg/mL）的可溶性H2L5持续24小时，以及使用NIR活/死染料，通过流式细胞术测定的死细胞百分比。包括已知诱导ADCC介导的T细胞杀死的抗CD52抗体作为阳性对照。（D）在新鲜解离的患者TIL上的ICOS表达。来自CD4、CD8、Treg和Teff细胞群体的ICOS的中值荧光强度。（肿瘤类型实心三角形 = NSCLC（6），实心圆圈 = CRC（4），实心菱形 = 膀胱（2），实心正方形 = 头/颈（1），空心三角形 = RCC（4），空心圆圈 = 子宫内膜（2），空心菱形 = 前列腺（1），空心正方形 = 甲状腺（1）；通过单因素Anova的p < 0.05）。插图显示来自子宫内膜癌患者的CD4（红色）、CD8（橙色）和Tre（g 蓝色）上的ICOS表达的直方图。
[0020] （E）对于其中两个数据点均可获得的所有样品，相对于同种型对照，在H2L5 IgG1同种型的存在下，从PBMC和患者肿瘤中分离的靶细胞中的总ICOS受体数目（通过将关于每种细胞类型的ICOS阳性百分比乘以每个阳性细胞的ICOS受体数目来计算）与FcγRIIIA报道基因测定法诱导倍数之间的斯皮尔曼相关性（r2=0.681，p< 0.001）。（F）使用与抗ICOS抗体一起温育的从NSCLC患者肿瘤5001003中分离的靶细胞，在FcγRIIIA报道基因测定法中观察到的诱导倍数。CD4 Teff、CD8 T细胞和Treg从解离的患者肿瘤中分离，并且在FcγRIIIA测定法中用作靶细胞。
[0021] 图17：H2L5显示FcR依赖性激动作用，以诱导T细胞活化（A）从用所示浓度的H2L5处理60小时的健康主体中分离的CD4 T细胞（结合的同种型相对于结合的H2L5 ***P=0.0006，t=9.777 df=4，可溶性同种型相对于可溶性H2L5 ***P=
0.0003，t=11.50 df=4和（#）结合的H2L5相对于可溶性H2L5 **P=0.0017，t=7.530 df=4）。
（B）来自用可溶性H2L5（ICOS IgG4PE）或Fc缺陷的（Fc-disabled）H2L5以（10μg/mL）处理3.5天的健康主体的PBMC（同种型对照相对于H2L5 **P=0.0056，t=5.426 df=4），（H2L5相对于Fc缺陷的H2L5 **P=0.0012，t=8.297 df=4）。（C）用抗CD3抗体，随后为可溶性H2L5或Fc缺陷的H2L5抗体以（10μg/mL）处理的MLR（同种型对照相对于H2L5 *P=0.0166，t=3.966 df=4），（H2L5相对于Fc缺陷的H2L5 *P=0.0158，t=4.022 df=4）。（D）连同以及不连同来自相同供体的单核细胞一起培养，随后用可溶性H2L5或Fc缺陷的H2L5以（10μg/mL）+/-抗CD32或Fc阻断抗处理4天的分离的T细胞。（#）***P=0.0009，t=8.734 df=4，（$）**P=0.0031，t=6.405 df=
4，（＆）*P=0.0389，t=3.026 df=4，（@ ）同种型对照相对于H2L5 **P=0.0027，t=6.612 df=
4，H2L5 相对于Fc缺陷的H2L5 *P=0.0239，t=3.544 df=4，H2L5（对照）相对于H2L5（抗CD32）**P=0.0066，t=5.184 df=4，H2L5（抗CD32）相对于 H2L5（Fc阻断）**P=0.0013，t=
8.047 df=4，以及H2L5（对照）相对于H2L5（Fc阻断）*P=0.0446，t=2.889 df=4。（E，F）用抗CD3预刺激48小时，并且加入具有人DC的共培养物中的人T细胞。AlexaFlour488标记的H2L5 IgG4PE以3µg/mL的量加入在冰上的共培养物中，然后对于指示时间点移至37ºC。箭头指示响应H2L5处理、极化和朝向邻近树突状细胞动员而活化的T细胞。数据代表使用不同供体细胞执行的三个分开实验。
0.0003，t=11.50 df=4和（#）结合的H2L5相对于可溶性H2L5 **P=0.0017，t=7.530 df=4）。
（B）来自用可溶性H2L5（ICOS IgG4PE）或Fc缺陷的（Fc-disabled）H2L5以（10μg/mL）处理3.5天的健康主体的PBMC（同种型对照相对于H2L5 **P=0.0056，t=5.426 df=4），（H2L5相对于Fc缺陷的H2L5 **P=0.0012，t=8.297 df=4）。（C）用抗CD3抗体，随后为可溶性H2L5或Fc缺陷的H2L5抗体以（10μg/mL）处理的MLR（同种型对照相对于H2L5 *P=0.0166，t=3.966 df=4），（H2L5相对于Fc缺陷的H2L5 *P=0.0158，t=4.022 df=4）。（D）连同以及不连同来自相同供体的单核细胞一起培养，随后用可溶性H2L5或Fc缺陷的H2L5以（10μg/mL）+/-抗CD32或Fc阻断抗处理4天的分离的T细胞。（#）***P=0.0009，t=8.734 df=4，（$）**P=0.0031，t=6.405 df=
4，（＆）*P=0.0389，t=3.026 df=4，（@ ）同种型对照相对于H2L5 **P=0.0027，t=6.612 df=
4，H2L5 相对于Fc缺陷的H2L5 *P=0.0239，t=3.544 df=4，H2L5（对照）相对于H2L5（抗CD32）**P=0.0066，t=5.184 df=4，H2L5（抗CD32）相对于 H2L5（Fc阻断）**P=0.0013，t=
8.047 df=4，以及H2L5（对照）相对于H2L5（Fc阻断）*P=0.0446，t=2.889 df=4。（E，F）用抗CD3预刺激48小时，并且加入具有人DC的共培养物中的人T细胞。AlexaFlour488标记的H2L5 IgG4PE以3µg/mL的量加入在冰上的共培养物中，然后对于指示时间点移至37ºC。箭头指示响应H2L5处理、极化和朝向邻近树突状细胞动员而活化的T细胞。数据代表使用不同供体细胞执行的三个分开实验。
[0022] 图18：H2L5在人源化的小鼠模型中诱导EM表型和抗肿瘤活性。
[0023] （A）与同种型对照IgG4PE相比，小鼠H2L5处理的血液中的人CD45+CD3+细胞的定量（****P=< 0.0001，F=33.57，df=24）。（B）来自小鼠H2L5（1.2mg/kg）相对于同种型对照IgG4PE的血液中的人CD45+CD3+CD69+细胞的定量（*P=0.0119，F=4.179，df=24）。（C）CD4+ TCM的百分比（0.04mg/kg **P=0.0038，0.4mg/kg ***P=0.0002，1.2mg/kg ***P=0.0005，F=+8.172，df=20。这分别等价于0.8、8和24μg/小鼠。（D）在小鼠的脾脏中的CD8 T幼稚//终末分化的效应型记忆TTEMR（A 0.004mg/kg **P=0.0036，0.04mg/kg和0.4mg/kg ****P=< 0.0001，
1.2mg/kg **P=0.0072，F=13.78，df=20）。（E）在皮下植入有A549肿瘤，并且通过使用PE缀合的小鼠抗人IgG4通过流式细胞术鉴定的小鼠中的ICOS+或PD-1+ T细胞百分比。（F）在整个肿瘤组织中的CD8/Treg细胞比。（G）在第13天时的HCT116肿瘤体积（0.04mg/kg）*P=0.0273，（0.4mg/kg）*P=0.0432，F=2.788，df=36。（H）在第21天时的A549肿瘤体积（0.4mg/kg）*P=
0.0056，F=3.906，df=36。（i）荷有A549肿瘤的人PBMC移植NSG小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。
（A-I）水平线表示中值，误差条表示四分位间距。所有统计检验都是单因素ANOVA。
1.2mg/kg **P=0.0072，F=13.78，df=20）。（E）在皮下植入有A549肿瘤，并且通过使用PE缀合的小鼠抗人IgG4通过流式细胞术鉴定的小鼠中的ICOS+或PD-1+ T细胞百分比。（F）在整个肿瘤组织中的CD8/Treg细胞比。（G）在第13天时的HCT116肿瘤体积（0.04mg/kg）*P=0.0273，（0.4mg/kg）*P=0.0432，F=2.788，df=36。（H）在第21天时的A549肿瘤体积（0.4mg/kg）*P=
0.0056，F=3.906，df=36。（i）荷有A549肿瘤的人PBMC移植NSG小鼠的卡普兰-迈耶存活曲线。
（A-I）水平线表示中值，误差条表示四分位间距。所有统计检验都是单因素ANOVA。
[0024] 图19：鼠ICOS mAb的同种型影响在同基因肿瘤中的功效。
[0025] （A）用指示剂量（5、100或200 μg分别对应于7E.17G9抗体的鼠IgG1或IgG2a版本的0.5、5和10mg/Kg，每周两次，持续3周，或同种型对照（200 μg或10mg/kg））处理的，荷有鼠（A）EMT6、鼠（B）CT26同基因肿瘤的小鼠的卡普兰-迈耶图。结果代表两次重复实验。每个符号代表单独一只小鼠。水平线代表中值，误差条代表四分位距。所有统计检验都是单因素ANOVA，随后为特定的治疗比较者。（C）在肿瘤大小为100 mm3时确定的EMT6或CT26肿瘤中的+
CD8/Treg比；（D）在用EMT6肿瘤植入的小鼠的肿瘤（实心圆圈）或脾脏（空心圆圈）中的ICOS+ CD4、CD8和Treg细胞的百分比；在肿瘤大小为100 mm3时，用（E）CT26或（F）EMT6肿瘤植入的小鼠的肿瘤（实心圆圈）或脾脏（空心圆圈）中的CD8、CD4和Treg上ICOS的MFI。（G）代表性流动图的直方图，其比较从EMT6和CT26肿瘤中分离的CD4、CD8和Treg上ICOS表达的MFI；（H）在用EMT6肿瘤中也发现的抗ICOS 7E.17G9血液治疗后扩增的TCR克隆的绝对数目（10 *P=
0.0173和100μg*P=0.0483；F=3.269 df=28）。
CD8/Treg比；（D）在用EMT6肿瘤植入的小鼠的肿瘤（实心圆圈）或脾脏（空心圆圈）中的ICOS+ CD4、CD8和Treg细胞的百分比；在肿瘤大小为100 mm3时，用（E）CT26或（F）EMT6肿瘤植入的小鼠的肿瘤（实心圆圈）或脾脏（空心圆圈）中的CD8、CD4和Treg上ICOS的MFI。（G）代表性流动图的直方图，其比较从EMT6和CT26肿瘤中分离的CD4、CD8和Treg上ICOS表达的MFI；（H）在用EMT6肿瘤中也发现的抗ICOS 7E.17G9血液治疗后扩增的TCR克隆的绝对数目（10 *P=
0.0173和100μg*P=0.0483；F=3.269 df=28）。
[0026] 图20：人癌症中的不同细胞类型上的ICOS表达评估。（A）通过来自TCGA数据库的ICOS表达排序的不同肿瘤类型中的ICOS、ICOS-L和PD-L1表达。（B）在NSCLC中通过单重IHC的ICOS+细胞表达，以及与PD-L1、PD-1、CD4、CD8、FOXP3和CD3表达的相关性。（C）来自不同实体瘤类型的解聚肿瘤中，其为CD3+、B细胞、单核细胞、NK细胞、巨噬细胞、树突状细胞的CD45+细胞百分比。实心三角形 = NSCLC（6），实心圆圈 = CRC（4），实心菱形 = 膀胱（2），实心正方形 = 头/颈（1），空心三角形 = RCC（4），空心圆圈= 子宫内膜（2），空心菱形 = 前列腺（1），空心正方形 =甲状腺（1）。（D）在不同肿瘤类型中的CD3+CD8+、CD3+CD4+Foxp3+（Treg）百分比以及CD3+、CD8+: CD3+CD4+Foxp3比。水平线显示中值。（E）通过多重IHC，从不同肿瘤类型获得的肿瘤活检样品中CD3+PD-1+ICOS+细胞的共表达的定量。（F）对于CD3、PD-1和ICOS共染色的头与颈FFPE肿瘤样品的多重IHC。（G）热图概括了如通过使用Human PanCancer-Immune概况分析实验对象组（N=6个供体）的NanoString nCounter分析系统确定的，与单独的抗CD3相比，用H2L5加上抗CD3 mAb处理的纯化的人T细胞中差异表达的基因。（H）在替代抗ICOS（7E.17G9大鼠IgG2b）处理后，抗CD3（0.6 μg/mL）加上H2L5（10 μg/mL）活化的人T细胞（n=6个供体）与鼠EMT6可移植肿瘤之间常见的基因表达变化（增加倍数）。
[0027] 图21：ICOS激动剂mAb诱导PD-1/PD-L1表达且增强抗PD-1的活性（A）在所示处理后，在EMT6中的PD-L1（CD274）（10 µg *P=0.0137和100µg *P=0.0374；F=5.175 df=10）和（B）PD-1（Pdcd1）（10 µg *P=0.0194和100 µg P=0.1626；F=3.911 df=10）的RNA表达定量。每个符号代表单独一份小鼠样品，水平线代表中值，误差条代表四分位距。
所有统计检验都是单因素ANOVA，具有平方根变换的数据以稳定差异。（C）在用同种型对照或H2L5以10 µg/mL处理72小时后，来自癌症患者的PBMC中的CD4+PD-1+和CD8+PD-1+ T细胞百分比。CD4+ *P=0.0128，t=3.026 df=10；CD8+ **P=0.005，t=3.548，df=10。双尾未配对t检验（D）。与健康主体相比，PD-1治疗（派姆单抗或纳武单抗）前和治疗后，NSCLC或黑色素瘤患者中的CD4+ ICOS+百分比。（E）荷有EMT6肿瘤的小鼠用7E.17G9 IgG1（10 µg等价于0.5mg/kg）、抗PD-1（200 µg等价于10mg/kg）、或同时给药的7E.17G9和抗PD-1的组合进行治疗，每周两次，共3周。（N=10/治疗组）。（F）NSG小鼠中的A549肿瘤体积，所述NSG小鼠用人PBMC重构，并且用以等价于0.04mg/kg的0.8μg小鼠的H2L5、等价于0.04mg/kg的同种型0.8μg、或等价于5mg/kg的抗PD-1（派姆单抗/ Keytruda）100 μg或两种抗体的组合治疗。（G）来自用抗CD3和H2L5（10 µg/mL）处理24小时的弥漫性NSCLC患者肿瘤的IFN-γ定量。（#）**P=0.0100（$）****P=< 0.0001（＆）***P=0.002，F=15.8，df=20。水平线代表中值，误差条代表四分位距。（H）MLR测定法，其评估ICOS+派姆单抗相对于ICOS **P=0.0036，IgG4PE ICOS+派姆单抗相对于派姆单抗**P=0.0090，ICOS+派姆单抗相对于2x IgG4PE ***P ＝ 0.0009，F＝
7.324，df＝10。条代表一式三份测量的平均值，且误差条代表标准差。（C-E）所有统计检验都是单因素ANOVA）
图22：H2L5 IgG4PE表位结合（A）通过MSD的ICOS-L竞争测定法证实，H2L5 IgG4PE与
ICOS-L部分竞争与人ICOS受体的结合。（B）使活化的T细胞与不同浓度的重组ICOS-L（R＆D系统）一起温育，然后与H2L5一起温育，并且通过流式细胞术确定ICOS CD4+和CD8+细胞的MFI。
所有统计检验都是单因素ANOVA，具有平方根变换的数据以稳定差异。（C）在用同种型对照或H2L5以10 µg/mL处理72小时后，来自癌症患者的PBMC中的CD4+PD-1+和CD8+PD-1+ T细胞百分比。CD4+ *P=0.0128，t=3.026 df=10；CD8+ **P=0.005，t=3.548，df=10。双尾未配对t检验（D）。与健康主体相比，PD-1治疗（派姆单抗或纳武单抗）前和治疗后，NSCLC或黑色素瘤患者中的CD4+ ICOS+百分比。（E）荷有EMT6肿瘤的小鼠用7E.17G9 IgG1（10 µg等价于0.5mg/kg）、抗PD-1（200 µg等价于10mg/kg）、或同时给药的7E.17G9和抗PD-1的组合进行治疗，每周两次，共3周。（N=10/治疗组）。（F）NSG小鼠中的A549肿瘤体积，所述NSG小鼠用人PBMC重构，并且用以等价于0.04mg/kg的0.8μg小鼠的H2L5、等价于0.04mg/kg的同种型0.8μg、或等价于5mg/kg的抗PD-1（派姆单抗/ Keytruda）100 μg或两种抗体的组合治疗。（G）来自用抗CD3和H2L5（10 µg/mL）处理24小时的弥漫性NSCLC患者肿瘤的IFN-γ定量。（#）**P=0.0100（$）****P=< 0.0001（＆）***P=0.002，F=15.8，df=20。水平线代表中值，误差条代表四分位距。（H）MLR测定法，其评估ICOS+派姆单抗相对于ICOS **P=0.0036，IgG4PE ICOS+派姆单抗相对于派姆单抗**P=0.0090，ICOS+派姆单抗相对于2x IgG4PE ***P ＝ 0.0009，F＝
7.324，df＝10。条代表一式三份测量的平均值，且误差条代表标准差。（C-E）所有统计检验都是单因素ANOVA）
图22：H2L5 IgG4PE表位结合（A）通过MSD的ICOS-L竞争测定法证实，H2L5 IgG4PE与
ICOS-L部分竞争与人ICOS受体的结合。（B）使活化的T细胞与不同浓度的重组ICOS-L（R＆D系统）一起温育，然后与H2L5一起温育，并且通过流式细胞术确定ICOS CD4+和CD8+细胞的MFI。
[0028] 图23：H2L5IgG4PE引起（A）通过MSD测量的细胞因子产生IFNɣ、IL-17、IL-10、IL-4、IL-13、IL-5、 IL-2、IL-6、TNFα，（B）CD4和CD8 T细胞上的活化标志物OX40、CD25和CD69中的剂量依赖性增加。PBMC用抗CD3（0.6ug/ml）和不同浓度的H2L5IgG4PE或同种型对照培养48小时，并且收获上清液用于细胞因子分析且收集细胞用于流式细胞术。
[0029] 图24：H2L5诱导来自不同癌症患者的解聚肿瘤细胞悬浮液中的细胞因子产生中的浓度依赖性增加。在体外用板结合的抗CD3（0.6µg/mL）和IL2（100ng/mL）刺激6天后，在抗CD3的存在或不存在下，用板结合的H2L5IgG4PE 或同种型对照培养解聚的肿瘤细胞悬浮液，随后通过MSD分析上清液中的（A）IL17、（B）IL10、（C）IL5、（D）IL13细胞因子。
[0030] 图25：H2L5诱导关于来自不同癌症患者的解聚肿瘤细胞悬浮液的（A）CD8+LAG3+（通过单因素Anova，p < 0.005）、（B）CD8+ PD-1+、（C）ICOS L+细胞和（D）（CD4+、CD25+ Foxp3+）（通过单因素Anova，p < 0.05）百分比的浓度依赖性增加。在体外用板结合的抗CD3（0.6 µg/mL）和IL-2（100 ng/mL）刺激6天后，在抗CD3的存在或不存在下，用板结合的H2L5（ICOS）IgG4PE或同种型对照培养解聚的肿瘤细胞悬浮液，随后为流式细胞术。虚线 = CD3+ IgG4同种型10μg/mL。水平条代表中值。
[0031] 图26：H2L5 IgG1经由负责在人中的ADCC的主要活化FcγR（FcγRIIIa）诱导信号传导。（A）Jurkat-FcγRIIIA-NFAT-萤光素酶效应细胞和原代人CD4+ T细胞以6:1的比率用不同同种型的可溶性H2L5处理6小时。包括已知诱导ADCC介导的T细胞杀死的抗CD52抗体作为阳性对照。（B）Jurkat-FcγRIIIA-NFAT-萤光素酶效应细胞，以及纯化的原代人离体肿瘤衍生的CD4、CD8和Treg以6:1的比率用可溶性H2L5 IgG1处理6小时。相对于同种型对照，由Jurkat-FcγRIIIA-NFAT-萤光素酶效应细胞产生的萤光素酶诱导中的倍数变化。
[0032] 图27：H2L5引起与血液和肿瘤中表达ICOS的T细胞的剂量依赖性结合。通过流式细胞术，使用PE缀合的小鼠抗人IgG4鉴定在第4次剂量后48小时，在每个组中全血（A）和肿瘤组织（B）中的ICOS+或PD-1+ T细胞百分比。条代表关于每个组的中值。
[0033] 图28：抗鼠ICOS激动剂抗体的表征。抗小鼠ICOS激动剂抗体（7E.17G9）在离体培养60小时的弥散性小鼠脾细胞中诱导IFNγ产生。
[0034] 图29：用10（0.5mg/kg）、100（5mg/kg）或200μg（10mg/kg）剂量的7E.17G9抗体的鼠IgG1或Ig2a变体、或者同种型对照（200µg（10mg/kg）每周两次持续3周治疗的（A）EMT6或（B）CT26鼠同基因肿瘤的肿瘤生长。*（数目）指示在研究终点具有最低限度可检测或不可检测肿瘤的小鼠数目。
[0035] 图30：荷有 100 mm3 CT26肿瘤的小鼠的肿瘤（实心圆圈）和脾脏（空心圆圈）中的~CD4、CD8和Treg群体内的%ICOS+细胞。
[0036] 图31：（A）相对于治疗前血液，用抗ICOS 7E17G9抗体治疗后的血液中收缩的TCR克隆的绝对数目（10µg *P=0.0327和100µg *P=0.0497；F=3.033 df=28）。（B）相对于治疗前血液，在治疗后血液中扩增的TCR克隆的绝对数目（10µg P=0.0975和100µg P=0.1915；F=1.958 df=28）。（C）平均T细胞级分估计量相对于平均生产克隆性。
[0037] 图32：使用兔抗人CD278单克隆抗体克隆SP98（Spring Biosciences），在非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌（BrCA）TNBrCa和结肠直肠癌（CRC）中通过IHC单重免疫组织化学检测ICOS 的在NSCLC、乳腺癌和CRC中的ICOS阳性细胞表达。测定法用相关平台试剂在Leica Bond RX上进行。DAB（3,3'-二氨基联苯胺）用于靶标检测。切片用苏木精进行复染（所有比例条 = 20um）。
[0038] 图33：响应用抗CD3加上同种型对照或H2L5 IgG4PE抗体以12.5 µg/mL的处理，关于来自健康人供体PBMC的细胞因子水平变化。
[0039] 图34：用同种型对照或H2L5 IgG4PE抗体以10μg/mL处理72小时后，来自NSCLC患者的PBMC的细胞因子诱导。
[0040] 图35：人源化H2L5抗体的不同同种型变体与人FcgR的结合亲和力。
[0041] 图36：不同同种型变体7E-17G9与鼠FcR的结合亲和力。
[0042] 图37：在来自TCGA的不同肿瘤病理学中的ICOS阳性细胞的mRNA表达。
[0043] 图38：如通过Nanostring测量的，在人T细胞中与单独的CD3相比，用抗CD3+ H2L5处理的基因表达变化。
[0044] 发明概述在一个方面，本发明提供了治疗有需要的患者中的癌症的方法，其包括向所述患者依
次施用有效量的针对人ICOS的药剂和有效量的针对人PD1或人PD-L1的药剂，其中在施用针对人ICOS的药剂之后，施用针对人PD1或人PD-L1的药剂。在一个实施方案中，针对人ICOS的药剂是ICOS激动剂。在一个实施方案中，针对人PD1或人PD-L1的药剂是PD1拮抗剂。
次施用有效量的针对人ICOS的药剂和有效量的针对人PD1或人PD-L1的药剂，其中在施用针对人ICOS的药剂之后，施用针对人PD1或人PD-L1的药剂。在一个实施方案中，针对人ICOS的药剂是ICOS激动剂。在一个实施方案中，针对人PD1或人PD-L1的药剂是PD1拮抗剂。
[0045] 在一个方面，本发明提供了抗ICOS抗体或其抗原结合片段和抗PD1抗体或其抗原结合片段，其依次用于治疗有需要的人中的癌症，其中在施用抗ICOS抗体或其抗原结合片段之后，施用抗PD1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗PD1抗体或其抗原结合片段是PD1激动剂。在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体或其抗原结合片段是ICOS激动剂。
[0046] 在一个方面，本发明提供了抗ICOS抗体或其抗原结合片段和抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其依次用于治疗有需要的人中的癌症，其中在施用抗ICOS抗体或其抗原结合片段之后，施用抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，所述抗PD-L1抗体或其抗原结合片段是PD1拮抗剂。在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体或其抗原结合片段是ICOS激动剂。
[0047] 发明详述定义
如本文所用，“ICOS” 意指任何诱导型T-细胞共刺激蛋白。ICOS（诱导型T-细胞共刺激剂）的替代名称包括AILIM；CD278；CVID1、JTT-1或JTT-2、MGC39850或8F4。ICOS是在活化的T细胞上表达的CD28-超家族共刺激性分子。由该基因编码的蛋白属于CD28和CTLA-4细胞表面受体家族。其形成同型二聚体并在细胞-细胞信号传导、免疫应答和细胞增殖的调节中发挥重要作用。人ICOS（同种型2）（登录号: UniProtKB - Q9Y6W8-2）的氨基酸序列下面如SEQ ID NO:9所示。
如本文所用，“ICOS” 意指任何诱导型T-细胞共刺激蛋白。ICOS（诱导型T-细胞共刺激剂）的替代名称包括AILIM；CD278；CVID1、JTT-1或JTT-2、MGC39850或8F4。ICOS是在活化的T细胞上表达的CD28-超家族共刺激性分子。由该基因编码的蛋白属于CD28和CTLA-4细胞表面受体家族。其形成同型二聚体并在细胞-细胞信号传导、免疫应答和细胞增殖的调节中发挥重要作用。人ICOS（同种型2）（登录号: UniProtKB - Q9Y6W8-2）的氨基酸序列下面如SEQ ID NO:9所示。
[0048] 人ICOS（同种型1）（登录号: UniProtKB - Q9Y6W8-1）的氨基酸序列下面如SEQ ID NO:10所示。
[0049] ICOS的活化经由通过ICOS-L（B7RP-1/B7-H2）的结合而发生。B7-1和B7-2（CD28和CTLA4的配体）都不结合或活化ICOS。然而，已经显示ICOS-L微弱结合CD28和CTLA-4两者（Yao S等人，“B7-H2 is a costimulatory ligand for CD28 in human”，Immunity，34（5）；729-40（2011））。ICOS的表达似乎限于T细胞。ICOS表达水平在不同的T细胞亚群和T细胞活化状态之间变化。已经显示ICOS表达在静息TH17、T滤泡辅助（TFH）和调节性T（Treg）细胞上；然而，不同于CD28；ICOS在幼稚TH1和TH2效应子T-细胞群体上并不高度表达（Paulos CM等人，“The inducible costimulator（ICOS）is critical for the development of human Th17 cells”， Sci Transl Med，2（55）；55ra78（2010））。在通过TCR接合而活化后，ICOS表达在CD4+和CD8+效应T-细胞上被高度诱导（Wakamatsu E,等人，“Convergent and divergent effects of costimulatory molecules in conventional and regulatory CD4+ T cells”，Proc Natal Acad Sci USA，110（3）；1023-8（2013））。通过ICOS受体的共刺激信号传导仅发生在接受同时TCR活化信号的T细胞中（Sharpe AH和Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”，Nat. Rev Immunol，2（2）；116-26（2002））。在活化的抗原特异性T细胞中，ICOS调节TH1和TH2细胞因子（包括IFN-γ、TNF-α、IL-10、IL-4、IL-13和其他）的产生。ICOS也刺激效应T细胞增殖，尽管程度小于CD28（Sharpe AH和Freeman GJ. “The B7-CD28 Superfamily”，Nat. Rev Immunol，2（2）；116-26（2002））。针对ICOS的抗体及其在疾病治疗中的使用方法描述于例如WO2012/131004、US20110243929和US20160215059中。US20160215059通过引用并入本文。具有激动剂活性的针对人ICOS的鼠抗体的CDR显示于PCT/EP2012/055735（WO 2012/131004）中。针对ICOS的抗体也公开于WO 2008/137915、WO
2010/056804、EP 1374902、EP1374901和EP1125585中。针对ICOS的激动剂抗体或ICOS结合蛋白公开于WO2012/13004、WO2014/033327、WO2016/120789、US20160215059和
US20160304610中。US2016/0304610中的示例性抗体包括37A10S713。37A10S713的序列在下面作为SEQ ID NO: 14-21再现。
2010/056804、EP 1374902、EP1374901和EP1125585中。针对ICOS的激动剂抗体或ICOS结合蛋白公开于WO2012/13004、WO2014/033327、WO2016/120789、US20160215059和
US20160304610中。US2016/0304610中的示例性抗体包括37A10S713。37A10S713的序列在下面作为SEQ ID NO: 14-21再现。
[0050] 37A10S713重链可变区：。
[0051] 37A10S713轻链可变区：。
[0052] “针对ICOS的药剂”意指能够结合ICOS的任何化学化合物或生物分子。在一些实施方案中，针对ICOS的药剂是ICOS结合蛋白。在一些其他实施方案中，针对ICOS的药剂是ICOS激动剂。
[0053] 如本文所用的术语“ICOS结合蛋白”是指能够结合ICOS的抗体和其他蛋白构建体，诸如结构域。在一些情况下，ICOS是人ICOS。术语“ICOS结合蛋白”可以与“ICOS抗原结合蛋白”可互换使用。因此，如本领域中所理解，抗ICOS抗体和/或ICOS抗原结合蛋白将被认为是ICOS结合蛋白。如本文所用，“抗原结合蛋白”是结合抗原（诸如ICOS）的任何蛋白，包括但不限于本文所述的抗体、结构域和其他构建体。如本文所用，ICOS结合蛋白的“抗原结合部分”将包括能够结合ICOS的ICOS结合蛋白的任何部分，包括但不限于抗原结合抗体片段。
[0054] 在一个实施方案中，本发明的ICOS抗体包含以下CDR中的任何一个或组合：。
[0055] 在一些实施方案中，本发明的抗ICOS抗体包含重链可变区，其与SEQ ID NO:7具有至少90%序列同一性。合适地，本发明的ICOS结合蛋白可包含重链可变区，其与SEQ ID NO:7具有约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
[0056] 人源化重链（VH）可变区（H2）：。
[0057] 在本发明的一个实施方案中，所述 ICOS抗体在具有SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的轻链可变区中包含CDRL1（SEQ ID NO:4）、CDRL2（SEQ ID NO:5）和CDRL3（SEQ ID NO:6）。包含SEQ ID NO:8中所示的人源化轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白被命名为“L5”。
因此，包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白在本文中可被命名为H2L5。
因此，包含SEQ ID NO:7的重链可变区和SEQ ID NO:8的轻链可变区的本发明的ICOS结合蛋白在本文中可被命名为H2L5。
[0058] 在一些实施方案中，本发明的ICOS结合蛋白包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90%序列同一性。合适地，本发明的ICOS结合蛋白可包含轻链可变区，其与SEQ ID NO:8具有约85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。
[0059] 人源化轻链（VL）可变区（L5）。
[0060] CDR或最小结合单元可以通过至少一个氨基酸取代、缺失或添加进行修饰，其中变体抗原结合蛋白基本上保留未修饰蛋白（诸如包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的抗体）的生物学特性。
[0061] 应理解，CDR H1、H2、H3、L1、L2、L3各自都可以单独或与任何其他CDR组合以任何排列或组合进行修饰。在一个实施方案中，通过取代、缺失或添加最多达3个氨基酸（例如1或2个氨基酸，例如1个氨基酸）来修饰CDR。典型地，所述修饰是取代，尤其是保守取代，例如如下表1中所示。
[0062] 表1侧链 成员
疏水的 Met、Ala、Val、Leu、Ile
中性亲水的 Cys、Ser、Thr
酸性的 Asp、Glu
碱性的 Asn、Gln、His、Lys、Arg
影响链取向的残基 Gly、Pro
芳族的 Trp、Tyr、Phe
疏水的 Met、Ala、Val、Leu、Ile
中性亲水的 Cys、Ser、Thr
酸性的 Asp、Glu
碱性的 Asn、Gln、His、Lys、Arg
影响链取向的残基 Gly、Pro
芳族的 Trp、Tyr、Phe
[0063] 抗体的亚类部分决定次级效应子功能，诸如补体活化或Fc受体（FcR）结合和抗体依赖性细胞的细胞毒性（ADCC）（Huber,等人，Nature 229（5284）: 419-20（1971）；Brunhouse,等人，Mol Immunol 16（11）: 907-17（1979））。在鉴定用于具体应用的最佳抗体类型中，可以考虑抗体的效应子功能。例如，hIgG1抗体具有相对长的半衰期，在固定补体方面非常有效，并且它们结合FcγRI和FcγRII两者。相比之下，人IgG4抗体具有较短的半衰期，不固定补体并且对FcR具有较低的亲和力。在IgG4的Fc区中用脯氨酸替代丝氨酸228（S228P）降低用hIgG4观察到的异质性并延长血清半衰期（Kabat,等人，“Sequences of proteins of immunological interest” 5.sup.th Edition（1991）；Angal,等人，Mol Immunol 30（1）: 105-8（1993））。用谷氨酸替代亮氨酸235（L235E）的第二个突变消除残余FcR结合和补体结合活性（Alegre，等人，J Immunol 148（11）: 3461-8（1992））。所得的具有两个突变的抗体被称为IgG4PE。hIgG4氨基酸的编号衍生自EU编号参考资料：Edelman，G.M.等人，Proc. Natl. Acad. USA，63，78-85（1969）. PMID: 5257969。 在本发明的一个实施方案中，ICOS抗体是IgG4同种型。在一个实施方案中，ICOS抗体包含IgG4 Fc区，所述IgG4 Fc区包含替代S228P和L235E，可以具有名称IgG4PE。
[0064] 如本文所用，“ICOS-L”和“ICOS配体”可互换使用，并且是指人ICOS的膜结合的天然配体。ICOS配体是在人中由ICOSLG基因编码的蛋白。ICOSLG也已被命名为CD275（分化簇275）。ICOS-L的替代名称包括B7RP-1和B7-H2。
[0065] 如本文所用，“针对PD-1的药剂”或“针对PD1的药剂”意指能够结合PD1的任何化学化合物或生物分子。在一些实施方案中，针对PD1的药剂是PD1拮抗剂。
[0066] 如本文所用，术语“PD1结合蛋白”或“PD-1结合蛋白”是指能够结合PD1的抗体和其他蛋白构建体，诸如结构域。在一些情况下，所述PD1是人PD1。术语“PD1结合蛋白”可以与“PD1抗原结合蛋白”可互换使用。因此，如本领域中所理解，抗PD1抗体和/或PD1抗原结合蛋白将被认为是PD1结合蛋白。如本文所用，“抗原结合蛋白”是结合抗原，诸如PD1的任何蛋白，包括但不限于本文所述的抗体、结构域和其他构建体。如本文所用，PD1结合蛋白的“抗原结合部分”将包括能够结合PD1的PD1结合蛋白的任何部分，包括但不限于，抗原结合抗体片段。
[0067] 程序性死亡1（PD-1）蛋白是CD28受体家族的抑制成员，所述CD28受体家族还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达（Agata等人，同上；Okazaki等人（2002）Curr. Opin. Immunol 14:391779-82；Bennett等人（2003）J Immunol 170:711-8）。通过单克隆抗体添加后对加强T细胞增殖的功能作用发现了该家族的最初成员，CD28和ICOS（Hutloff等人（1999）Nature 397:263-266；Hansen等人（1980）Immunogenics 10:247-260））。通过筛选凋亡细胞中的差异表达发现了PD-1（Ishida等人（1992）EMBO J 11:3887-95）。通过筛选细胞毒性T淋巴细胞和TH1细胞中的差异表达分别发现了该家族的其他成员，CTLA-4和BTLA。CD28、ICOS和CTLA-4都具有未配对的半胱氨酸残基，允许同型二聚化。相比之下，PD-1被提议作为单体存在，缺乏在其他CD28家族成员中的未配对的半胱氨酸残基特征。PD-1抗体及在疾病治疗中的使用方法描述于美国专利号：US 7,595,048；US 8,168,179；US 8,728,474；US 7,722,868；US 8,008,449；US 7,488,802；US
7,521,051；US 8,088,905；US 8,168,757；US 8,354,509；以及美国公开号US20110171220；
US20110171215；和US20110271358中。CTLA-4和PD-1抗体的组合描述于美国专利号9,084,
776中。
7,521,051；US 8,088,905；US 8,168,757；US 8,354,509；以及美国公开号US20110171220；
US20110171215；和US20110271358中。CTLA-4和PD-1抗体的组合描述于美国专利号9,084,
776中。
[0068] 在一些实施方案中，针对PD1的药剂是PD1拮抗剂，并且阻断癌细胞上表达的PD-L1与免疫细胞（T细胞、B细胞或NKT细胞）上表达的PD-1的结合，并且还可以阻断癌细胞上表达的PD-L2与免疫细胞表达的PD-1的结合。关于PD-1及其配体的替代名称或同义词包括：关于PD-1的PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；关于PD-L1的PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；以及关于PD-L2的PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。人PD-1氨基酸序列可在NCBI基因座编号：NP_005009中找到。NCBI基因座编号：NP_005009中的氨基酸序列在下面再现：
[0069] 人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可分别在NCBI基因座编号：NP_054862和NP_079515中找到。
[0070] NCBI基因座编号：NP_054862中的氨基酸序列在下面再现：
[0071] NCBI基因座编号：NP_079515中的氨基酸序列在下面再现：
[0072] 在本发明的任何方面或实施方案中针对PD-1的药剂包括特异性结合PD-1的单克隆抗体（mAb）或其抗原结合片段。在一些实施方案中，针对PD-1的mAb特异性结合人PD-1。mAb可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体，并且可包括人恒定区。在一些实施方案中，人恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4恒定区，并且在优选的实施方案中，人恒定区是IgG1或IgG4恒定区。在一些实施方案中，抗原结合片段选自Fab、Fab'-SH、F（ab'）2、scFv和Fv片段。
[0073] 与人PD-1结合并且可用于本发明各个方面和实施方案中的mAb的实例描述于美国专利号8,552,154；美国专利号8,354,509；美国专利号8,168,757；美国专利号8,008,449；美国专利号7,521,051；美国专利号7,488,802；WO2004072286；WO2004056875；以及
WO2004004771中。
WO2004004771中。
[0074] 可用于本发明的任何方面和实施方案中的其他PD-1结合蛋白包括特异性结合PD-1，并且优选地特异性结合人PD-1的免疫粘附素，例如，含有与恒定区（例如免疫球蛋白分子的Fc区）融合的PD-L1或PD-L2的细胞外部分或PD-1结合部分的融合蛋白。特异性结合PD-1的免疫粘附素分子的实例描述于WO2010027827和WO2011066342中。在本发明的治疗方法、药物和用途中可用作PD-1拮抗剂的特异性融合蛋白包括AMP-224（也称为B7-DCIg），其为PD-L2-FC融合蛋白，并且与人PD-1结合。
[0075] OPDIVO/纳武单抗是具有免疫增强活性、由Bristol Myers Squibb销售的完全人单克隆抗体，其针对阴性免疫调节性人细胞表面受体PD-1（程序性死亡1或程序性细胞死亡-1/PCD-1）。纳武单抗通过其配体PD-L1和PD-L2结合并阻断PD-1（Ig超家族跨膜蛋白）的活化，导致T细胞的活化以及细胞介导的针对肿瘤细胞或病原体的免疫应答。活化的PD-1通过压制P13k/Akt途径活化来负面调节T细胞活化和效应子功能。关于纳武单抗的其他名称包括：BMS-936558、MDX-1106和ONO-4538。关于纳武单抗的氨基酸序列以及使用和制备方法公开于美国专利号US 8,008,449中。
[0076] KEYTRUDA/派姆单抗是由Merck销售、用于治疗肺癌的抗PD-1抗体。派姆单抗的氨基酸序列和使用方法公开于美国专利号8,168,757中。
[0077] “针对PD-L1的药剂”意指能够结合PD-L1的任何化合物或生物分子。在一些实施方案中，针对PD-L1的药剂是PD-L1结合蛋白。
[0078] 如本文所用，术语“PDL1结合蛋白”或“PD-L1结合蛋白”是指能够结合PD-L1的抗体和其他蛋白构建体，诸如结构域。在一些情况下，所述PD-L1是人PD1。术语“PD-L1结合蛋白”可以与“PD-L1抗原结合蛋白”可互换使用。因此，如本领域中所理解，抗PD-L1抗体和/或PD-L1抗原结合蛋白将被认为是PD-L1结合蛋白。如本文所用，“抗原结合蛋白”是结合抗原，诸如PD-L1的任何蛋白，包括但不限于本文所述的抗体、结构域和其他构建体。如本文所用，PD-L1结合蛋白的“抗原结合部分”将包括能够结合PD-L1的PD-L1结合蛋白的任何部分，包括但不限于，抗原结合抗体片段。
[0079] 在一些实施方案中，针对PD-L1的药剂是PD1拮抗剂，并且阻断癌细胞上表达的PD-L1与免疫细胞（T细胞、B细胞或NKT细胞）上表达的PD-1的结合，并且还可以阻断癌细胞上表达的PD-L2与免疫细胞表达的PD-1的结合。
[0080] PD-L1是在许多细胞类型（包括APC和活化的T细胞）上表达的B7家族成员（Yamazaki等人（2002）J. Immunol. 169:5538）。PD-L1与PD-1和B7-1两者结合。T细胞表达的B7-1由PD-L1的结合以及T细胞表达的PD-L1由B7-1的结合两者均导致T细胞抑制（Butte等人（2007）Immunity 27:111）。也有证据表明，如同其他B7家族成员，PD-L1也可以对T细胞提供共刺激信号（Subudhi等人（2004）J. Clin. Invest. 113:694；Tamura等人（2001）Blood 97:1809）。其为PD-1的配体的PD-L1（人PD-L1 cDNA由通过EMBL/GenBank登录号AF233516所示的碱基序列组成，而小鼠PD-L1 cDNA由通过NM.sub.--021893所示的碱基序列组成）在所谓的抗原呈递细胞（APC）中表达，所述抗原呈递细胞例如活化的单核细胞和树突状细胞（Journal of Experiment Medicine（2000），第19卷，第7期，第1027-1034页）。这些细胞呈现诱导对T淋巴细胞的各种免疫诱导信号的相互作用分子，并且PD-L1是诱导通过PD-1的抑制信号的这些分子之一。已揭示PD-L1配体刺激压制了表达PD-1的T淋巴细胞的活化（细胞增殖和各种细胞因子产生的诱导）。PD-L1表达不仅已在免疫活性细胞中得到证实，而且还在某一种类的肿瘤细胞系（衍生自单核细胞白血病的细胞系、衍生自肥大细胞的细胞系、衍生自肝癌的细胞系、衍生自神经母细胞的细胞系以及衍生自乳腺癌的细胞系）（Nature Immunology（2001），第2卷，第3期，第261-267页）中得到证实。
[0081] 抗PD-L1抗体及其制备方法是本领域已知的。此类针对PD-L1的抗体可以是多克隆或单克隆的，和/或重组的，和/或人源化的，和/或完全人的。PD-L1抗体作为用于治疗癌症的免疫调节剂正在开发中。
[0082] 示例性的PD-L1抗体公开于美国专利号9,212,224；美国专利号8,779,108；美国专利号8,552,154；美国专利号8,383,796；美国专利号8,217,149；美国专利公开号20110280877；WO2013079174；和WO2013019906中。针对PD-L1（也称为CD274或B7-H1）的另外示例性抗体和使用方法公开于美国专利号8,168,179；美国专利号7,943,743；美国专利号
7,595,048；WO2014055897；WO2013019906；和WO2010077634中。可在本发明的治疗方法、药物和用途中用作PD-1拮抗剂的特异性抗人PD-L1单克隆抗体包括MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB0010718C。
7,595,048；WO2014055897；WO2013019906；和WO2010077634中。可在本发明的治疗方法、药物和用途中用作PD-1拮抗剂的特异性抗人PD-L1单克隆抗体包括MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB0010718C。
[0083] 阿特珠单抗是作为TECENTRIQ商购可得的完全人源化的单克隆抗PD-L1抗体。阿特珠单抗被指示用于治疗一些局部晚期或转移性泌尿上皮癌。阿特珠单抗阻断PD-L1与PD-1和CD80的相互作用。
[0084] 度伐鲁单抗（先前称为MEDI4736）是针对PD-L1的人单克隆抗体。度伐鲁单抗阻断PD-L1与PD-1和CD80的相互作用。度伐鲁单抗作为IMFINZITM商购可得。
[0085] 针对PD-L1（也称为CD274或B7-H1）的抗体和使用方法公开于美国专利号7,943,743；美国专利号8,383,796；US20130034559、WO2014055897、美国专利号8,168,179；和美国专利号7,595,048中。PD-L1抗体作为用于治疗癌症的免疫调节剂正在开发中。
[0086] 如本文所用，术语“激动剂”是指抗原结合蛋白（包括但不限于抗体），其在与共同信号传导受体接触后引起以下中的一种或多种：（1）刺激或活化受体；（2）增强、增加或促进、诱导或延长受体的活性、功能或存在；和/或（3）增强、增加、促进或诱导受体的表达。可以通过本领域中已知的各种测定法在体外测量激动剂活性，所述测定法诸如但不限于测量细胞信号传导、细胞增殖、免疫细胞活化标志物、细胞因子产生。还可以通过测量替代终点（诸如但不限于测量T细胞增殖或细胞因子产生）的各种测定法在体内测量激动剂活性。
[0087] 如本文所用，术语“拮抗剂”是指抗原结合蛋白（包括但不限于抗体），其在与共同信号传导受体接触后引起以下中的一种或多种：（1）减弱、阻断或失活受体和/或阻断其天然配体对受体的活化，（2）降低、减少或缩短受体的活性、功能或存在，和/或（3）降低、减少、消除受体的表达。可以通过本领域中已知的各种测定法在体外测量拮抗剂活性，所述测定法诸如但不限于测量细胞信号传导、细胞增殖、免疫细胞活化标志物、细胞因子产生的增加或减少。还可以通过测量替代终点（诸如但不限于测量T细胞增殖或细胞因子产生）的各种测定法在体内测量拮抗剂活性。
[0088] 如本文所用，术语“交叉竞争结合”是指将与本发明的任何药剂竞争结合靶标的任何药剂，诸如抗体。两种抗体之间对结合的竞争可以通过本领域中已知的各种方法（包括流式细胞术、Meso Scale Discovery和ELISA）测试。可以直接测量结合，意味着可以将两种或更多种结合蛋白与共同信号传导受体接触，并且可以测量对一种或每种的结合。或者，可以针对结合或天然配体来测试目标分子的结合，并彼此进行定量比较。
[0089] 如本文所用，术语“结合蛋白”是指能够结合抗原的抗体和其他蛋白构建体，例如结构域。
[0090] 术语“抗体”在本文中以最广泛意义使用来指具有免疫球蛋白样结构域（例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE）的分子，并且包括单克隆、重组、多克隆、嵌合、人、人源化、多特异性的抗体，包括双特异性抗体和异源缀合物抗体；单一可变结构域（例如VH、VHH、VL、结构域抗体TM（dAb ））、抗原结合抗体片段、Fab、F（ab’）2、Fv、二硫化物连接的Fv、单链Fv、二硫化物连接的scFv、双抗体、TANDABS™等，以及上述任一种的修饰版本。
[0091] 替代抗体形式包括替代骨架，其中抗原结合蛋白的一个或多个CDR可以被排列在合适的非免疫球蛋白支架或骨架上，诸如亲合体、SpA支架、LDL受体A类结构域、亲和多聚体（avimer）或EGF结构域。
[0092] 术语“结构域”是指折叠的蛋白结构，其保留其独立于蛋白的其余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的离散的功能特性，并且在许多情况下可以被添加、去除或转移至其他蛋白，而不损失蛋白和/或结构域的其余部分的功能。
[0093] 术语“单一可变结构域”是指包含抗体可变结构域特征序列的折叠的多肽结构域。因此，其包括完整抗体可变结构域诸如VH、VHH和VL以及修饰的抗体可变结构域（例如，其中一个或多个环已经被抗体可变结构域的非特征序列替代），或已被截短或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。单一可变结构域能够独立于不同的可变区或结构域来结合抗原或表位。“结构域抗体”或“dAb（TM）”可以被认为与“单一可变结构域”相同。单一可变结构域可以是人的单一可变结构域，但也包括来自其他物种的单一可变结构域，诸如啮齿类铰口鲨和骆驼科VHH dAbsTM。骆驼科VHH是衍生自物种（包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼和原驼）的免疫球蛋白单一可变结构域多肽，其产生天然缺乏轻链的重链抗体。此类VHH结构域可以根据本领域中可得的标准技术人源化，并且此类结构域被认为是“单一可变结构域”。如本文所用，VH包括骆驼科VHH结构域。
[0094] 可以通过在非抗体蛋白支架上布置一个或多个CDR来提供抗原结合片段。如本文所用的“蛋白支架”包括但不限于免疫球蛋白（Ig）支架，例如IgG支架，其可以是四链或二链抗体，或其可仅包含抗体的Fc区，或其可以包含来自抗体的一个或多个恒定区，所述恒定区可以是人或灵长类来源的，或者其可以是人和灵长类动物恒定区的人工嵌合体。
[0095] 蛋白支架可以是Ig支架，例如IgG或IgA支架。IgG支架可以包含抗体的一些或全部结构域（即，CH1、CH2、CH3、VH、VL）。抗原结合蛋白可以包含选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgG4PE的IgG支架。例如，所述支架可以是IgG1。支架可以由抗体的Fc区组成或包含抗体的Fc区，或者是其一部分。
[0096] 亲和力是一个分子（例如本发明的抗原结合蛋白）与另一分子（例如其靶抗原）在单一结合位点的结合强度。可以通过平衡方法（例如酶联免疫吸附测定（ELISA）或放射性免疫测定（RIA））或动力学（例如BIACORETM分析）来测定抗原结合蛋白与其靶标的结合亲和力。例如，实施例5中描述的BIACORETM方法可用于测量结合亲和力。
[0097] 亲合力（avidity）是两个分子在多个位点彼此结合的强度的总和，例如，考虑到相互作用的价数。
[0098] “分离的”意指将该分子，诸如抗原结合蛋白或核酸，从天然发现其的环境中移出。例如，分子可以从天然与其一起正常存在的物质中纯化出来。例如，样品中分子的质量可以是总质量的95%。
[0099] 如本文所用，术语“表达载体”意指可用于将目标核酸引入细胞（诸如真核细胞或原核细胞）或无细胞表达系统中的分离的核酸，其中目标核酸序列被表达为肽链，诸如蛋白。此类表达载体可以是例如包含目标核酸的粘粒、质粒、病毒序列、转座子和线性核酸。一旦将表达载体引入细胞或无细胞表达系统（例如网织红细胞裂解物）中，由目标核酸编码的蛋白通过转录/翻译机制产生。本发明范围内的表达载体可为真核或原核表达提供必要的元件，并且包括病毒启动子驱动的载体，诸如CMV启动子驱动的载体（例如pcDNA3.1、pCEP4及其衍生物）、杆状病毒表达载体，果蝇表达载体；以及由哺乳动物基因启动子，诸如人Ig基因启动子驱动的表达载体。其他实例包括原核表达载体，诸如T7启动子驱动的载体（例如pET41）、乳糖启动子驱动的载体和阿拉伯糖基因启动子驱动的载体。本领域普通技术人员将认识到许多其他合适的表达载体和表达系统。
[0100] 如本文所用，术语“重组宿主细胞”意指包含目标核酸序列的细胞，所述目标核酸序列在将其引入细胞之前被分离。例如，目标核酸序列可以在表达载体中，而细胞可以是原核的或真核的。示例性真核细胞是哺乳动物细胞，诸如但不限于COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HepG2、653、SP2/0、NS0、293、HeLa、骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞或其任何衍生物。最优选地，真核细胞是HEK293、NS0、SP2/0或CHO细胞。大肠杆菌是示例性原核细胞。根据本公开的重组细胞可以通过转染、细胞融合、永生化或本领域中众所周知的其他程序产生。转染入细胞的目标核酸序列，诸如表达载体，可以是染色体外的或被稳定整合至细胞的染色体中。
[0101] “嵌合抗体”是指一种类型的工程改造的抗体，其含有衍生自供体抗体的天然存在的可变区（轻链和重链），其与衍生自受体抗体的轻链和重链恒定区缔合。
[0102] “人源化抗体”是指其CDR衍生自非人供体免疫球蛋白的一种类型的工程改造的抗体，该分子的剩余免疫球蛋白衍生部分衍生自一种或多种人免疫球蛋白。另外，可以改变框架支持残基以保持结合亲和力（参见例如，Queen等人 Proc. Natl Acad Sci USA，86:10029-10032（1989），Hodgson,等人，Bio/Technology，9:421（1991））。合适的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性选自常规数据库、例如KABAT™数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库的抗体。特征在于与供体抗体的框架区同源性（基于氨基酸）的人抗体可以合适于提供重链恒定区和/或重链可变框架区用于插入供体CDR。可以类似的方式选择能够提供轻链恒定或可变框架区的合适的受体抗体。应当注意，不需要受体抗体的重链和轻链源于相同的受体抗体。现有技术描述了生产此类人源化抗体的几种方式-例如参见EP-A-0239400和EP-A-054951。
[0103] 术语“完全人抗体”包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区（如果存在）的抗体。本发明的人序列抗体可以包括不被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机或位点特异性诱变引入的突变，或通过体内体细胞突变引入的突变）。完全人抗体包含仅由最终人来源的多核苷酸编码的氨基酸序列或与此类序列相同的氨基酸序列。如本文所意指，由插入转基因小鼠中产生的小鼠基因组中编码人免疫球蛋白的DNA编码的抗体是完全人抗体，因为它们由最终为人来源的DNA编码。在这种情况下，编码人免疫球蛋白的DNA可以在小鼠内重排（以编码抗体），并且也可以发生体细胞突变。由已经在小鼠中经历此类变化的原始人DNA编码的抗体是如本文所意指的完全人抗体。使用此类转基因小鼠使得可以针对人抗原选择完全人抗体。如本领域中所理解，可以使用噬菌体展示技术制备完全人抗体，其中将人DNA文库插入包含人种系DNA序列的用于生成抗体的噬菌体中。
[0104] 术语“供体抗体”是指将其可变区、CDR或其他功能片段或其类似物的氨基酸序列贡献给第一免疫球蛋白配偶体的抗体。因此，供体提供了改变的免疫球蛋白编码区，和所得的表达改变的抗体，其具有供体抗体特征性的抗原特异性和中和活性。
[0105] 术语“受体抗体”是指与供体抗体异源的抗体，其向第一免疫球蛋白配偶体贡献编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的全部（或任何部分）氨基酸序列。人抗体可以是受体抗体。
[0106] 术语“VH”和“VL” 在本文中用于分别是指抗原结合蛋白的重链可变区和轻链可变区。
[0107] “CDR” 被定义为抗原结合蛋白的互补决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高可变区。在免疫球蛋白的可变部分中存在三个重链CDR（或CDR区）和三个轻链CDR（或CDR区）。因此，如本文所用的“CDR”是指全部三个重链CDR、全部三个轻链CDR、全部重链CDR和轻链CDR、或至少两个CDR。
[0108] 在整个本说明书中，可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基根据Kabat编号惯例编号。类似地，实施例中使用的术语“CDR”、“CDRL1”、“CDRL2”、“CDRL3”、“CDRH1”、“CDRH2”、“CDRH3”遵循Kabat编号惯例。对于进一步信息，参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Department of Health and Human Services，National Institutes of Health（1991）。
[0109] 对于本领域技术人员显而易见的是，存在可变结构域序列和全长抗体序列中的氨基酸残基的替代编号惯例。也存在CDR序列的替代编号惯例，例如在Chothia等人（1989）Nature 342: 877-883中阐述的那些。抗体的结构和蛋白折叠可意味着其他残基被认为是CDR序列的一部分，且为本领域技术人员所理解为如此。
[0110] 技术人员可获得的CDR序列的其他编号惯例包括“AbM”（University of Bath）和“接触（contact）”（University College London）方法。可使用Kabat、Chothia、AbM和接触方法中的至少两种确定最小重叠区域以提供“最小结合单元”。最小结合单元可以是CDR的子部分。
[0111] 查询核酸序列和主题核酸序列之间的“同一性百分比”为“同一性”值，其表示为百分比，其是在进行成对BLASTN比对后，当主题核酸序列与查询核酸序列具有100%查询覆盖率时，通过BLASTN算法计算。查询核酸序列和主题核酸序列之间的此类成对BLASTN比对通过使用在National Center for Biotechnology Institute网站上可得的BLASTN算法的默认设置进行，其中关闭低复杂度区域的过滤器。
[0112] 查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的“同一性百分比”为“同一性”值，其表示为百分比，其是在进行成对BLASTP比对后，当主题氨基酸序列与查询氨基酸序列具有100%查询覆盖率时，通过BLASTP算法计算。查询氨基酸序列和主题氨基酸序列之间的此类成对BLASTP比对通过使用在National Center for Biotechnology Institute网站上可得的BLASTP算法的默认设置进行，其中关闭低复杂度区域的过滤器。
[0113] 查询序列可以与主题序列具有100%同一性，或者与主题序列相比，其可以包括最多达某一整数数目的氨基酸或核苷酸改变，使得%同一性小于100%。例如，查询序列与主题序列具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。这种改变包括至少一个氨基酸缺失、取代（包括保守和非保守取代）或插入，并且其中所述改变可以发生在查询序列的氨基或羧基末端位置，或那些末端位置之间的任何位置，其单独的散布在查询序列中的氨基酸或核苷酸间，或在查询序列内的一个或多个连续组中。
[0114] 可以在查询序列的整个长度（包括CDR）上确定%同一性。或者，%同一性可以排除CDR，例如CDR与主题序列具有100%同一性，并且%同一性变化在查询序列的剩余部分中，使得CDR序列是固定的/完整的。
[0115] 在一个方面，提供了治疗有需要的患者中的癌症的方法，其包括向所述患者依次施用有效量的针对人ICOS的药剂和有效量的针对人PD1或人PD-L1的药剂。在一个实施方案中，在施用针对人ICOS的药剂之后，施用针对人PD1或人PD-L1的药剂。在一个实施方案中，在针对人ICOS的药剂施用后的阶段中，针对人PD1或人PD-L1的药剂与针对人ICOS的药剂同时施用。
[0116] 在另一个方面，在施用针对人PD1或人PD-L1的药剂之后，施用针对人ICOS的药剂。在一个实施方案中，针对人ICOS的药剂是抗ICOS抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，在针对人PD1或人PD-L1的药剂施用后的阶段中，针对人ICOS的药剂与针对人PD1或人PD-L1的药剂同时施用。
[0117] 在一个方面，提供了抗ICOS抗体或其抗原结合片段和抗PD1抗体或其抗原结合片段，其依次用于治疗有需要的人中的癌症。在一个实施方案中，在施用抗ICOS抗体或其抗原结合片段之后，施用抗PD1抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，在施用抗PD1抗体或其抗原结合片段之后，施用抗ICOS抗体或其抗原结合片段。
[0118] 在一个方面，提供了抗ICOS抗体或其抗原结合片段和抗PD-L1抗体或其抗原结合片段，其依次用于治疗有需要的人中的癌症。在一个实施方案中，在施用抗ICOS抗体或其抗原结合片段之后，施用抗PD-L1抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，在施用抗PD-L1抗体或其抗原结合片段之后，施用抗ICOS抗体或其抗原结合片段。
[0119] 在另一个方面，提供了抗ICOS抗体或其抗原结合部分和抗PD1抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中依次施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分和抗PD1抗体或其抗原结合部分，且其中在施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用抗PD1抗体或其抗原结合部分。
[0120] 在另一个方面，提供了抗ICOS抗体或其抗原结合部分和抗PDL1抗体或其抗原结合部分在制备用于治疗癌症的药物中的用途，其中依次施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分和抗PDL1抗体或其抗原结合部分，且其中在施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用抗PDL1抗体或其抗原结合部分。
[0121] 本发明还提供了编码本发明的抗ICOS抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体或所述抗体中任一种的抗原结合部分的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了宿主细胞，其包含编码本发明的抗ICOS抗体、抗PD1抗体、或抗PDL1抗体或所述抗体中任一种的抗原结合部分的多核苷酸。本发明还提供了制备抗ICOS抗体、抗PD1抗体、抗PDL1抗体或所述抗体的抗原结合部分的方法，其包括以下步骤：a）在合适的条件下培养包含编码本发明的抗ICOS抗体、抗PD1抗体、或抗PDL1抗体或所述抗体的抗原结合部分的多核苷酸的宿主细胞，以表达所述抗ICOS抗体、抗PD1抗体、或抗PDL1抗体或所述抗体的抗原结合部分；和b）分离所述抗ICOS、抗PD1、或抗PDL1抗体或所述抗体的抗原结合部分。
[0122] 在另一个方面，提供了编码抗ICOS抗体或其抗原结合部分的多核苷酸，其中将抗ICOS抗体或其抗原结合部分与抗PD1抗体或其抗原结合部分依次施用于癌症患者，且其中在施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用抗PD1抗体或其抗原结合部分。
[0123] 在另一个方面，提供了编码抗ICOS抗体或其抗原结合部分的多核苷酸，其中将抗ICOS抗体或其抗原结合部分与抗PDL1抗体或其抗原结合部分依次施用于癌症患者，且其中在施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用抗PDL1抗体或其抗原结合部分。
[0124] 在又另一个方面，提供了编码抗PD1抗体或其抗原结合部分的多核苷酸，其中将抗PD1抗体或其抗原结合部分与抗ICOS抗体或其抗原结合部分依次施用于癌症患者，且其中在施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用抗PD1抗体或其抗原结合部分。
[0125] 在再另一个方面，提供了编码抗PDL1抗体或其抗原结合部分的多核苷酸，其中将抗PDL1抗体或其抗原结合部分与抗ICOS抗体或其抗原结合部分依次施用于癌症患者，且其中在施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后，施用抗PDL1抗体或其抗原结合部分。
[0126] 在另一个方面，提供了包含本文任一方面的多核苷酸的载体。在另一个方面，提供了包含本文任一方面的载体的宿主细胞。
[0127] 在又另一个方面，提供了制备抗ICOS抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：a）在合适的条件下培养包含本文任一方面的多核苷酸的宿主细胞以表达抗ICOS抗体或其抗原结合部分；和b）分离所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分。
[0128] 在另一个方面，提供了制备抗PD1抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：a）在合适的条件下培养包含本文任一方面的多核苷酸的宿主细胞以表达抗PD1抗体或其抗原结合部分；和b）分离所述抗PD1抗体或其抗原结合部分。
[0129] 在再另一个方面，提供了制备抗PDL1抗体或其抗原结合部分的方法，所述方法包括：a）在合适的条件下培养包含本文任一方面的多核苷酸的宿主细胞以表达抗PDL1抗体或其抗原结合部分；和b）分离所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分。
[0130] 在本文任一方面的一个实施方案中，所述抗ICOS抗体是ICOS激动剂。在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体包含：包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VH结构域；和包含与如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VL结构域。在另一个实施方案中，所述抗ICOS抗体包含：包含SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列的VH结构域和包含如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列的VL结构域。在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体包含以下中的一种或多种：如SEQ ID NO:1中所示的CDRH1；如SEQ ID NO:2中所示的CDRH2；如SEQ ID NO:3中所示的CDRH3；如SEQ ID NO:4中所示的CDRL1；如SEQ ID NO:5中所示的CDRL2和/或如SEQ ID NO:6中所示的CDRL3或每个CDR的直接等同物，其中所述直接等同物在所述CDR中具有不多于两个氨基酸取代。
[0131] 在本文任一方面的一个实施方案中，针对人PD1的药剂是抗PD1抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗PD1抗体是PD1拮抗剂。在一个实施方案中，抗PD1抗体是派姆单抗。在另一个实施方案中，抗PD1抗体是纳武单抗。在本文任一方面的一个实施方案中，针对人PD-L1的药剂是抗PD-L1抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是PD1拮抗剂。在一个实施方案中，抗PD-L1抗体是度伐鲁单抗。
[0132] 在本文任一方面的一个实施方案中，将针对人ICOS的药剂施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30连续天。在本文任一方面的一个实施方案中，将针对人PD1或人PD-L1的药剂施用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30连续天。
12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30连续天。
[0133] 在一个方面，所述癌症选自结肠直肠癌（CRC）、胃癌、食管癌、子宫颈癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、黑色素瘤、肾细胞癌（RCC）、EC鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、间皮瘤、胰腺癌和前列腺癌。
[0134] 在一个方面，本发明提供了治疗有需要的人中的癌症的方法，该方法包括向所述人施用抗ICOS抗体或其抗原结合片段和/或向所述人施用抗PD1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，抗ICOS抗体或其抗原结合片段诱导T细胞增殖、扩增和肿瘤浸润。在另一个实施方案中，抗ICOS抗体或其抗原结合片段增加T细胞上的PD-1表达。在一个实施方案中，抗PD1抗体或其抗原结合片段增加T细胞上的ICOS表达。在一个实施方案中，抗ICOS抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且减少了ICOS阳性T细胞的消耗。在另一个实施方案中，抗ICOS抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且当与IgG1同种型抗ICOS抗体相比时，导致增加的抗癌功效。
[0135] 在另一个实施方案中，所述癌症选自头颈癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、星型细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、炎性乳腺癌、威尔姆氏肿瘤（Wilm's tumor）、尤因氏肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、肾癌、肝癌、黑色素瘤、胰腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞肿瘤、甲状腺癌、成淋巴细胞性T细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、AML、慢性中性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞性T细胞白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤原巨核细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、红细胞白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞型T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、泌尿道上皮癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食管癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、口腔癌、口部癌症、GIST（胃肠间质瘤）和睾丸癌。
[0136] 本发明的一些实施方案进一步包括将至少一种肿瘤剂和/或至少一种免疫刺激剂施用于所述人。
[0137] 在一个方面，所述人具有实体瘤。在一个方面，所述肿瘤选自头颈癌、胃癌、黑色素瘤、肾细胞癌（RCC）、食管癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和胰腺癌。在另一个方面，所述人具有液体肿瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、多发性骨髓瘤、慢性成淋巴细胞性白血病（CLL）、滤泡性淋巴瘤、急性骨髓性白血病和慢性髓细胞性白血病。
[0138] 本公开还涉及用于治疗癌症或减轻癌症的严重程度的方法，所述癌症选自：脑癌（神经胶质瘤）、成胶质细胞瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、威尔姆氏肿瘤、尤因氏肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞瘤、甲状腺癌、成淋巴细胞性T-细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、慢性中性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞性T-细胞白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞性大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤原巨核细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、早幼粒细胞性白血病、红细胞白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞型T细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、泌尿道上皮癌、肺癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食管癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、口腔癌、口部癌症、GIST（胃肠间质瘤）和睾丸癌。
[0139] 如本文所用，术语“治疗”及其语法变型是指治疗性治疗。在提到特定病况时，治疗意味着（1）改善病况或该病况的一种或多种生物临床表现；（2）干扰（a）导致或造成该病况的生物级联中的一个或多个点或（b）病况的一种或多种生物临床表现；（3）缓解与病况或其治疗相关的一种或多种症状、效应或副作用；或（4）减缓病况的发展或该病况的一种或多种生物临床表现。还考虑使用本发明的方法和/或组合物的预防性治疗。技术人员将理解，“预防”不是绝对的术语。在医学中，“预防”被理解为是指药物的预防性施用，以显著降低病况或其生物临床表现的可能性或严重程度，或延迟该病况或其生物临床表现的发生。例如当认为主体处于发展癌症的高风险中时，诸如当主体具有强烈的癌症家族史或当主体暴露于致癌物质时，预防性治疗是适当的。
[0140] 如本文所用，术语“癌症”、“赘生物”和“肿瘤”可以可互换使用，并且呈单数或复数形式，是指已经历使其变为对宿主生物体具有病理性的恶性转化的细胞。可以通过良好确立的技术，尤其是组织学检查，容易地将原发性癌细胞与非癌细胞区分开。如本文所用的癌细胞的定义不仅包括原发性癌细胞，还包括衍生自癌细胞祖先的任何细胞。这包括转移的癌细胞，以及衍生自癌细胞的体外培养物和细胞系。当提及通常表现为实体瘤的癌症类型时，“临床可检测”的肿瘤是基于肿瘤块可检测到的肿瘤；例如，通过程序诸如计算机断层摄影（CT）扫描、磁共振成像（MRI）、X-射线、超声或身体检查时触诊，和/或其由于从患者可获得的样品中的一种或多种癌症特异性抗原的表达而可检测到。肿瘤可能是造血性（或血液学或血液或血液相关的）癌症，例如衍生自血细胞或免疫细胞的癌症，其可被称为“液体肿瘤”。基于血液肿瘤的临床病况的具体实例包括：白血病，诸如慢性粒细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病和急性淋巴细胞性白血病；浆细胞恶性肿瘤，诸如多发性骨髓瘤、MGUS和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症；淋巴瘤，诸如非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；等。
[0141] 所述癌症可以是其中存在异常数目的母细胞或不希望的细胞增殖或被诊断为血液癌症（包括淋巴性和骨髓性恶性肿瘤）的任何癌症。骨髓性恶性肿瘤包括但不限于：急性骨髓性（或粒细胞性或髓细胞性或原粒细胞性）白血病（未分化或分化的）、急性前骨髓性（或早幼粒细胞性或前髓细胞性或前髓母细胞性）白血病、急性骨髓单核细胞性（或骨髓单核母细胞性）白血病、急性单核细胞性（或单核母细胞性）白血病、红细胞白血病和巨核细胞性（或巨核母细胞性）白血病。这些白血病可以一起称为急性骨髓性（或粒细胞性或髓细胞性的）白血病（AML）。骨髓恶性肿瘤还包括骨髓增值性病症（MPD），其包括但不限于：慢性髓细胞性（或骨髓性）白血病（CML）、慢性骨髓单核细胞性白血病（CMML）、原发性血小板增多症（或血小板增多）和真性红细胞增多症（PCV）。骨髓恶性肿瘤还包括：脊髓发育不良（或骨髓增生异常综合征或MDS），其可被称为难治性贫血（RA）、具有过量母细胞的难治性贫血（RAEB）以及具有过量转化中的母细胞的难治性贫血（RAEBT）；以及伴有或不伴有原因不明性髓样化生的骨髓纤维化（MFS）。
[0142] 造血癌症还包括淋巴恶性肿瘤，其可影响淋巴结、脾脏、骨髓、外周血和/或结外位点。淋巴癌包括B-细胞恶性肿瘤，其包括但不限于B-细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）。B-NHL可以是惰性的（或低度）、中度（或侵袭性）或高度（高侵袭性）。惰性B细胞淋巴瘤包括：滤泡性淋巴瘤（FL）；小淋巴细胞性淋巴瘤（SLL）；边缘区淋巴瘤（MZL），包括结节MZL、结外MZL、脾MZL和具有绒毛状淋巴细胞的脾MZL；淋巴浆细胞性淋巴瘤（LPL）；以及粘膜相关淋巴样组织（MALT或结外边缘区）淋巴瘤。中度B-NHL包括：涉及或不涉及白血病的套细胞淋巴瘤（MCL）、弥漫性大细胞淋巴瘤（DLBCL）、滤泡性大细胞（或3级或3B级）淋巴瘤和原发性纵隔淋巴瘤（PML）。高度B-NHL包括伯基特淋巴瘤（BL）、伯基特样淋巴瘤、小无裂解细胞淋巴瘤（SNCCL）和成淋巴细胞性淋巴瘤。其他B-NHL包括免疫母细胞性淋巴瘤（或免疫细胞瘤）、原发性渗出性淋巴瘤、HIV相关（或AIDS相关）的淋巴瘤和移植后淋巴增值性病症（PTLD）或淋巴瘤。B细胞恶性肿瘤还包括但不限于：慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、幼淋巴细胞性白血病（PLL）、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症（WM）、毛细胞白血病（HCL）、大颗粒淋巴细胞性（LGL）白血病、急性淋巴性（或淋巴细胞性或成淋巴母细胞性）白血病和卡斯尔曼氏病。NHL还可包括：T-细胞非霍奇金淋巴瘤（T-NHL），其包括但不限于未另作说明（NOS）的T-细胞非霍奇金淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤（PTCL）、间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）、血管免疫母细胞性淋巴样病症（AILD）、鼻自然杀伤（NK）细胞/T-细胞淋巴瘤、γ/δ淋巴瘤、皮肤型T细胞淋巴瘤、蕈样肉芽肿和塞扎里综合征（Sezary syndrome）。
[0143] 造血癌症还包括霍奇金淋巴瘤（或疾病），其包括典型霍奇金淋巴瘤，结节硬化型霍奇金淋巴瘤，混合细胞型霍奇金淋巴瘤，淋巴细胞主型（LP）霍奇金淋巴瘤，结节LP霍奇金淋巴瘤和淋巴细胞衰竭型霍奇金淋巴瘤。造血癌症还包括浆细胞疾病或癌症，诸如多发性骨髓瘤（MM），包括郁积型MM，意义未确定（或未知或未明）的单克隆丙种球蛋白病（MGUS），浆细胞瘤（骨，髓外），淋巴浆细胞性淋巴瘤（LPL），瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症，浆细胞白血病和原发性淀粉样变性病（AL）。造血癌症还可包括额外造血细胞的其他癌症，包括多形核白细胞（或中性粒细胞），嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，树突状细胞，血小板，红细胞和自然杀伤细胞。包括造血细胞的组织，在本发明中被称为“造血细胞组织”，包括骨髓；外周血；胸腺；和外周淋巴组织，诸如脾脏、淋巴结、与粘膜相关的淋巴组织（例如与肠相关淋巴组织）、扁桃体，派伊尔淋巴集结和阑尾，以及与其他粘膜相关的淋巴组织，例如支气管内衬。
[0144] 如本文所用，术语“化合物A2”意指针对人ICOS的药剂。在一些实施方案中，化合物2 2
A是针对人ICOS的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，化合物A是ICOS激动剂。合适地，化合物A2意指具有如SEQ ID NO:7中所示的重链可变区和如SEQ ID NO:8中所示的轻链可变区的人源化单克隆抗体。
A是针对人ICOS的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，化合物A是ICOS激动剂。合适地，化合物A2意指具有如SEQ ID NO:7中所示的重链可变区和如SEQ ID NO:8中所示的轻链可变区的人源化单克隆抗体。
[0145] 如本文所用，术语“化合物B2”意指针对人PD1的药剂或针对人PD-L1的药剂。在一些实施方案中，化合物B2是PD1拮抗剂。在一些实施方案中，化合物B2是针对人PD1的抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，化合物B2是针对人PD-L1的抗体或其抗原结合部分。合适地，化合物B2是纳武单抗。合适地，化合物B2是派姆单抗。
[0147] 如本文所用，术语“指定时段”及其语法变型意指施用化合物A2和化合物B2中的一种和化合物A2和化合物B2中的另一种之间的时间间隔。
[0148] 合适地，如果化合物在“指定时段”内施用而不是同时施用，则它们两者在彼此的约24小时内施用 - 在该情况下，指定时段将为约24小时；合适地，它们将两者在彼此的约12小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约12小时；合适地，它们将两者在彼此的约11小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约11小时；合适地，它们将两者在彼此的约10小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约10小时；合适地，它们将两者在彼此的约9小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约9小时；合适地，它们将两者在彼此的约8小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约8小时；合适地，它们将两者在彼此的约7小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约7小时；合适地，它们将两者在彼此的约6小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约6小时；合适地，它们将两者在彼此的约5小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约5小时；合适地，它们将两者在彼此的约4小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约4小时；合适地，它们将两者在彼此的约3小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约3小时；合适地，它们将在彼此的约2小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约2小时；合适地，它们将两者在彼此的约1小时内施用 - 在该情况下，所述指定时段将为约1小时。如本文所用，化合物A2和化合物B2在分开少于约45分钟内的施用被视为同时施用。
[0149] 合适地，当将本发明的组合施用“指定时段”时，将所述化合物共同施用“时间的持续时间”。
[0150] 如本文所用，术语“时间的持续时间”及其语法变型意指将本发明的两种化合物施用指定的连续天数。除非另有定义，否则连续天数不必以治疗开始起始或以治疗结束终止，只需要连续天数在治疗过程期间的某个点发生。
[0151] 关于“指定时段”施用：合适地，两种化合物都将在指定时段内施用至少一天 - 在该情况下，时间的持续时间为至少一天；合适地，在治疗过程期间，两种化合物都将在指定时段内施用连续至少3天 - 在该情况下，时间的持续时间将为至少3天；合适地，在治疗过程期间，两种化合物都将在指定时段内施用连续至少5天 - 在该情况下，时间的持续时间将为至少5天；合适地，在治疗过程期间，两种化合物都将在指定时段内施用连续至少7天 - 在该情况下，时间的持续时间将为至少7天；合适地，在治疗过程期间，两种化合物都将在指定时段内施用连续至少14天 - 在该情况下，时间的持续时间将为至少14天；合适地，在治疗过程期间，两种化合物都将在指定时段内施用连续至少30天 - 在该情况下，时间的持续时间将为至少30天。
[0152] 合适地，如果化合物不在“指定时段”内施用，则将它们依次施用。如本文所用，术语“依次施用”及其语法衍生物意指将化合物A2和化合物B2中的一种施用连续两天或更多天，并且随后将化合物A2和化合物B2中的另一种施用连续两天或更多天。在其中施用化合物A2的连续数天的时段期间，施用至少1个剂量、至少2个剂量、至少3个剂量、至少4个剂量、至少5个剂量、至少6个剂量、至少7个剂量、至少8个剂量、至少9个剂量或至少10个剂量的化合物A2。在其中施用化合物B2的连续数天的时段期间，施用至少1个剂量、至少2个剂量、至少3个剂量、至少4个剂量、至少5个剂量、至少6个剂量、至少7个剂量、至少8个剂量、至少9个剂量或至少10个剂量的化合物B2。在其中施用化合物A2的连续数天的时段期间，可以将化合物A2施用每天至少三次，每天至少两次，每天至少一次或每天少于一次，例如每2天一次，每3天一次，每周一次，每2周一次，每3周一次或每4周一次。在其中施用化合物B2的连续数天的2
时段期间，可以将化合物B施用每天至少三次，每天至少两次，每天至少一次或每天少于一次，例如每2天一次，每3天一次，每周一次，每2周一次，每3周一次或每4周一次。
时段期间，可以将化合物B施用每天至少三次，每天至少两次，每天至少一次或每天少于一次，例如每2天一次，每3天一次，每周一次，每2周一次，每3周一次或每4周一次。
[0153] 同样，本文考虑在化合物A2和化合物B2中的一种和化合物A2和化合物B2中的另一种的依次施用之间利用的药物假期。如本文所用，药物假期是在依次施用化合物A2和化合2 2 2
物B中的一种之后且在施用化合物A 和化合物B中的另一种之前数天的时段，其中既不施用化合物A2也不施用化合物B2。合适地，所述药物假期将是选自以下的数天的时段：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天和14天。
物B中的一种之后且在施用化合物A 和化合物B中的另一种之前数天的时段，其中既不施用化合物A2也不施用化合物B2。合适地，所述药物假期将是选自以下的数天的时段：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天和14天。
[0154] 依次施用也可以包括将化合物A2和化合物B2中的一种施用连续两天或更多天，且2 2
然后将化合物A和化合物B两者随后施用连续两天或更多天。依次施用可以包括将化合物A2和化合物B2两者施用连续两天或更多天，且然后将化合物A2和化合物B2中的一种随后施用连续两天或更多天。
然后将化合物A和化合物B两者随后施用连续两天或更多天。依次施用可以包括将化合物A2和化合物B2两者施用连续两天或更多天，且然后将化合物A2和化合物B2中的一种随后施用连续两天或更多天。
[0155] 关于依次施用：合适地，将化合物A2和化合物B2中的一种施用连续1至30天，随后为任选的药物假期，随后将化合物A2和化合物B2中的另一种施用连续1至30天。合适地，将化合物A2和化合物B2中的一种施用连续1至21天，随后为任选的药物假期，随后将化合物A2和化合物B2中的另一种施用连续1至21天。合适地，将化合物A2和化合物B2中的一种施用连续1至14天，随后为1至
14天的药物假期，随后将化合物A2和化合物B2中的另一种施用连续1至14天。合适地，将化合物A2和化合物B2中的一种施用连续1至7天，随后为1至10天的药物假期，随后将化合物A2和化合物B2中的另一种施用连续1至7天。
14天的药物假期，随后将化合物A2和化合物B2中的另一种施用连续1至14天。合适地，将化合物A2和化合物B2中的一种施用连续1至7天，随后为1至10天的药物假期，随后将化合物A2和化合物B2中的另一种施用连续1至7天。
[0156] 合适地，将按顺序首先施用化合物B2，随后为任选的药物假期，随后施用化合物A2。合适地，将化合物B2施用连续3至21天，随后为任选的药物假期，随后将化合物A2施用连续3至21天。合适地，将化合物B2施用连续3至21天，随后为1至14天的药物假期，随后将化合物A2施用连续3至21天。合适地，将化合物B2施用连续3至21天，随后为3至14天的药物假期，随后将化合物A2施用连续3至21天。合适地，将化合物B2施用连续21天，随后为任选的药物假期，随后将化合物A2施用连续14天。合适地，将化合物B2施用连续14天，随后为1至14天的药物假
2 2
期，随后将化合物A施用连续14天。合适地，将化合物B施用连续7天，随后为3至10天的药物假期，随后将化合物A2施用连续7天。合适地，将化合物B2施用连续3天，随后为3至14天的药物假期，随后将化合物A2施用连续7天。合适地，将化合物B2施用连续3天，随后为3至10天的药物假期，随后将化合物A2施用连续3天。
2 2
期，随后将化合物A施用连续14天。合适地，将化合物B施用连续7天，随后为3至10天的药物假期，随后将化合物A2施用连续7天。合适地，将化合物B2施用连续3天，随后为3至14天的药物假期，随后将化合物A2施用连续7天。合适地，将化合物B2施用连续3天，随后为3至10天的药物假期，随后将化合物A2施用连续3天。
[0157] 应理解，“指定时段”施用和“依次”施用可以随后为重复给药或可以随后为替代给药方案，并且药物假期可以在重复给药或替代给药方案之前。
[0158] 本发明的方法也可以与癌症治疗的其他治疗方法一起采用。
[0159] 化合物A2和化合物B2可以通过任何适当的途径施用。合适的途径包括经口、直肠、经鼻、局部（包括经颊和舌下）、肿瘤内、阴道和肠胃外（包括皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鞘内和硬膜外）。应理解，优选的途径可以随着例如组合的接受者的状况和待治疗的癌症而变化。还应理解，施用的每种药剂可以通过相同或不同的途径来施用，并且化合物A2和化合物B2可以在药物组合物/制剂中复合在一起。
[0160] 在一个实施方案中，静脉内施用本发明的组合的一种或多种组分。在一个实施方案中，经口施用本发明的组合的一种或多种组分。在另一个实施方案中，肿瘤内施用本发明的组合的一种或多种组分。在另一个实施方案中，全身性、例如静脉内施用本发明的组合的一种或多种组分，且肿瘤内施用本发明的组合的一种或多种其他组分。在任何实施方案中，例如，在本段落中，本发明的组分作为一种或多种药物组合物施用。
[0161] 在一个方面，提供了用于治疗癌症的方法，其包括向有需要的人施用治疗有效量的（i）抗ICOS抗体或其抗原结合部分以及一种或多种稀释剂、媒介物、赋形剂和/或非活性成分，以及（ii）抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PDL1抗体或其抗原结合部分以及一种或多种稀释剂、媒介物、赋形剂和/或非活性成分。在一个实施方案中，与作为单一疗法的任一药剂的施用或同时施用相比，抗ICOS抗体或其抗原结合部分和抗PD1抗体或其抗原结合部分的依次施用提供了协同作用。在一个实施方案中，与作为单一疗法的任一药剂的施用或同时施用相比，抗ICOS抗体或其抗原结合部分和抗PDL1抗体或其抗原结合部分的依次施用提供了协同作用。
[0162] 在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分包含：包含与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VH结构域；和包含与如SEQ ID NO:8中所示的氨基酸序列具有至少90%同一性的氨基酸序列的VL结构域。
[0163] 在一个实施方案中，提供了治疗癌症的方法，其中以选自每周一次、每两周一次、每三周一次和每四周一次的时间间隔施用抗ICOS抗体或其抗原结合部分。在另一个实施方案中，以选自每周一次、每两周一次、每三周一次和每四周一次的时间间隔施用抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PDL1抗体或其抗原结合部分。如本领域中所理解，任一药剂的施用的开始可以通过间隙时段分开。所述间隙时段可以是12小时、1至6天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。通过实例的方式，可以在治疗的第1天施用抗ICOS抗体，两周的间隙时段之后，开始在第14天开始的抗PD1抗体疗法。在一个方面，用所述抗ICOS抗体治疗可以继续以例如每一、二、三或四周的时间间隔施用单一IV输注。类似地，用所述抗PD1抗体治疗可以继续以例如每一、二、三或四周的时间间隔施用单一IV输注。
[0164] 在一个实施方案中，所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分作为IV输注施用。在一个实施方案中，所述抗PD1抗体或其抗原结合部分作为IV输注施用。在一个实施方案中，所述抗PDL1抗体或其抗原结合部分作为IV输注施用。在一个方面，所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分在抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PD1抗体或其抗原结合部分之前施用。在一个实施方案中，在开始施用所述抗ICOS抗体或其抗原结合部分之后的选自1周、2周、3周和4周的时间点，起始抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PDL1抗体或其抗原结合部分的施用。在一个方面，所述抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PDL1抗体或其抗原结合部分在抗ICOS抗体或其抗原结合部分之前施用。在一个实施方案中，开始抗PD1抗体或抗PDL1疗法和开始抗ICOS抗体疗法之间的间隙时段选自1天、1周、2周、3周、4周、5周和6周。
[0165] 在一个实施方案中，将抗ICOS抗体或其抗原结合部分和所述抗PD1抗体或其抗原结合部分或者抗PDL1抗体或其抗原结合部分施用于所述人，直至所述人显示疾病进展或不可接受的毒性。在一个实施方案中，提供了用于治疗癌症的方法，其进一步包括将至少一种抗肿瘤剂和/或至少一种免疫调节剂施用于所述人。
[0166] 典型地，在本发明中，对所治疗的易感肿瘤具有活性的任何抗肿瘤剂都可以在癌症治疗中被共同施用。此类药剂的实例可见于Cancer Principles and Practice of Oncology，V.T. Devita，T.S. Lawrence,和S.A. Rosenberg（编辑），第10版（2014年12月5日），Lippincott Williams & Wilkins Publishers。本领域普通技术人员将能够基于药物的特定特征和所涉及的癌症来辨别何种药剂组合是可用的。可用于本发明中的典型的抗肿瘤剂包括但不限于：抗微管剂或抗有丝分裂剂诸如二萜类和长春花生物碱；铂配位络合物；
烷基化剂诸如氮芥、氧氮磷环类（oxazaphosphorines）、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯；抗生素药剂诸如放线菌素、蒽环类和博来霉素；拓扑异构酶I抑制剂诸如喜树碱；拓扑异构酶II抑制剂诸如表鬼臼毒素；抗代谢物诸如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂；
细胞周期信号传导抑制剂；蛋白酶体抑制剂；热休克蛋白抑制剂；癌症代谢的抑制剂；和癌症基因治疗剂，诸如基因修饰的T细胞。
烷基化剂诸如氮芥、氧氮磷环类（oxazaphosphorines）、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯；抗生素药剂诸如放线菌素、蒽环类和博来霉素；拓扑异构酶I抑制剂诸如喜树碱；拓扑异构酶II抑制剂诸如表鬼臼毒素；抗代谢物诸如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸激酶血管生成抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡剂；
细胞周期信号传导抑制剂；蛋白酶体抑制剂；热休克蛋白抑制剂；癌症代谢的抑制剂；和癌症基因治疗剂，诸如基因修饰的T细胞。
[0167] 用于与本发明的方法或组合组合使用或共同施用的进一步的一种或多种活性组分的实例是抗肿瘤剂。抗肿瘤剂的实例包括但不限于化疗剂；免疫调节剂；免疫调节物和免疫刺激佐剂。实施例
[0168] 以下实施例举例说明本发明的各个非限制性方面。
[0169] 实施例1进行的抗ICOS抗体/抗PD1抗体同时和分阶段给药研究的研究设计显示于图1中。图2是
显示抗ICOS抗体/抗PD1抗体同时和分阶段给药研究的研究程序的示意图。在图2的底部显示的是列出该研究中使用的抗体的表格。在图3-7、图8A-8C、图9A-9C和图10-14中，“Rt ICOS”是指“大鼠抗ICOS抗体”；“Rt PD1”是指“大鼠抗PD1抗体”。“Rt IgG2A”是指“大鼠IgG2A”；“Rt IgG2B”是指“大鼠IgG2B”。
显示抗ICOS抗体/抗PD1抗体同时和分阶段给药研究的研究程序的示意图。在图2的底部显示的是列出该研究中使用的抗体的表格。在图3-7、图8A-8C、图9A-9C和图10-14中，“Rt ICOS”是指“大鼠抗ICOS抗体”；“Rt PD1”是指“大鼠抗PD1抗体”。“Rt IgG2A”是指“大鼠IgG2A”；“Rt IgG2B”是指“大鼠IgG2B”。
[0170] 单一疗法：如图3、4、8B、10和11中所示，大鼠抗小鼠ICOS抗体（17G9）100 μg或10 μg显示相似的肿瘤生长率（图3、图4、图8B）和总体存活率（40%）（图10、图11）。
[0171] 大鼠抗小鼠抗PD1抗体（200 μg）对肿瘤生长速率没有作用（图3、图4、图8A-8B）。总体存活率为10%（图10、图11）。
[0172] 组合：在第10天时，与单一或分阶段给药方案相比，与抗PD1抗体组合的抗ICOS抗体（100 µg或10 µg）的同时给药显示协同的抗肿瘤功效（图3-7、8A-8C、9A- 9C）。
[0173] 用抗ICOS导入/抗PD1后续给药治疗的组12中的小鼠显示令人惊讶和出乎意料的长期存活率增加。关于小鼠的长期存活率（第1个剂量后第67天），来自组12（抗ICOS导入，随后为6个剂量的抗PD1）的60%小鼠显示完全应答（6只小鼠是无肿瘤的，发现1只小鼠由于抗药物抗体（ADA）而死亡）（图10、图12、图14）。来自组11（抗ICOS导入，随后为6个剂量的大鼠IgG2A）的百分之二十（20%）小鼠显示完全应答（3只小鼠是无肿瘤的，发现3只小鼠由于ADA而死亡）（图10、图12、图14）；该数据与抗ICOS单一疗法数据可比较。来自组8（抗PD1导入，随后为3个剂量的抗PD1+大鼠IgG2b）的百分之三十（30%）小鼠显示完全应答（3只小鼠是无肿瘤的）（图10、图12、图13 ）；这显示比3个剂量的抗PD1（10%，1只无肿瘤的小鼠）更好的总体存活率。来自组9（抗PD1导入，随后为3个剂量的抗PD1+抗ICOS）的百分之二十（20%）小鼠显示完全应答（3只小鼠是无肿瘤的，发现3只小鼠由于ADA而死亡）（图10、图12、图13）。ADA在第4个和第5个剂量时发生。
[0174] 用以下材料和方法获得本文实施例1中所述的结果。
[0175] 小鼠、肿瘤攻击和治疗所有研究都根据GSK关于实验动物的护理、福利和治疗的政策（GSK Policy on the
Care，Welfare and Treatment of Laboratory Animals）进行，并且由GSK的机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）（IACUC）、或由在其中执行工作的机构的伦理审查过程进行审查。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠（Envigo）在完全认可的AAALAC设施中用于体内研究。
Care，Welfare and Treatment of Laboratory Animals）进行，并且由GSK的机构动物护理和使用委员会（Institutional Animal Care and Use Committee）（IACUC）、或由在其中执行工作的机构的伦理审查过程进行审查。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠（Envigo）在完全认可的AAALAC设施中用于体内研究。
[0176] 将CT26小鼠结肠癌（ATCC CRL-2638）肿瘤细胞的5.0 x 104个细胞/小鼠皮下接种至右侧腹。使用Study DirectorTM软件包（Studylog Systems，South San Francisco，CA，USA）收集肿瘤体积和体重数据。使用下式计算肿瘤体积：肿瘤体积（mm）3 =0.52* l *w2，其中w＝以mm计的肿瘤宽度且l＝以mm计的肿瘤长度。当肿瘤达到大约50–100 mm3时，在治疗起始之前，使用Study LogTM软件中的分层采样方法，基于肿瘤体积将小鼠随机分为不同的组（n=10/治疗组）。关于个体小鼠大于2,000 mm3的肿瘤测量、和/或肿瘤中开放性溃疡的发展、和/或体重减轻大于20%，导致小鼠从研究中去除。在随机化当天时开始给药。从随机化当天开始，小鼠每周两次经由腹膜内注射接受小鼠抗ICOS（克隆7E.17G9）和/或小鼠抗PD1（克隆RMP1-14）抗体或盐水，总共3个剂量的抗ICOS和3个或6个剂量的抗PD1分别用于同时和依次给药。为了评估组合抗ICOS和抗PD-1单克隆抗体的抗肿瘤活性，小鼠每周两次用抗ICOS（克隆7E.17G9，大鼠IgG2b 100 µg）或其同种型对照（大鼠IgG2b 100 µg）连同抗PD-1（克隆RMP1-14，大鼠IgG2a 200 µg）或其同种型对照（大鼠IgG2a 200 µg）同时给药。对于涉及依次给药的实验，用抗ICOS抗体的任一给药在3个剂量的抗PD1后开始，这意味着6个抗PD1剂量中的最后3个与所有3个剂量的抗ICOS抗体完成后开始的抗ICOS或抗PD1给药组合给予。在相似的给药方案中也采用适当的同种型对照。
[0177] 使用GraphpadTM软件绘制数据，并且由统计学家执行统计分析。
[0178] 实施例2单独和伴随PD-1阻断引发T细胞活化和抗肿瘤应答的IgG4抗ICOS激动剂抗体的表征
实施例2中描述的是人源化的非耗尽性抗ICOS激动剂抗体的免疫刺激和抗肿瘤活性的
表征，其中重点在于同种型选择对于最佳功效的重要性，并且提供了用于在癌症患者中探索这作为单一试剂以及与PD-1检查点阻断组合的强有力理由。
实施例2中描述的是人源化的非耗尽性抗ICOS激动剂抗体的免疫刺激和抗肿瘤活性的
表征，其中重点在于同种型选择对于最佳功效的重要性，并且提供了用于在癌症患者中探索这作为单一试剂以及与PD-1检查点阻断组合的强有力理由。
[0179] 诱导性T细胞共刺激物（ICOS）是受T细胞限制的共刺激受体，在T细胞受体接合后，其表达在活化的T细胞上被诱导。我们证实抗体介导的ICOS激动作用在同基因小鼠模型中引发有效的T细胞活化，T细胞动员到肿瘤部位和抗肿瘤应答。我们的数据指示，关于激动剂抗体的同种型选择对于避免Fc依赖性细胞毒性和效应T细胞（Teff）的耗尽是至关重要的，如用测试的抗体的IgG1版本观察到的。此外，我们的数据提示，尽管较高，但在调节性T细胞（Treg）上的ICOS表达水平提供了用于大多数肿瘤中Tregs的选择性耗尽的窄窗口，这是由于Teff上的重叠ICOS水平以及在检查点阻断的存在下的ICOS上调。同种型的探索导致用于临床开发的人源化IgG4抗ICOS激动剂抗体（H2L5 IgG4PE）的选择。我们呈现了这种ICOS激动剂抗体的免疫活性和治疗潜力的表征，目前在首次人临床研究中单独以及与派姆单抗组合进行调查。
[0180] 引言诱导性T细胞共刺激物（ICOS）是与CD28/CTLA-4-Ig超家族具有结构和功能同源性的共刺激受体（Hutloff，A. Nature 397:263-266（1999））。ICOS表达受抗原刺激而上调，并且ICOS信号传导诱导TH1和TH2细胞因子的产生以及效应T细胞（Teff）的增殖。已经在静息TH17、T滤泡辅助（TFH）和调节性T（Treg）细胞上观察到ICOS表达；然而，与CD28不同，它在大多数静息幼稚和记忆T细胞群体上并非高度表达的（Fazilleau，N.等人Nat Immunol. 8（7）:753-
61.（2007），Paulos，C.M.等人Sci Transl Med. 2（55）: 55-78.（2010））。ICOS在免疫应答过程中的Teff和Treg存活和扩增中起关键作用（Burmeister，Y.等人J Immunol. 180（2）:
774-82.（2008）），并且已经显示对于TH17的发育和功能是至关重要的（Paulos，C.M.等人Sci Transl Med. 2（55）: 55-78.（2010），Guedan，S.等人Blood 124（7）: 1070-80.（2014））。
61.（2007），Paulos，C.M.等人Sci Transl Med. 2（55）: 55-78.（2010））。ICOS在免疫应答过程中的Teff和Treg存活和扩增中起关键作用（Burmeister，Y.等人J Immunol. 180（2）:
774-82.（2008）），并且已经显示对于TH17的发育和功能是至关重要的（Paulos，C.M.等人Sci Transl Med. 2（55）: 55-78.（2010），Guedan，S.等人Blood 124（7）: 1070-80.（2014））。
[0181] 来自用抗CTLA-4抗体治疗的患者的新出现数据提示，表达ICOS的记忆T细胞可以帮助介导抗肿瘤免疫应答和长期存活（Liakou，C.I.等人Proc Natl Acad Sci USA. 105（39）: 14987-92.（2008）；Di Giacomo，A.M.等人Cancer Immunol Immunother. 62（6）: 1021-8.（2013）；Carthon，B.C.等人Clin Cancer Res. 16（10）: 2861-71.（2010）；
Vonderheide，R.H.等人Clin Cancer Res. 16（13）: 3485-94.（2010））。已经显示ICOS对于小鼠中的抗CTLA-4抗肿瘤活性是至关重要的（Fu，T. He，Q.，Sharma，P. Cancer Res. 71（16）: 5445-54.（2011）；Fan，X，等人J Exp Med. 211（4）:715-25.（2014）），并且先前的报道支持使用重组鼠ICOS配体活化CD4和CD8 T细胞上的ICOS具有抗肿瘤潜力的概念（Ara，G.等人Int. J Cancer. 103（4）: 501-7（2003））。除ICOS之外，人ICOS配体（ICOS L）已经显示还结合CTLA-4和CD28两者，这限制了重组ICOS-L作为在人中的治疗剂的潜在用途（Yao，S.等人Immunity 34（5），729-40.（2011））；需要活化癌症患者中的ICOS的替代治疗方法。
Vonderheide，R.H.等人Clin Cancer Res. 16（13）: 3485-94.（2010））。已经显示ICOS对于小鼠中的抗CTLA-4抗肿瘤活性是至关重要的（Fu，T. He，Q.，Sharma，P. Cancer Res. 71（16）: 5445-54.（2011）；Fan，X，等人J Exp Med. 211（4）:715-25.（2014）），并且先前的报道支持使用重组鼠ICOS配体活化CD4和CD8 T细胞上的ICOS具有抗肿瘤潜力的概念（Ara，G.等人Int. J Cancer. 103（4）: 501-7（2003））。除ICOS之外，人ICOS配体（ICOS L）已经显示还结合CTLA-4和CD28两者，这限制了重组ICOS-L作为在人中的治疗剂的潜在用途（Yao，S.等人Immunity 34（5），729-40.（2011））；需要活化癌症患者中的ICOS的替代治疗方法。
[0182] 在此处，我们描述了首创的人源化IgG4抗ICOS激动剂单克隆抗体（mAb）H2L5 IgG4PE的免疫学和抗肿瘤表征，所述抗体设计为经由Fcγ受体（FcγR）交联递送最佳ICOS激动作用，伴随最低限度的抗体依赖性细胞的细胞毒性（ADCC）和吞噬活性；从而减少了Teff耗尽的风险。本文所述的全面临床前数据支持目前在首次人临床研究中单独以及与派姆单抗组合进行调查的H2L5 IgG4PE的临床测试。
[0183] 结果有效且选择性的抗人ICOS激动剂单克隆抗体（mAb）的开发
我们通过用ICOS细胞外结构域免疫小鼠进行了激动性抗人ICOS mAb的生成。这些mAb
之一被人源化，并且表达为具有2个Fc突变的人IgG4（谷氨酸取代在残基235处的亮氨酸）（Kabat，E. A.，等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Dept. of Health and Human Services，Bethesda，MD，NIH出版号91-3242.（1991））以及脯氨酸取代在残基228处的丝氨酸（EU编号），以减少与天然IgG4的抗原结合片段（Fab）臂交换（Manjula，P.等人The Journal of Immunology. 164:1925-1933.（2000），Rispens，T.等人J. Am. Chem. Soc. 133（26）:10302–10311.（2011））。以下将所得的H2L5 IgG4PE称为“H2L5”。
我们通过用ICOS细胞外结构域免疫小鼠进行了激动性抗人ICOS mAb的生成。这些mAb
之一被人源化，并且表达为具有2个Fc突变的人IgG4（谷氨酸取代在残基235处的亮氨酸）（Kabat，E. A.，等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S. Dept. of Health and Human Services，Bethesda，MD，NIH出版号91-3242.（1991））以及脯氨酸取代在残基228处的丝氨酸（EU编号），以减少与天然IgG4的抗原结合片段（Fab）臂交换（Manjula，P.等人The Journal of Immunology. 164:1925-1933.（2000），Rispens，T.等人J. Am. Chem. Soc. 133（26）:10302–10311.（2011））。以下将所得的H2L5 IgG4PE称为“H2L5”。
[0184] H2L5以1.34 nM的亲和力与人ICOS结合（图15A），其比天然ICOS L/CD275相互作用高大约17倍（图15B）。H2L5不与鼠ICOS或者人CD28或CTLA-4（两种最接近的结构相关蛋白）结合。这与结合CTLA-4和CD28两者的天然人ICOS-L形成对比（Yao，S.等人Immunity 34（5），729-40.（2011））。H2L5通过流式细胞术阻断了ICOS/ICOS-L结合，并且在MSD免疫测定法中，在高于1 µg/mL的浓度下，与ICOS-L部分竞争（≤50%）与ICOS的结合（图22A-22B）。H2L5还与来自健康人供体的活化的PBMC样品中的CD4和CD8 T细胞两者结合（图15C）。先前已经显示ICOS响应人T细胞中的ICOS-L结合而活化AKT（Okamoto，N.等人Biochem Biophys Res Commun. 310（3）: 691-702.（2003））；预活化的原代人CD4 T细胞证实响应用H2L5的治疗，在pAKT和pGSK3β中的增加（图15D）。当以板结合的形式连同抗CD3一起使用时，H2L5显著增加CD4和CD8 T细胞活化，如通过CD69表达（图15E）和增殖（图15F）所测量的。在不存在抗CD3处理的情况下，用H2L5观察到最低限度的活化，指示它在这些测定法条件下不具有超激动剂活性。
[0185] 板结合的H2L5抗体在来自健康供体（HD）的PBMC中诱导TH1、TH2和TH17细胞因子，IFN-γ、TNF-α、IL-17a、IL-10、IL-6以及较小程度的IL-2、IL-5和IL-13中的剂量依赖性增加（图15G、图23A、图33）。在来自NSCLC患者的PBMC中观察到相似的细胞因子诱导概况，具有IFN-γ的强诱导，以及较低水平的其他细胞因子，包括TNF-α、IL-10和IL-2（图15H、图34）。用板结合的抗CD3和H2L5刺激后，用HD也观察到在CD4和CD8 T细胞两者上的T细胞活化标志物：CD25、OX40和CD69中的剂量依赖性增加（图23B）。对于分离的人CD3+ T细胞，用H2L5处理导致TH1转录因子T-Bet（图15I）以及细胞毒性分子颗粒酶-B（图15J）的mRNA表达中的显著增加。观察到L-选择素表达中的显著降低，指示朝向活化的效应子表型的转变（图15K）。还评价了在培养6天后，在抗CD3的存在下，板结合的H2L5抗体共刺激来自解聚肿瘤的离体分离的T细胞的能力。在9/10个供体中可见IFN-γ的浓度依赖性和稳固增加（图15L），连同与健康的PBMC相比，IL-17和IL-10的较不稳固诱导，以及低-无法检测水平的TH2细胞因子（IL-5和IL-13）（图24A-D）。除CD8+PD-1+细胞和CD4+CD25+Foxp3+（Treg）细胞中的适度增加之外，在CD8 T细胞上还观察到了活化标志物OX40（图15M）、CD25（图15N）和LAG3（图25A）中的显著增加（图25B-25D）。在大多数供体中仅观察到低百分比的表达ICOS-L的细胞（图
25C）。
25C）。
[0186] 总之，这些数据显示H2L5是有效的ICOS激动剂，能够驱动T细胞活化和增殖，但在不存在TCR刺激的情况下，并非是能够驱动T细胞活化的超激动剂。
[0187] 抗体同种型和FcγR接合对于H2L5功能是至关重要的FcγR介导的交联对于激动剂抗体功能是至关重要的（Dahal，L.N.等人Immunol Rev.
268（1）: 104-22.（2015）；Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014））。图15中描述的结果利用板结合的抗体，其克服了对于FcγR交联的需要，并且提示能够接合FcγR并介导交联的抗体同种型是实现最佳ICOS激动作用的关键。为了正式评价这一点，我们克隆了H2L5的重链和轻链可变区，并且将它们表达为不同的人IgG同种型（IgG1、IgG2、IgG4PE和Fc缺陷的IgG1[氨基酸（AA）取代L235A和G237A）（Bartholomew，M.等人Immunology 85（1）: 41-8（1995））。确定了不同H2L5同种型变体针对人FcγRI、FcγRIIa（H131）、FcγRIIa（R131）、FcγRIIb、FcγRIIIa（V158）和FcγRIIIa（F158）的结合，并且证实预期的结合模式（图35）。IgG4PE含有来自天然人IgG4的两个AA取代；谷氨酸取代在残基
235处的亮氨酸（Kabat，E. A.，等人Sequences of Proteins of Immunological
Interest，第五版，U.S. Dept. of Health and Human Services，Bethesda，MD，NIH出版号
91-3242.（1991）），以及脯氨酸取代在残基228处的丝氨酸（EU编号），以减少与天然IgG4的抗原结合片段（Fab）臂交换（Manjula，P.等人The Journal of Immunology. 164:1925-
1933.（2000），Rispens，T.等人J. Am. Chem. Soc. 133（26）:10302–10311.（2011）），并且降低与活化FcγR和C1q的结合，同时保持与抑制性FcgRIIb的结合。在PBMC测定法中，当以大于50%的测试供体加入溶液中时，H2L5 IgG1抗体降低了CD4和CD8 T细胞两者的增殖（图
16A）。相比之下，H2L5的IgG2、IgG4PE和Fc缺陷的同种型变体在测试的任何供体中都未导致CD4或CD8 T细胞增殖的大量抑制，而H2L5 IgG4PE形式导致在供体的亚群中的增殖增加（图
16A）。我们接下来测试了H2L5 IgG1的抑制作用是否归因于经由PBMC混合物中的NK细胞的ADCC。在来自10个健康供体（HD）的PBMC中，当从PBMC库中去除NK细胞时，H2L5 IgG1对CD4和CD8群体两者的抑制作用丧失（图16B）。H2L5同种型变体也在报道基因测定法中进行测试，所述报道基因测定法检测FcγRIIIa的接合，所述FcγRIIIa是负责在人中NK介导的ADCC的主要活化FcγR。尽管H2L5 IgG1诱导萤光素酶信号传导中的显著增加，但当与活化的T细胞一起温育时，H2L5 IgG4PE或Fc缺陷的H2L5抗体均未诱导FcγRIIIa介导的信号传导（图
26A）。另外，H2L5 IgG1以NK依赖性方式诱导T细胞死亡，而与同种型对照相比，IgG4PE或Fc缺陷的H2L5均未导致细胞死亡中的任何显著增加（图16C）。
268（1）: 104-22.（2015）；Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014））。图15中描述的结果利用板结合的抗体，其克服了对于FcγR交联的需要，并且提示能够接合FcγR并介导交联的抗体同种型是实现最佳ICOS激动作用的关键。为了正式评价这一点，我们克隆了H2L5的重链和轻链可变区，并且将它们表达为不同的人IgG同种型（IgG1、IgG2、IgG4PE和Fc缺陷的IgG1[氨基酸（AA）取代L235A和G237A）（Bartholomew，M.等人Immunology 85（1）: 41-8（1995））。确定了不同H2L5同种型变体针对人FcγRI、FcγRIIa（H131）、FcγRIIa（R131）、FcγRIIb、FcγRIIIa（V158）和FcγRIIIa（F158）的结合，并且证实预期的结合模式（图35）。IgG4PE含有来自天然人IgG4的两个AA取代；谷氨酸取代在残基
235处的亮氨酸（Kabat，E. A.，等人Sequences of Proteins of Immunological
Interest，第五版，U.S. Dept. of Health and Human Services，Bethesda，MD，NIH出版号
91-3242.（1991）），以及脯氨酸取代在残基228处的丝氨酸（EU编号），以减少与天然IgG4的抗原结合片段（Fab）臂交换（Manjula，P.等人The Journal of Immunology. 164:1925-
1933.（2000），Rispens，T.等人J. Am. Chem. Soc. 133（26）:10302–10311.（2011）），并且降低与活化FcγR和C1q的结合，同时保持与抑制性FcgRIIb的结合。在PBMC测定法中，当以大于50%的测试供体加入溶液中时，H2L5 IgG1抗体降低了CD4和CD8 T细胞两者的增殖（图
16A）。相比之下，H2L5的IgG2、IgG4PE和Fc缺陷的同种型变体在测试的任何供体中都未导致CD4或CD8 T细胞增殖的大量抑制，而H2L5 IgG4PE形式导致在供体的亚群中的增殖增加（图
16A）。我们接下来测试了H2L5 IgG1的抑制作用是否归因于经由PBMC混合物中的NK细胞的ADCC。在来自10个健康供体（HD）的PBMC中，当从PBMC库中去除NK细胞时，H2L5 IgG1对CD4和CD8群体两者的抑制作用丧失（图16B）。H2L5同种型变体也在报道基因测定法中进行测试，所述报道基因测定法检测FcγRIIIa的接合，所述FcγRIIIa是负责在人中NK介导的ADCC的主要活化FcγR。尽管H2L5 IgG1诱导萤光素酶信号传导中的显著增加，但当与活化的T细胞一起温育时，H2L5 IgG4PE或Fc缺陷的H2L5抗体均未诱导FcγRIIIa介导的信号传导（图
26A）。另外，H2L5 IgG1以NK依赖性方式诱导T细胞死亡，而与同种型对照相比，IgG4PE或Fc缺陷的H2L5均未导致细胞死亡中的任何显著增加（图16C）。
[0188] 先前的研究已报道受体密度可能影响T细胞对通过ADCC的杀死的敏感性，导致不同T细胞亚群的潜在优先耗尽，与淋巴组织相比，其在肿瘤微环境中可能不同（Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014））。通过流式细胞术确定在从不同肿瘤中新鲜分离的CD4、CD8和Treg上的ICOS表达水平。尽管相对于CD4和CD8 T细胞，在Treg细胞上观察到更高的表达，但这是异质的，其中一些肿瘤显示在这些群体之间的重叠水平；因而，ICOS的高表达不是Treg的独特特点（图16D）。为了进一步评估Fc同种型对通过ADCC的潜在耗尽的相对贡献，直接从不同癌症患者中纯化CD4、CD8和Treg细胞，并且将ICOS受体密度的水平与H2L5的IgG1或IgG4PE同种型在离体报道基因测定法中刺激FcγRIIIA的能力相关联（图16E、图26B）。当与H2L5 IgG4PE同种型一起温育时，从肿瘤分离的T细胞并不刺激FcγRIIIa，而与H2L5 IgG1一起温育确实导致一些（可变）刺激。在一些肿瘤中，FcRγIIIa受体接合用Treg、CD4和CD8可见，尤其是在1-10 µg/mL的剂量下，这支持Treg的选择性ADCC耗尽而不影响CD4和CD8在所有肿瘤中并非普遍地可能的想法（例如，乳腺癌1001202患者样品常规CD4 T细胞在1-10 μg/ml的剂量下诱导与Treg相似的刺激；图16F、图26B）。
[0189] 基于上述数据，选择用于开发的同种型是工程改造的IgG4PE抗体H2L5。
[0190] H2L5诱导FcγR介导的TCR依赖性T细胞活化的激动作用。
[0191] 用分离的人CD4 T细胞以板结合（固定抗体）形式以及在溶液中测试H2L5。与可溶性抗体相比，以固定化形式的H2L5（其模拟膜结合的FcγR依赖性交联）诱导了显著更大水平的IFN-γ（图17A）。FcγR接合对于最佳H2L5激动剂活性的重要性在活化的人PBMC测定法中得到进一步确认，其中H2L5导致>2倍的IFN-γ诱导；而与同种型对照相比，H2L5的Fc缺陷版本没有细胞因子诱导活性（图17B）。还在改良的混合淋巴细胞反应（MLR）中测试了H2L5的IgG4PE和Fc缺陷版本。H2L5 IgG4PE mAb提供了>2倍的IFN-γ诱导，而与同种型对照相比，Fc缺陷的H2L5 mAb没有活性（图17C）。接下来，利用CD4T细胞/CD14单核细胞供体匹配的共培养测定法来确定表达FcγR的单核细胞是否增加了可溶性H2L5的激动剂潜力。如同MLR测定法形式，当作为IgG4PE同种型进行测试时，H2L5仅诱导IFN-γ；与同种型对照相比，Fc缺陷的抗体未显示显著的细胞因子诱导。与单独的T细胞相比，已知表达FcγR包括FcγRII亚型的单核细胞的添加导致H2L5 IgG4PE诱导的细胞因子产生中的显著增加。已经显示与FcγRIIB的相互作用对于靶向TNF-α家族受体以及CD28的其他免疫调节抗体的激动活性是至关重要的（Bartholomew，M.等人Immunology 85（1）: 41-8（1995）；Bartholomaeus，P.等人J Immunol. 192（5）: 2091-8.（2014））。相反，FcγR阻断抗体的添加完全抑制了H2L5诱导的细胞因子诱导（图17D）。这些结果指示，如对于其他IgG4激动剂抗体可见的，H2L5可能经由FcγRIIB实现FcγR接合（Bartholomaeus，P.等人J Immunol. 192（5）: 2091-8.（2014），Hussain，K.等人Blood 125（1）: 102-110（2015）），同时避免ICOS+ T细胞的ADCC杀死，如对于IgG1同种型可见的。
[0192] 为了评价其在细胞表面处的定位和动员，将H2L5进行荧光标记，连同DC一起加入原代活化的人CD3+ T细胞培养物中，并且进行成像。结合后，H2L5在T细胞表面上快速极化。动员的T细胞开始扫描培养物，直到起始与树突状细胞（DC）的结合。在其中T细胞与DC处于细胞接触的情况下，H2L5在接触点处累积（图17E）。使用人DC和T细胞的共培养物的另外研究证实，H2L5与CD28以及较低程度的CD4快速共定位于活化T细胞的极化帽、以及随后在T细胞与DC结合后形成的免疫突触处（图17F）。这些结果指示ICOS诱导人T细胞动员，并且在T细胞活化后共定位于免疫突触处。
[0193] H2L5在体内诱导效应记忆表型和抗肿瘤活性在植入有A2058肿瘤的人PBMC移植的NSG小鼠模型中评估了H2L5的体内功能性。该模型
诱导了移植物抗宿主病（GVHD）应答，并且先前已被用于研究效应子和记忆T细胞的活性（23）。在H2L5处理的小鼠的血液中，人T细胞的数目以剂量依赖性方式降低（图18A），同时观察到CD69表达（代表T细胞活化）中的相应增加（图18B）。与H2L5 IgG4PE相比，H2L5的Fc缺陷版本显示相似（尽管更弱）的趋势，提示细胞的消失并非由于ADCC。H2L5诱导CD4+CD45R0+CD62L-效应型记忆（TEM）细胞（图18C）和CD8+CD45RO-CD62L-终末分化的CD8效应子细胞（TEMRA）（图18D）中的剂量依赖性增加。接下来在携带HCT116或A549肿瘤的人PBMC移植的NSG小鼠中测试H2L5。在血液和肿瘤中在0.4和更低程度的0.04 mg/kg的剂量下观察到，H2L5与ICOS+ T细胞（CD4、CD8和Treg）的结合通过人抗IgG4荧光标记抗体的检测，证实荷有A549肿瘤的小鼠中的靶接合（图18E、图27A-27B）。用抗PD-1 IgG4抗体（Keytruda）治疗的小鼠也显示使用相同检测试剂的结合抗体检测。用H2L5治疗小鼠与A549肿瘤中的CD8:Treg比增加相关，与用抗PD-1治疗的小鼠中观察到的那种可比较。（图18F）。H2L5导致HCT116和A549肿瘤模型两者中显著的肿瘤生长抑制（图18G-18H）。在其中GVHD应答较不严重的A549模型中，肿瘤生长抑制导致超过50天的剂量依赖性存活率增加（图18I）。这些实验提示与ICOS受体的成功接合相关联的0.4 mg/kg剂量，导致与血液和肿瘤中的T细胞活化以及肿瘤生长的减少有关的后续药理效应。
诱导了移植物抗宿主病（GVHD）应答，并且先前已被用于研究效应子和记忆T细胞的活性（23）。在H2L5处理的小鼠的血液中，人T细胞的数目以剂量依赖性方式降低（图18A），同时观察到CD69表达（代表T细胞活化）中的相应增加（图18B）。与H2L5 IgG4PE相比，H2L5的Fc缺陷版本显示相似（尽管更弱）的趋势，提示细胞的消失并非由于ADCC。H2L5诱导CD4+CD45R0+CD62L-效应型记忆（TEM）细胞（图18C）和CD8+CD45RO-CD62L-终末分化的CD8效应子细胞（TEMRA）（图18D）中的剂量依赖性增加。接下来在携带HCT116或A549肿瘤的人PBMC移植的NSG小鼠中测试H2L5。在血液和肿瘤中在0.4和更低程度的0.04 mg/kg的剂量下观察到，H2L5与ICOS+ T细胞（CD4、CD8和Treg）的结合通过人抗IgG4荧光标记抗体的检测，证实荷有A549肿瘤的小鼠中的靶接合（图18E、图27A-27B）。用抗PD-1 IgG4抗体（Keytruda）治疗的小鼠也显示使用相同检测试剂的结合抗体检测。用H2L5治疗小鼠与A549肿瘤中的CD8:Treg比增加相关，与用抗PD-1治疗的小鼠中观察到的那种可比较。（图18F）。H2L5导致HCT116和A549肿瘤模型两者中显著的肿瘤生长抑制（图18G-18H）。在其中GVHD应答较不严重的A549模型中，肿瘤生长抑制导致超过50天的剂量依赖性存活率增加（图18I）。这些实验提示与ICOS受体的成功接合相关联的0.4 mg/kg剂量，导致与血液和肿瘤中的T细胞活化以及肿瘤生长的减少有关的后续药理效应。
[0194] 鼠抗ICOS抗体的Fc同种型影响同基因肿瘤中的功效在文献中使用CTLA-4、PD-L1、OX40和CD40的研究已经显示，mAb的Fc同种型的选择可以显著影响不同肿瘤模型中的功效（Dahal，L.N.等人Immunol Rev. 268（1）: 104-22.（2015）；Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014））。为了生成就FcγR结合而言等价于人IgG4的替代小鼠抗ICOS抗体，（图36）将抗小鼠ICOS抗体7E-17G9克隆到鼠（m）IgG1和mIgG2a同种型内，并且在2种不同的肿瘤模型中进行测试。7E-17G9抗体以板结合的形式显示与抗CD3的激动活性（图28）。在EMT6模型中，mIgG1抗体显示比mIgG2a在存活率（图19A）和肿瘤生长抑制（图29A）两者上更大的功效，尤其是在更高的剂量（>5 mg/kg，100 µg/小鼠）下。然而，两个同种型在CT26模型中仅显示适度的剂量依赖性功效，如单一疗法一样（图19B、图29B）。如上文对于人IgG1所述，mIgG2a耗尽的抗体可能不如mIgG1有
3
效，因为它具有耗尽Teff和Treg两者的潜力。在治疗之前（100 mm），相对于CT26，对于EMT6观察到明显更高的CD8:Treg比（图19C），并且EMT6和CT26模型两者均显示肿瘤相对于脾脏中ICOS阳性CD4和CD8以及Treg细胞的百分比增加（图19D、图30），但相对于CT26，在EMT6的脾脏中观察到更高百分比的IC0S CD8阳性细胞（80%相对于10%）。尽管对于EMT6和CT26肿瘤两者均观察到在来自肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的Treg上高水平的ICOS表达，但CD8 TIL的ICOS水平在EMT6是CT26的大约10倍（30,000相对于3000 MFI）。这提示在外周和肿瘤两者中在CD8上的高ICOS表达可能与EMT6模型中的mIgG1抗体的激动活性的应答相关（图19E-19G）。为了进一步探索激动剂抗ICOS mAb在荷有EMT6乳腺肿瘤的小鼠中的机制，调查了对TCR多样性的作用；注意到在ICOS mAb治疗的小鼠的血液中，独特的循环TCR克隆数目中的显著变化，以及TCR克隆性中的相应增加（图31A-31C）。还在肿瘤中发现了响应ICOS激动剂mAb治疗在小鼠血液中扩增的大多数克隆（图19H）。这些发现指示，小部分的肿瘤反应性T细胞克隆响应ICOS mAb治疗而扩增。
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效，因为它具有耗尽Teff和Treg两者的潜力。在治疗之前（100 mm），相对于CT26，对于EMT6观察到明显更高的CD8:Treg比（图19C），并且EMT6和CT26模型两者均显示肿瘤相对于脾脏中ICOS阳性CD4和CD8以及Treg细胞的百分比增加（图19D、图30），但相对于CT26，在EMT6的脾脏中观察到更高百分比的IC0S CD8阳性细胞（80%相对于10%）。尽管对于EMT6和CT26肿瘤两者均观察到在来自肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的Treg上高水平的ICOS表达，但CD8 TIL的ICOS水平在EMT6是CT26的大约10倍（30,000相对于3000 MFI）。这提示在外周和肿瘤两者中在CD8上的高ICOS表达可能与EMT6模型中的mIgG1抗体的激动活性的应答相关（图19E-19G）。为了进一步探索激动剂抗ICOS mAb在荷有EMT6乳腺肿瘤的小鼠中的机制，调查了对TCR多样性的作用；注意到在ICOS mAb治疗的小鼠的血液中，独特的循环TCR克隆数目中的显著变化，以及TCR克隆性中的相应增加（图31A-31C）。还在肿瘤中发现了响应ICOS激动剂mAb治疗在小鼠血液中扩增的大多数克隆（图19H）。这些发现指示，小部分的肿瘤反应性T细胞克隆响应ICOS mAb治疗而扩增。
[0195] 人癌症中的ICOS/ICOS-L途径的表征为了进一步探索ICOS激动剂mAb作为抗肿瘤治疗性抗体的转变，通过ICOS mRNA表达对
来自TCGA数据库的人实体瘤进行排序（图26）。在头颈癌、胃癌、食管癌、黑色素瘤、NSCLC、子宫颈癌和乳腺癌中观察到最高的表达。通过单重IHC在NSCLC中证实表达（图32）。由于H2L5激动剂mAb的作用方式被设计为表型模拟（phenocopy）ICOS-L活性，因此在这些肿瘤类型中分析了关于ICOS和ICOS-L的mRNA的共表达（图20A）。ICOS表达经常不与ICOS-L共表达，支持H2L5可能加强这些肿瘤中的低水平ICOS信号传导的假说。我们还评价了相同样品中PD-L1的相对表达。PD-L1的表达已经与T细胞浸润增加相关，并且用作预测性生物标志物，以富集在不同适应症中响应抗PD-1/PD-L1治疗的患者。总体上，PD-L1和ICOS表达之间存在明确相关，但这在不同适应症之间是可变的（图20A）。这些结果通过CD4、CD8和FOXP3表达的IHC染色得到证实，并且在NSCLC中趋于与ICOS定位于免疫浸润物中（图20B）。
来自TCGA数据库的人实体瘤进行排序（图26）。在头颈癌、胃癌、食管癌、黑色素瘤、NSCLC、子宫颈癌和乳腺癌中观察到最高的表达。通过单重IHC在NSCLC中证实表达（图32）。由于H2L5激动剂mAb的作用方式被设计为表型模拟（phenocopy）ICOS-L活性，因此在这些肿瘤类型中分析了关于ICOS和ICOS-L的mRNA的共表达（图20A）。ICOS表达经常不与ICOS-L共表达，支持H2L5可能加强这些肿瘤中的低水平ICOS信号传导的假说。我们还评价了相同样品中PD-L1的相对表达。PD-L1的表达已经与T细胞浸润增加相关，并且用作预测性生物标志物，以富集在不同适应症中响应抗PD-1/PD-L1治疗的患者。总体上，PD-L1和ICOS表达之间存在明确相关，但这在不同适应症之间是可变的（图20A）。这些结果通过CD4、CD8和FOXP3表达的IHC染色得到证实，并且在NSCLC中趋于与ICOS定位于免疫浸润物中（图20B）。
[0196] 在来自不同肿瘤类型的活检样品中，通过流式细胞术分析在肿瘤微环境中关键细胞类型的存在。在CD45+白细胞群体中，CD3 T细胞看起来是占主导的细胞类型，范围为20-80%；还存在其他细胞类型，例如B细胞、巨噬细胞、单核细胞、NK细胞和DC（图20C）。这些细胞类型表达FcγR包括FcγRIIb，其可提供肿瘤微环境中的H2L5激动活性所需的交联
（Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014））。T细胞亚群的组成平均为CD4（68%）、CD8（30%）和Tre（g 2%），尽管在不同肿瘤之间存在相当大的异质性。当分开分析肿瘤类型时，CD8和Treg之间的异质性很明确，其中NSCLC和RCC显示高CD8/Treg比（图20D）。
执行通过多重IHC的进一步分析，以表征不同T细胞亚型的ICOS表达。在一定比例的CD3+PD-
1+细胞上观察到ICOS的共表达，尤其是在头颈癌、食管癌、NSCLC和黑色素瘤中，这支持用抗PD-1疗法的组合治疗的原理（图20E-20F）。
（Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014））。T细胞亚群的组成平均为CD4（68%）、CD8（30%）和Tre（g 2%），尽管在不同肿瘤之间存在相当大的异质性。当分开分析肿瘤类型时，CD8和Treg之间的异质性很明确，其中NSCLC和RCC显示高CD8/Treg比（图20D）。
执行通过多重IHC的进一步分析，以表征不同T细胞亚型的ICOS表达。在一定比例的CD3+PD-
1+细胞上观察到ICOS的共表达，尤其是在头颈癌、食管癌、NSCLC和黑色素瘤中，这支持用抗PD-1疗法的组合治疗的原理（图20E-20F）。
[0197] 接下来，使用Human PanCancer-Immune概况分析实验对象组确定H2L5共刺激对通过纯化的人T细胞的基因表达的作用，以鉴定ICOS基因表达特征（gene signature）。与单独的抗CD3相比，差异诱导了120个基因，其中85个上调和35个下调（图20G）。与单独的抗CD3相比，由H2L5诱导了几种免疫相关基因或途径，包括TH1细胞因子和趋化因子、T细胞功能和细胞毒性、以及TNF家族成员（图38）。从用7E.17G9治疗的EMT6小鼠肿瘤中鉴定的与人ICOS诱导的表达特征重叠的顶部基因显示于图20H中。这种信息被用于指导ICOS转录表达特征的开发，以在早期临床研究中监测H2L5的药效学作用。
[0198] ICOS激动剂治疗在肿瘤中诱导PD-1/PD-L1，并且证实与抗PD-1阻断组合增加的活性PD-L1，已知的IFN-γ应答基因，以及PD-1，在ICOS mAb治疗的小鼠的肿瘤中显著增加（图21A-21B）。人PBMC从六个癌症患者中收集并且用H2L5处理，其导致在CD4和CD8 T细胞两者上的PD-1表达中的显著增加（图21C）。另外，与治疗前相比，用抗PD-1疗法治疗的NSCLC和黑色素瘤患者显示外周血中的CD4 T细胞上的ICOS表达增加（图21D）。因此，我们测试了与PD-1阻断抗体的组合是否可以加强ICOS激动剂mAb的抗肿瘤活性。ICOS激动剂mAb（7E17G9 mIgG1同种型）在具有已建立的EMT6肿瘤（150 mm3）的小鼠中单独或与抗PD-1抗体组合给药。与单独用ICOS或PD-1抗体的单一疗法治疗相比，组合导致增加的抗肿瘤应答和长期存活率（90%的小鼠）（图21E）。还在人源化的小鼠模型中评价了H2L5和抗PD-1（派姆单抗）的组合，并且与单独的单一疗法相比，导致对A549肿瘤增强的抗肿瘤应答（图21F）。这些数据显示ICOS激动剂抗体的添加显著改善由PD-1抗体诱导的抗肿瘤活性。
[0199] H2L5进一步单独或与派姆单抗组合在离体测定法中，在来自6个NSCLC患者的原发切除肿瘤中进行测试。虽然用单独的H2L5处理导致所测试的4/6个NSCLC肿瘤样品中的IFN-γ中的显著增加，但H2L5和派姆单抗的组合导致与单独的派姆单抗相比IFN-γ中的显著增加，以及与单独的H2L5处理相比5/6个样品中的增加（图21G）。还在改良的同种异体人MLR测定法中测试了与派姆单抗组合的H2L5，其中在3/3个不同的健康供体对中，与单独的任一药剂相比，组合处理导致增加的IFN-α水平（图21H）。
[0200] 讨论我们已经呈现了首创的人源化的IgG4抗ICOS激动剂mAb H2L5的免疫活性和治疗潜力
的首次充分表征。我们已经证实，H2L5 IgG4PE激动剂抗体在体外和体内诱导CD4和CD8 T细胞两者的显著活化和克隆扩增。通过增加TH1细胞因子（例如IFN-γ）的表达、以及增加细胞毒性因子（例如颗粒酶B）的产生，这些T细胞具有增加的效应子功能。ICOS抗体活化的T细胞展示对具有显著累积和浸润的肿瘤的组织归巢性增加，导致抗肿瘤应答。使用ICOS-/-和-/-
ICOS-L 小鼠以及针对ICOS-L的阻断抗体的先前报道已经证实，ICOS对于小鼠中的CD4和CD8 TEM细胞的扩增、存活和功能的重要性（4、24-25）。另外，已经发现患有普通变异型免疫缺陷病（其特征在于ICOS的纯合丢失）的患者具有较少的记忆T细胞，特别是其为CD62L低的那些患者（26）。我们使用新型人ICOS特异性激动剂抗体的研究已经确认ICOS用于诱导这一记忆T细胞群体的作用，提供了用于靶向人中的这一重要机制的可行治疗方法。
的首次充分表征。我们已经证实，H2L5 IgG4PE激动剂抗体在体外和体内诱导CD4和CD8 T细胞两者的显著活化和克隆扩增。通过增加TH1细胞因子（例如IFN-γ）的表达、以及增加细胞毒性因子（例如颗粒酶B）的产生，这些T细胞具有增加的效应子功能。ICOS抗体活化的T细胞展示对具有显著累积和浸润的肿瘤的组织归巢性增加，导致抗肿瘤应答。使用ICOS-/-和-/-
ICOS-L 小鼠以及针对ICOS-L的阻断抗体的先前报道已经证实，ICOS对于小鼠中的CD4和CD8 TEM细胞的扩增、存活和功能的重要性（4、24-25）。另外，已经发现患有普通变异型免疫缺陷病（其特征在于ICOS的纯合丢失）的患者具有较少的记忆T细胞，特别是其为CD62L低的那些患者（26）。我们使用新型人ICOS特异性激动剂抗体的研究已经确认ICOS用于诱导这一记忆T细胞群体的作用，提供了用于靶向人中的这一重要机制的可行治疗方法。
[0201] 我们显示对于实现针对人ICOS的激动剂功能，相对于天然人IgG4掺入突变S228P和L235E（EU编号）的IgG4的工程改造形式是超过IgG1的优选抗体同种型。这些AA变化阻止了与天然IgG4的异质交换（Rispens，T.等人J. Am. Chem. Soc. 133（26）:10302–10311.（2011））。与人IgG1相比，IgG4PE同种型还具有与活化FcγR和C1q的减少结合，从而缩小了H2L5的细胞毒性潜力，其可以分别通过抗体依赖性机制或补体依赖性机制导致ICOS阳性T细胞的耗尽（Manjula，P.等人The Journal of Immunology. 164:1925-1933.（2000））。我们的体外研究已经显示，H2L5的IgG1同种型（计划开发的H2L5的初始同种型）能够杀死表达高水平ICOS的活化CD4和CD8 T细胞，并且以NK依赖性方式减少其增殖；这对于IgG4PE同种型未见。重要的是，IgG4PE同种型保留了与FcbRIIb（抑制性FcγR）的功能性结合，这对于使得针对几种刺激性免疫受体的激动剂活性成为可能至关重要（Bartholomaeus，P.等人J Immunol. 192（5）: 2091-8.（2014）；Hussain，K.等人 Blood 125（1）: 102-110（2015），Aalberse，R.C和Schuurman，J. Immunology 105（1）: 9–19.（2002）；Schuurman J.和Parren P.W. Curr Opin Immunol.（2016）；White A.L.等人J Immunol. 187（4）:1754-63.（2011）；White A.L.等人J Immunol 193（4）: 1828-1835（2014）；Dahal R.等人Cancer Cell. 29（6）:820-31.（2016）；Yu X.等人Cancer Cell 33（4）: 664-675（2018）），其对于ICOS激动剂活性以及在人中相关的抗肿瘤效应也可能是必不可少的。IgG4PE同种型的选择通过使用抗鼠ICOS 7E17G9替代抗体的体内研究得到进一步支持，其中鼠IgG1同种型在EMT6同基因模型中显示比缺失IgG2a抗体更大的功效。鼠IgG1具有与人IgG4相似的概况，具有与活化的FcγR受体的低结合，但仍保留与一些Fcγ受体包括抑制性FcγRIIB的结合，并且诱导Fc依赖性交联以改善抗ICOS抗体的激动作用；而鼠IgG2a可以如同人IgG1一样结合活化的FcγR，并且能够介导有效的缺失。用CTLA-4、PD-L1、OX40和CD40执行的研究已经显示，mAb的Fc同种型的选择可以显著影响不同肿瘤模型中的功效；然而，这需要对于每个靶标进行优化，取决于不同细胞类型（例如CD8相对于Teff相对于Treg）上的相对表达水平、以及抗体的作用模式（激动/缺失）和表位特异性（Dahal，L.N.等人Immunol Rev. 268（1）: 104-22.（2015），Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014），Yu X.等人Cancer Cell 33（4）: 664-675（2018））。离体人肿瘤含有不同比例的已知表达FcγRIIB的B细胞、巨噬细胞和DC，其对于介导肿瘤微环境中H2L5所需的FcγR交联是至关重要的
（Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014），Hussain，K.等人Blood 125（1）: 102-110（2015），Aalberse，R.C和Schuurman，J. Immunology 105（1）: 9–
19.（2002）；Schuurman J.和Parren P.W. Curr Opin Immunol.（2016）；White A.L.等人J Immunol. 187（4）:1754-63.（2011）；White A.L.等人J Immunol 193（4）: 1828-1835（2014）；Dahal R.等人 Cancer Cell. 29（6）:820-31.（2016）；Yu X.等人Cancer Cell 33（4）: 664-675（2018））。在人肿瘤的免疫抑制环境中经常可见有利于抑制FcγRIIB相对于活化FcγR的平衡，其可能有助于H2L5的交联并增强其激动剂活性（Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014），Dahal，L.等人Cancer Research 77（13）
3619-3631（2017））。
（Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014），Hussain，K.等人Blood 125（1）: 102-110（2015），Aalberse，R.C和Schuurman，J. Immunology 105（1）: 9–
19.（2002）；Schuurman J.和Parren P.W. Curr Opin Immunol.（2016）；White A.L.等人J Immunol. 187（4）:1754-63.（2011）；White A.L.等人J Immunol 193（4）: 1828-1835（2014）；Dahal R.等人 Cancer Cell. 29（6）:820-31.（2016）；Yu X.等人Cancer Cell 33（4）: 664-675（2018））。在人肿瘤的免疫抑制环境中经常可见有利于抑制FcγRIIB相对于活化FcγR的平衡，其可能有助于H2L5的交联并增强其激动剂活性（Furness A.J.等人Trends in Immunology 35（7）: 290-298（2014），Dahal，L.等人Cancer Research 77（13）
3619-3631（2017））。
[0202] 鉴于上述H2L5的激动剂活性，必须考虑的一个因素是肿瘤微环境中的Treg细胞上的ICOS表达。探索了在EMT-6和CT26鼠肿瘤模型中响应的ICOS阳性T细胞亚群与鼠7E.17E7 IgG1替代抗体的关系。相对于肿瘤中的CT26，在EMT6模型中在基线时观察到更高比率的ICOS+ CD8: Treg，这可能是导致用7E.17G9 IgG1观察到的EMT6模型中的更大功效的一个因素。类似地，在人源化的小鼠模型中，通过H2L5的肿瘤减少与增加的CD8:Treg比相关。在该模型中，对用H2L5单一疗法的治疗的响应与抗PD-1治疗相似。这些结果提示，ICOS阳性Treg的存在并不排除ICOS激动剂提供治疗益处的能力。
[0203] 人肿瘤表达不同比例的CD4和CD8 Teff和Treg，在肿瘤类型之间具有相当大的变异性。发现ICOS阳性细胞的百分比和ICOS表达的水平在不同细胞类型之间是异质的，具有对于Treg上的更高ICOS水平的趋势，尽管在许多患者中，在Treg相对于CD4和CD8 T细胞上的ICOS表达之间存在重叠。H2L5抗ICOS抗体的IgG1同种型而不是IgG4同种型，能够结合并诱导FcγRIIIA萤光素酶报道基因测定法中离体纯化的Treg以及一定程度的CD8和CD4细胞的活化。尽管发现该测定法系统中IgG1介导的活性与ICOS受体密度相关联，如对于其他靶标如CTLA-4、OX40和GITR已经报道的（19），但ICOS在Treg相对于Teff上的差异表达较不显著。此外，由于在Teff上的ICOS表达用抗PD-1和抗CTLA-4处理得到增强，因此这提示对于IgG1同种型可能不存在大的治疗窗以在体内介导Treg相对于Teff的选择性耗尽。基于上述数据，用于H2L5开发的策略包括选择具有高CD8:Treg比与在CD8 T细胞上的高ICOS表达的肿瘤类型（例如NSCLC），以及开发与降低Treg的丰度或限制Treg的功能的药剂的合理组合。
[0204] 由我们的数据支持的合理组合配偶体是PD-1/PD-L1阻断抗体。ICOS激动剂抗体治疗显著诱导人T细胞上的PD-1，以及治疗小鼠的肿瘤中的PD-1和PD-L1表达；此外，抗PD-1处理还显示诱导在CD4和CD8 Teff细胞上的ICOS表达。如同在小鼠中观察到的组合活性，在离体人免疫细胞测定法中，相对于单独的任一药剂，与PD-1阻断抗体派姆单抗组合的人ICOS激动剂H2L5证实增加的细胞因子产生。IFN-γ通过H2L5 IgG4PE的这种稳固诱导支持抗PD-1组合的原理，因为已知IFN-γ通过上调PD-L1对负反馈起作用（Mandal，M.等人Clinical cancer Research 22（10）:2329-2334）。
[0205] 用抗PD-1或抗PD-L1抗体的单一药剂治疗已经证实在许多实体瘤（例如膀胱、头颈、肺）中15%至30%的响应率（Hoos，A. Nat. Rev. Drug Disc. 15（4）:235-47.（2016））。使用与其他药剂组合的PD 1或PD-L1抗体的新出现临床数据已经显示在一些背景下活性增加的信号，然而，在一些情况下具有显著增加的毒性（Larkin，J.等人N Engl J Med. 373:23-34.（2015）；Forde P.M.，等人New England Journal of Medicine（2018）；Xu,X.等人Int. J Cancer. 142: 2344-2354（2018））。几种预测性生物标志物已经显示对于抗PD-1治疗的应答和抗性机制，并且支持关于组合的原理（Gibney G.T.等人Lancet Oncology 17（12）:
542-551（2016）；Tumeh P.C.等人Nature. 515（7528）: 568-71.（2014）；Taube，T.M.等人 Clin. Cancer Research. 20（19）:5064-5074（2014））。已经显示肿瘤突变负荷是新抗原生成的关联，所述新抗原刺激内源性肿瘤特异性储库的扩展，并且与对于抗PD-1疗法的响应相关（Schumacher，T.N.和Schreiber，R.D. Science 348: 69-74（2015））。最近已经显示肿瘤中T细胞浸润的克隆性和程度是癌症中的免疫治疗结果的重要阳性预测物（Xu,X.等人Int. J Cancer. 142: 2344-2354（2018））。我们的发现证实，用鼠替代抗体，TCR克隆得以扩展并且在血液和肿瘤之间共享。此外，诱导T细胞增殖、扩增和肿瘤浸润的H2L5可能与具有不同作用机制的其他免疫疗法药剂互补。
542-551（2016）；Tumeh P.C.等人Nature. 515（7528）: 568-71.（2014）；Taube，T.M.等人 Clin. Cancer Research. 20（19）:5064-5074（2014））。已经显示肿瘤突变负荷是新抗原生成的关联，所述新抗原刺激内源性肿瘤特异性储库的扩展，并且与对于抗PD-1疗法的响应相关（Schumacher，T.N.和Schreiber，R.D. Science 348: 69-74（2015））。最近已经显示肿瘤中T细胞浸润的克隆性和程度是癌症中的免疫治疗结果的重要阳性预测物（Xu,X.等人Int. J Cancer. 142: 2344-2354（2018））。我们的发现证实，用鼠替代抗体，TCR克隆得以扩展并且在血液和肿瘤之间共享。此外，诱导T细胞增殖、扩增和肿瘤浸润的H2L5可能与具有不同作用机制的其他免疫疗法药剂互补。
[0206] 使用以下材料和方法获得实施例2中所述的结果：材料和方法
人源化的H2L5抗体
H2L5是鼠mAb克隆422.2的人源化变体，其得自Daniel Olive实验室，Institut Paoli-Calmettes，INSERM（Marseille，法国）。通过使用COS7细胞用重组人ICOS-Fc腹膜内免疫BALB/c小鼠，使用标准杂交瘤技术来生成鼠抗体。
人源化的H2L5抗体
H2L5是鼠mAb克隆422.2的人源化变体，其得自Daniel Olive实验室，Institut Paoli-Calmettes，INSERM（Marseille，法国）。通过使用COS7细胞用重组人ICOS-Fc腹膜内免疫BALB/c小鼠，使用标准杂交瘤技术来生成鼠抗体。
[0207] 细胞系和原代细胞培养鼠肿瘤细胞系EMT6（ATCC# CRL-2755）和CT26（ATCC# CRL-2638），以及人细胞系A549（ATCC# CCL-185）A2058（ATCC# CRL-11147）、HCT116（ATCC# CCL-247）在接收后进行扩增并冷冻，并且在低传代（≤10次传代）时用于对小鼠接种。在体内使用之前，使用小鼠/大鼠综合CLEAR实验对象组（Charles River Research Animal Diagnostic Services），细胞系通过PCR进行测试，并且确认对于病原体（包括支原体）呈阴性。
[0208] 所有患者材料都依据GSK人生物样品管理（HBSM）政策和SOP获得适当的知情书面同意书。肝素钠试管（BD Biosciences）中的全血和来自癌症患者的手术切除的肿瘤组织通过邮寄过夜运送从Avaden Biosciences（Seattle）获得。来自健康人供体的原代T细胞或PBMC从在GSK现场献血单位的肝素钠试管中收集的全血中纯化，伴随适当的同意书且依据GSK HBSM政策。经由Histopaque通过密度梯度离心来分离PBMC。使用DynabeadsTM Untouched™ Human T-cell试剂盒（Life Technologies）或RosetteSep人CD4或CD8 T细胞富集试剂盒（StemCell），通过负选择来分离T细胞，用于结合和功能测定法。分离的T细胞用板结合的抗CD3（克隆OKT3，eBioscience）和抗CD28（克隆CD28.2，eBioscience）预活化48-
96小时，以上调ICOS表达。
96小时，以上调ICOS表达。
[0209] 小鼠、肿瘤攻击和治疗所有研究都根据GSK关于实验动物的护理、福利和治疗的政策进行，并且由GSK的机构
动物护理和使用委员会、或由在其中执行工作的机构的伦理审查过程进行审查。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠（Harlan /Envigo）在完全认可的AAALAC设施中用于体内研究。将5 x 104个细胞/小鼠CT26小鼠结肠癌或1 x 105个EMT6小鼠乳腺癌肿瘤细胞皮下接种至右侧腹。除非另有说明，否则在治疗起始之前，当肿瘤达到100 mm3时，小鼠（n=10/治疗组）用Study Director软件包（Studylog Systems）进行随机化。ANOVA用于确保组之间的相似性（P>
0.9）。在组分配期间，研究调查员是不知情的，并且评价了最终结果，以确保组分布对于研究起始是可接受的（P>0.9）。
动物护理和使用委员会、或由在其中执行工作的机构的伦理审查过程进行审查。6-8周龄的雌性BALB/c小鼠（Harlan /Envigo）在完全认可的AAALAC设施中用于体内研究。将5 x 104个细胞/小鼠CT26小鼠结肠癌或1 x 105个EMT6小鼠乳腺癌肿瘤细胞皮下接种至右侧腹。除非另有说明，否则在治疗起始之前，当肿瘤达到100 mm3时，小鼠（n=10/治疗组）用Study Director软件包（Studylog Systems）进行随机化。ANOVA用于确保组之间的相似性（P>
0.9）。在组分配期间，研究调查员是不知情的，并且评价了最终结果，以确保组分布对于研究起始是可接受的（P>0.9）。
[0210] 基于来自CT26同基因模型中的5项分开研究的肿瘤生长率中的个体间差异，将10只小鼠/组调整为观察对照组和药物治疗组之间大约0.8的效应量并且生成统计显著数据所需的最佳数目。
[0211] 荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受在不同同种型背景下的小鼠抗ICOS（克隆7E.17G9）、或H2L5、和/或小鼠抗PD-1（克隆RMP1-14）、或盐水中的同种型对照，每周两次，在随机化当天开始，总共6个剂量。关于个体小鼠大于2,000 mm3的肿瘤测量和/或开放性溃疡的发展，导致小鼠从研究中去除。
[0212] 结合研究使用Biacore™ T200（GE Healthcare™）测定H2L5与兔加上Fc标签的重组细胞外人或食蟹猴ICOS（内部生成）结合的亲和力和动力学。使用T200数据分析软件，将ICOS结合数据拟合至1:1动力学模型。H2L5与新鲜分离的未活化的以及CD3/CD28活化的CD4和CD8 T细胞两者的细胞表面结合经由通过流式细胞术检测抗人IgG，κ轻链FITC（Sigma）与H2L5的结合来确定。
[0213] 抗体以下抗人抗体用于流式细胞术分析，CD4（RPA-T4，BD Biosciences）、CD8（RPA-T8，Biolegend）、CD69（FN50，Biolegend）、OX40（ACT-35，eBioscience）、Ki67（B56，BD Biosciences）、ICOS（ISA3，eBioscience）。以下抗小鼠抗体用于流式细胞术分析：CD3（145-
2C11，BD Biosciences）、CD4（RM4-5，BD Biosciences）、CD8（53-6.7，BD Biosciences）、CD25（PC61，BD Biosciences）、CD44（IM7，Biolegend）、CD62L（MEL14，BD Biosciences）、FOXP3（Fjk-16s，eBioscience）、ICOS（C398.4a，Biolegend）、Ki67（16A8，Biolegend）。使用膜联蛋白V试剂盒与7-AAD（Biolegend）测量细胞凋亡。对于人PBMC小鼠模型的流式细胞分析，使用以下抗体：CD45（HI30，BD Biosciences）、CD3（UCHT1，Biolegend）、CD4（SK3，BD Biosciences）、CD45RO（UCHL1，Biolegend）、CD62L（SK11，BD Biosciences）。p-AKT（S473，#
4060和T308，#13038）、total Akt（#9272）、pGSK3-α（#5558）、总GSK3-α（#12456）、pS6（S235/
236，#2211和S240/244，#5364）、总S6（#2317）和pERK（#9101）（全部来自Cell Signaling Technology）用于蛋白质印迹。
2C11，BD Biosciences）、CD4（RM4-5，BD Biosciences）、CD8（53-6.7，BD Biosciences）、CD25（PC61，BD Biosciences）、CD44（IM7，Biolegend）、CD62L（MEL14，BD Biosciences）、FOXP3（Fjk-16s，eBioscience）、ICOS（C398.4a，Biolegend）、Ki67（16A8，Biolegend）。使用膜联蛋白V试剂盒与7-AAD（Biolegend）测量细胞凋亡。对于人PBMC小鼠模型的流式细胞分析，使用以下抗体：CD45（HI30，BD Biosciences）、CD3（UCHT1，Biolegend）、CD4（SK3，BD Biosciences）、CD45RO（UCHL1，Biolegend）、CD62L（SK11，BD Biosciences）。p-AKT（S473，#
4060和T308，#13038）、total Akt（#9272）、pGSK3-α（#5558）、总GSK3-α（#12456）、pS6（S235/
236，#2211和S240/244，#5364）、总S6（#2317）和pERK（#9101）（全部来自Cell Signaling Technology）用于蛋白质印迹。
[0214] ADCC测定法完整的PBMC或NK耗尽的PBMC用板结合的抗CD3和抗CD28抗体进行活化。使细胞与以10
μg/mL最终浓度的抗ICOS抗体（H2L5 IgG1、H2L5 IgG4PE和Fc缺陷的H2L5）或对照抗体一起温育24小时。细胞用抗CD8和CD4抗体进行染色，然后与NIR Live/Dead染料（Invitrogen）一起温育。通过流式细胞术（FACSCanto，BD Biosciences）分析染色的细胞，以基于NIR Live/Dead细胞染料染色来测量T细胞杀死。
μg/mL最终浓度的抗ICOS抗体（H2L5 IgG1、H2L5 IgG4PE和Fc缺陷的H2L5）或对照抗体一起温育24小时。细胞用抗CD8和CD4抗体进行染色，然后与NIR Live/Dead染料（Invitrogen）一起温育。通过流式细胞术（FACSCanto，BD Biosciences）分析染色的细胞，以基于NIR Live/Dead细胞染料染色来测量T细胞杀死。
[0215] 在添加以6:1的E:T细胞比的Jurkat-FcγRIIIA-NFAT-萤光素酶效应细胞之前，在FcγRIIIa接合报道物生物测定法（Promega）中，使抗CD3/CD28预活化的CD4 T细胞与抗ICOS抗体和对照抗体一起温育45分钟。在处理6小时后，将ONE-GLO萤光素酶试剂加入每个孔中，并且测量发光强度以确定在Victor板阅读器（Perkin Elmer）上的靶T细胞和效应细胞之间的接合。CD4、CD8和Treg群体从用抗CD3/CD28预活化的供体PBMC或解聚的肿瘤细胞中纯化，并且在IgG1或IgG4PE H2L5抗体的存在下，以6:1的E:T比直接进行离体测试。
[0216] 功能测定法如较早所述，H2L5在人PBMC测定法中以板结合的形式伴随使用新鲜分离的PBMC的同时
CD3刺激、或在CD3/CD28预刺激的PBMC中以可溶形式进行测试。对于来自癌症患者的PBMC，在治疗起始之前包括过夜休息步骤。10 µg/mL可溶性派姆单抗在体外测定法中用于研究组合的效应。使用定制的人多重中尺度检测（MSD）试剂盒（Meso Scale Diagnostics），测量来自这些测定法的上清液中的细胞因子浓度。
CD3刺激、或在CD3/CD28预刺激的PBMC中以可溶形式进行测试。对于来自癌症患者的PBMC，在治疗起始之前包括过夜休息步骤。10 µg/mL可溶性派姆单抗在体外测定法中用于研究组合的效应。使用定制的人多重中尺度检测（MSD）试剂盒（Meso Scale Diagnostics），测量来自这些测定法的上清液中的细胞因子浓度。
[0217] 使用CD14 MicroBeads（Miltenyi Biotec）用于T细胞:单核细胞混合培养测定法，从健康人供体的全血中分离人单核细胞。T细胞和单核细胞是供体匹配的。CD3/CD28预刺激的T细胞和单核细胞在AIM-V无血清培养基中以2:1的比率混合，并且在与可溶性H2L5或其他对照抗体一起在37℃下温育4天之前，与抗CD3免疫磁珠(dynabeads)（Life Technologies）、100 IU重组人IL-2和100 ng/ml M-CSF（Peprotech）一起培养。20 μg/mL人Fc阻断剂（B564220）（BD biosciences）或抗CD32 mAb（MCA1075EL，克隆AT10）（AbD serotec）用于测试FcγR交联的作用。
[0218] 对于MLR测定法，单核细胞（Lonza，瑞士）在GM-CSF和IL-4（Pepro Tech）补充的LGM-3培养基（Lonza）中生长9天，并在用于MLR测定法中之前分化成mDC和TNFα（R&D Systems）额外一天。在以1:10的珠/细胞比的抗CD3珠（Life Technologies ）、或CEFT肽混合物（0.02 μg/mL）（JPT Peptide Technologies）的存在下， mDC-T细胞（1:10的比率）混合物用10 µg/mL可溶性Fc缺陷的H2L5或同种型对照抗体处理4天，然后收集上清液用于通过MSD的细胞因子分析。
[0219] 使用GentleMACS（Miltenyi Biotec）组织分离器，将原发性患者肿瘤分离。在用抗CD3加上H2L5处理之前，在补充IL-2的RPMI培养基中扩增TIL（Baldan等人，2015）。或者，在用抗CD3加上H2L5伴随在24小时后加入的100ng/ml IL-2刺激后，将肿瘤分离细胞直接离体培养高达6天。
[0220] 对于测试不同H2L5同种型的PBMC测定法，来自健康供体的匿名白细胞锥从位于Southampton General Hospital，UK的National Blood Service获得，并且在4小时内使用。人样品的使用已通过当地伦理委员会依据赫尔辛基宣言（Declaration of Helsinki）批准。PBMC通过密度梯度离心（Lymphoprep）分离，并且在补充有谷氨酰胺（2 mM）、丙酮酸钠（1 mM）、青霉素和链霉素（100 IU/mL）的RPMI培养基1640（Life Technologies）中在37℃下在5% CO2中进行培养。
[0221] 如先前详述的执行增殖测定法（35）。简言之，新鲜的PBMC用1 μM羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行标记，并且在抗体刺激之前以高密度（1×107/mL）培养48小时。对于PBMC刺激，将细胞以1×105/孔转移到圆底96孔板内，并且用1 µg/ml OKT3（板结合的）和5 µg/ml（可溶的）H2L5 mAb进行刺激。在第6天时，细胞用抗CD8-e450（SK-1，eBioscience）和抗CD4-APC（RPA-T4，Insight Biotechnology）进行标记，并且通过CFSE稀释在FACSCantoII流式细胞仪（BD Biosciences）上评价增殖。结果表示为与未刺激的细胞相比的%分裂细胞。在48小时高密度培养后，根据制造商的说明书，使用CD56微珠（Miltenyi Biotec）执行NK耗尽（Hussain等人，Blood 2014）。
[0222] 免疫荧光研究未刺激和CD3/CD28刺激的T细胞用20µg/mL的人Fc阻断剂（B564220）（BD biosciences）或抗CD32 mAb（MCA1075EL，克隆AT10）（AbD serotec）进行Fc阻断，以测试FcγR交联的作用，然后用6 µg/mL冷标记的抗体（抗ICOS或IgG4PE同种型对照）在冰上处理1小时。细胞在冷缓冲液中洗涤，并且转移到37℃用于不同的时间（0、5、15、30分钟和1小时），以允许蛋白质运输，然后用新鲜制备的4%多聚甲醛（Sigma）固定。在37℃下的初始脉冲后1或2小时，样品用Alexa Fluor 647标记的抗ICOS在37℃下再脉冲30分钟，洗涤并在多聚甲醛中固定。将细胞转移至聚L-赖氨酸包被的盖玻片共15分钟，然后用DAPI（Invitrogen）固定在ProLong Gold中的载玻片上。使用具有63X油浸透镜的ZEISS LSM510 Meta共聚焦显微镜执行样品的分析。
[0223] 人T细胞基因表达如上所述，从在GSK现场献血单位的健康志愿者供体（n=6）获得全血，并且使用
RosetteSep™ Human T-Cell Enrichment Cocktail（Stemcell Technologies）纯化T细胞。将细胞重悬浮（5x106细胞/mL）于AIM-V培养基（Gibco）中，并且在96孔板（Falcon）中温育，所述96孔板依次用0.6 μg/mL小鼠抗人CD3 mAb（ eBioscience）和10 μg/mL抗人ICOS或相应的同种型对照mAb –小鼠IgG2ακ（eBioscience）和IgG4PE进行预包被。在37℃和5% CO2下温育24小时后，将细胞沉淀，悬浮于RLT缓冲液（Qiagen）中，并且贮存在–80°C下用于RNA分离。使用RNeasy Mini QIAcube试剂盒（Qiagen）提取总RNA。RNA表达水平通过NanoString nCounter Analysis System进行确定。根据制造商的说明书，使用NanoString Human PanCancer Immune概况分析CodeSet，50 ng RNA在每个反应中用于基因特征。使用内置的阳性对照和管家基因（nCounter Expression Data Analysis Guide，NanoString），将原始数据标准化。ArrayStudio（OmicSoft）和GraphPad Prism（GraphPad Software）用于进一步分析和绘图。
RosetteSep™ Human T-Cell Enrichment Cocktail（Stemcell Technologies）纯化T细胞。将细胞重悬浮（5x106细胞/mL）于AIM-V培养基（Gibco）中，并且在96孔板（Falcon）中温育，所述96孔板依次用0.6 μg/mL小鼠抗人CD3 mAb（ eBioscience）和10 μg/mL抗人ICOS或相应的同种型对照mAb –小鼠IgG2ακ（eBioscience）和IgG4PE进行预包被。在37℃和5% CO2下温育24小时后，将细胞沉淀，悬浮于RLT缓冲液（Qiagen）中，并且贮存在–80°C下用于RNA分离。使用RNeasy Mini QIAcube试剂盒（Qiagen）提取总RNA。RNA表达水平通过NanoString nCounter Analysis System进行确定。根据制造商的说明书，使用NanoString Human PanCancer Immune概况分析CodeSet，50 ng RNA在每个反应中用于基因特征。使用内置的阳性对照和管家基因（nCounter Expression Data Analysis Guide，NanoString），将原始数据标准化。ArrayStudio（OmicSoft）和GraphPad Prism（GraphPad Software）用于进一步分析和绘图。
[0224] ICOS/ICOS-L竞争测定法使MSD板与在PBS中稀释的10 μg/mL重组ICOS蛋白（R&D Systems）一起在4°C下温育过夜。将板洗涤并封闭，然后在7点剂量曲线中添加同种型对照或H2L5。在过夜温育和洗涤后，使板与1μg/mL人ICOS配体（B7-H2）（R&D Systems）一起温育，随后与10 μg/mL生物素化的抗人ICOS配体（B7-H2）（R&D Systems）抗体一起温育。在稀释剂100中以10 μg/mL的加上硫标签的链霉抗生物素蛋白用于检测生物素化的配体。在MSD MESO Quick Plex SQ 120上的MSD Read缓冲液添加后立即读取板，并且在MSD工作台软件上分析数据。流式细胞术还用于调查由抗CD3/CD28活化的T细胞表达的细胞表面ICOS与由H2L5表达的ICOS-L之间的竞争。
使活化的T细胞与不同浓度的重组ICOS-L一起温育，然后与H2L5一起温育，并且确定ICOS CD4+和CD8+ ICOS细胞的MFI。
使活化的T细胞与不同浓度的重组ICOS-L一起温育，然后与H2L5一起温育，并且确定ICOS CD4+和CD8+ ICOS细胞的MFI。
[0225] 人PBMC小鼠模型通过经由尾静脉的静脉内注射，用人PBMC（20x106/小鼠）注射成年免疫缺陷的NOD/
SCID/IL-2Rγnull（NSG）小鼠（Jackson Labs）。人PBMC注射后1-3天，向小鼠植入人肿瘤细胞系A2058、A549、HCT116（1 x 106）；通过腹膜内注射向小鼠施用同种型对照或抗人ICOS抗体，剂量范围为0.004 mg/kg至1.2 mg/kg，每周两次，共3周。荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受在不同同种型背景下的小鼠抗ICOS（克隆7E.17G9）、或H2L5、和/或派姆单抗（Merck；NDC#
0006-3026-02）抗体、或盐水中的同种型对照，每周两次，在随机化当天开始，总共6个剂量。
关于个体小鼠大于2,000 mm3的肿瘤测量和/或开放性溃疡的发展，导致小鼠从研究中去除。
SCID/IL-2Rγnull（NSG）小鼠（Jackson Labs）。人PBMC注射后1-3天，向小鼠植入人肿瘤细胞系A2058、A549、HCT116（1 x 106）；通过腹膜内注射向小鼠施用同种型对照或抗人ICOS抗体，剂量范围为0.004 mg/kg至1.2 mg/kg，每周两次，共3周。荷瘤小鼠经由腹膜内注射接受在不同同种型背景下的小鼠抗ICOS（克隆7E.17G9）、或H2L5、和/或派姆单抗（Merck；NDC#
0006-3026-02）抗体、或盐水中的同种型对照，每周两次，在随机化当天开始，总共6个剂量。
关于个体小鼠大于2,000 mm3的肿瘤测量和/或开放性溃疡的发展，导致小鼠从研究中去除。
[0226] 在抗体的第2个或第4个剂量后24小时的安乐死后收集脾脏和全血。通过机械解离分离脾细胞，随后为用LCK裂解缓冲液（Lonza）的RBC裂解和抗体染色，而在用FACSlyse（BD Biosciences）的RBC裂解之前，用适当的抗体对全血进行染色。如下所述，通过在FACScanto（BD）上的流式细胞术评估所有样品。
[0227] 蛋白质印迹活化的T细胞用H2L5或同种型对照处理高达48小时。CD4+ T细胞用CD3/CD28
®
Dynabeads（ThermoFisher）以1:20的细胞/珠比率预刺激48小时，允许在不存在刺激的情况下静置24小时，然后在板结合的抗CD3抗体存在下用同种型对照抗体或H2L5（10 μg/mL）处理。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）的细胞裂解缓冲液（Cell Signaling Technologies）裂解细胞。25-30 μg蛋白质在4-12% Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上运行，并且转移到硝酸纤维素膜（Invitrogen）上。膜使用LI-COR Odyssey Blocking Buffer进行封闭，然后使用一抗和二抗进行免疫印迹，并且在LI-COR Odyssey成像系统上进行扫描。
®
Dynabeads（ThermoFisher）以1:20的细胞/珠比率预刺激48小时，允许在不存在刺激的情况下静置24小时，然后在板结合的抗CD3抗体存在下用同种型对照抗体或H2L5（10 μg/mL）处理。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche）的细胞裂解缓冲液（Cell Signaling Technologies）裂解细胞。25-30 μg蛋白质在4-12% Bis-Tris凝胶（Invitrogen）上运行，并且转移到硝酸纤维素膜（Invitrogen）上。膜使用LI-COR Odyssey Blocking Buffer进行封闭，然后使用一抗和二抗进行免疫印迹，并且在LI-COR Odyssey成像系统上进行扫描。
[0228] FACS分析通过适当地与人或小鼠Fc阻断剂（Miltenyi Biotec）一起温育，封闭活化的T细胞上的非特异性结合，然后与针对缀合至不同荧光团的细胞表面标志物的检测抗体一起在冰上温育30分钟。对于细胞内染色，使用Transcription Factor Buffer组（BD biosciences），将细胞固定并渗透化。在补偿后，在FACS Canto II或Fortessa（BD biosciences）上获取数据，并且用FACSDiva（BD）或Flowjo（Treestar）软件进行分析。
[0229] 免疫组织化学在具有相关平台试剂的Leica Bond RX上，使用兔抗人CD278 mAb（克隆SP98；Spring Biosciences），执行非小细胞肺癌（NSCLC）、乳腺癌（BrCA）TNBrCa和结肠直肠癌（CRC）中ICOS的免疫组织化学检测。DAB（3,3'-二氨基联苯胺）用于靶标检测。切片用苏木精进行复染（所有比例条 = 20µm）。
[0230] Clarient MultiOmyx平台（Neogenomics，California），多重免疫荧光（IF）测定法，用于评估在FFPE肿瘤组织上的其他T细胞标志物中的ICOPE、PD-1、CD3、CD4和CD8表达，所述FFPE肿瘤组织得自如上所述由GSK HBS团体审查的供应商。迭代过程包括各自用Cy3和Cy5缀合的抗体的一轮染色和成像，随后为染料失活、背景荧光成像和背景扣除，然后对于实验对象组中的所有标志物重复该循环。
[0231] 统计分析如附图图例中指定的，使用单因素ANOVA或斯氏t检验。用GraphPad Prism软件
（GraphPad）分析数据，并且< 0.05的p值被认为是统计学显著的。（*P≤ 0.05；**P≤
0.01；***P≤ 0.005；****P< 0.0001）。
（GraphPad）分析数据，并且< 0.05的p值被认为是统计学显著的。（*P≤ 0.05；**P≤
0.01；***P≤ 0.005；****P< 0.0001）。
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